Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MikroRNA (miRNA) ovat lyhyitä yksijuosteisia Koodaamattomat RNA: t, jotka tukahduttaa geenin ilmentymistä joko translaation tukahduttaminen tai hajoamisen kohde mRNA: iden. Hehkutus välillä lähetti-RNA: ita ja 5 ’siementen alueella miRNA uskotaan olevan välttämättömiä tietyn suppressio kohdegeenin ilmentymisen. Yksi miRNA voi olla useita satoja erilaisia ​​tavoitteita solussa. Nopeasti saatu todisteita siitä, että monet miRNA osallistuvat solukierron säätelyssä ja consequentially kriittisiä rooleja syövän synnyn.

Menetelmät /Principal Havainnot

Synteettisten miR-107 tai miR-185 kasvun estyminen ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat. Virtaussytometria analyysi paljasti nämä miRNA indusoivat G1 solusyklin pysähtymisen H1299 soluissa ja tukahduttaminen solusyklin etenemisen on vahvempi kuin Let-7 miRNA. Geenin ilmentymisen analyysit oligonukleotidigeenisirumenetelmää, löydämme satoja geenejä vaikuttavat transfektoimalla nämä miRNA. Käyttämällä miRNA-kohde ennustus analysoi ja array data, me listataan joukko todennäköinen tavoitteita miR-107 ja miR-185 G1 solusyklin pysähtymiseen ja validoida osan niistä käyttäen reaaliaikaista RT-PCR ja immunoblottauksella varten CDK6.

Johtopäätökset /merkitys

tunnistettu uusi solusykliä säätelevä miRNA, miR-107 ja miR-185, lokalisoitu usein muuttunut kromosomialueita ihmisen keuhkosyövässä. Erityisesti miR-107, useita alassäädetty geenit liitettiin Euroopan geenin ontologian termi ”solusyklin”. Tuloksemme viittaavat siihen, että nämä miRNA voivat osaltaan säädellä solusyklin ihmisen pahanlaatuisia kasvaimia.

Citation: Takahashi Y, Forrest ARR, Maeno E, Hashimoto T, Daub CO, Yasuda J (2009) MiR-107 ja MiR -185 voi aiheuttaa solukierron pysähtymisen Human Non pienisoluinen keuhkosyöpä Cell Lines. PLoS ONE 4 (8): e6677. doi: 10,1371 /journal.pone.0006677

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 kesäkuu 2009; Hyväksytty: 17 heinäkuu 2009; Julkaistu: 18 elokuu 2009

Copyright: © 2009 Takahashi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Research Grant for RIKEN OMICS Science Center MEXT ja Yoshihide Hayashizaki, Grant varten RIKEN Frontier Research System, toiminnallinen RNA tutkimusohjelman YH ja Grant-in-tuki tieteellisen tutkimuksen ja J.Y. ARRF tukee CJ Martin Fellowship Australian NHMRC (ID 428261). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

miRNA ovat 19-23 emästä pitkän, yksijuosteinen RNA: t että kriittisiä rooleja biologisissa prosesseissa [1]. Nukleotidisekvenssejä miRNA usein evolutionally konservoituneet monisoluisista organismeista [2]. MiRNA ilmaistaan ​​hiusneula muotoinen kaksijuosteista ennalta miRNA ja juokseva käsittely eri RNaasi III entsyymejä, Drosha ja Dicer, tuottaa kypsä miRNA [3] kantavassa kypsä miRNA sitoutuu joukon proteiineja, kuten Agonaute, muodostaen miRNA aiheuttama hiljentäminen kompleksi (miRISC). MiRISC uskotaan tehdä monimutkaisia ​​tavoite lähetti-RNA: iden ja transkription jälkeen estää ilmentymisen kohdegeenien. Vaikutusmekanismi on miRISC on edelleen kiistanalainen [4], on kuitenkin yleinen yksimielisyys, että suurin osa tavoite RNA: iden on sitoutumiskohtia miRNA että 3’alueilla. Vuodesta toinen-kahdeksas perustaa 5′-sekvenssi miRNA kutsutaan siemen sekvenssin ja uskotaan olevan tärkeää tunnistaa kohde RNA: iden mukaan miRNA.

On käynyt selväksi, että jotkut miRNA kriittisiä rooleja solusyklin asetuksen yhteistyössä onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille (katso katsaus [5], [6]). Yksi esimerkki solukierron säännellään miRNA on

let-7

(varten

HSA-let-7a

, MIMAT0000062). Käyttöönotto synteettinen ennalta let-7 aiheuttaa solukierron pysähtymisen keuhkojen syöpäsoluja [7]. Monet miRNA tiedetään säätelevät vaimentaen solusyklin liittyviä geenejä. MIR-17~92 klusteri tunnistettiin alavirtaan

MYC

onkogeenin [8] ja säätelevät vaimentaen E2F transkriptiotekijöitä, jotka ovat tunnettuja välittäjäaineita solusyklin etenemistä [9] .Toinen tärkeää kasvaimen liittyvät geenin,

TP53

, indusoida miR-34 perheenjäsenet ja yli-ilmentyminen miR-34 aiheutti solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa [10] – [16].

Kirjoittajat raportoivat potentiaali solusyklin säännellään miRNA haun aikana syöpään liittyvien miRNA ihmisen keuhkosyövän soluja. Tässä tutkimuksessa uudelleen joukon genomialueiden tunnistaa Zhao

et al

. että monistetaan tai poistetaan ihmisen keuhkosyövässä [17]. Tutkimuksen aikana huomasimme, että

miR-107

(MIMAT0000104) ja

miR-185

(MIMAT0000455) tukahduttaa proliferaation keuhkoadenokarsinooma solulinjoissa ja aiheuttaa solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa solusyklin. Yritimme luonnehtia alavirran kohde lähetti-RNA: iden näistä miRNA käyttämällä mikrosirun profiloinnin geeni ontologian analyysit ja TargetScan ennusteita [18].

Tulokset

Expression of miR-31, 107, ja 185 ihmiskudosnäytteissä kokoelma kuten keuhkosyövän kudosten ja solulinjoissa

Valitse alueet tunnistetaan Zhao

et al

. [17], löysimme 13 ja 26 selityksin miRNA vuonna homozygously poistetaan ja vahvistetaan alueiden vastaavasti (täydentävä taulukko S1). Koska monet syöpään liittyvät geenit edistävät pahanlaatuisiin laaja kirjo solutyyppejä, me etusijalle miRNA, jotka on liitetty muihin aikuisiän ihmisen syövissä. Sitten päätimme kolme miRNA: miR-107, miR-185, ja miR-31 (MIMAT0000089) [19] – [22]. Lisäsimme anna-7a solujen kasvulle ja solusyklikontrollin koska miRNA voi tukahduttaa solujen kasvua keuhkosyövän solulinjat [23] ja aiheuttaa solukierron pysähtymisen HepG2 solulinjassa [7].

käyttäminen Taq-Man kvantitatiivinen RT-PCR-tekniikka, mittasimme ekspression neljän miRNA ihmisen keuhkosyövän solulinjat A549 ja H1299 ja koko paneeli kaupallisesti saatavilla RNA: iden normaalissa kudoksessa ja keuhkosyöpä näytteitä (Fig. 1). Useimmat miRNA osoittivat suhteellisen läsnä ilmaus keskuudessa terveiden kudosten (Fig. 1). On mielenkiintoista, että ilmaus analysoitu miRNA (miR-107, 185, ja anna-7) olivat pienemmät keuhkoissa kasvain ja keuhkosyövän solulinjoja kuin normaalissa keuhkossa. MIR-31 on erittäin ilmaistu keuhkosyövän solulinjat.

miRNA ekspressiotasot mitattiin miRNA TaqMan qRT-PCR normaalissa keuhko-, aivo-, aivolisäkkeen, maksan ja munasarja kudoksissa, keuhkojen kasvain näytteen ja myös keuhkoissa tuumorisolulinjoja, H1299 ja A549. Pystysuora akseli osoittaa suhteellinen ekspressio kunkin miRNA normalisoitu että RNU44.

kasvun hidastuminen ja solusyklin pysähtymisen yli-ilmentyminen ehdokas miRNA ihmisen keuhkosyövän solulinjat

vaikutus näiden miRNA proliferaatioon testattiin MTT: llä valmiiksi miRNA transfektoidut H1299 ja A549-soluja. Transfektio HSA-miR-107 ja HSA-miR-185 pienensi dramaattisesti solujen lisääntymisen molemmissa solulinjoissa (Fig. 2). Kun kyseessä on H1299-solujen, let-7a miRNA osoitti merkittävästi vähentää proliferaatiota, kun taas vaikutukset olivat vähemmän ilmeisiä A549-soluja. Laajuus kasvun suppressio A549 by let-7a on samanlainen kuin raportoitu [7]. MIR-31 osoitti lievää suppression solujen kasvua, mutta tukahduttaminen tasot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä monissa ajankohtina sekä solujen (Fig. 2).

kasvu tukahduttaminen vaikutus miRNA ehdokas transfektiot H1299 (vasemmalla paneeli) ja A549 (oikea paneeli) mitattuna MTT: llä. Pystysuora akseli osoittaa suhteellisen suhde A450 nm: että päivänä 0 kunkin solun 1. Huomaa miR-107 ja miR-185 estää proliferaation molemmissa solulinjoissa.

DNA-pitoisuus analyysi virtaussytometria osoitti, transfektio HSA-miR-107: n ja HSA-miR-185 indusoi merkittävää kasvua solujen prosenttiosuus on G1 vaiheen solusyklin, jotta samaa tasoa kuin päästää 7a ohjaus, kun taas sekoitetun negatiivinen kontrolli ei (Fig. 3). Emme havainneet myöskään mitään ilmeisiä kasvua osa-G1 väestön virtaussytometrialla tai apoptoosiin liittyviä morfologisia muutoksia, kuten ydin- kupliminen ja tiivistyminen, alla vaihekontrastimikroskoopilla (tuloksia ei ole esitetty). Tämä viittaa siihen, että kasvua vaimentava aiheuttama HSA-miR-107 ja HSA-miR-185 transfektio johtui induktion G1 pidätyksen sijasta apoptoosin.

histogrammit DNA sisältö on saatu FACS-analyysi on esitetty. Prosenttiosuudet kunkin solusyklin vaiheissa on esitetty osakuva histogrammit. Ei ollut portti sovelletaan tapahtumiin niin, että ei ollut selvää kertymistä osa-G1 väestön kaikissa kokeissa.

tunnistaminen ehdokas kohde-mRNA: n miRNA geenitekniikan profilointi analyysi

microarray profilointi tehtiin määrittää maailmanlaajuisia muutoksia mRNA ekspressiotasot H1299 transfektoiduissa soluissa kasvun ehkäisevästä miRNA verrattuna negatiiviseen kontrolliin. HSA-miR-107, HSA-miR-185 ja HSA-anna-7a transfektoiduissa soluissa oli 561, 646 ja 812 selostukset alassäädetty ja 608, 698 ja 949 voimistuvan 1,5 kertaiseksi tai enemmän, tässä järjestyksessä. Gene ontologia analyysi suoritettiin geenejä alas-säädellä transfectans. Taulukossa 1 luetellaan merkittävimmin rikastettu GO ehtoja alas geenien jokaisen miRNA. Viisi parasta termit geeneissä alas-säätelee HSA-miR-107 olivat kaikki solusyklin liittyvät (taulukko 1). Down-geenien kanssa let-7a olivat pääasiassa mukana rRNA aineenvaihdunnassa, ribosomien biogeneesiä, ja M vaiheen solusyklin. Lopuksi alas geenien kanssa HSA-miR-185 osoitti väkevöimättömien solusyklin liittyviä termejä, sen sijaan, että termit kehittämiseen liittyvien ja erilaistumista olivat näkyvästi. Lisäksi 127 ja 33 geenit yleisesti alassäädetty ja voimistunut vastaavasti molempien miRNA osoittanut mitään geeniä ontologian rikastusta, mikä viittaa siihen, että nämä miRNA aiheuttaa solukierron pysähtymisen eri signalointireittejä (taulukot 2, 3, ja tuloksia ei esitetty).

Vertasimme miRNA kohde ennusteiden kanssa TargetScan ohjelmiston [18] näiden miRNA geeneihin alassäädetty meidän ilmaisun profilointi aineistoja. Sekä säilyneitä että ei-säilyneitä sivustoja, löysimme mediaani kertainen muutos ennustetun tavoitteet oli johdonmukaisesti alhaisempi kuin kaikkien geenien havaittiin paneelit (Fig. 4). On suuntaus voimakkaammin ennusti tavoitteiden olevan alassäädetty kuin heikko ennustettu tavoitteita. Samoin konservoitunutta tavoitteet ovat yleensä alassäädetty kuin kaikki ennustettu tavoitteet (Fig. 4).

Target skannata ennustukset uutettiin miRNA 185, 107 ja let7a. Mediaani ilmaisu-signaali on esitetty vain geenien pitää havaita Agilent ohjelmisto. Y-akseli ilmaisee mediaani kertainen muutos sarjaa ennustetun mikroRNA kohdegeenien eri kynnysarvoja, verrattuna kaikkiin geenien microarray (mustia). Kaikissa tapauksissa mediaani signaali ennustaa tavoitteet on alhaisempi kuin on havaittu, jos kaikki koettimia käytetään. Kun koe on laajennettu ulos kolme päivää, vietämme vähemmän vaikutusta, mikä viittaa siihen kohdistu suoraa ovat useammin ensimmäisten päivä.

jälkeen suhteuttaa nämä tietokone-ennustetut tavoitteet geenien alaspäin säännelty yli 0,75-kertaisesti RNA-tasolla kaventamaan mahdollisia kohteita näitä miRNA. Löysimme monet näistä mahdollisia kohteita olivat selityksin termien ”solusyklin” in Entrez Gene merkinnät (taulukko 2) viittaa siihen, että nämä kolme miRNA voi suoraan säädellä solusyklin etenemisen kautta näitä geenejä. Mielenkiintoista on, että meidän kädessä, anna-7 ei tukahduttaa ilmaus CDK6 (NM_001145306) mRNA, joka tukahdutti yli-ilmentyminen anna-7 edellisessä tutkimuksessa [7]. Taulukko 3 osoittaa, että erillistä sarjaa tunnettuja onkogeenien ovat vaimentua nämä miRNA.

Näistä luetteloista ja muista lista kuvaavat ehdokas miRNA tavoitteet selityksin ehtojen solusyklin, keuhkosyöpä, onkogeeni tai tuumorisuppressori Entrez Gene merkinnät ( täydentävä taulukko S2), päätimme osajoukko selostukset tehtävän hyväksynnän qRT-PCR jota verrattuna tavoite luetteloissa oleviin TargetScan [18] ja PicTar [24] ohjelmisto (Kuva. 5A). Mir-107, varmistimme mRNA alas-säätely

CCNE1

(NM_001238),

CDK6

,

CDCA4

(NM_017955.3),

RAB1B

(NM_030981.2) ja

CRKL

(NM_005207.3), ja miR-185, varmistimme alas-säätely

CCNE1

,

CDK6

,

AKT1

(NM_001014431.1),

HMGA2

(NM_003483.4) ja

CORO2B

(NM_006091.3) (Fig. 5B). Toteamme, että molemmat miR-107 ja miR-185 transfektio aiheutti alas-säätely sykliini E1 (CCNE1) ja sykliiniriippuvainen kinaasi 6 (CDK6) mRNA-tasot, vaikka tukahduttaminen taso CDK6 by miR-185 on vaatimaton (Fig. 5B). Sitten varmistettiin western blotting että CDK6 proteiini tasot ovat myös alas-säädellä miR-107, kun taas CDK6 ilme oli suhteellisen muuttumattomana miR-185 (Kuva. 5C). Koska tukahduttaminen taso CDK6 mRNA ilmentymisen miR-185 on hyvin vaatimaton, myöhemmin lasku CDK6 proteiinin ilmentymisen aikaan pisteen havainnon (24 tuntia transfektion jälkeen) saattaa olla liian vähän noudatettava tavanomaiseen immunoblottings.

) edustaja nukleotidisekvenssin väliset ottelut mahdollista kohdegeeneissä ja miRNA. Suluissa olevat numerot osoittavat kantoja kohde nukleotidin lopetuskodonista. Vain sovitettu nukleotidin miRNA siemeniä sekvenssit on merkitty pystyviivan. B) Kvantitatiivinen RT-PCR analyysit mahdollisia kohteita miR-107 (CCNE1, CDK6, CDCA4, RAB1B ja CRKL) ja miR-185 (CCNE1, CDK6, AKT1, HMGA2, CORO2B) näkyvät. Pystyakseli osoittaa suhteellisen ilmentymisen suhde kunkin geenin normalisoitunut että GAPDH. C) Western blot, joka osoittaa alaspäin säätely CDK6 proteiinin miR-107.

Keskustelu

sattui huomaavat miR-107 ja miR-185 voi estää solujen lisääntymisen kahdessa keuhkosyövän solulinjoja ja aiheutti G1 pidätyksen solusyklin. Laajuus kasvun hidastuminen näiden miRNA on samanlainen kuin kasvaimen tukahduttava miRNA, anna-7. Geeniekspressioprofilointi analyysin kanssa transfektoimalla nämä miRNA osoitti, että vain miR-107 osoitti merkittävää rikastumista solusyklin sääntelyviranomaisten loppupään efektoreja. Toisaalta, miR-185 ei merkittävästi tukahduttaa solusyklin säädin sekä anna-7, joka on tunnettu solusykliä säätelevä miRNA [6]. MIR-185 voisi kuitenkin estää mRNA ilmaus solukierron säännellä geenejä, kuten CDK6 ja AKT1.

yleensä säädellään geenin sarjaa kaikkien kolmen kasvua tukahduttava miRNA ei niin paljon ja ei niin vahvasti sidoksissa solusyklin asetuksen (taulukko 2). Nämä tulokset viittaavat siihen, että kolmen miRNA säädellä erilliseen solun signalointireitteihin. Koska miRNA on monenlaisia ​​tavoitteita solussa (eli vähemmän spesifinen) ja koska laajuus tukahduttaminen kohde ilmentymisen miRNA on yleensä kohtalainen, toiminta miRNA olisi pidettävä ”hienosäätöä” geeniekspression nisäkkäiden soluihin [25]. Kertyminen nämä pienet sääntelyn vaikutukset voivat aiheuttaa merkittäviä biologisia reaktioita soluissa [5] osuutensa oli Toisaalta, muutama mahdollinen kohde molekyylit, kuten CCNE1, ja CDK6 voi olla kriittinen solusyklin säätelyssä nämä miRNA. Esimerkiksi vähentäminen CCNE1 siRNA aiheuttaa solukierron pysähtymisen maksasyövän solulinjoissa [26]. Kun kyseessä on CDK6, vähentäminen CDK6 siRNA aiheuttama pitkäaikainen S-vaiheessa ihmisen alkion kantasoluja [27]. Yleensä tärkeyttä miRNA solusyklin asetuksessa on varsin kohtuullinen, koska miRNA on tarkoitus olla keskeinen molekyylejä induktioon solujen erilaistumisen, joka liittyy kanssa solusyklin pysähtymisen monissa tapauksissa.

Mitä miR-107 , muut todisteet tukevat rooli tämän miRNA vuonna G1 pidätyksen ja kasvun hidastuminen. miR-107 osakkeita 7 8 perustan sen siemen sarjasta kuin miR-16 perheen miRNA, jotka indusoivat G1 pidätyksen kohdistamalla useita sykliinejä ja solusyklin sääntelyviranomaisten, mukaan lukien CDK6 jota vahvistettiin kuin miR-107 tavoite [28]. Lisäksi aiemman tutkimuksen mukaan synteettisiä inhibiittoreita miR-107 kasvu leviämisen A549-solut, mutta eivät vaikuta HeLa-solut [29] viittaa miR-107 voi todellakin olla keuhkojen erityinen rooli vähentää leviämisen. Mielenkiintoista, miR-107 osoitti overexpressions haiman syövät viittaa tässä miRNA on joitakin myönteisiä rooli haiman syövän synnyn [21]. Toisaalta, valmistelun aikana tämän käsikirjoituksen, Lee et al. raportoitu, että demetylaatio ja deasetylaatio hoitoja ihmisen haimasyövän solulinjoissa indusoi yliekspressio miR-107 ja yli-ilmentyminen miR-107 tukahdutetaan solujen kasvua ja ilmentymistä CDK6 ihmisen haimasyövän solulinjoissa [30]. Viimeksi mainittu tutkimus on yhteensopiva meidän tiedot kannalta CDK6 ehdokkaaksi alavirran kohde miR-107. On mielenkiintoista, onko tämä miRNA ei ole mitään erityistä solun toimintojen soluissa sijaan solukierron säätelyssä. Safdar

et al

. ehdotti, että miR-107 on aiheutettiin käyttänyt hiirillä reisilihakseen lihakset [31]. Selvityksen mukaan Wilfred et al., MIR-107 ja sen paralogi, miR-103, voi toimia säätelyyn solujen aineenvaihduntaa [32]. Se voi olla mielenkiintoinen mahdollisuus, että nämä miRNA säätelevät olennainen solun toimintoja, kuten aineenvaihdunta tai solusyklin etenemisen sijaan erittely solujen erilaistumisen.

mekanismia solukierron pysähtymisen by miR-185 ei ole selvä. Määrä solusyklin sääntelyviranomaisten loppupään tukahdutettu geenejä on paljon pienempi miR-185 kuin miR-107. Yksi ryhmä tutkijat ehdotti, että tämä miRNA yli-ilmennetään virtsarakon syöpä [20]. Muissa paperi, Choong raportoitu että miR-185 on voimakas positiivinen korrelaatio ulkonäön punasolupesäkkeiden pinta-antigeenejä (CD71, CD36, ja CD235a) ihmisen napanuoran verisolujen stimuloidaan kasvutekijöillä ja aiheuttama erytroidien erilaistuminen [33]. Yleisesti ottaen induktio solujen erilaistumisen yleensä pareille tukahduttaminen solusyklin etenemisen. Ottaen huomioon miRNA toiminnot muilla metazoans monet miRNA indusoitavissa solujen erilaistumista saattaa olla joitakin solusyklin ehkäisevästä toimintoja. Mirna tulisi olla muita biologisia toimintoja eri solutyyppejä. Tämän vuoksi on mielenkiintoista tutkia, onko miR-185 on mitään erottaa toiminnot keuhkosyövän soluja. Toinen tärkeä kysymys on, että miR-185 osoitti kasvua tukahduttava toiminnot (luvut 2, 3) ja vähentää ilmentymistä keuhkosyövässä soluissa (kuvio 1), vaikka miRNA on lokalisoitu kromosomialueella monistettiin kaksi keuhkosyövän solulinjat ([17 ] ja täydentävä taulukko S1). Nämä tulokset ovat vasta-intuitiivinen. On kuitenkin mahdollista, että tuumorisuppressorit voidaan paikantaa alueella osoittaa kromosomaalisen vahvistus kasvainsoluissa. Yksi esimerkki on potentiaalinen tuumoria tukahduttavan geenin,

GSDMA

(NM_178171.4) [34], on lokalisoitu kromosomialueella monistettiin mahasyövän soluihin [35]. Tämä geeni vaimentua ihmisen syöpien, vaikka geenin osoitti vahvistus tuumorisoluissa [35]. Siinä tapauksessa miR-185, epigeneettisiä hiljentäminen miRNA voi tapahtua ennen geenin monistamisen kromosomin 22q21.1 alueella. Lisätutkimuksia selvästi puututtava näihin kysymyksiin perusteellisesti.

Lopuksi me raportoimme että uusi ehdokas miRNA joka voi säädellä solusyklin etenemisen ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat. Se on vielä avoin kysymys, onko somaattiset geneettiset muutokset voivat aiheuttaa tukahduttaminen näiden miRNA ihmisen keuhkosyövän tai muita pahanlaatuisia kasvaimia. Edelleen luonnehdinta genomisen loci näiden miRNA on tarpeen tehdä kysymys selväksi.

Methods

uuttaminen miRNA aseman

Annotated miRNA loci uutettiin alueilta kromosomi voitto ja tappio tunnistaa Zhao

et al

. [17] suuressa paneelissa ihmisen keuhkosyövän avulla SNP paneelit. Hg16 koordinaatit muunnettiin niiden Hg18 käyttämällä vastineet käyttäen UCSC Lift-Over työkalu (https://genome.ucsc.edu).

Solulinjat

Ihmisen keuhkosyöpä solulinjat , H1299 ja A549, ostettiin ATCC. Solulinjoja kasvatettiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia, 100 ug /ml penisilliiniä /streptomysiiniä ja 292 ug /ml L-glutamiinia (Invitrogen, Carlesbad, CA, USA).

RNA valmisteet ja kvantifiointiin RNA: t käyttäen reaaliaikaista PCR

Kaikki reaaliaikainen PCR suoritettiin StepOnePlus Realtime PCR -järjestelmää (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) neljänä kappaleena. Kokonais-RNA uutettiin H1299 ja A549-soluja kanssa

mir

Vana miRNA eristyspakkausta (Ambion, Austin, TX, USA). Yhteensä RNA: t ihmisen kudokset hankittiin BioChain Institute, Inc. (Hayward, CA, USA, luettelonumerot: R1234152-50, R1235152-50, R1234035-50, R1234068-10, R1234149-50, R1234183-50). Kvantifiointiin miRNA, 100 ng kokonais-RNA analysoitiin TaqMan MicroRNA Reverse Transcription (RT) Kit (Applied Biosystems), jossa RNU44 kuin lastaus ohjaus. Kvantitoimiseksi mRNA, 500 ng kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin käyttämällä PrimeScript II RT-entsyymiä (Takara Bio Inc., Shiga, Japani), ja PCR suoritettiin SYBR esiseos Ex Taq (Perfect Real Time: Takara Bio Inc. ), jossa GAPDH kuin latauskontrollina. Kaikki reaaliaikainen PCR-analyysi tehtiin kolmena kappaleena.

miRNA transfektion

Synteettinen pre-miRNA ja epäspesifinen negatiivinen kontrolli (miRIDIAN microRNA mimiikkapanelit Negative Control # 1) ostettiin Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, USA). Pre-miRNA transfektoitiin lopulliseen konsentraatioon 10 nM Iipofectamine2000 (Invitrogen), ja väliaine vaihdetaan 24 tuntia transfektion jälkeen.

Cell kasvun mittaus

Solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä käyttäen Cell laskenta kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japani), mukaisesti valmistajan protokollaa. 1 tunnin inkubaation median sisältävä tetratsoliumyhdiste, absorbanssi 450 nm: ssä havaittiin 0,1 sek Arvo MX 1420 (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA).

Solusyklianalyysiä

Solut kerättiin 72 tunnin jälkeen ja kiinnitetään 70% jääkylmää etanolia, ja sen jälkeen RNAasi hoito, värjättiin 50 ug /ml propidiumjodidia DNA-sisällön analyysi virtaussytometrialla analysointia FACS Calibur-järjestelmä (Becton Dickinson, Franklin, NJ, USA). Tiedot kerättiin ja käsiteltiin käyttäen FlowJo FACS-analyysi ohjelmisto (Puu Star, Inc., Ashland, OR, USA).

Expression profilointi käyttäen Agilent Geenien ilmentyminen array

cRNA koetin luotiin kokonais-RNA (500 ng) kanssa Low RNA Input lineaarisen vahvistuksen -leimauskittiä (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Cy3-leimattua cRNA (1,65 ug) lisättiin sitten hajanaista ja suhteellinen ilmentyminen mitattiin hybridisoimalla 4 × 44K koko ihmisen oligo mikrosiru (Agilent). Feature Extraction ver. 9.1 ohjelmisto (Agilent) käytettiin analysoimaan kuvan microarray. Microarray analyysit tehtiin kahtena kappaleena. Kaikki microarray tiedot raportoitu käsikirjoituksen kuvataan mukaisesti MIAME suuntaviivojen ja tiedot on talletettu CIBEX (Center for Information Biology geenin ilmentyminen) tietokantaan [36] at Center for Information biologian ja DNA Data Bank of Japan (DDBJ), Kansallinen Institute of Genetics (Mishima, Japani). Liittymistä numero aineisto on CBX79.

Microarray ja Gene ontologia analyysi

Microarray data tehtiin näkyväksi ja normalisoitu käyttämällä GeneSpring GX 7.3 ohjelmisto (Agilent). Arvot alle 0,01 asetettiin 0,01. Kunkin sirun jokaista mittausta jaettiin 50. prosenttipiste kaikki mittaukset, jotka siru. Sitten kunkin koettimen mittaukset normalisoitiin negatiiviseen kontrolliin mittauksia. Koska rajoittamisesta resursseja, tilastollinen

p

-arvo ehkä ole sovellettavissa kriteereitä geenin valintaan meidän aineisto. Siksi geenien ontologiaa analyysin differentiaalisesti ilmentyvien geenien määriteltiin ≥1.5 taittaa ylös tai alas suhteessa negatiiviseen kontrolliin vastaava päivä. Gene ontologia aikavälillä rikastumisen ylös ja alas säädellään geenin sarjaa arvioitiin käyttäen GOstat verkkotyökalu [37]. GOstat web Työkalu tarjoaa p-arvo, onko geeni luettelossa on huomattavasti rikastunut geenien selityksineen tietyn Gene ontologia. Tämä lasketaan perustuu siihen, kuinka monta geenien geeniperimä joihin on merkitty tietyn ontologian, ja kuinka monien geenien koko mikrosirulla (taustalla) joihin on merkitty samalla ontologian. Olemme määritelleet tausta joukko geenejä havaittiin ainakin yksi ryhmän kokeissa.

Vasta-aineet ja immunoblottaus analyysi

vasta-aineet α-tubuliinin (Sigma) ja CDK6 (Santa-Cruz Biotechnology, Santa-Cruz, CA) käytettiin. Viljeltyjä soluja (5,0 x 105 solua /kuoppa) kasvatettiin 6-kuoppaisilla kuoppiin ja transfektoitiin miRNA. 24 tuntia transfektion jälkeen solut lyysattiin ja suoritettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi. Erotetut proteiinit siirrettiin Immobilon (Millipore, Billerica, MA) elektroforeesin avulla. Immuunijärjestelmän kompleksit on todettu tehostetun kemiluminesenssin (Perkin Elmer) ja näkyväksi LAS 3000 kuva-analysaattori (Fuji elokuva, Tokio, Japani).

tukeminen Information

Taulukko S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0006677.s001

(0,03 MB XLS) B Taulukko S2.

doi: 10,1371 /journal.pone.0006677.s002

(0,27 MB XLS) B

Kiitokset

Kiitämme MSES. Satomi Fujiwara, Asami Hirakiyama, ja Kana Nakamura niiden teknistä apua.