Krooninen sairaus

tiivistelmä

Dynaaminen ylikuulumisen kasvutekijän reseptoreita, solu- adheesiomolekyylien ja soluväliaineen on välttämätön syövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Integriinit ovat transmembraaninen reseptorit, jotka sitovat soluväliaineen proteiinien ja mahdollistaa soluadheesiota ja solun tukirangan organisaatioon. He myös välittävät signaalitransduktiota säätelemään solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen. Tyypin 1 insuliinin kaltainen kasvutekijä-reseptori (IGF-IR) välittää kasvainsolujen kasvua, adheesio ja apoptoosin inhibi- useiden syöpätyyppien. Olemme aiemmin osoittaneet, että β

1 integriinit säädellä kiinnittymisestä riippumattoman kasvun eturauhassyövän (PRCA) solut säätämällä IGF-IR ilmaisun ja androgeenireseptorin välittämän transkription toimintoja. Lisäksi olemme hiljattain raportoitu, että IGF-IR säätelee ilmentymistä β

1 integriinien punasoluaplasian soluissa. Olemme dissektoitujen mekanismin, jolla IGF-IR säätelee β

1 integriinin ilmentymisen PRCA. Kirjoittajat raportoivat, että IGF-IR on ratkaisevan tärkeää PRCA solujen kasvua ja että β

1 integriinit edistää sääntelyn lisääntymisen IGF-IR. Osoitamme, että β

1 integriini sääntelyä IGF-IR ei tapahdu mRNA-tasolla. Eksogeeninen ilmaus CD4 – β

1 integriini sytoplasmadomeenissa chimera ei häiritse tällaisen sääntelyn ja ei vakauttaa β

1 integriinin ilmentymisen puuttuessa IGF-IR. Tämä näyttää johtuvan siitä, ettei vuorovaikutusta β

1 sytoplasmadomeenissa ja IGF-IR. Osoitamme, että IGF-IR stabiloi β

1 alayksikköä suojaamalla sitä proteasomaalisten hajoamista. Α

5 alayksikköä, yksi sidoskumppanien β

1, on myös vaimentua yhdessä β

1 upon IGF-IR Knockdown taas mitään muutosta ei havaittu ilmaus α

2 , α

3, α

4, α

6 ja α

7 alayksiköistä. Tuloksemme osoittavat ratkaiseva mekanistinen rooli α

5β

1 integriini, myötävirtaan IGF-IR, säätelyssä syövän kasvua.

Citation: Sayeed A, Fedele C, Trerotola M, Ganguly KK , Languino LR (2013) IGF-IR Edistää Eturauhassyöpä kasvua stabiloimalla α

5β

1 Integrin Protein Levels. PLoS ONE 8 (10): e76513. doi: 10,1371 /journal.pone.0076513

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 3. heinäkuuta 2013. Hyväksytty: 23 elokuu 2013; Julkaistu: 09 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Sayeed et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Sopimus apurahan sponsori: NIH; Sopimus lupanumeroon: R01 CA-89720 ja CA-109.874 (ja LRL), P01 CA-140.043 (ja LRL); American Cancer Society (ACS) -IRG-08-060-04 (AS); Sopimus apurahan sponsori: Pennsylvania Department of Health. Tämä hanke on myös rahoitettu osittain alle Commonwealth University Research Enhancement Program avustuksen kanssa Pennsylvania Department of Health (H. R.). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Dr. Languino, vastaava kirjoittaja, on toimituskunta jäsenenä PLoS ONE. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Solujen adheesio soluväliaineen (ECM) välittyy ensisijaisesti integriinien ja on ratkaiseva solun kasvua ja selviytymistä. Integriinit ovat heterodimeerisiä transmembraani- reseptoreita, jotka koostuvat α ja β-alayksiköitä, jotka ovat ei-kovalenttisesti assosioituneet; ne fyysisesti yhdistää ECM solunsisäiseen aktiinisytoskeletonille, mutta voivat myös välittää signaaleja kaksisuuntaisesti solukalvon poikki [1]. Sitoutumalla ECM ligandeihin, integriinit aktivoituvat ja kykenee säätelemään solutoiminnoille aloittamalla solunsisäinen cascades signalointi. Toistaiseksi 24 integriinin heterodimeerejä, 18 α ja 8 β-alayksiköt ja viisi β

1variantsubunits β

1Aβ

1Bβ

1Cβ

1C-2 ja β

1D, syntyy vaihtoehtoisen silmukoinnin , on kuvattu [2], [3]. Integriinit ovat kriittisiä säätelijöitä kasvun, erilaistumisen, selviytyminen, muuttoliike ja invaasio [4], [5]. On raportoitu, että etenemistä eturauhassyövän (PRCA) on pitkälle edennyt liittyy muutoksiin integriinin ekspressioprofiileja [6], [7], [8].

väylät integriinin ja kasvutekijän signalointi ovat arvellaan mekaanisesti liitetty, koska solun tarttumista ECM on ratkaisevan tärkeää solujen vastata tiettyjä kasvutekijöitä [9]. Kasvutekijän signalointi voi häiritä paikallisessa tarttumisessa, oletettu sivustoja integriini-välitteisen signaloinnin [9] ja siten moduloivat integriini-välitteistä soluadheesiota ja liikkuvuuteen. Fyysisen ja toiminnallisen välistä vuorovaikutusta integriinien ja komponenttien kasvutekijän signalointireittien, kuten insuliinin kaltainen kasvutekijä 1 (IGF-1) tai sen alavirran signalointia proteiinien [10], [11], on raportoitu. Meidän laboratorio on osoittanut, että β

1 integriinien moduloimaan selektiivisesti tyypin 1 insuliinin kaltainen kasvutekijän reseptori (IGF-IR) -välitteisen signalointi ja toiminnot PRCA [10], [12]. IGF-1 on myös raportoitu aiheuttavan adheesion ja muuttoliike ihmisen multippelin myelooman solujen osittain aktivoimalla β

1 integriinien [13]. Lisäksi konstitutiivisesti aktiivinen β

1 integriinien edistää pahanlaatuisten fenotyypin PRCA soluissa ja kohdentaminen niitä oli raportoitu estävän PRCA etäpesäkkeitä [14].

IGF-1 on yksiketjuinen polypeptidi, joka sen lisäksi, enemmän klassista hormonaaliset rooli, välittää autokriinisen tai parakriinisen kasvua ja toimii siten voimakas kasvua ja selviytymistä tekijä. IGF-1 saa aikaan sen toimia soluilla sitoutumalla sen reseptoriin, IGF-IR. IGF-IR on heterotetrameerisiä transmembraaninen glykoproteiini, joilla on tyrosiinikinaasiaktiivisuutta [15]. Insuliinin reseptori substraatti (IRS) proteiinit toimivat erityiset telakka proteiineja IGF-IR ja insuliinin reseptorin (IR) [16]. Insuliinireseptorisubstraatti 1 ja IRS2 eivät sisällä luontaista kinaasiaktiivisuutta vaan toiminto rekrytoimalla proteiinien pintaan reseptoreihin, missä ne koota signalointi komplekseja. Signaloinnin IRS proteiineista johtaa aktivoinnin reittejä, mukaan lukien inositoli-3-kinaasi (PI3K) ja mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK) [17], [18]. Mielenkiintoista, molemmat reitit tiedetään myös aktivoitua integriinin sitoutuminen [19], [20]. Yhdistyksen välillä integriinien ja insuliinireseptorisubstraatti 1 on ehdotettu mahdolliseksi mekanismi synergistinen vaikutus kasvutekijän ja soluväliaineen reseptoreihin [21]. IGF-1 signalointi on raportoitu säädeltävä negatiivista palautetta mekanismin kautta ubikitiini /proteasomin välittämän hajoamista IRS2, jolloin suuruus ja kesto vaste insuliinin tai IGF-1 säätelee [22]. Meidän laboratorio on viime aikoina osoittanut, että β

1 integriinit säädellä IGF-IR ilmaisun ja ovat kriittisiä IGF-1-välitteisen lisääminen androgeenireseptorin (AR) aktiivisuus [23]. Olemme myös raportoitu, että IGF-IR tiukasti säätelee β

1 integriinin ilmentymisen PRCA soluissa [24], mutta mekanismia taustalla tätä asetusta ei ole vielä ominaista.

Huolimatta rajallinen yksimielisyyttä tasot IGF- IR ilmentyminen hyvän- ja pahanlaatuisten eturauhasen epiteelin, useissa kliinisissä tutkimuksissa kohdistuvat IGF-IR eri kasvaimissa, kuten punasoluaplasia, ovat käynnissä. Tunnistaminen ja ymmärtäminen alavirran efektoreja IGF-IR auttaisi paremmin määriteltäessä toiminnallista roolia IGF-1-akselilla PRCA. Koska raportoitu todisteita vahva fyysinen ja toiminnallinen vuorovaikutus β

1 integriinit ja IGF-IR, tässä tutkimuksessa tutkittiin mekanismin, jolla IGF-IR säätelee β

1 integriinit. Raportoimme uutta polun ylikuulumisen IGF-IR ja β

1 integriinien, joka edistää syöpäsolujen lisääntymistä, ja osoittavat, että IGF-IR stabiloi α

5β

1 integriini suojaamalla sitä proteasomaalisten hajoamista.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja vasta-aineet

seuraavia reagensseja käytettiin. Opti-Mem ja Oligofectamine (kaikki Invitrogen, CA), synteettisen androgeenin R1881 (Perkin-Elmer, CA), proteinaasi-inhibiittorit (Sigma, MO), rekombinantti-IGF-1 (R että a

2 integriini (Abcam, Cambridge, UK); että a

7 integriinin (8G2, EMD, NJ). Rat mAb CD4 ostettiin Santa Cruz, CA. Seuraavat kanin polyklonaalisia vasta-aineita (pAb) käytettiin: IGF-IR (IGF-IR-β sc713), jotta AKT ja ERK1 /2 (Santa Cruz, CA); surviviinille (Novus Biologicals, CO). Rabbit pAb että a

3, α

4, ja α

5 spesifisiä C-terminaalissa domain kunkin alayksikön, olivat ystävällinen lahja Dr. E. Ruoslahti, University of California Santa Barbara, Sanford -Burnham Medical Research Institute, CA. Α

6 Ab (AA6A) spesifisiä C-pään domeenista ihmisen α

6 integriini oli ystävällinen lahjoitus tri Anne Cress, University of Arizona, AZ. SiRNA oligonukleotidit käytetään tässä raportissa on kuvattu aikaisemmin [24].

Solut

LNCaP ja C4-2B solut hankittiin ATCC. Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 RPMI-1640, johon oli lisätty 5% FBS: ää ja 1% kutakin natriumpyruvaattia, HEPES ja ei-välttämättömiä aminohappoja. Vaikutusten arvioimiseksi agonistien, transfektion jälkeen solut ilman ravintoa 2% hiilellä erotettua seerumia (CSS) sisältävässä väliaineessa 24 h ja sen jälkeen ligandin stimulaation vielä 24 tuntia. PC3-soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 RPMI-1640, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. PC3-Ch1, PC3-Ch2 ja PC3-Ch β

1C-soluja käytetään indusoituvaa ekspressiota kimeerisiä konstrukteja on kuvattu aiemmin [25], [26]. Solut seerumin puutteessa 24 tunnin ajan ja käsiteltiin 75 uM ZnSO

4 6 tuntia. Ch1 kimeerinen konstrukti sisältää ekstrasellulaarisen domeenin hiiren CD4: n ja transmembraani- ja sytoplasmisia β

1A integriini; Ch β

1C konstruktia (käytettiin kontrollina) on sama kuin Ch1 paitsi että β

1A integriini-koodaava alue on korvattu β

1C koodaavan alueen. Ch2 konstrukti edustaa toista ohjaus ja kuljettaa ekstrasellulaarisen domeenin hiiren CD4 liitetty transmembraanidomeeni on β

1 integriinin alayksikkö. Kaikki konstruktit on ilmaistu valvonnassa ja hiiren metallotioneiini-1-promoottorin ja ekspressio kimeerisen varianttien indusoituu lisättäessä ZnSO

4 kasvualustaan.

Transient siRNA transfektion

Ohimenevä transfektio solujen siRNA oligonukleotidien suoritettiin, kuten on kuvattu [23]. Käännetyn IGF-IR siRNA, jolla on käänteinen kohdesekvenssin IGF-IR siRNA toimi kontrollina.

Proliferaatiomääritys

LNCaP ja C4-2B-soluja transfektoitiin ohimenevästi ohjaus- tai IGF-IR siRNA . Kaksikymmentä neljä tuntia transfektion jälkeen solut trypsinoitiin ja analysoitiin tehokkuuden IGF-IR ja β

1 integriini downregulation. Transfektoidut solut laskettiin ja uudelleen maljattiin kolmena rinnakkaisena 6-kuoppalevyille 3 x 10

4 solua per kuoppa 2% CSS sisältävässä väliaineessa, kun läsnä on 1 nM R1881. Elävät solut laskettiin seuraavan kolmen peräkkäisen päivän hemosytometrillä. Kuvia elävien solujen otettiin päivänä 2 ja 3 ennen otettiin talteen laskemista.

Anchorage riippumattoman kasvun määrityksessä

LNCaP solut levytettiin ja transfektoitu ohjaus tai IGF-IR siRNA yhdistettynä joko pelkällä vektorilla, pBJ1 tai pBJ1-β

1-rakenne [27]. Kaksikymmentä neljä tuntia myöhemmin solut käsiteltiin trypsiinillä ja maljattiin pehmeässä agarissa 6-kuoppaisilla levyillä on 5000 solua /kuoppa. Solujen annettiin kasvaa kahden viikon ajan ja pesäkkeet laskettiin. Siirtomaa koko mitattiin käyttämällä okulaari varustettu mittaus- ristikkoa ja pesäkkeet koko 0,1 mm laskettiin eri näytteissä. Pesäkkeet kiinnitettiin ja värjättiin Crystal violetti ja kuvia pesäkkeitä vangiksi stereo mikroskoopilla.

Immunosaostusanalyysi ja Immunoblottausmääritys

immunosaostus PC3-solujen suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [28]. Solulysaatit käytettiin immunoblottauksella, kuten on kuvattu [12]. Analysoida PC3 solulysaateista transfektoitu kimeerisellä konstruktien, PC3-Ch1 ja PC3-CH2-solut transfektoitiin ohjaus- tai IGF-IR siRNA ja 24 tuntia myöhemmin, solut kasvatettiin seerumittomassa väliaineessa 24 h ja sen jälkeen käsittelemällä 75 uM ZnSO

4 6 tuntia ja sitten, korjattu immunoblottauksella. Voimakkuus kunkin kaistan arvioitiin ImageJ analyysin ja normalisoitu latauskontrollina.

FACS

PC3-Ch1 ja PC3-Ch 2 solut käsiteltiin kuten edellä ja korjataan FACS-analyysiä. Solut värjättiin 1 ug /ml Ab CD4 tai rotan IgG: tä negatiivisena kontrollina, mitä seurasi värjäys FITC-konjugoidulla sekundaarisella Ab. Ekspressioprofiileja hankittiin käyttäen FACS Calibur väline (BD) ja tiedot analysoitiin Flowjo ohjelmisto (Puu Star Inc., OR).

proteasomaalisten inhibitiomääritystä

LNCaP-solut transfektoitiin kontrolli tai IGF -IR siRNA ja 24 tuntia myöhemmin, solut ilman ravintoa 2% CSS sisältävässä väliaineessa 24 tunnin ajan. Soluja käsiteltiin 1 nM R1881 kanssa tai ilman 10 uM MG132: ssa 6 tuntia. PC3-2 solut transfektoitiin samalla tavalla kuin LNCaP-solujen ja 24 h transfektion jälkeen käsiteltiin 10 uM MG132 joko 6 tai 24 tuntia ja analysoitiin immunoblottauksella. Erityisiä esto proteasomin funktion epoxomicin, LNCaP-solut transfektoitiin kuten edellä, nälässä 2% CSS sisältävässä elatusaineessa 24 h, ja sen jälkeen käsittelemällä 1 nM R1881 yhdessä 0, 100, 250 tai 500 nM epoxomicin 18 tuntia ja korjattu. Lysaatit analysoitiin immunoblottauksella. Suhteellinen band intensiteettejä β

1-integriinin alayksiköiden

kvantitatiivisella PCR

Reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [23]. Jokainen reaktio suoritettiin ainakin kolmena kappaleena; keskihajonnat ja merkitys laskettiin Excel (Microsoft) ohjelmisto. Sekvenssit oligojen käyttää, ovat seuraavat: β

1 integriini, (sense: CTCAAGCCAGAGGATATTAC, antisense: TCATTGAGTAAGACAGGTCC), IGF-IR, sense: AATGAGTGCTGCCACCCCGA, antisense: ACACAGCGCCAGCCCTCAAA), GAPDH, (sense: GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT, antisense: GTTCTCAGCCTTGACGGTGC) , β-aktiini, (sense: TCCATCATGAAGTGTGACGT, antisense: GGAGGAGCAATGATCTTGAT).

tilastollinen

tilastollinen merkitys (P-arvo ja t-testi) välillä aineistot laskettiin Excel (Microsoft) ohjelmisto. Kaksipuolinen P-arvo on ≤0.02 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Tulokset graafisesti käyttäen DeltaGraph 4,5 (RockWare) ohjelmisto.

Tulokset

Menetys IGF-IR ja β

1 integriinien estää leviämisen PRCA solujen

Olemme aiemmin osoittaneet, että β

1 integriinit ovat ratkaisevia IGF-IR-välitteisten c Ancer soluproliferaatiota [10]. Koska IGF-IR tiukasti säätelee β

1 integriinin ilmentyminen, arvioimme suora vaikutus IGF-IR ehtyminen soluproliferaatioon. LNCaP ja C4-2B solut ohimenevästi köyhdytettyä IGF-IR: n ja uudelleen päällystetty 2% CSS sisältävässä väliaineessa, kun läsnä on 1 nM synteettistä androgeenin (R1881). Menetys IGF-IR silmiinpistävän estää soluproliferaatiota molemmissa solulinjoissa (

* P 0,02) (Fig. 1A, top paneelit). Alennettu ekspressio IGF-IR: n ja β

1-integriinin alayksiköiden sekä solulinjoissa vahvistettiin immunoblottauksella (Fig. 1A, alempi paneeli). R1881 käytettiin parantamaan ilmaisua IGF-IR: n ja β

1 ja lisäämään vaikutuksia näiden reseptorien jakautumiseen. Merkittäviä vaikutuksia soluproliferaatiota havaittiin myös ilman R1881 LNCaP ja C4-2B soluissa, sen jälkeen IGF-IR ehtyminen (tuloksia ei ole esitetty). Alennettu solutiheyden viljelyolosuhteet on selvästi havaittavissa, kun analyysi C4-2B solujen alentunut IGF-IR ja β

1 tasot verrattuna solujen endogeenisen ilmentymisen Molempien reseptorien (Fig. 1 B). Edustavia solutiheys kuvia päivä 2 ja päivä 3 proliferaatiomäärityksillä esitetään. Nämä tiedot osoittavat, että IGF-IR: n ja β

1-integriinit ovat tärkeitä proliferaation punasoluaplasian soluja.

(A) LNCaP ja C4-2B-solut transfektoitiin joko ohjata siRNA tai IGF-IR siRNA ja 24 tuntia myöhemmin solut käsiteltiin trypsiinillä ja laskettiin. Solut maljattiin uudelleen kolmena rinnakkaisena 3 x 10

5 solua per kuoppa 6-kuoppaisille levyille, jossa on 2% CSS sisältävässä väliaineessa, kun läsnä on 1 nM R1881, kerättiin ja laskettiin päivinä 1, 2 ja 3 jälkeen uudelleen pinnoitus . Kukin koe-määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja virhepalkit edustavat keskihajonta kolmesta itsenäisestä arvoja (

* P 0,01), suhteessa vastaaviin kontrolli-siRNA hoitoja. Rinnakkainen joukko LNCaP ja C4-2B solulysaateista analysoitiin tehokkuuden IGF-IR ja β

1 integriinin alayksikkö downregulation immunoblottauksella (alempi paneeli). (B) Kuvat ovat suhteellisen C4-2B solutiheyksien päivänä 2 ja päivänä 3 on esitetty.

Eksogeeninen ilmaus β

1 integriinin alayksikkö palauttaa heikentynyt kiinnittämisestä riippumaton kasvu PRCA solut upon IGF-IR downregulation

havainnot että IGF-IR säätelee β

1 integriinin ilmentymisen ja että kumoamisesta IGF- IR vaaransi syöpäsolujen kasvua, sai meidät tutkimaan, β

1 integriinit osansa IGF-IR-välitteistä kasvun säätelyssä. Sen määrittämiseksi, jos β

1 integriinin ilmentyminen kääntää esto kiinnittymisestä riippumattoman kasvun aiheuttama IGF-IR ehtyminen, LNCaP-solut transfektoitiin IGF-IR siRNA, tai ilman β

1 integriini cDNA, ja annetaan kasvaa ja muodostaa pesäkkeitä pehmeässä agarissa kahden viikon ajan. IGF-IR ehtyminen vähentää merkittävästi kasvua pesäkkeiden pehmeässä agarissa (

** P 0,01) (Fig. 2). Eksogeeninen ilmaus β

1 alayksikkö kuitenkin osittain lievittää kasvun hidastuminen aiheuttama IGF-IR Knockdown mitattuna useissa pesäkkeiden koko ≥100 pm (

* P 0,02). Edustavia kuvia elävien pesäkkeiden vangittiin käännettyä mikroskooppia ja näkyvät alapaneeli (Fig. 2). Nämä tiedot korostavat rooli β

1 integriinien IGF-IR-säätelyyn kasvun punasoluaplasian soluissa.

LNCaP-solut ko-transfektoitiin joko ohjaus- tai IGF-IR siRNA ja joko pBJ1 -β

1-rakenteen tai kontrollivektorilla pBJ1. Solut maljattiin pehmeässä agarissa ja annettiin kasvaa 2 viikkoa. Koko pesäkkeiden mitattiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia varustettu okulaari, joka sisältää 25 mm: n ristikon ja yhteensä pesäkkeet, joiden koko ≥100 um laskettiin. Numerot näkyvät kaaviossa edustavat keskiarvoa lasketaan kolmesta itsenäisestä näytettä (

* P 0,02;

** P 0,001). Edustavia kuvia elävien pesäkkeiden heijastaa vaihtelua pesäkkeen koko kanssa tai ilman eksogeenista β

1 on esitetty alempi paneelit. Mittausikkuna palkit edustavat koko 100 gm.

IGF-IR sääntely β

1 integriinin ilmentyminen ei tapahdu mRNA-tasolla

Cooperative vaikutusta näiden reseptorien syöpäsolujen kasvua johti meidät tutkimaan mekanismia, jolla IGF-IR säätelee β

1 ilme. Olemme osoittaneet aiemmin, että IGF-IR säätelee ilmentymistä β

1 integriinin alayksiköiden PRCA soluissa [24]. Tämä asetus voi esiintyä transkription, transkription jälkeisen, translaation tai translaation jälkeisen tasolle. mRNA sääntely β

1-integriinien IGF-IR: analysoitiin LNCaP vähentämällä ilmentymisen IGF-IR, jonka RNA-interferenssi, jota seuraa käsittely R1881 ja /tai IGF-1. Reaaliaikainen analyysit mRNA transkriptien osoittavat, että IGF-IR mRNA indusoi 8-kertaiseksi, kun R1881 ja 2,5-kertaiseksi, kun IGF-1 hoito (Fig. 3). Kuitenkaan mitään merkittäviä muutoksia β

1 integriinin mRNA havaitaan kumpaakin hoitoja. Ehtyminen IGF-IR ilmentymisen tuloksia nelinkertaisen vähentymisen IGF-IR-mRNA: n jälkeen ligandin hoitoja. Tulokset osoittavat, että β

1 integriini transkriptipitoisuuksissa eivät merkittävästi muutu, kun IGF-IR knockdown. Analyysi GAPDH mentymisprofiili tässä kokeessa toimi ylimääräisenä vertailukontrollina. Tulokset osoittavat selvästi, että IGF-IR ei säännellä β

1 integriini alayksiköiden mRNA-tasolla.

LNCaP-solut transfektoitiin joko ohjaus- tai IGF-IR siRNA. Kaksikymmentä neljä tuntia myöhemmin, soluja kasvatettiin elatusaineessa, joka sisälsi 2% CSS vielä 24 tuntia ja käsiteltiin vehikkelillä, 1 nM R1881 tai 100 ng /ml IGF-1 vielä 24 tuntia. RNA eristettiin näistä soluista arvioitiin transkriptio IGF-IR, β

1-integriinin ja GAPDH käyttämällä kvantitatiivista reaaliaikaista PCR: llä. Expression normalisoitiin yli transkriptin tasot β-aktiini ja tiedot on esitetty suhteellinen ekspressio. Jokainen reaktio suoritettiin kolmena kappaleena ja virhepalkit edustavat keskihajonta (

* P 0,01) suhteessa käsittelemättömiin näytteisiin.

Indusoituvaa ekspressiota CD4-β

1A-integriinin sytoplasmisen domeenin kimeeran ei ei suojaa endogeeninen β

1 integriinin alayksikkö hajoamiselta aiheuttama IGF-IR ehtyminen

Tutkitaan onko eksogeeninen ilmaus sytoplasmisen alueen β

1A muuttaa IGF-IR-säätelyyn endogeenisen β

1 integriinin alayksiköiden, kimeerisiä konstruktioita koostuu transmembraanisen ja sytoplasmisen alueen β

1A integriinin kanssa CD4 ekstrasellulaarista domeenia (Ch1) käytettiin. Sytoplasmisen domeenin β

1 alayksikön olemassa viisi eri liitettyjä muotoja; yleisimmin ilmaistuna muodossa syöpä, β

1A, säätelee β

1 lokalisointi, solujen lisääntymisen ja muuttoliike [2]. Me arveltu, että sitoutuminen sytoplasmisen alueen β

1 integriinien IGF-IR johtaisi jonkin verran kilpailua varten IGF-IR erilaisiin muotoihin β

1 ja johtaa β

1 suojaava vaikutus alle köyhdytettyä IGF-IR olosuhteissa. Ilmaus Ch1 kimeeran (Ch1-solut), tai CH2-kimeeran, joka vastaa transmembraanidomeenin β

1 sekä CD4 solunulkoisen domeenin (CH 2-solut), PC3-solut indusoitiin ZnSO

4 hoitoon. IGF-IR ehtyminen stabiilisti transfektoiduissa soluissa varmistettiin immunoblot-analyysillä (kuvio. 4A, vasemman paneelin yläreunassa). Induktio sytoplasmisen β

1 variantti vahvistettiin FACS (Fig. 4A, alempi paneeli). Kun induktio, IGF-IR, voidaan olettaa jakaa ja sitoutuvat sekä endogeenisen β

1 ja eksogeenisen sytoplasmisen variantti. Eksogeeninen induktion β

1 sytoplasmadomeenia, ei kuitenkaan muuta IGF-IR-säätelyyn endogeenisen β

1 integriini tasoja (kuvio 4A, ylhäällä oikealla paneeli). Sen tutkimiseksi, jos β

1A sytoplasmisen variantti fyysisesti vuorovaikutuksessa IGF-IR, immunosaostus CD4 PC3-Ch1 ja PC3-Ch β

1C-solut (stabiilisti transfektoitu sytoplasmadomeenissa β

1C integriini plus CD4 solunulkoisen alueen [29]) jälkeen tehtiin inkuboimalla soluja ZnSO

4. Immunoblottaustietojen osoittaa (ylempi paneeli) läsnäolo IGF-IR solulysaatissa mutta ei CD4 immunosaostettiin näytteissä. Alempi paneeli osoittaa, että CD4 oli tehokkaasti immunosaostettiin; merkityksetön vyöhyke havaittiin myös IgG immunosaostettiin näytteitä. Tiedot osoittavat, että sytoplasmista β

1A integriinin muunnos ei ole vuorovaikutuksessa endogeenisen IGF-IR (Fig. 4B).

(A) PC3-Ch1 (ilmentävät solunulkoisen domeenin hiiren CD4: n ja transmembraani- ja sytoplasmiset domeenit β

1) ja valvonta PC3-Ch2 soluja (ilmentävät solunulkoisen domeenin hiiren CD4 liitetty transmembraanidomeeni on β

1) transfektoitiin joko ohjaus- tai IGF-IR siRNA. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin arvioimaan tehokkuutta IGF-IR taintumisen (ylhäällä vasemmalla paneelit). PC3-Ch1 ja PC3-CH2-soluja nälkiinnytettiin seerumittomassa väliaineessa 24 h ja joissa osoitetaan, indusoitiin 75 uM ZnSO

4 vielä 6 h edistää ilmentymistä kimeerisiä proteiineja. Solut kerättiin analyysiä varten β

1 alayksikköä lauseke (ylhäällä oikealla paneelit). Rinnakkainen sarja näytteitä käsiteltiin vahvistaa indusoituvan ilmentymisen kimeerojen FACS-analyysillä käyttämällä Ab CD4 (alempi paneeli). 10000 solut kussakin näytteessä on hankittu ja tulokset on esitetty histogrammeja, joissa x-akseli edustaa keskimääräinen suhteellinen CD4 ilmaisun ja y-akseli edustaa solujen lukumäärä. (B) PC3-Ch1 ja PC3-Chβ

1C (kontrolli solut, jotka ilmentävät solunulkoisen domeenin hiiren CD4: n ja transmembraani- ja sytoplasmisia β

1C) inkuboitiin 75 pM ZnSO

4 indusoida sytoplasmisen domeenin β

1A tai β

1C integriinit, vastaavasti. Lysaatit immunosaostettiin joko kontrolli-lgG tai Ab vastaan ​​kimeeristä CD4 verkkotunnuksia. Immunokompleksit analysoitiin IGF-IR ilmentymistä immunoblottauksella. Input lysaatit ajettiin kontrolleina.

Tehostettu proteasomaalisten hajoamista β

1 integriinin alayksiköiden ilman IGF-IR

Sen jälkeen osoitetaan, että IGF-IR: ei säädellä β

1 integriinin selostukset, etsimme onko IGF-IR-säätelyyn of β

1 integriinin tasot tapahtuisivat translaation jälkeisen tason. Ohimenevä väheneminen IGF-IR LNCaP-soluissa seurasi R1881 hoito yksinään tai yhdistelmänä, jossa on proteasomin inhibiittoria, MG132, 6 tuntia. R1881 käytettiin parantamaan perusilmentymisen IGF-IR: n ja β

1 integriinin alayksikkö, kuten on raportoitu ryhmämme aiemmin [23] ja solulysaateista analysoitiin. Vähentäminen β

1 integriini tasoilla aiheuttama IGF-IR ehtyminen oli poistetaan heti solujen hoito tällä proteasomin estäjä (Kuva. 5A). Tulokset Tämän kokeen varmistettiin PC3-soluissa transfektion jälkeen joko ohjaus siRNA tai IGF-IR siRNA, jota seuraa käsittely MG132 joko 6 tai 24 h (Fig. 5B). Olemme lisäksi tukee näitä tuloksia käyttäen erilaisia ​​annoksia epoxomicin toinen erittäin spesifinen proteasomi- inhibiittori [30]. LNCaP-solut transfektoitiin joko ohjaus- tai IGF-IR: siRNA kuten edellä ja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla epoxomicin. β

1 integriinin alayksiköiden ovat läsnä joko esiaste tai kypsät muodot (110 ja 130 kD) ja molemmat ovat vaimentua upon IGF-IR menetys. Tiedot osoittavat, että epoxomicin estää hajoamista kypsän muodon β

1 integriinin alayksikkö (Fig. 5C). Kypsä β

1 -reseptorin yksin näyttää seuraavan proteasomaalisten hajoamisen jälkeen sisäistämisen. Edeltäjä muodossa β

1 (110 kD), joka on vielä translaation jälkeisiä modifikaatioita tehdään kypsyminen ei talteen proteasomaalisten esto. Tiedot osoittavat, että IGF-IR stabiloi β

1 integriinin alayksikön ekspression estämällä sen proteasomaalisten hajoamista.

(A) LNCaP-solut transfektoitiin joko ohjaus- tai IGF-IR siRNA. Kaksikymmentä neljä tuntia myöhemmin, soluja kasvatettiin elatusaineessa, joka sisälsi 2% CSS vielä 24 tuntia ja käsiteltiin vehikkelillä, 1 nM R1881 ja /tai 10 uM MG132: ssa 6 tuntia. Solulysaatit analysoitiin ilmentymisen β

1 integriinin alayksikkö ja IGF-IR immunoblottauksella. AKT käytettiin latauskontrollina. Bändi intensiteetit β

1 integriinin alayksikön kvantitoitiin ImageJ analyysi ja normalisoitu kuin AKT latauskontrollina. Suhteellinen intensiteetti arvot ilmaistaan ​​prosenttia kontrollinäyte transfektoitu ohjaus siRNA yksin. (B) PC3-soluja transfektoitiin joko ohjaus- tai IGF-IR siRNA. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen soluja käsiteltiin 10 uM MG132 6 tai 24 tunnin ajan RPMI-alustassa, joka sisälsi 10% seerumia. Solulysaatit analysoitiin ilmentymisen β

1 integriinin alayksikkö ja IGF-IR immunoblottauksella. AKT käytettiin latauskontrollina. β

1 integriinin alayksiköiden kvantitoitiin ImageJ kuten edellä ja arvot normalisoitu niiden kanssa latauskontrollina AKT. Suhteellinen voimakkuus arvot β

1 ilmaistaan ​​prosenttia kontrollinäyte transfektoitu ohjaus siRNA yksin. (C) LNCaP-solut transfektoitiin kuten edellä, ja 24 tuntia myöhemmin soluja viljeltiin alustassa, joka sisälsi 2% CSS vielä 24 tuntia, minkä jälkeen käsittelemällä 0, 100, 250 tai 500 nM epoxomicin yhdessä 1 nM R1881: ssa 18 tuntia. Solulysaatit analysoitiin kypsät ja prekursorimuotojen β

1 integriinin alayksikkö ja IGF-IR immunoblottauksella. AKT toimii latauskontrollina. Suhteellinen kaistaintensiteettejä kypsien β

1 integriini määritettiin ImageJ analyysi kuten edellä.

Analyysi α integriinin alayksiköiden upon IGF-IR downregulation

Integriinit ovat heterodimeerejä, joka koostuu α ja p-alayksiköt. On 24 mahdollista heterodimeerejä kyky aktivoida tiettyjä signalointireittien [19]. β

1 integriinit, muun alayksiköt, tiedetään heterodimerisoitua α2, α3, α4, α5, α6 ja α7 integriinin alayksiköiden, jotka on ilmaistu LNCaP-soluissa. Koska väheneminen IGF-IR ekspressiotasot johtaa vaimennussäätely β

1 integriinin alayksikkö, päätimme mitkä a integriinin alayksikkö on vaikuttanut IGF-IR: downregulation. Osoitamme merkittävä väheneminen α5 integriinin alayksikkö yhdessä vähensi IGF-IR ja β

1 tasot (Fig. 6). Mitään muutosta ei havaittu ekspressiotasot muiden α-integriinin heterodimeerinen kumppanit (Fig. 6 ja tietoja ei ole esitetty). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen PC3-soluissa, joissa kumota β

1 integriinien mukaan shRNA johtaneet huomattavaan vähenemiseen pinnan ilmentyminen α5 integriinin alayksikön [3]. Meidän tiedot osoittavat, että suuri kompleksi säätelee IGF-IR on α5β

1-integriiniin.

LNCaP-solut transfektoitiin joko ohjaus- tai IGF-IR siRNA ja käsiteltiin 2% CSS-alustassa, joka sisälsi 24 h ja sen jälkeen käsittelemällä 1 nM R1881: ssa 24 tuntia. IGF-IR ja β1 integriinin downregulation arvioitiin immunoblot. Lysaatit analysoitiin sitten ekspressiota eri α-integriinin alayksiköiden. Erityiset Abs vastaan ​​α

2, α

4, α

5, α

6 ja α

7 integriinin alayksiköiden käytettiin tunnistamaan α integriini kumppani β

1 integriini alayksikköä, joka on vaimentua, kun IGF-IR ehtyminen.

keskustelu

Tässä tutkimuksessa kuvataan uusi havainto, että IGF-IR toimintoja PRCA solut osittain välittyvät β

1 integriinit. Leikellä mekanismi, jonka IGF-IR säätelee β

1 integriinin ilmentyminen, me osoittavat, että IGF-IR Parantaa β

1 integriini vakautta vähentämällä proteasomaalisten hajoamista. Lisäksi osoitetaan, että α

5 integriinin alayksikkö liittyy β

1 selektiivisesti vaimentua upon IGF-IR menetys.

Huomattava epidemiologiset ja prekliiniset tiedot ovat tunnistaneet IGF-IR-reitin tärkeänä säädin kasvain solubiologian. Huono tulos on kuitenkin useista kliinisistä tutkimuksista, joiden tarkoituksena estää IGF-IR, ovat kuitenkin aiheuttaneet tutkijoita kehittämään ennakoivaa biomarkkereiden parantamaan potilaiden valinnassa, jotka hyötyisivät hoitoja kohdistaminen IGF-IR. Lisäksi selkeämpi käsitys suhteelliset IGF-IR ja IR-kompleksit kasvaimissa on tarpeen.