Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Ihmisen syöpien kuluttavat suuria määriä glukoosia verrattuna normaaleissa kudoksissa painottuen muunnetaan ja erittyy laktaatti huolimatta runsas Hapen (Warburg vaikutus). Taustalla korkeampi Glykolyysivaiheen on siis juureen kasvaimen muodostumisen ja kasvun. Normaali ohjaus glykolyyttisten allosteerisen entsyymien vaikuttaa heikentynyt kasvaimissa; kuitenkin, ilmiö ei ole täysin ratkaistu.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä paperi-, me osoituksia siitä, että natiivi 85-kDa 6-phosphofructo-1-kinaasi (PFK1) keskeinen säätelyentsyymi glykolyysin, joka on normaalisti valvonnassa palaute esto, läpikäy posttranslationaalinen modifikaatio. Sen jälkeen, kun proteolyyttinen pilkkominen C-terminaalinen osa entsyymin, joka on aktiivinen, lyhyempi 47-kDa: n fragmentti muodostui, joka oli epäherkkä sitraatti ja ATP inhibition. Kasvaimia tuottavassa solulinjat, vain lyhyen fragmentteja, mutta ei natiivi 85-kDa PFK1 havaittiin immunoblottauksella. Samanlaisia ​​fragmentteja havaittiin myös kasvaimen kudos, joka on kehitetty hiirillä sen jälkeen, kun ihon alle infektion kasvaimia synnyttäviä B16-F10-soluja. Perustuen rajoitettu proteolyyttisen digestion kaniinin lihas PFK-M, aktiivinen sitraatti esto kestävä lyhyempi muoto on saatu, mikä osoittaa, että yksittäinen posttranslational muutos askel oli mahdollista. Tarkka molekyylimassat aktiivisen lyhyemmän PFK1 fragmenttien määritettiin laittamalla katkaistu geenit rakennettiin ihmisen lihaksen PFK1 cDNA

PFK

null

E. coli

rasitusta. Kaksi

E. coli

transformanttien koodaavat modifioidun PFK1s on 45551 Da ja 47835 Da kasvoi glukoosi väliaineessa. Lisäämällä modifioitu katkaistu ihmisen

PFK

M-geenien myös stimuloi glukoosin kulutusta ja laktaattia erittyminen vakaa transfektanteista ei-tuumorigeenisen ihmisen HEK solu, mikä viittaa tärkeä rooli lyhyempiä PFK1 fragmenttien parantamisessa glykolyyttisissä muutostilassa.

Johtopäätökset /merkitys

käännösten jälkeinen muutos PFK1 entsyymin voisi olla keskeinen tekijä vapautettiin glykolyyttisen vuon kasvaimia, jotka yhdistettynä muuttuneisiin signalointimekanismeja olennaisesti tukee nopeaa lisääntymistä syöpäsoluja.

Citation: Šmerc A, Sodja E, Legiša M (2011) käännösten jälkeinen muokkaus 6-phosphofructo-1-kinaasi tärkeänä tekijänä of Cancer Metabolism. PLoS ONE 6 (5): e19645. doi: 10,1371 /journal.pone.0019645

Editor: Anil Kumar Tyagi, University of Delhi, Intia

vastaanotettu: 10 joulukuu 2010; Hyväksytty: 12 huhtikuu 2011; Julkaistu: 4. toukokuuta 2011

Copyright: © 2011 Šmerc et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat Slovenian Research Agency (Sopimus nro J4-9606 ja 1000-07-310027; https://www.arrs.gov.si/sl/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

johdonmukainen ominaispiirre pahanlaatuisten solujen kulutus on suurempi määrä glukoosia verrattuna normaaleihin soluihin ja muuntaminen enemmistön glukoosin maitohappoa. Kasvain solut ensisijaisesti käyttää Glykolyysivaiheen yli mitokondrion oksidatiivinen fosforylaatio glukoosin riippuvaisen ATP tuotanto jopa läsnäollessa runsaasti happea polttoaineen mitokondrioiden hengitystä. [1]. Tämä poikkeava energinen aineenvaihduntaa, joka tunnetaan nimellä ”Warburg vaikutus” on siis juureen kasvaimen muodostumisen ja kasvun ja on jopa keskusteltu mahdollisena tunnusmerkki syöpä [2].

Viime vuosikymmenen aikana löytö onkogeenien siirretään kiinnostusta pois tutkimuksista solun aineenvaihdunnan kasvaimissa niitä kohtaan, joilla pyritään paljastamaan toimintaa onkogeenien että valvonta aineenvaihduntaan. Toistaiseksi ratkaisevista tekijöistä tunnustettu tuottamisesta syövän metabolisen fenotyyppi näyttää olevan kasvaimia synnyttävän mutaatioita, jotka muuttavat kasvutekijä signalointi kautta PI3K /Akt /mTOR-reitin [3]. Aktivointi tämän reitin parantaa metabolisen toiminnan Glykolyysivaiheen kaksi merkittävää tapahtumaa. Ensimmäinen synteesi sokerin kuljettajan Glut1 indusoituu helpottaa glukoosin sisäänottoa soluihin [4], [5]. Toinen aktiivisuus transkription monimutkaisia ​​HIF-1α kasvaa, mikä yhdessä transkriptiotekijän c-Myc parantaa synteesin enemmistön glykolyyttisten entsyymien [6]. Lisääntynyt määriä villityyppientsyymejä siten johtaa lisääntyneeseen erityistoimia. Kuitenkin glykolyyttisissä vuo eukaryoottiorganismeja on tiukasti ohjataan allosteric entsyymit säilyttävät sääntelyn palautetta esto huolimatta kohonnut toiminta välittäjänä entsyymejä. Tämä selvitys on vahvistanut kokeiden

E. coli

[7] ja

S. cerevisiae

[8], jossa yliekspressio kaikki glykolyyttisten entsyymien ei ollut vaikutusta määrä glukoosin kulutuksen ja /tai etanolin tuotannossa. Siksi yksi on pakko todeta, että merkittäviä muutoksia kinetiikasta sääntelyn entsyymejä on myös mukana aineenvaihdunnan muutoksia, jotka tapahtuvat aikana muutosta normaalin nisäkkäiden solujen syöpäsoluja.

Glykolyysi on keskeinen primaariaineenvaihduntaan, ja normaalisti, se on tiukasti säädeltyä kolme allosteerisiä entsyymejä, heksokinaasi, 6-phosphofructo-1-kinaasi (PFK1) ja pyruvaattikinaasin (PK), jotka katalysoivat yksittäisen peruuttamattomia vaiheita. Heksokinaasilla, mukana ensimmäisessä sääntelyn vaiheessa, näkyy pääasiallisesti käytettäessä HK2 isoentsyymi muodossa kasvaimia, jotka on sidottu mitokondrion ulkokalvon päin sytosoliin. Microlocation tämän entsyymin avulla etuoikeutettu pääsy juuri syntetisoidun ATP fosforyloimiseksi glukoosia, ja se on vastustuskykyinen tuoteinhibiitio [9]. Toinen allosteeristen entsyymi on pyruvaattikinaasi, joka säätelee metabolinen virtaus yli terminaalisen osan glykolyysin. Kasvainsolujen on osoitettu yksinomaan ilmaista alkion M2 isoformin PK, joka voidaan aktivoida fruktoosi-1,6-bisfosfaatti-. Kuitenkin sitoutuminen tyrosiinifosforyloitunut peptidien PK-M2 johtaa vapautumisen allosteerisen aktivaattorin, joka johtaa entsyymiaktiivisuuden inhibitio. Deaktivointi PK-M2 kasvainsoluissa uskotaan siirtää glukoosiaineenvaihdunnan energiantuotannon anabolisten prosessien [10].

Kuitenkin kaikkein monimutkainen valvoa glykolyyttisissä vuon johtuu PFK1 (EY 2.7.1.11), joka selviäisikin sääntelyn rooleja kahden muun allosteric entsyymejä. PFK1 katalysoi fosforylaation fruktoosi-6-fosfaatin fruktoosi-1,6-bisfosfaatti-, käyttäen MgATP kuten fosforyylikloridilla luovuttajan [11]. PFK1 stimuloi fruktoosi-2,6-bisfosfaatin (F-2,6-BP), ADP /AMP ja ammoniumioneja, kun taas sitraatti- ja ATP toimivat vahvoina inhibiittoreina [11], [12].

evoluution aikana, eukaryoottisia PFK1 entsyymit kehittämä päällekkäisyyksiä, tandem fuusio ja eroavaisuudet katalyyttinen ja efek- sitoutumiskohtiin prokaryoottisen esi [12]. Kuitenkin tiukka säilyttäminen aktiivisten tähteet N-terminaalinen segmentti eukaryoottisen entsyymin ja bakteeri- PFKs viittaavat siihen, että aktiivisen eukaryoottisten PFK1 sijaitsee vain N-terminaaliseen osaan [12]. Sitä vastoin allosteeriset ligandia sitovat kohdat, jotka aikana kehittynyt evoluution mutaatiot C-terminaalissa mahdollistavat hienosäätöä sääntely entsyymin kohonneet tasot erityisten loppupään aineenvaihduntatuotteiden. Yksi allosteerisen ligandien on sitraatti, joka toimii voimakas inhibiittori kaikissa nisäkkäiden PFK1 isoformeja. Tutkimukset sitraatti allosteric sivustojen kanin lihaksen PFK1 päätteli, että nämä sivustot kehitetty fosfofofenolipyruvaattia (PEP) /ADP allosteeriseen

Escherichia coli

. Aminohappotähteet, jotka muodostavat sitraatti allosteeriseen sijaitsevat sekä N- ja C-päät molekyylin [13].

nisäkkään genomin, kolme erilaista PFK1 geenit ovat läsnä ja ovat eri tavalla ilmaistuna yksittäisissä kudoksissa. Ihmisen kudoksissa, niiden proteiini tuotteet ovat seuraavat molekyyli- massat: lihastyyppiä (PFK-M), 85051 Da [14]; maksan tyyppi (PFK-L) 84917 Da [15]; ja verihiutaleiden tyyppi (PFK-P), 85596 Da [16].

Kaikki kolme -isoentsyymit voimakkaasti estyy sitraatti, IC

50-arvot 0,08, 0,13 ja 0,18 mM aivojen (verihiutaleiden), lihas ja maksa PFK1, vastaavasti [17]. Kaikki ihmisen PFK1 isoformit ovat myös raportoitu voimakkaasti estävät ATP suurempina pitoisuuksina 0,05 mmol, mutta (F-2,6-BP) voi antagonisoida kielteisiä vaikutuksia ATP jossain määrin [18].

Tällä hetkellä , syöpäsoluissa, aktiivisuus PFK1 entsyymien uskotaan olevan säädelty vain menetys p53-toiminto, joka johtaa alaspäin säätelyn Tigar proteiini, joka toimii fruktoosi-2,6-bisphosphatase [19 ]. Niinpä taso F-2,6-BP pysyi suurena kasvaimia ja toiminut vahvasti positiivinen ärsyke.

Kuitenkin PFK1 isoformi, joka oli vähemmän herkkä sitraattiin esto (K

i = 0,75 mM sitraatti) ja herkempi aktivaatio F-2,6-BP on kuvattu ihmisen gliooman [20]. PFK1 isoformi samanlaisia ​​kineettinen ominaisuudet havaittiin myös nopeasti kasvavilla jyrsijän AS-30D hepatoomasolujen, joka osoitti täydellistä sieto kohti allosteeristen estäjiä, sitraatti ja ATP, läsnäollessa fysiologisten pitoisuuksien F-2,6-BP. Lisäksi entsyymi erittäin aktivoidaan sen aktivaattoreita NH

4

+, AMP, ja F-2,6-BP [21]. Silti luonne PFK1 isomuotojen esillä muutoksia entsyymikinetiikka ei ole tutkittu yksityiskohtaisesti.

sitraatti esto kestävä muoto PFK1 joka aktivoitiin korkeammalle tasolle allosteric aktivaattoreita on hiljattain kuvattu kaupallisesti tärkeitä sieni,

Aspergillus niger

[22] – [24]. Nämä kineettinen ominaisuudet johtuivat 49-kDa: n alayksiköt, jotka ovat suhteellisen pieniä PFK1 molekyylejä suhteessa muihin eukaryoottisissa PFK1s noin 85 kDa. Lisätutkimukset osoittivat, että mitä lyhyempi 49 kDa fragmentit muodostettu kaksivaiheisella posttranslational muuttaminen natiivin 85-kDa entsyymin [23] – [25].

Tässä raportissa esitämme näyttöä siitä, että samanlaisia ​​translaation jälkeinen modifikaatio natiivin lihas-tyypin PFK1 voi esiintyä myös nisäkkäiden syöpäsolut, jotka näin ollen johtaa muodostumista aktiivisen lyhyempiä PFK1 fragmentit, joilla on muuttuneita kineettiset parametrit.

tulokset

Analyysit aminohapon sekvenssit ihmisen PFK-M-proteiinin

alkuperä nisäkkäiden geenit, jotka koodaavat PFK1 entsyymien päällekkäisyys prokaryoottisten esi-geenien [12] voidaan vahvistaa kohdistus aminohapposekvenssit N- ja C- puolikkaat ihmisen PFK-M isoentsyymin osoittaen oleellista homologiaa (täydentävä Fig. S1). Analyysi suoritettiin CLUSTALW [26] paljasti 25,4% identtisyys, 21,6% vahvaa samankaltaisuutta, 11,6% heikko samankaltaisuus ja 41,8%: n ero joukossa aminohappotähdettä molemmat puoliskot kantavan rakenteen.

tutkimukset posttranslational muutos

. niger

PFK1 osoittivat, että natiivi entsyymi ensin pilkkoa seriiniproteaasin lyhyempään proteiiniin, joka oli alun perin aktiivinen, mutta saavutti toimintaa sen jälkeen, fosforylaatiota tietyn treoniinin jäännös, joka sijaitsee entsyymin aktiiviseen keskukseen [25]. Negatiivisesti varautunut aminohappotähde (fosforyloitu treoniini) oli välttämätöntä tuottaa entsyymin aktiivisuus [25]. Korvaamalla kodoni treoniinitähteen, jossa yksi glutamiinihappo katkaistu

a. niger PFK

A, tarvitaan fosforylaation aluksi aktiivinen lyhyempi PFK1 fragmentit poistettiin ja aktiivista lyhyempi PFK1 fragmentit koodataan suoraan modifioitu

PFK

geenejä [25]. Kohdistamalla päätellyt aminohapposekvenssit kolmen ihmisen isoentsyymien kanssa,

a. niger

entsyymin (täydentävä Fig. S2), joka on negatiivisesti varautunut aminohappotähde (asparagiinihappo) havaittiin vain sekvenssin PFK-M on asemassa, joka vastaa treoniinitähteen

a. niger

proteiinia. Kaksi muuta isoentsyymit, PFK-L ja PFK-P, sisälsivät ei-polaarinen alaniinijäännös vastaavan sivuston. PFK-M negatiivisesti varautuneen asparagiinihappojäämään tässä kriittisessä lokuksessa ollen pääteltiin olevan todennäköisin ehdokas tuottaa aktiivisen lyhyempiä PFK1 fragmentteja kerta posttranslationaalinen muutos vaiheessa.

In vitro

posttranslational muuttaminen nisäkkäiden PFK1

Jos haluat varmistaa, että PFK1 eristettiin kaniinin lihas. Puhdistettua entsyymiä inkuboitiin eri proteaaseilla ja testattiin läsnäolo juuri muodostettujen, aktiivinen, sitraatti esto-resistenttejä lyhyempi PFK1 fragmentteja. Erilaisia ​​kaupallisesti saatavilla proteaasit eri lajeista työskenteli yksittäisissä kokeissa.

Koe suoritettiin puskurissa, joka sisälsi 5 mM sitraattia, joka toimii estää voimakkaasti natiivin entsyymin muttei lyhyempiä fragmentteja. Kun rajoitettu proteolyysi puhdistetun natiivin PFK1 proteinaasi K: lla (0,001 mg /ml), PFK1 aktiivisuutta ei havaittu. Lisääntyi asteittain PFK1 aktiivisuutta havaittiin näytteissä, jotka altistettiin proteolyyttiselle toimia pitkiä aikoja (Fig. 1). SDS-PAGE, fragmentit noin 45 kDa: n havaittiin, kun rajoitettu proteolyysiä 0,001 mg /ml proteinaasi K (täydentävä Fig. S3), kun taas inkubointi proteinaasi K suurempina pitoisuuksina (0,01 mg /ml), jota tuottaa ei-aktiivinen, hieman lyhyempi fragmentit. Ei aktiivisia fragmentteja voitiin havaita katkaisun jälkeen natiivi entsyymiä muihin kaupallisesti saatavilla entsyymeillä mikrobi- tai nisäkkäistä peräisin.

toiminta natiivi PFK1 eristetään kaniinin lihas kun rajoitettu proteolyysi proteinaasi K (tumma) ja käsittelemätön natiivi entsyymi (valo) mitattuna joka sisältää 5 mM sitraattia. Tiedot edustavat kolmea riippumatonta mittausta ja esitetään keskiarvoina ± standardipoikkeama.

Tämä koe ensisijaisesti osoitti, että yhden vaiheen posttranslational muutos nisäkkään PFK1 oli mahdollista, jolloin saatiin aktiivinen lyhyempi PFK1 fragmentteja. Proteaasi, joka oli todella mukana tuotannon tällaisten fragmenttien ihmissoluissa Vielä on selvitettävä, mutta todennäköisin ehdokkaat ovat seriiniproteaaseja jotka on aktivoitava solunsisäisesti.

havaitseminen lyhyen PFK-M fragmenttien etäpesäkekasvainkudoksen solussa linjat immunoblottauksella

tutkimiseksi, jotka PFK1 muodot ovat läsnä tuumorisoluissa, neljä eri neoplastisia solulinjoja, joiden tiedetään aiheuttavan etäpesäkkeitä asettamisen jälkeen koe-eläimiin käytettiin. Seuraavat solulinjat testattiin: ihmisen kohdunkaulan HeLa-soluissa; Hiiren melanooma B16-F10-solut; ja kaksi lymfoomat, rotan Nb2-11 linjan ja ihmisen TF-1 rivi. Länsi-blottauksella, vasta-ainetta epitooppia vastaan ​​entsyymin aktiiviseen keskukseen, joka oli identtinen eri nisäkkään PFK1-M-isoformeja, mutta ei L tai P-isoformien, käytettiin.

homogenaateissa kaikki neoplastisen solukasvun linjat, määrä natiivin PFK1 85 kDa oli alle immunoblottaus määritysrajan (Fig. 2). Kuitenkin useat alemman molekyylipainon fragmentteja täplikäs. Kaikissa soluhomogenaattien sirpaleet noin 47 kDa oli läsnä, kun taas jotkut muut fragmentit näyttivät satunnaisesti. Toisin kasvaimia solulinjat, vain natiivi 85 kDa: n PFK1 entsyymien havaittiin lymfosyyttien eristetty ääreisveren ihmisen verestä. Native entsyymit olivat hallitseva myös ihmisen munuaisen alkion solujen (HEK293-solulinja) samanlaisella immunohistokemiallisen. HEK-solut kuolemattomiksi adenovirus, mutta eivät olleet tuumorigeenisiä. Vaikka mitään 47 kDa pienimolekyylipainoinen fragmentti havaittiin HEK-soluissa, jotkut hieman lyhennetty natiivi entsyymi muotoja havaittiin, että saattaisi olla tuote vaihtoehtoisen silmukoinnin. Ihmisen lihaksen, vaihtoehtoinen transkripti koodaa PFK-M-isoentsyymin on raportoitu, jolloin saatiin aktiivinen entsyymi, jolla on 749 aminohappotähdettä ja molekyylipaino 81776 Da [27]. Todisteet vaihtoehtoisen silmukoinnin ja PFK-M-geeni on myös raportoitu hiirissä [28].

Western blotit neljä tuumorigeenisen solulinjojen (edellä) osoitti, että läsnä on eri pituisia fragmentteja, fragmentin kanssa, jolla 47 kDa säännöllisesti läsnä, kun taas mitään natiivi 85-kDa PFK1 voitiin havaita. Ei-neoplastisia solulinjoja (alla) (HEK-solut), natiivi PFK1 muodot olivat vallitsevia, kun taas normaalissa eristetyt lymfosyytit perifeerisen ihmisen verestä vain yksi proteiini detektoitiin vastaa 85 kDa: n natiivia PFK1. Kun Western blot lymfosyyttien kaksi määriä solulysaattia geeliin: 10 ui (vasemmalla), ja 20 ui (oikealla).

ohjaus, ei vyöhykkeitä havaittiin, kun näytettä kasvualustaa immunoblotat- kanssa käytetyt vasta PFK1 havaitsemiseen.

havaitseminen lyhyen PFK-M fragmenttien kasvaimissa immunoblottauksella

kasvain, joka on kehittynyt C57BL /6 hiiri, 10 päivää sen jälkeen, kun ihon alle B16-F10-solut, lähes identtinen fragmentit havaittiin, kuten B16-F10-solut kasvavat kudosviljelmässä (Fig. 3). Kuitenkin kasvaimen, voimakas juova, joka vastasi natiivi PFK-M entsyymi oli läsnä, joka luultavasti oli peräisin ei-tuumorigeenisiä sidekudoksen, kuten verisuonia, strooman tai tulehdussolujen. Yksityiskohtaisen tarkastuksen lyhyemmän fragmenttien B16-F10-solut ja vastaavat kasvain osoitti, että 47 kDa fragmentti oli läsnä yksittäin kasvavat solut, kun taas ne, jotka kehitetty kasvain ilmaisivat 45 kDa fragmenttiin.

Ei syntyperäinen PFK1 entsyymi oli havaittu soluissa kasvaa kudosviljelmässä, kun kasvain, voimakkaan signaalin, joka vastaa natiivia entsyymiä oli läsnä. Lyhyemmät fragmentit havaittiin molemmissa homogenaateissa kanssa 47 fragmentin läsnä yksittäin kasvavissa soluissa ja 45 kDa: n fragmentin läsnä kasvainkudoksessa.

Katkaistu ihmisen lihaksen PFK1 cDNA koodaa aktiivista lyhyempi PFK-M fragmenttien

E.coli

solut hajotettiin natiivi

PFK

seuraavassa vaiheessa, tehokkuus aktiivisen lyhyemmän ihmisen PFK-M-fragmentit testattiin käytettäessä

E. coli

kanta, joka puuttui sen oma natiivi PFK1 proteiineja. Vaikka tarkkaa molekyylimassa lyhyempiä fragmentteja ei voitu määrittää western blotit, sarja katkaistun geenit valmistettiin ihmisen lihaksen PFK1 cDNA. Katkaistu geenit insertoitiin

E. coli

RL 257 [29] rasitusta, ja transformantit testattiin muuttuneita kasvuominaisuudet keskipitkällä sisältää glukoosia. Koodaamien proteiinien katkaistun geenien erosivat useita aminohappotähteitä ja peitetty molekyylimassat vaihtelevat 45 kDa ja 46 kDa: n ja 47 kDa: n ja 48 kDa: n (täydentävä taulukko S2). Kaksi transformanttia kykenivät kasvamaan lisäglukoosin minimialusta paljastui, yksi kustakin ryhmästä molekyylimassa (Fig. 4). Ensimmäinen kanta syntetisoitiin Fragment numero 4 (täydentävä taulukko S2) 422 aminohappotähdettä ja molekyylipaino 45551 Da, kun taas muut kannan koodattu Fragment numero 9 (täydentävä taulukko S2) kanssa 443 aminohappotähdettä ja massa 47835 Da. Solut Molempien kantojen kerrotaan optiseen tiheyteen 2 noin 24 tuntia, mikä osoitti, että molemmat rekombinantti- proteiinit olivat aktiivisia ja pystyvät osallistumaan tehokkaasti bakteerien aineenvaihduntaa. Ei kasvua transformanttien, jotka koodaavat muita lyhyempi PFK-M-fragmentit voitiin havaita, vaikka syntetisoida yhdistelmä-DNA-proteiinit havainnoitiin Western blotit (täydentävä Fig. S4). Ei kasvua glukoosielatusaineessa voitiin havaita ohjaus, vanhempien RL257 kanta, jossa pALTER-Ex1 plasmidin, jossa ei ole geenin insertoituna. Yllättäen, transformantti, joka koodaa ihmisen natiivin PFK-M (85051 Da) ei kyennyt proliferoitumaan samoissa olosuhteissa, mutta korkea entsyymiaktiivisuus (yli 600 mU /ml) havaittiin solu-uutos.

kaksi

E. coli

transformanttien koodaavaa fragmenttia 4 (⧫) ja fragmentti 9 (□) pystyivät kasvamaan lisäglukoosin minimimediumissa. Ei kasvua emokannassa, RL 257, kantaen pALTER-Ex-1-plasmidi ilman siirretyn geenin (•) voitiin havaita. Tiedot edustavat kolmea riippumatonta mittausta ja esitetään keskiarvoina ± standardipoikkeama.

molemmat transformantit, jotka kykenivät kasvamaan glukoosilla väliaineessa, PFK1 aktiivisuus havaittiin homogenaateissa. Molemmissa transformantit, jotka kykenivät kasvamaan glukoosilla väliaineessa, PFK1 toimintaa havaittiin homogenaateissa. Trans- koodaus Fragment 9, aktiivisuus resistenttejä ATP: n ja sitraatin inhibitio kirjattiin 0,5 mM F6P, joka on lähellä fysiologista konsentraatio [30]. Fragmentti 9 osoitti suuren affiniteetin kohti ATP (K

m on noin 0,05 mm) kun taas suurempina pitoisuuksina 0,2 mM, ei ATP esto voitu havaita (Fig. 5A). Päinvastoin, rekombinantti ihmisen natiivin 85 kDa PFK-M eristetty

E.coli

RL257 kanta osoitti huippu-entsyymin toimintaa kasvavien pitoisuuksien ATP. Alhaisilla ATP pitoisuuksina toimintaa nousi hitaammin nähden lyhyemmän fragmentti, joka ilmaisee alempi affiniteetti natiivin entsyymin kohti ATP (K

m~0,3 mM). Kuitenkin ATP pitoisuus on yli 0,6 mM aiheutti jyrkän laskun natiivi entsyymin aktiivisuutta ja vain vaatimaton PFK1 aktiivisuus havaittiin ATP pitoisuutena 1 mM (Fig. 5A). Natriumsitraatti ei inhiboi lyhyemmän PFK-M-fragmentti (kuvio. 5B). Tämä on päinvastoin kuin kineettinen ominaisuuksia ihmisen rekombinantti natiivin PFK-M-entsyymin, jossa on vahva herkkyyttä kohti sitraatti paljastui [31]. O inhibitio lyhyemmän fragmentin laktaattia voidaan havaita joko (Fig. 5B), joka on metaboliitti, joka on hiljattain ehdotettu alas säädellä hiiren PFK1 toimintaa [32].

Kuviossa 5A suhteessa erityisiä PFK1 toimintaa havaitaan Homogenaattia transformantin koodaavaa fragmenttia 9 (□) ja kotoperäisten PFK-M entsyymi eristetty

E.coli

transformantti (○) esitetään, että mitattiin kasvavia pitoisuuksia ATP. Kuviossa 5B erityisiä PFK1 toimintaa mitattiin homogenaattia transformantin koodaavan fragmentin 9 ilman inhibiittoria (□), kun läsnä oli 5 mM Na

3-sitraatti (◊), ja 5 mM Na-laktaattia (Δ) . Kaikki mittaukset tehtiin 0,5 mM F6P. Tiedot edustavat vähintään kolme riippumatonta mittausta ja esitetään keskiarvoina ± standardipoikkeama.

Fruktoosi-6-fosfaatti-kylläisyys käyrät ilman ja F-2,6-BP osoitti muutoksen PFK- M toimintaa sekä natiivi entsyymi (Fig. 6A) ja Fragment 9 (Fig. 6B). Lisäämällä F-2,6-BP mittausjärjestelmän, sigmoidisen juoni muutettiin Michaelis-Menten kinetiikkaa, jolle on ominaista voimakas nousu toimintaan nähden substraattikonsentraatiota. Vaikka F-2,6-BP lisääntynyt affiniteetti molemmat entsyymit kohti F6P substraattina, aktivaattori aiheuttivat myös merkittävä lisääntyminen Maksiminopeus lyhyemmän Fragment 9 (Fig. 6B), kun taas tällaista vaikutusta voidaan kirjata kanssa natiivi entsyymiä (Fig. 6A).

kuvassa 6A F6P kyllästyminen käyrät eristetyn natiivin PFK-M-entsyymin kanssa (○) ja ilman (◊) 4 uM F-2,6-BP on esitetty. Kuvassa 6B F6P kylläisyyttä käyrien havaittiin homogenaattia transformantin koodauksen Fragment 9 (□) ja ilman (Δ) 4 uM F-2,6-BP on esitetty. Mittaukset tehtiin 1 mM ATP: tä. Molemmissa kuvaajat suhteessa erityistoimet on esitetty. Tiedot edustavat vähintään kolme riippumatonta mittausta ja esitetään keskiarvoina ± standardipoikkeama.

lyhyempi PFK-M fragmentit näyttivät olevan hyvin epästabiili in vitro olosuhteissa. Aktiivisuus voidaan vakiinnuttaa jossain määrin solutonta uutetta, joka sisälsi noin 10 mg proteiineja per ml lisäämällä fruktoosi-6-fosfaatin lopulliseen pitoisuuteen 6 mM. Kuitenkin nopea deaktivointi kirjattiin mittaus- injektiopullossa (täydentävä Fig. S5), kun liuenneen proteiinien väheni merkittävästi. Noin 10 minuutin inkuboinnin 30 ° C: ssa, ei NADH kulutusta voitu havaita järjestelmässä.

ilmentyminen h

PFK

MFrg9 ei-tuumorigeenisiä HEK 293-solut edistää kasvua, glukoosin kulutuksen ja laktaatintuotto

Voit selvittää modifioitu PFK-M entsyymit on samanlaisia ​​fysiologisia vaikutuksia kuin tuumorigeeniset ihmisen soluja (Fip-T-Rex HEK 293-solulinja), vakaa transfektantit valmistettiin joka mahdollisti konstitutiivista ilmentymistä h

PFK

M koodaavan natiivin PFK-M ja h

PFK

MFrg9 koodaavan PFK-M Fragment 9. kasvu, glukoosin kulutusta ja laktaatti kertymistä verrattiin in transfektanteista integroituneen tyhjällä plasmidilla identtisissä kasvuolosuhteissa. Solut ilmentävät h

PFK

M ja h

PFK

MFrg9 lisääntyneet nopeammin verrattuna vanhempien soluihin, kuten havaittiin semi-logaritminen kaavio, mutta yksityiskohtaisia ​​analyysejä lineaarisesta kuvaaja samat tiedot ehdotti hieman lyhyempi lag-vaihe transfektoitujen solujen suhteen emokannan (Fig. 7A). Voimakkain ero keskuudessa testattu transfektantit havaittiin laktaatti erittymistä. 24 tunnin inkubaation laktaatin määrä kertynyt keskipitkällä ja normalisoitu 1 miljoonaa solua paljasti neljä taittuu korkeampi tuottavuus kantaa syntetisoimalla fragmentti 9 nähden rasitusta, joka koodaa natiivia PFK-M ja kuusi taittuu korkeampi verrattuna emokannassa. Päivänä kaksi, laktaatin määrä kertynyt oli vielä noin 30% korkeampi solujen kanssa Fragment 9, kun taas myöhemmin, samanlaiset arvot saatiin kaikkien kolmen testattu solulinjoissa (kuvio. 7C). Lisääntynyt laktaatintuotto ilmentävät solut h

PFK

MFrg9 geeni näkyy myös glukoosin kulutuksen hinnat. Klo 24 tuntia, korkein määrä glukoosia, normalisoitu kiinteään solujen määrä, on otettu solujen koodaava fragmentti 9, noin 40% vähemmän glukoosin solut kuluttavat syntetisoimalla natiivia PFK-M entsyymi, kun taas vanhempien solut metaboloituu vielä vähemmän glukoosia (Fig. 7B).

kuvassa 7A kasvu Flp-In T-Rex HEK 293-solut, joissa on integroitu h

PFK

MFrg9 (h

PFK

MFrg9 /HEK – ▪), joka koodaa fragmenttia 9; integroitu h

PFK

M (h

PFK

M /HEK – •), joka koodaa natiivia PFK-M entsyymi; ja solut, joissa on integroitu tyhjällä plasmidilla (HEK – ◊) esitetään logaritminen tilassa. Kuvassa 7B glukoosin kulutusta transfektantteja normalisoitu 1 miljoonaa solua on esitetty. Kuviossa 7C laktaattituotanto muunnettuna 1 miljoonaa solua on esitetty. Identtistä symbolia yksittäisten transfektantit käytetään kaikki luvut. Tiedot edustavat kolmea riippumatonta mittausta ja esitetään keskiarvoina ± standardipoikkeama.

Keskustelu

erilaisia ​​onkogeenien, kuten Akt [33], BCR-Abl [34], c-Myc ja HIF [35], edistää glukoosiaineenvaihdunnan syöpäsoluissa. Kuitenkin aktivointi Akt yksin, joka koodaa seriini /treoniini-kinaasi, joka on valvonnassa phosphatidylinositide-3-kinaasi-PI3K, on ​​osoittautunut, joka riittää kiihdyttämään kytkin aerobinen Glykolyysivaiheen [36]. Kuitenkin taustalla molekyylitason muutokset tasolla sääntelyn glykolyyttisten entsyymien yhä puutteellisia. Konstitutiivisen aktivaation Akt on osallisena solujen jakautumisen [37] ja ehdotti jäsenet edistävät Glut1 transporter aktiivisuus [4]. Lisäksi stimuloiva rooli PI3K /Akt-signalointireitin on raportoitu hormoniriippuvaiset proteolyyttisen induktio (kallikreiinin geenin ilmentyminen) rintasyövän [38] ja eturauhasen [39] syöpäsolulinjoilla. Ihmisen kudosta kallikreiinien kuuluvat alaryhmään seriiniproteaasien, jotka ovat samankaltaisia ​​kuin proteinaasi K, jotka olemme osoittaneet tässä pilkkomiseksi natiivi PFK1 entsyymit muodostavat aktiivisia, sitraatti esto-resistenttejä lyhyempi PFK1 fragmentteja. Näin ollen, Akt-välitteisen induktion aerobinen Glykolyysivaiheen voi myös olla mukana translaation jälkeinen muutos PFK1 aktivoimalla proteolyyttisten entsyymien.

Tätä oletusta tukevat samanlaisia ​​tuloksia saatiin transfektoitujen solujen konstitutiivisesti ilmentävien Akt [36] ja solut syntetisointi erittäin aktiivisia lyhyemmät PFK1 fragmentteja tässä tutkimuksessa. Molemmat solujen kuluttaa glukoosia nopeammin ja erittyy laktaatin korkeammat saannot verrattuna YK-transfektoiduissa soluissa.

Western blotting kokeiluja tuumorigeenisemmiksi ja normaalien solujen ei syntyperäinen 85 kDa entsyymi voitiin havaita neoplastisten solujen, kun taas fragmentti 47 kDa oli ominaista läsnä. Kuitenkin jotkut muut pienemmät fragmentit täplikäs samoin. Ne todennäköisesti peräisin natiivi PFK1 koska käytetty vasta-aine, osoittautunut riittävän tarkkoja eikä pienimolekyylistä peptidejä ilmestyi lysaatin lymfosyyttien ja HEK-soluissa. Lisäksi tiedetään vähän sytosolin proteolyyttinen aktiivisuus syöpäsoluja vuoksi on vaikea spekuloida määrä proteaasien, jotka saattavat hyökätä PFK1 entsyymi. Epäilemättä parempaa tietoa posttranslational muutos voitaisiin saavuttaa käyttämällä epitooppimerkattu PFK1 alleeli. Itse testasimme AU1 epitooppimerkin [40], joka oli N-terminaalisesti fuusioitu natiivi PFK-M. Vaikka on merkitty

PFK

-M-geeni ilmennettiin ja proteiini havaitaan, ei entsyymin aktiivisuus voitiin havaita (tuloksia ei ole esitetty). Uskomme, että laajennus kuusi aminohappotähdettä vaikuttanut proteiinin laskostumisen soluissa ja estää oikean yhdistys monomeres toimivaan tertameric holoentsyymin. Valitettavasti aktiivinen entsyymi ei olla työssä tutkimuksissa translaation jälkeinen muutos proteolyyttisellä katkaisulla.

Mielenkiintoista, hieman erilainen lyhyemmät fragmentit havaittu B16-F10-solut kasvavat yksittäin ja kasvainkudoksessa. Vaikka in vivo suoritetut kokeet

E. coli

transformantit paljasti, että molemmat 45 ja 47 kDa PFK-M fragmentteja voitaisiin yhdistää aktiiviseksi holoentsyymin. Tämä havainto viittasi siihen, että ympäristöolosuhteet saattavat vaikuttaa translaation jälkeinen muutos PFK-M B16-F10-soluja.

Kun posttranslationaalinen muutos PFK-M, entsyymin aktiivisuus on säilynyt, koska aktiivisen eukaryoottisen PFK1s on joka sijaitsee N-terminaalisessa päässä [12]. Kuitenkin kineettinen ominaisuudet lyhyemmän PFK-M fragmentit muutetaan (Fig. 5-6). Tärkein muutettu entsyymien tulla tunteeton sitraattiin ja ATP esto. Proteolyyttisellä katkaisulla C-terminaalinen osa natiivin molekyylin joitakin osia sitraatin sitoutumiskohdan menetetään, sekä motiivi vastaa inhibitio ATP (täydentävä Fig. S1). Samanlaisia ​​kineettinen muutokset modifioidun PFK1 fragmentteja havaittiin myös, kun posttranslational muuttaminen natiivi PFK1 entsyymin rihmasieni

Aspergillus niger

[24]. 5′-AATTATGGATCCATGACCCATGAAGAGCACC-3′.

doi:10.1371/journal.pone.0019645.s006

(TIF)

Table