Krooninen sairaus

tiivistelmä

luun morfogeneettinen proteiini (BMP) signalointiryöpyn on poikkeuksellisesti aktivoitu ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), mutta ei normaaleissa keuhkojen epiteelisoluissa, mikä viittaa siihen, että estäminen BMP signalointi voi olla tehokas terapeuttinen lähestymistapa keuhkosyöpään. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että jotkut BMP antagonisteja, jotka sitoutuvat solunulkoisen BMP ligandeihin ja estää niiden yhdessä BMP-reseptoreihin, vähentynyt huomattavasti keuhkojen kasvaimen kasvua. Kuitenkin kliininen soveltaminen proteiiniperustaisista BMP antagonistit rajoittaa lyhyet puoliintumisajat, huono sisäinen kasvain toimitus sekä vastuksen aiheuttama mahdollinen tuotto-of-function mutaatioita alavirtaan BMP-reitin. Pienimolekyylisiä BMP-inhibiittorit, jotka kohdistuvat solunsisäistä BMP kaskadeista olisi ihanteellinen syöpälääkkeen kehittämiseen. Vuonna Seeprakala alkio perustuvaa rakennetta ja toimintaa tutkimuksessa olemme aiemmin tunnistettu joukko hyvin valikoiva pienmolekyylisalpaajien nimenomaan vastavaikuttamalla solunsisäinen kinaasidomeenia BMP tyypin I reseptorien. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että DMH1, yksi tällainen estäjiä, voimakkaasti keuhkojen soluproliferaatiota, edistää solukuolemaa, ja laski solumigraatio ja hyökkäyksen NSCLC soluissa estämällä BMP signalointi, kuten jonka poistaminen Smad 1/5/8 fosforylaatio ja geenin ilmentymisen ID1, Id2 ja id3. Lisäksi DMH1 hoito vähensi kasvaimen kasvua ihmisen keuhkosyövän ksenograftimallissa. Lopuksi todettakoon, että tutkimus osoittaa, että pienmolekyylisalpaajilla BMP tyypin I reseptorit voivat tarjota lupaavaa uusi strategia keuhkosyövän hoitoon.

Citation: Hao J, Lee R, Chang A, Tuuletin J, Labib C, Parsa C, et ai. (2014) DMH1, joka on pienmolekyylisalpaaja- BMP tyypin I reseptorit, vaimentaa kasvu ja Invasion of Lung Cancer. PLoS ONE 9 (3): e90748. doi: 10,1371 /journal.pone.0090748

Editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 joulukuu 2013; Hyväksytty: 05 helmikuu 2014; Julkaistu: 06 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Hao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat siemen rahasto College eläinlääketieteellisen Western University of Health Sciences (JH), ja Western University of Health Sciences tiedekunnan kehitysrahaston (YH). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi yleisimmistä syöpien ja johtava syy syövän kuolemia. Noin 228190 keuhkosyöpää odotetaan äskettäin diagnosoitu vuonna 2013, osuus ~27% kaikista syöpäkuolemista vuosittain Yhdysvalloissa [1]. Suuret keuhkosyövän, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), käsittää noin 85% kaikista diagnosoitu keuhkosyövässä. Huolimatta parannuksista diagnosointiin ja kemoterapiaa, 5 vuoden pysyvyys potilaille NSCLC on edelleen hyvin pieni. Viime aikoina suuri edetessä on tehty ymmärrystä molekyylimekanismeja ajo keuhkosyöpä kehitystä, joka johti muutamassa kohdennettua hoitomuotojen [2]. Kuitenkin potilaat reagoivat aluksi poikkeuksetta taudin uusiutumiseen. On tarve tunnistaa uusia kohteita NSCLC.

Luun morfogeneettiset proteiinit (BMP: t) ovat TGF-β-superperheen ja niiden biologinen aktiivisuus välittyy muodostumista heterodimeerinen komplekseja BMP tyyppi I ja tyyppi II seriini /treoniini-kinaaseja reseptoreihin. Sen jälkeen, kun ligandin sitoutuminen, BMP-tyypin I reseptorit fosforyloituu konstitutiivisesti aktiivista tyypin II reseptoreita, mikä johtaa fosforylaatioon solunsisäisen Smad 1/5/8 proteiineja, joka sitten muodostaa kompleksin Smad4 ja translokoituvat tumaan säädellä transkription vasteena [3], [4]. Yli 20 BMP ligandeja on tunnistettu tähän mennessä [5]. Yliekspressio BMP-2 on liittynyt ~98% NSCLC ja muun tyyppisiä maligniteetteja [6], [7]. Lisäksi, pakko ilmentyminen BMP-2 NSCLC solulinjoissa tehostaa merkittävästi kasvaimen kasvua hiirimallissa keuhkosyöpään seuraavan hännän laskimoon kasvainsolujen [8]. Toisaalta, BMP-antagonisti noggin ja solunulkoisen pseudoreceptor spp24 (erittyy fosfoproteiini 24 kD) huomattavasti heikentynyt keuhkojen kasvaimen kasvua ihonalaisen ksenograftin hiiren malleissa [9], [10], mikä viittaa siihen, että inhibitio BMP-signalointi voi olla tehokas hoito keuhkosyöpä . Kuitenkin proteiini-pohjainen BMP antagonisteja tai pseudoreceptor spp24 pääasiassa häiritä sitoutumisen solunulkoisen BMP-ligandien niiden reseptoreihin. Niiden kliininen soveltaminen voitaisiin rajoittaa mahdollisia voitto-of-function mutaatioita alavirtaan jäsenet BMP signalointiryöpyn tai lyhyt puoliintumisaika ja huono toimitus kasvaimia, jotka ovat yleisiä ongelmia, jotka liittyvät proteiini-pohjainen terapia.

Eräässä

in vivo

rakenteen ja tehokkuuden suhteen tutkimus perustuu zebrafish alkion kehityksen malli, me aiemmin tunnistettu joukko hyvin valikoiva pieni molekyyli BMP estäjien DMH1 ja DMH2, jossa nimenomaan estää BMP signalointi kohdistamalla solunsisäinen kinaasi domeeni BMP tyypin I reseptorit [11] (rakenne DMH1 on esitetty kuviossa 1A). Erittäin tuoreen tutkimuksen raportoitu että DMH2, yksi BMP-estäjien, alentaa tehokkaasti kasvun ja indusoi solukuolemaa NSCLC-solujen

in vitro

[12]. Kuitenkin

in vivo

tutkimuksessa pieni molekyyli BMP estäjien NSCLC kasvaimen kasvu ei ole raportoitu. Koska DMH1 näyttää parempi selektiivisyys BMP tyypin I reseptorien kuin DMH2 [11], esillä olevassa tutkimuksessa selvitimme vaikutuksia DMH1 soluproliferaatioon, muuttoliike ja invaasion NSCLC solulinjojen

in vitro

sekä on ksenograftissa keuhkojen kasvaimen kasvua hiirissä. Tutkimuksemme osoitti, että DMH1 pystyi vähentämään merkittävästi NSCLC solujen kasvua, muuttoliikkeen ja invaasio, ja vaimentaa ksenografti- keuhkojen kasvaimen kasvua

in vivo

.

kemiallinen rakenne DMH1; (B) Western-blottauksella fosforyloidun Smad1 /5/8 in A549-soluja käsiteltiin DMH1 eri pitoisuuksina (1, 3, ja 5 uM); (C) QPCR tulokset ID1, 2 ja 3, A549-soluja käsiteltiin DMH1 ja ajoneuvon DMSO. *:

p

-arvo sanoen 0,05.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

A549 ja H460-solut hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää (Gibco) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Cellgro) atmosfäärissä, 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Western blotting

Solut lyysattiin RIPA soluhajotuspuskurin (Santa Cruz, Santa Cruz, CA), johon oli lisätty proteaasi-inhibiittoriseosta (Santa Cruz) ja fosfataasi-inhibiittorin cocktail 2 (Santa Cruz). Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttämällä BCA-proteiinin kit (Thermo Fisher), ja solulysaatti erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle. Alfa-tubuliinia ja p-Smad1 /5/8 havaittiin Odyssey-järjestelmä (Li-Cor biotieteiden) kanssa inkuboinnin jälkeen sopivan primaarisen ja sekundaarisen vasta-aineita. Ensisijainen vasta käytettiin kanin anti-p-Smad1 /5/8 (Cell Signaling Tech, 1:1000 laimennus) ja hiiren anti-alfa-tubuliinin (Cell Signaling Tech, 1:1000 laimennus). Toissijainen vasta-aineita käyttää, ovat IRDye 680-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä (Li-Cor Bioscience, 1:5000 laimennos) ja IRDye 800CW-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG: tä (Li-Cor Bioscience, 1:5000 laimennus).

Cell scratch-haavan Pitoisuus

A549 ja H460-soluja ympättiin 35 mm ruokia luoda yksisolukerroksena. Astiat annettiin inkuboitua yön yli, jotta solut saisivat kiinnittyä pohjaan astian. Seuraavana päivänä, haavat luotiin suora naarmu pipetin kärki keskellä kulttuurin. Solut käsiteltiin sitten DMSO: ssa tai DMH1 1 uM ja 3 uM pitoisuuksina. Kuvat on otettu, kun haavat luotiin ja sen jälkeen 24 tunnin inkubaation käyttäen faasikontrastimikroskopiaan, ja kuilu etäisyydet kvantitatiivisesti arvioitiin käyttämällä ohjelmistoa ImageJ (NIH). Kuilu etäisyydet kuluttua 24 tunnin inkuboinnin normalisoituivat että aukko etäisyyden 0 hr kuin siirtymänopeuksien.

proliferaatiomääritystä

Tietoja 10000 A549-soluja kuoppaa kohti siemennettiin 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin yön yli. Viljelyväliaine vaihdettiin sitten tuoreeseen elatusaineeseen, joka sisältää DMSO: ta tai DMH1 eri pitoisuuksina. Sitten soluja inkuboitiin 48 tuntia ja 96 tuntia ennen käsittelyä päättymisestä korvaamalla väliaineessa 100 ui 10% trikloorietikkahappoa (Sigma) 1 x PBS: ssä, mitä seurasi inkubointi 4 ° C: ssa vähintään 1 tunnin ajan. Sen jälkeen levyt pestiin vedellä ja kuivattiin ilmassa. Levyt värjättiin 50 ui 0,4% Sulphordamine (SRB, Sigma) määritys 1% etikkahapossa 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sitoutumaton väriaine pestiin pois 1% etikkahappoa. Ilmakuivauksen jälkeen ja liukeneminen proteiiniin sitoutunut väriaine 10 mM Tris liuosta, absorbanssi luettiin mikrolevylukijalla 565 nm.

Quantitative real-time PCR

A549 ja H460-solut ympätään 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 3 x 10

5 solua per kuoppa käsiteltiin DMSO: ssa tai DMH1 24 tuntia. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen) noudattaen valmistajan protokollaa. cDNA syntetisoitiin käyttäen High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) ja Applied Biosystems 7300 PCR System. Kaikki vahvistus kontrollit ja näytteet tehtiin kolmena kappaleena. Alukesekvenssejä ovat saatavilla pyynnöstä.

Modified Boyden kammion määritys

Solun hyökkäystä mitattiin käyttämällä 24-Multiwell Insert System (8 uM kalvo, BD Biosciences) mukaan valmistuksen opetusta. Soluviljelmästä insertit päällystettiin matrigeelin (BD Biosciences). A549-soluja ympättiin pitoisuutena 3 x 105 solua /kammio, sen jälkeen 24-tunnin inkuboinnin kanssa tai ilman DMH1 (3 uM), solut, jotka eivät olleet siirtynyt alempiin kuoppiin poistettiin yläpinnan läpi käyttäen vanupuikkoa ja solut, jotka tunkeutuivat läpi Matrigel-päällystetty-insertit laskettiin. Keskiarvot kolme satunnaisesti valittua kentät saatiin kuhunkin kuoppaan. Kokeet suoritettiin kahtena kappaleena. Keskiarvot kolme satunnaista kenttiä saatiin kultakin hyvin.

Vieraslajisiirteen keuhko kasvaimen kasvua

Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals National Institutes of Health. Eläin Koejärjestely hyväksynyt Western University of Health Sciences Institutional Animal Care ja Käytä komiteat (IACUC). Kaikki pyrittiin minimoimaan eläinten kärsimyksiä. Sub-konfluentteja A549-solut trypsinoitiin ja suspendoitiin sitten seerumivapaassa RPMI 1640-väliaine. Solususpensio (1 x 10

6 solua 100 ul elatusalustassa kutakin injektiota) ihonalaisesti sekä oikean ja vasemman sivun kahdeksan viikon ikäisten NOD SCID hiiriin (Taconic, Hudson, NY) (n = 5 kussakin ryhmässä). Hiirille annettiin intraperitoneaalinen (i.p.) ajoneuvon (12,5% 2-hydroksipropyyli-β-syklodekstriiniä) tai 5 mg /kg DMH1 joka toinen päivä. Kasvain koot mitattiin mikrometrillä kuudennesta päivästä neljännen viikon kuluttua kasvaimen istutuksen. Kasvaimen tilavuus (V) laskettiin formulaation: Volume = (leveys) ∧2 x pituus /2. Kasvain leikeltiin lopussa tutkimuksen, ja leikattiin ja värjättiin H E, ja immunohistokemiallista analyysia varten.

Kasvain analyysissä

Lung tuumorikudoksista sekä ajoneuvon ja DMH1 käsitellyistä hiiristä leikattiin irti ja kiinteät välittömästi formaliiniin ja upotettiin parafiiniin lohkoissa. Sulautettu kasvaimet leikattiin 3 mikronin paksuisia leikkeitä ja värjättiin H 0,05.

Tulokset

DMH1 lohkot BMP signalointi NSCLC soluissa

ensin tutki DMH1 voivat tukkia BMP signalointia NSCLC soluissa käyttäen Western blotting ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qPCR). NSCLC A549-soluja käsiteltiin ajoneuvon (DMSO) tai DMH1 1, 3, ja 5 uM 24 tuntia, vastaavasti. Western blotting -analyysi osoitti, että A549-soluja näkyy suhteellisen suuri pohjapinta-fosfo-Smad 1/5/8 ilmaisun, ja DMH1 hoito esti tehokkaasti Smad 1/5/8 fosforylaatiota annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1 B). Koska estäjät DNA: ta sitovaa /erilaistumiseen (Id) perheenjäsenet ovat suoraan välittäjiä BMP signaloinnin [13], ja ne ovat mukana hyökkäyksen, leviämisen ja etäpesäkkeiden syöpäsolujen [14], mittasimme geenin ilmentymistä ID1, Id2 ja ID3 A549 by qPCR. 24 tunnin kuluttua hoidon, 3 ja 5 uM DMH1 voimakkaasti vähentynyt ilmentyminen kaikki kolme geeniä (kuvio 1C). Yhdessä DMH1 pystyy tehokkaasti estämään BMP signalointia NSCLC soluissa.

DMH1 pienenee NSCLC solumigraatioon ja invaasiota

Koska solumigraatioon ja invaasio tiedetään olevan tärkeä rooli etenemistä syövän etäpesäkkeiden selvitimme vaikutuksia DMH1 on NSCLC solumigraatioon ja invaasiota

in vitro

. Käytimme naarmuuntumista haavan sen määrittämiseksi NSCLC solumigraatio luomalla haavan aukkoja viljellyissä A549 [15]. Soluja käsiteltiin sitten DMSO: ta, yksi BMP-ligandien BMP4 tai DMH1 24 tuntia vastaavasti, ja ero etäisyydet olivat sitten normalisoidaan alun perin mitattu etäisyydet. BMP4 käytettiin, koska se on jaettu funktion BMP2 mutta korkeammat teho. Kuten kuviossa 2A ja 2B, BMP4 etenkin nopeutettua solujen vaeltamiseen taas DMH1 dramaattisesti hidastui muuttoliikettä annosriippuvaisesti. Samanlaisia ​​vaikutuksia BMP4 ja DMH1 solun maahanmuuttoa havaittiin myös toisessa NSCLC solulinjassa H460 (kuvio 2C). Lisäksi tutkimme vaikutus DMH1 solujen invaasiota käyttämällä muunnettua Boyden kammion määritystä. A549-soluja ympättiin Matrigel kuorrutettu kammioita, jota seurasi 24 tunnin inkuboinnin tai ilman DMH1. 3 uM DMH1 vähentänyt dramaattisesti A549 soluinvaasiota kautta Matrigel päällystettyjä kalvoja noin 52% verrattuna ajoneuvon hallintalaitteita (Kuva 2D).

Kuvat ovat tyhjästä-haava määritykset suoritetaan viljellyissä A549 käsitelty DMSO , BMP4 ja DMH1 (1 uM ja 3 uM) 24 tunnin ajan. (B) Cell vaellukset A549-solut kvantitoitiin rako etäisyydet jälkeen 24 tunnin hoidon normalisoitunut alkuperäinen ero etäisyydet. (C) Cell migraatiot H460-solujen määrä määritettiin samalla tavalla. (D) vaikutus DMH1 (3 uM) A549 soluinvaasiota määritettiin käyttämällä muunnettua Boyden kammion määritys 24-Multiwell Insert System (8 uM kalvo, BD Biosciences) päällystetty matrigeeliä. *:

p

-arvo sanoen 0,05.

DMH1 vähentää NSCLC solujen proliferaatiota ja indusoi solukuoleman

vieressä tutkinut, mitä vaikutuksia DMH1 on NSCLC solu leviämisen ja selviytymistä. A549-soluja käsiteltiin DMH1 ja ajoneuvon DMSO 48 tuntia, ja solujen lisääntyminen määritettiin sulforodamiini B (SRB) määritys. Tulos osoitti, että 5 uM DMH1 johti noin 10%: n vähennys solujen kasvun kahden hoitopäivän, viittaa siihen, että inhibitio BMP-signaloinnin DMH1 vähentää merkittävästi keuhkosyövän soluproliferaation

in vitro

(kuvio 3A). Lisäksi tutkimme vaikutus DMH1 A549 solujen selviytymistä samoin. A549-soluja käsiteltiin DMH1 tai ajoneuvon DMSO 72 tuntia, ja kelluvat ja tarttuvat solut kerättiin ja värjättiin trypaanisineä määrittämiseksi kuolleiden ja kuolevien solujen. Toisin kuin ajoneuvon käsittely, DMH1 huomattavasti prosenttiosuutta kuolleita soluja 5 uM pitoisuuksina, mikä viittaa siihen, että antagonisoimiseksi BMP signalointi DMH1 lisää merkittävästi keuhkosyövän solukuolemaa (kuvio 3B). Siten DMH1 hoito voi merkittävästi vähentää NSCLC solujen proliferaatiota ja indusoi solukuoleman

in vitro.

A549-soluja käsiteltiin DMH1 (3 ja 5 uM) tai DMSO 48 tuntia ja solujen lisääntymistä oli määräytyy sulforodamiini B (SRB) määritys. (B) A549-soluja käsiteltiin DMH1 tai DMSO: ssa 72 tunnin ajan, ja solut kerättiin solukuoleman määritys käyttämällä Trypan Blue-värjäyksellä. *:

p

-arvo on 0,05.

DMH1 vaimentaa ksenografti keuhko kasvaimen kasvua hiirissä

vieressä tutkittiin, mikä vaikutus DMH1 on keuhkotuumorisolulinjoissa kasvu

in vivo

. A549-soluja ihon alle istutettiin kaksi puolta pienempi takana kylkien sekamuotoinen immuunipuutos (SCID) hiiriä. Intraperitoneaalinen (ip) injektioilla ajoneuvon (12,5% 2-hydroksipropyyli-β-syklodekstriiniä, n = 5) tai 5 mg /kg DMH1 (n = 5), aloitettiin samana päivänä tuumorisolujen implantaation ja tehtiin joka toinen päivä 4 viikkoa. Tuumoritilavuudet mitattiin säännöllisesti alkaen kuudentena päivänä istutuksen jälkeen. Kasvaimen kasvu oli mahtua eksponentiaalinen kasvukäyrä (kuvio 4A) (R

2 = 0,87 ja 0,84 varten DMH1 käsiteltyjen ja kontrolli hiirille). Tuloksena todettiin, että hinnan kaksinkertaistaa kasvaimen kokoon DMH1-käsitellyillä hiirillä oli noin yksi päivä pidempi kuin kontrolleilla (5,6 vs. 4,7 päivää vuonna DMH1 käsiteltyjen ja kontrollihiirten, vastaavasti) (kuvio 4A). Koska alkuperäisen kasvaintilavuudet olivat samanlaiset, ei tilastollisia eroja näiden kahden ryhmän välillä ei havaittu päivään 25. lopussa 4 viikon hoitojakson, DMH1 hoito johti tilastollisesti merkittävä väheneminen kasvaimen tilavuutta noin 50% verrattuna vehikkelikontrolliin (p-arvo 0,05) (kuvio 4B). Hiiren ruumiinpaino mitattiin joka toinen päivä koko kokeen ajan, ja mitään merkittävää painon muutokset havaittiin sekä ohjaus- ja DMH1 käsitellyissä ryhmissä, mikä viittaa siihen puuttuminen DMH1 toksisia vaikutuksia annoksesta (aineistoa ei esitetty). Tutkimaan edelleen vaikutusta DMH1 on kasvainsoluproliferaation

in vivo

, kasvain kudosnäytteitä sekä ajoneuvon hallinnan ja DMH1 hoitoryhmien tehtiin hematoksyliinillä ja eosiinilla värjättyjen (H 0,05.

Keskustelu

BMP: t ovat poikkeavasti ilmaistaan ​​monenlaisia ​​karsinoomasoluja, mukaan lukien eturauhas-, keuhko-, rinta-, maha- ja munasarjojen [16], [17], [18], [19]. Esimerkiksi yli-ilmentyminen BMP-2 on liittynyt ~98% NSCLC, mutta vähän tai ei lainkaan aktiivisuutta BMP signalointiryöpyn havaitaan aikuisen normaalin keuhkokudoksen kudoksissa viittaa siihen, että estäminen BMP-signalointireitin voi olla tehokas lähestymistapa keuhkosyövän hoitoon [3], [4]. Todellakin, BMP-antagonisti noggin ja solunulkoisen pseudoreceptor spp24 osoitettiin vähentävän keuhkojen kasvaimen kasvua ihonalaisen ksenograftin hiiren malleissa [6], [7]. Vaikka proteiini-pohjainen BMP antagonistit ja solunulkoisen pseudoreceptors saattaa olla lupaava lähteitä keuhkosyöpä lääkekehityksen, niillä on joitakin mahdollisia rajoituksia, kuten lyhyt puoliintumisaika ja vaikea toimitus kasvaimiin [8]. Lisäksi sekä ryyppy ja spp24 lohko BMP signalointi häiritsemällä sitoutumisen BMP ligandeja niiden reseptorien ekstrasellulaarisen tasolla, ja niiden kliininen soveltaminen voitaisiin rajoittaa mahdollisia voitto-of-function mutaatioita alavirtaan BMP signalointiryöpyn. Pienimolekyylisiä antagonisteja, kuten DMH1, joka selektiivisesti kohdentaa solunsisäisen kinaasin domeenit BMP tyypin I reseptorien olisi ihanteellinen inhiboivaa ainetta keuhkosyövän kasvun ja etäpesäkkeiden. Tuore tutkimus osoitti, että DMH2, yksi BMP estäjien tunnistettu meidän zebrafish tutkimuksessa alentaa tehokkaasti kasvun ja indusoi solukuolemaa NSCLC-solujen

in vitro

[12]. Tässä osoitimme, että valikoivampi BMP estäjä, DMH1 vähensi merkitsevästi NSCLC solujen kasvua, muuttoliikkeen ja invaasio

in vitro

, ja heikennettyjä kasvaimen kasvua NSCLC ksenograftissa hiirimallissa, mikä viittaa siihen, että inhibitio BMP reitin vastavaikuttamalla tyyppi I reseptorit pienten molekyylien kanssa voi olla tehokas lähestymistapa keuhkosyövän hoidossa.

vaikutukset DMH1 on lieventävien keuhkojen kasvain kasvu voi välittää useita mekanismeja, mukaan lukien häiritsevät kasvain microenvironment tai keuhkosyöpään kantasoluja. Aiemmat tutkimukset raportoitu, että BMP-2 indusoi uudissuonittumisen kehittää kasvaimia, ja stimuloitiin verisuonten muodostumista A549-johdettu kasvainten nude-hiirissä [20]. BMP-2 antagonisti ryyppy kumottu BMP-2-aiheuttama angiogeenisen vasteen, ja kaatamalla BMP-2 laski verisuonten muodostumista matrigeelin määrityksissä [20]. Siten DMH1 hoito voidaan samoin rikkovat aikaisemmin mikroympäristölle tarvitaan keuhkojen kasvaimen kasvua estämällä angiogeneesiä. Lisäksi BMP signalointi tunnetaan säätelyssä kantasolujen itseuudistumiseen ja erilaistumista, ja jotkut tutkimukset viittaavat siihen populaatiokohortteja keuhkosyöpään solujen näyttää kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia kuten itseuudistumiseen ja erilaistuminen [21]. Esto BMP opastinjärjestelmillä DMH1 voi keskeyttää keuhkosyövän kantasolujen kasvua, mikä tukahduttaa syövän etenemiseen. Tätä hypoteesia tukee hyvin tuoreessa tutkimuksessa, että esto BMP signaloinnin tukahdutti kasvu väestön keuhkosyöpien soluja, jotka ilmentävät kantasolujen merkkiaineita [22]. Lisäksi on raportoitu useista tutkimuksista, BMP-aktivoitua Smad signalointia tai Id geeniperheen on mahdollista edistää muuttoliikettä ja invaasion eri syöpätyyppien [18], [23], [24]. Siksi on erittäin mahdollista, että vaikutus kohdistaminen BMP opastinjärjestelmillä DMH1 voi vähentää kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden laajemmissa syövän luokkiin.

in vivo -tutkimus käyttäen A549 ksenograftimallia, hoito aloitettiin samana päivä kasvainsolujen istutuksen. Näin ollen kasvaimen kokoa olivat suhteellisen pieniä lopussa in vivo kokeissa. Jatkossa tutkimuksissa jää onko hoitoa DMH1 seuraavissa eri aikatauluja voi aiheuttaa enemmän syöpää ehkäisevistä vaikutuksista. Vaikka DMH1 hoito vaimensi merkittävästi keuhkosyöpää kasvu

in vivo

verrattuna

in vivo

vaikutuksia kemoterapiaa huumeiden kuten paklitakselin samalla ksenograftimallia (julkaisemattomat tulokset), vaikutus DMH1 ollut voimakkaina. Tämä havainto viittaa siihen, että DMH1 ei ole sytotoksinen aine eikä se saa aiheuttaa apoptoosin alemmilla annoksilla. Niinpä tulevaisuuden kliinisissä sovelluksissa, yksi mahdollisista tutkimussuuntia on keskittyä sekakäytöstä DMH1 muiden täsmähoitoihin tai kemoterapiaa. Systemaattinen lähestymistapa etsivät synergistinen yhdistelmä tarvitaan. Lisätutkimuksia tarvitaan myös tunnistamiseen alaryhmiin keuhkosyövässä, jotka ovat herkempiä BMP estäjiä varten yksilöllisen hoidon.

Yhteenvetona Tutkimuksemme osoitti, että vastavaikuttamalla BMP tyypin I reseptorien kanssa pienten molekyylien on tehokas tukahduttaa keuhkosyövän solujen lisääntymistä, muuttoliike, invaasio

in vitro

ja kasvaimen kasvu

in vivo

. Ei-myrkyllisiä ja erittäin selektiivinen pienimolekyylisiä BMP-inhibiittorit, kuten DMH1, voivat edustaa uutta luokkaa terapeuttisia aineita, vähentää keuhkosyöpä potilaan kuolleisuutta ja liikkuvuutta.