Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tyypillinen Länsi ruokavalio ei tasapainossa metyyli ravinteita, jotka säätelevät taso metyyliluovuttajayhdiste S-adenosylmethionine (SAM) ja sen johdannainen metaboliitin S-adenosyylihomokysteiinin (SAH ), joka puolestaan ​​voi ohjata toimintaa tiettyjen metyylitransferaasit. Ruokinta jyrsijöitä määrittämää aminohappoa ja metyyli-epätasapainoinen ruokavalio vähentää maksan SAM ja aiheuttaa maksan syövät. RIZ1 (PRDM2 tai KMT8) on tuumorisuppressorina ja toimintoja transkription repression metyloimalla histoni H3 lysiinin 9.

Menetelmät /Principal Havainnot

Täällä näytämme, että metyyli-tasapainoisen ruokavalion siirrettävä ylimääräistä selviytyminen edut verrattuna kasvaimia aiheuttavista metyyli-epätasapainoinen ruokavalio vain hiirillä villityypin RIZ1 mutta ei hiirillä, joilta puuttuu RIZ1. Vaikka puuttuminen RIZ1 oli tuumorigeenisia hiirillä ruokittu tasapainoisen ruokavalion, sen läsnäolo ei estä kasvaimen muodostumista hiirillä ruokittu epätasapainoinen ruokavalio. Microarray ja geenien ilmentymisen analyysi osoitti, että toisin kuin useimmat siihen liittyvien entsyymien RIZ1 oli voimistuvan metyyli-tasapainoisen ruokavalion. Metyyli-tasapainoisen ruokavalion ei täysin tukahduttaa onkogeenien kuten c-Jun puuttuessa RIZ1. Korkeampi RIZ1 aktiivisuus liittyi suurempi H3 lysiinin 9 metylaation RIZ1 kohdegeenien mikä näkyy kromatiinin immunoprecipiation analyysi.

Johtopäätökset /merkitys

Tiedot tunnistaa RIZ1 kriittinen tavoitteeksi metyyli-tasapainoisen ruokavalion syövän ehkäisyyn. Molekyyli ymmärtäminen ruokavalion syövän synnyn voi auttaa ihmisiä tekemään perusteltuja valintoja ruokavalion, mikä voi merkittävästi vähentää syövän.

Citation: Zhou W, Alonso S, Takai D, Lu SC, Yamamoto F, Perucho M, et ai. (2008) Vaatimus RIZ1 syövän ehkäisemisen by metyyli-tasapainoista ruokavaliota. PLoS ONE 3 (10): e3390. doi: 10,1371 /journal.pone.0003390

Editor: Yihai Cao, Karolinska Institutet, Ruotsi

vastaanotettu: 02 kesäkuu 2008; Hyväksytty: 16 syyskuu 2008; Julkaistu: 13 lokakuu 2008

Copyright: © 2008 Zhou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NIH avustus CA105347 SH, CA63585 MP, CA087069 on FY, ja DK51719, AA13847 ja AT001576 SCL

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tyypillinen länsimaisessa ruokavaliossa liittyy kolmannes syöpäkuolemista Yhdysvalloissa [1]. Ruokavalio on runsaasti lihaa ja vähän vihanneksia ja hedelmiä. Se ei ole tasapainossa metyyli ravintoaineiden tai alhainen foolihapon. Ruokavalion ravinteita, ja niiden aineenvaihdunnan välituotteita ja tuotteita, vaikuttavat suoraan toimintaan monissa solun entsyymejä. Yksi ryhmä tällaisia ​​entsyymejä on SAM-riippuvaista metyylitransferaasien, laaja joukko entsyymejä, joilla on yksi ominaisuus yhteinen käyttö S-adenosylmethionine (SAM) kuten metyyli luovuttajana. Solutasolla SAM riippuu ravinnostaan ​​metyyliryhmän luovuttajien, kuten metioniini, foolihappo, B6-vitamiini, B12, ja koliini. Jotkut metylaatio reaktiot estyvät alhainen SAM tai korkea tuotteen estäjä S-adenosyylihomokysteiinin (SAH). Metyyli epätasapainoinen ruokavalio, joka on alhainen foolihappo, metioniini tai koliinia tiedetään alentavan SAM tasolle ja SAM /SAH-suhde.

Ruokinta jyrsijöitä määrittämää aminohappoa ja metyyli-epätasapainoinen ruokavalio vähentää maksan SAM ja aiheuttaa maksan syöpien [2], [3], [4]. Molekyylitason mekanismit suhde ruokavalion ja syövän edelleen heikosti ymmärretty. Olemme aiemmin ehdottaneet, että metyyli-tasapainoisen ruokavalion ehkäisee syöpää aktivoimalla histoni lysiiniä metyylitransferaasin (KMT) luokka tuumorisuppressoreilla kuten RIZ1 (PRDM2 tai KMT8) [5], [6]. RIZ1 tuumorisuppressori toimintoja transkription repression metyloimalla histoni H3 lysiinin 9 [7], [8], [9]. Täällä selvitettävä, RIZ1 voi olla kriittinen kohde metyyli tasapainoisen ruokavalion syövän ehkäisyyn. Olemme myös suoritetaan microarray, ja geeni-ilmentymisen analyysi tutkia ruokavalion vaikutusta RIZ1 ja muita geenejä. Vaikutusta ruokavalion RIZ1 metylaatio entsyymin aktiivisuus analysoitiin kromatiinin immunoprecipiation määrityksessä. Tulokset viittaavat siihen, että RIZ1 säätelee ruokavalion ja voi olla kriittinen kohde metyyli-tasapainottavat ruokavaliota syövän ehkäisyssä.

Tulokset

Vertasimme RIZ1 mutantin ja villityypin hiirillä on metyyli-tasapainoinen ruokavalio (ruokavalio 1), verrattuna epätasapainoinen ruokavalio puuttuu metioniini ja koliini (ruokavalio 2). Metyyliesteröity epätasapainoinen ruokavalio 2 (ks Täydentävä taulukko S1) on tunnettu alentaa maksan SAM ja aiheuttaa maksa- syöpää jyrsijöillä [2], [3], [4]. Siten tämä metyyli-epätasapainoinen ruokavalio aiheutti maksan kasvaimia ja laski eloonjääminen verrattuna metyyli-tasapainoisen ruokavalion (kuvio 1A). Useimmat kuolleita tai kuolevia eläimiä, jotka olivat sopivia ruumiinavaus analyysiä havaittiin hepatokarsinoomissa. Sen sijaan ei ole villityypin RIZ1, ei ollut eroa eloonjäämisessä riippumatta ruokavaliota (kuvio 1 B). Nämä RIZ1 tyrmäyseläinten kehitetty lähinnä hepatokarsinoomissa riippumatta ruokavaliosta. Näin ollen, vaikka tasapainoinen ruokavalio 1 tuonut lisää selviytymisen etuja verrattuna epätasapainoinen ruokavalio 2 hiirillä villityypin RIZ1, se ei tehdä niin hiirissä, joilta puuttuu RIZ1.

. Elinkelpoisuus RIZ1 villityypin eläinten ruokavalio 1 vs. ruokavalio 2. B. elinkelpoisuus RIZ1 mutanttieläimissä diet 1 vs. ruokavalio 2. C. elinkelpoisuus RIZ1 villityypin ja mutantti eläimiä ruokavalio 1. D. elinkelpoisuutta RIZ1 villityypin ja mutantti eläimiä ruokavalio 2. Useimmat kuolleita tai kuolevia eläimiä, jotka olivat sopivia ruumiinavaus analyysiä havaittiin kasvaimia. Kuvaajan piirtämisen kanssa Prism tilastoihin ohjelma (GraphPad Software), joka perustuu Kaplan-Meyer teoria.

P

arvot laskettiin Fisherin testiä (2 tailed) käyttäen eloonjäämisaste iässä 20-22 kuukautta.

Tietojen tarkastelu osoittaa myös, että yhdenmukaisia ​​aiempien työtä [7 ], RIZ1 + /+ hiirillä oli alhaisempi kuolleisuus ja kasvaimen esiintymistiheys kuin RIZ1 – /- hiirille syötettiin metyyli-tasapainoinen ruokavalio 1 (kuvio 1 C). Kuitenkin, kun ruokitaan epätasapainossa ruokavalio 2, RIZ1 + /+ hiirillä osoittivat samanlaisia ​​kuolleisuus kuin RIZ1 – /- hiirissä (kuvio 1 D). Siten tuumorisuppressori funktio RIZ1 on riippuvainen metyyli-tasapainoisen ruokavalion. Samanlainen eloonjäämislukuja RIZ1 puutteesta ja villityypin eläinten ruokavalio 2 (kuvio 1 D) viittaa myös siihen, että kapasiteetti ruokavalio 1 antaa ylimääräisiä selviytymisen etuja verrattuna ruokavalioon 2 RIZ1 villityypin (kuvio 1A), mutta ei RIZ1 puutteesta eläinten (kuvio 1 B) ei ole, koska triviaali syy että RIZ1 puutosta eläimet saattavat olla liian sairas yleensä vastata ruokavalion 1.

vaikutusten määrittämiseksi ruokavalion RIZ1, tutkimme RIZ1 geeniekspression maksassa kohdekudokseen käyttäen kvantitatiivista RT-PCR ja Western blot-analyysi. RIZ1 mRNA tasolla säädeltiin vähentävästi 4,2 kertaisesti hoidon jälkeen ruokavalio 2 2 kuukautta (Täydentävä taulukko S2). Vaimennussäätely ei ollut ilmeinen 1 kuukauden ruokavaliosta 2, mutta kävi selväksi 2, 4, ja 6 kuukauden (Täydentävä taulukko S2). Vaimennussäätely RIZ1, että metyyli-epätasapainoinen ruokavalio varmistettiin Western blot -analyysillä (kuva 2). Toisin RIZ1, lyhyempi RIZ2 proteiini, joka puuttuu PR /SET domain [10] ei vaikuta merkittävästi ruokavalio.

. Koko solu-uutteista maksan eläinten ruokavalio 1 ja ruokavalio 2 kaksi kuukautta analysoitiin Western blot-analyysillä käyttäen vasta-ainetta, joka reagoi sekä RIZ1 ja RIZ2 proteiineja. Western blot käyttäen beeta-aktiini-vasta toimi latauskontrollina. B. kvantifiointi proteiinin tasot densitometrisesti analyysi. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD 4 eläimen kohti alaryhmä. *

P

= 0,012 (Studentin t-testi, 2 tailed).

Lisäksi tutkittiin muita metyylitransferaasit ja liittyvistä entsyymeistä kvantitatiivisella RT-PCR ja DNA-siru analyysi. Yhteensä 25 histoni metyylitransferaasit tutkittiin, mukaan lukien ainakin yksi entsyymi, joka on spesifinen kullekin aminohappo- tähteitä, joita tiedetään olevan metyloitunut. Mikään näistä entsyymeistä, paitsi RIZ1, oli merkittävästi vaimentua ( 2 kertainen) 2 kuukauden ruokavalion 2 hoitoa (Täydentävä taulukko S2).

edelleen selvittää RIZ1 ilme on herkkä SAM tasolle, käytimme MATA1 hiirissä, malli [11]. Nämä eläimet ovat alhaisemmat (3-4 kertainen) maksan SAM ja myös kehittää maksan syövät. Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi eläinten 4,5-+5,5kuukautta iässä osoitti, että RIZ1 ilmentymistä villityypin maksa (n = 6) oli 2,0 kertaa suurempi kuin MATA1 aihiot (n = 5, P = 0,03, Studentin t-testiä, 2 tailed), verrattavissa kertainen vähennys saman ikäisten villityypin hiirten ruokavalioon 2 (täydentävä taulukko S2).

seuraava tutki RIZ1 kohde- geeniä säätelee ruokavaliota. DNA-siru analyysi maksa RIZ1 villityypin eläimiä 2 kuukauden ruokavalion hoidon paljasti listan 1636 geenejä, jotka vaikuttivat ruokavalion yli 2-kertainen (Täydentävä taulukko S3). DNA-siru analyysi maksa RIZ1 tyrmäyseläinten tunnistettu 97 otaksuttu RIZ1 kohdegeenien osoittaa yli 2-kertainen ero villityypin ja Knockout (Täydentävä taulukko S4). Näistä 29 oli läsnä myös luettelo geenien säätelee ruokavalio, osoittaa merkittävää rikastumista RIZ1 kohdegeenien luettelossa ruokavalio geenien (29/97 vs. 1636/48000,

P

0,0001, Chi neliö testi, 2 tailed). Kiinnostavat geenit, jotka voimistunut sekä RIZ1 pudotuspelit ja metyyli-epätasapainoinen ruokavalio sisältää c-Jun, c-Fos, ja CTGF. Jotkut näistä geeneistä voi olla suora rooli maksasyöpien (eli c-Jun) [12]. Vaikutus RIZ1 knockout tai ruokavalioon näiden geenien ilmentymistä vahvistettiin kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi (taulukko 1). Tulokset viittaavat siihen, että downregulation RIZ1 ruokavaliolla 2 liittyi vapauttamisen RIZ1 kohdegeenien.

Koska RIZ1 ilmentyminen ei muuttunut merkittävästi ruokavaliolla 2 1 kuukauden hoidon (Täydentävä taulukko S2), mikä tahansa lauseke muutokset kohdegeenien RIZ1 1 kuukauden ruokavalio hoito voi heijastaa muutoksia RIZ1 pikemminkin toimintaa kuin ilmaisun tasolla. Valitsimme seitsemän RIZ1 kohdegeenien ja määritettiin niiden ekspressiotasot joko 1 kuukausi tai kaksi kuukautta ruokavalion hoidon. Kuten taulukosta 1, kuusi seitsemästä geenien havaittiin voimistuvan ruokavalio 2 1 kuukauden ruokavalio hoito. Tiedot viittaavat siihen, että ruokavalio 2 aiheutti vapautuminen RIZ1 kohdegeenien ennen merkittävästi vähentynyt RIZ1 ekspressiotasoja.

seuraavaa käyttöä chromatin immunosaostuksella (chip) määritys tutkia muutoksia histoni metylaatio on RIZ1 kohdegeenien seurauksena vähentynyt RIZ1 aktiivisuutta. Käytimme RIZ1-spesifistä vasta-ainetta ab9710 (Abcam), joka ei reagoi RIZ2 (ks Täydennyskuvio S1 Western blot RIZ1 tämä vasta-aine). Kuten kuviossa 3A, c-Jun proksimaalisen promoottorin sitoi RIZ1 ja osoitti korkeampia H3 lysiinin 9 monomethylation in RIZ1 villityypin versus tyrmäyksellä maksa. RIZ1 ei sitoudu distaalisen alueen c-Jun promoottori tai promoottori Elovl3 geeni, joka ei tukahdutettu RIZ1. 1 kuukauden ruokavalio 2 hoitoa, H3K9me1 c-Jun promoottori vähentynyt vaikka RIZ1 sitoutuminen ole muuttunut, mikä viittaa jälleen, että RIZ1 aktiivisuus väheni, vaikka RIZ1 ilme oli normaalilla tasolla (kuva 3).

. Liukoinen chromatin valmistettiin maksa RIZ1 villityypin ja tyrmäyseläinten. Immunosaostus suoritettiin käyttäen mainituilla vasta-aineilla. DNA monistettiin käyttämällä aluketta sarjaa, jotka peittävät proksimaalisen tai distaalisen promoottorialueet c-Jun ja Elovl3 geenin. B. Liukoinen chromatin valmistettiin maksa Villityypin eläimet joko ruokavalio 1 tai ruokavalio 2 1 kuukausi. Immunosaostus suoritettiin käyttäen mainituilla vasta-aineilla. DNA monistettiin käyttämällä aluketta sarjaa, jotka peittävät proksimaalisen tai distaalisen promoottorialueet c-Jun ja Elovl3 geenin. Yksi edustaja data set esitetään neljästä kokeita.

Meillä on myös tarkasteltava yleisesti DNA metylaatiomuutokset vastauksena metyyli-epätasapainoinen ruokavalio DNA maksoista eläinten 15 kuukauden hoidon jälkeen. Vaikka olemme huomanneet, että ruokavalio 2 pieneni DNA: n metylaatio (Täydennyskuvio S2), emme löytäneet muutoksia DNA: n metylaatio (joko hyper tai hypo metylaatio) yksittäisissä satunnaisessa CpG rikkaita alueita (Täydennyskuvio S3) käyttämällä tekniikkaa

Not1 -Mse1

MS-AFLP (metylaatioherkän monistettu fragmentti pituus polymorfismi) [13]. Western blot-analyysi, emme löytäneet merkittäviä muutoksia ( 2 kertaisesti) metylaatio H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3, H4K20me1 ja H4K20me2 maksassa eläimiä, jotka olivat ruokavalio 2 kuusi kuukautta (tuloksia ei ole esitetty).

keskustelu

Koska vain RIZ1 ja 4 pienimolekyylisiä metyylitransferaasit (GNMT, GAMT, NNMT, ja TEMT) löytyivät vaimentua ruokavaliolla 2 ei-puolueellinen seulonta käyttäen sekä DNA-siru ja RT-PCR menetelmiä (katso täydentävä taulukko S2), emme tutki, oliko nämä 5 entsyymit jaettu joitakin yhteisiä ominaisuuksia, jotka voisivat selittää heidän herkkyys ruokavalioon. Löysimme kirjallisuudesta Km-arvot SAM varten 3 4 pienimolekyylisiä metyylitransferaasit ja kaikki kolme osoittautui on korkea Km-arvo ( 49 uM) (ks Täydentävä taulukko S5). Sillä suuri määrä metyylitransferaasit, joita ei säännellä ruokavalio tunnistimme Km-arvot 7 niistä ja kaikkien 7 on Km-arvot ovat alle 10 uM (katso Täydentävä taulukko S5). Siten on olemassa merkittävä assosiaatio korkea Km SAM ja downregulation ruokavaliolla 2 (

P

= 0,0083, Fisherin testiä, 2 tailed).

Maksan SAM pitoisuus on -60 uM ja metyyli-epätasapainossa ruokavalio tyypillisesti aiheuttaa 1,5-3 kertainen lasku SAM tasoilla [3], [14], mikä olisi vielä riittävän korkealla, jotta lähellä suurta aktiivisuutta useimmille metyylitransferaasit alhainen Km SAM mutta merkittävästi estää niitä entsyymejä, joilla on korkea km-arvot. Etuuskohteluun downregulation ruokavaliolla 2 metyylitransferaasit korkea Km SAM voi kertoa palautetta esto omaan geeniekspressiota unliganded tai käyttämättömät entsyymejä. Kanoninen SET verkkotunnuksen yhteisiä useimmat kmts on alhainen Km SAM [15]. Mutta RIZ1 voi olla poikkeus, sillä sen SET domain on erilainen kuin muut [16], [17].

Lukuisat vaikutuksia metyyli-epätasapainoinen ruokavalio, kuten rasvan kertymistä, proteiinikinaasi C: n aktivoitumisen, epänormaali solujen uusiutumista, oksidatiivisen stressin, alhainen SAM /SAH-suhde, DNA hypometylaatio ja urasiili yhdistyminen DNA: han tai mutaatio, on estetty metyyli-tasapainoisen ruokavalion. Lisäksi metyyli-epätasapainossa ruokavalio vaikuttaa ilmentyminen useiden geenien, kuten on esitetty tässä. Havaintomme, että puute yhden geenin voi neutraloida syöpää ennaltaehkäisevää hyöty metyyli-tasapainoinen ruokavalio osoittaa, että ainakin yksi lukuisista Tällaisen ruokavalion voi olla nopeutta rajoittava merkitys syövän ehkäisyä prosessi.

Mistä kaikki nämä havainnot voidaan väittää, että rakenteisen syövän metyyli-epätasapainoinen ruokavalio voi olla seuraavat ominaisuudet: a metyyli-epätasapainoinen ruokavalio – krooninen matala SAM /SAH suhde useimmissa soluissa ruokavalio reagoiva kohdekudos -inhibition ja downregulation RIZ1 useimmissa soluissa kohdekudoksen – säätelyä prosurvival ja progrowth onkogeenien kuten c-Jun useimmissa soluissa kohdekudoksen – stokastinen kertyviä geneettiset ja epigeneettiset muutokset yhdessä solussa – klonaalinen leviämisen yksisoluvaiheessa – syöpä. Tässä multi-soluista malli syövän aloittamista [6], inaktivoinnin RIZ1 ja säätelyä joidenkin onkogeenien, kuten c-Jun useimmissa soluissa ruokavalio-reagoiva kudos voi olla riittävä aiheuttamaan klonaalisen proliferaatiota, mutta se voi sallia suuri allas on vähemmän kuin täysin normaalit solut olla alttiimpia klonaalisen proliferaation vasteena stokastisia vahva onkogeenisen mutaatiot yhdessä solussa. Sitä vastoin täysin normaalit solut voivat läpikäydä vanhenemista tai solukuolemaa vasteena kasvaimia mutaatioita [18]. Siten nopeutta rajoittava vaihe syövän ehkäisyyn voi olla ylläpidon RIZ1 toiminnaksi useimmilla soluissa kohdekudokseen [6].

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet, ruokavalion ja kudosten

RIZ1 hiirten in 129Sv /C57BL6 taustalla olivat ristissä 129Sv hiirille 8 sukupolvien tuottaa RIZ1 hiirten in 99,625% 129Sv tausta. Nämä RIZ1 – /- hiiret sitten risteyttää p53 +/- 129Sv hiiriä (Jackson Laboratory) tuottaa RIZ1 +/- p53 +/- hiiri 129Sv taustalla. Eläimet seuraavista genotyyppien pidettiin koekäyttöön: RIZ1 – /- p53 +/- ja RIZ1 + /+ p53 +/-. Käyttöönotto p53 heterotsygoottinen mutaatio oli tarkoitus lyhentää viivettä kasvaimen kehitystä RIZ1 hiirissä, [7]. Urospuolisten eläinten Kunkin genotyypin satunnaistettiin kahteen ryhmään -30 kukin. Alkaen noin 4 viikon iässä, kaikki eläimet ruokittiin metyyli-tasapainoinen ja aminohapon määrittämä ruokavalio tai ruokavalion 1. Kun tätä ruokavaliota viikon, yksi ryhmä eläimistä edelleen pysyä ruokavalio 1 jäljellä olevaksi kokeilu. Toinen ryhmä syötettiin metioniini ja koliini puutteellinen ruokavalio tai ruokavalion 2. koostumukset ruokavalion (ks täydentävä taulukko S1) olivat olennaisesti samat kuin ne, joita käytetään yleisesti alalla [2], [3], [4]. Ruokavalion säilytettiin 4 ° C: ssa ja annettiin ad libitum kanssa puolikuukausijulkaisu vaihto. Eläinten kasvua seurasi kuukausittain kehon painon mittaus Jopa 15 kuukautta. Ei ole merkittävää eroa kehon paino merkittiin eri genotyyppejä. Eläimet ruokavalioon 2 oli vähentynyt (15% vähemmän 15 kuukauden iässä) kehon paino verrattuna eläimiin ruokavalioon 1. Tämä vähäinen vaikutus ruokavalion 2 kehon paino samanlainen kuin mitä muut ovat löytäneet [2]. Kaplan-Meyer eloonjäämiskäyrien piirrettiin käyttämällä Prism-tilasto-ohjelmaa (GraphPad software). Maksa fiksoitiin histologista analyysit tai jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes se käytettiin biokemiallisia analyysejä. Kudokset kiinnitettiin 10% formaliinilla rutiininomaisesti käsitelty parafiiniupotusta leikattuna, ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. Mittauksissa ravinnon vaikutuksia geenien ilmentyminen ja histoni metylaatio, muut eläimet ruokittiin ruokavalio 1 tai 2 1 6 kuukautta ennen uhrataan kudoksen keräämistä.

Eettinen hyväksyntä kaikkiin teoksiin eläimillä saatiin Animal tutkimuskomitea The Burnham Institute for Medical Research.

Western blotting

kudokset homoginized RIPA puskuriin (150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0,25% Na-deoksikolaattia 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, plus proteinaasi-inhibiittorit). Koko lysaatit sekoitettiin sitten SDS-geelin latauspuskuria, jota seuraa SDS-geelin fraktiointi- ja western-blottauksella. RIZ vasta-aine oli kanin seerumi KG7.1S vastaan ​​RIZ1 aa 245-573, joka reagoi sekä RIZ1 ja RIZ2, kuten aiemmin on kuvattu (saatavana Abcam ab3790) [19]. Western blot vastaan ​​RIZ1 mutta ei RIZ2, käytimme Abcam RIZ1 vasta-aineen ab9710. Vasta-aineet metyloidulle histonien olivat Abcam ja Upstate.

Kvantitatiivinen RT-PCR

Yhteensä-RNA: t uutettiin kudoksista käyttäen Magna lyser Green Helmet (Roche) ja RNAmini (Qiagen). Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysit (SYBR vihreä) suoritettiin käyttäen Mx3000P QPCR järjestelmän Stratagene. Kaikki alukkeilla vahvistettiin, jolloin saatiin yksi vyöhyke odotetun kokoinen. Syklofiliinistä A (PPIA) geeni toimi kontrollina RNA määrä. Tämä geeni ei ole säännelty ruokavaliota tai RIZ1 Knockout kuten on osoitettu mikrosiruanalyysillä.

DNA mikrosiruanalyysi

cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA: t hybridisoitiin Sentrix Hiiri-6 Expression BeadChip alkaen Illumina sisältävien 48000-geenin taulukot. Tiedot saatiin samanlaiset biologisista näytteistä. Data normalisointi suoritettiin käyttäen cubic spline normalisointi.

ChIP analyysi

Rabbit spesifistä vasta-ainetta RIZ1 mutta ei RIZ2 päässä Abcam (ab9710) käytettiin ChIP analyysi RIZ1 sitoutumaan kohde-geenejä. Vasta-aineet methylationed histones olivat Abcam (ab9045 varten H3K9me1, ab8898 varten H3K9me3, ab9051 varten H4K20me1) ja Upstate (07-212 varten H3K9me2). Maksakudoksissa (-30 mg vasta-ainetta kohti immunosaostuksella) on hienonnettu palasiksi käyttäen partakoneenteriä ja rajat liittyvät 1% formaldehydiä huoneenlämmössä 15 minuutin ajan. Kromatiinin oli hajanaista ja keskikoko on 700 emäsparin käyttämällä Misonix XL2020 sonikaattorilla. Siru iinianalyysikitissä Upstate käytettiin. PCR, käytimme seuraavaa alukeparia: 5′-AAATCTCTGGTTTCCAGGTACAGC-3 ’(-801–777) ja 5′-GAGAAAGGGCTGAATGATCTGAGT-3’ (-595–571) ja c-Jun proksimaalinen promoottorialue, ja 5 ’ -GTGTGGGGGTAGAGGAGTGA-3 ’(-4337–4317) ja 5′-AGTGTCACTGGACCCTCACC -3′ (-4128–4108) ja c-Jun distaalinen alue. PCR on Elovl3-geenin promoottori, käytimme alukeparia 5’-CCCCATTTTTCTCTCCAACA-3 ’(-768–748) ja 5′-CCAAGCTGGACCATAAGGAA-3’ (-578–558) varten Elovl3 promoottorialueen, ja 5 ’ -CCAGGCTGTCCTGAAACTAATTCT-3 ’(-8325–8301) ja 5′-CTGTAGACCAGGTGACTGCAAACT-3’ (-8132–8108) varten Elovl3 distaalinen alue.

DNA metylointianalyysi

Genomi-DNA: iden uutettiin kudoksista käyttäen standardimenetelmiä. Analyysi metylaation CpG rikkaiden alueiden

Not1-MSE1

MS-AFLP menetelmää kuten aiemmin on kuvattu [13]. Genominen metyyli-sytosiini pitoisuus määritettiin Metylointilaitteistoon entsyymi Sss1 menetelmä [20].

tukeminen Information

Taulukko S1.

kokoonpano aminohapon määritelty ja metyyli-tasapainoinen perusruokavaliolla (Teklad Tuote nro TD 99366). Tätä kutsutaan nimellä Diet 1. metyyli-epätasapainoinen ruokavalio tai ruokavalion 2 formulaatiota ((Teklad Tuote nro TD 01513) on sama kuin ruokavalion 1, paitsi että se sisältää 9,0 g /kg DL-homokystiini ja puuttuu metioniini ja koliinibitartraatti.

doi: 10,1371 /journal.pone.0003390.s001

(0,05 MB DOC) B Taulukko S2.

Kvantitatiivinen RT-PCR ja mikrosiruanalyysillä joidenkin histoni metyylitransferaasit ja liittyviä entsyymejä. Villityyppistä uroseläimet olivat käsitelty ruokavalio 1 tai ruokavalion 2 (alkaen 3-4 viikkoa iässä) 1, 2, 4 ja 6 kuukautta ennen RNA uuttamalla maksa. tasot 25 histoni metyylitransferaasit ja 8 muiden siihen liittyvien entsyymien määritettiin joko kvantitatiivinen RT- PCR tai mikrosirujen tai molempia, ja suhde (fold change) Diet 1 vs. Diet 2 laskettuna. tiedot kvantitatiivinen RT-PCR edustavat hoidettava vähintään 3 eläintä kohden alaryhmä. * P 0,05 Diet 1 vs. Diet 2 (Opiskelijan t- testi, 2 tailed). histoni metyylitransferaasit, joita ei ole lueteltu tässä ei havaittu merkittävää ilmentymistä maksassa, joka käy ilmi DNA mikrosiruanalyysillä. Tiedot mikrosiruanalyysi edustavat avulla 2 eläimiä kohti alaryhmä. DNA-siru analyysi paljasti downregulation ruokavaliolla 2 neljän pienen molekyylin metyylitransferaasit, GNMT, GAMT, NNMT, ja TEMT, jotka sittemmin vahvistettiin kvantitatiivisen RT-PCR.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0003390.s002

(0,08 MB DOC) B Taulukko S3.

geenit säätelevät ruokavalion paljasti DNA mikrosiruanalyysillä. Villityypin hiiriä ruokittiin joko ruokavalio 1 tai ruokavalion 2 kaksi kuukautta ennen niiden maksat kerättiin RNA. Tiedot edustavat avulla 2 eläimiä kohti alaryhmä. Vain geenit osoittavat yli 2-kertaiseksi muutoksia luetellaan.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0003390.s003

(0,85 MB XLS) B Taulukko S4.

geenit säätelevät RIZ1 tyrmäyksellä joka käy ilmi DNA mikrosiruanalyysillä. RNA: t käytetään analysointiin olivat villityypin ja hiirten neljän kuukauden iässä tasapainoista ruokavaliota. Tiedot edustavat avulla 2 eläimiä kohti alaryhmä. Geenit lihavoitu myös säädellä ruokavaliolla. Vain geenit osoittavat yli 2-kertaiseksi muutoksia luetellaan.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0003390.s004

(0,06 MB XLS) B Taulukko S5.

metyylitransferaasit korkea Km-arvo SAM oli vaimentua metyyli-epätasapainossa ruokavaliota. Km-arvo SAM ja Ki-arvo SAH näkyvät eri metyylitransferaasit. Suhde (kertamuutoksia) Diet 1 vs. Diet 2 ilmentymisen tasoilla metyylitransferaasit laskettiin kvantitatiivinen RT-PCR. Tiedot edustavat hoidettava vähintään 3 eläintä kohti alaryhmä 2 kuukauden ruokavalion hoidon. * P 0,05 Diet 1 vs. Diet 2 (Studentin t-testi, 2 tailed).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0003390.s005

(0,03 MB DOC) B Kuva S1.

Western blot-analyysi vahvistaa tunnustamisesta RIZ1 muttei RIZ2 joita Abcam RIZ1-spesifistä vasta-ainetta ab9710. Yhteensä teiiniuutteissa maksa joko RIZ1 villityypin tai tyrmäyseläinten erotettiin SDS seurasi western blot käyttämällä RIZ1 vasta-ab9710. Equal lastaus varmistettiin western blot käyttämällä beeta-aktiini vasta-aine.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0003390.s006

(0,07 MB PDF) B Kuva S2.

DNA hypometylaatio hiirillä ruokittu ruokavalion 2. Yhteensä genomisten DNA eristettiin maksasta hiirten joko ruokavalio 1 tai ruokavalion 2 15 kuukautta. Metylaatiotasot nämä DNA: t määritettiin Sss1 entsyymin määritystä. Tiedot ovat keinoja + SD 3 eläintä kohden alaryhmä. * P = 0,03 (Studentin t-testi, 2 tailed).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0003390.s007

(0,02 MB PDF) B Kuva S3.

analyysi metylaatiomuutokset CpG rikas genomin alueita MS-AFLP. A. Genominen DNA eristetään MCF7-solut, jotka oli joko käsitelty tai ei ole käsitelty demetyloiva aineen Aza-C: tä käytettiin positiivisena kontrollina MS-AFLP-menetelmällä. B. genomiset DNA: t, joita käytetään analyysissä olivat aivojen (B) ja maksan (L) kudoksissa hiiret joko ruokavalio 1 tai ruokavalion 2 15 kuukautta.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0003390.s008

(1,49 MB PDF) B

Kiitokset

Kiitämme Emily Larson varten kudosnäytteiden.