Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

kliinistä hyötyä guaiac ulosteen piilevän veren testit (FOBT) on nyt vakiintunut ja peräsuolen syövän seulontaa. Kasvava todistusaineisto on osoittanut, että epigeneettisellä muutoksia ja ulosteen mikrobiston muutokset, joka tunnetaan myös nimellä dysbiosis, liittyy CRC synnyssä ja voitaisiin käyttää sijaismarkkereiden CRC.

Potilaat ja menetelmät

Teimme poikkileikkaustutkimuksen joka sisälsi kaikkia peräkkäisiä kohteita, jotka saatettiin (2003-2007) seulontaan colonoscopies. Ennen kolonoskopia, päästöt (tuore uloste, sera-S ja virtsa-U) kerättiin ja FOBTs suoritettu. Metylaatiotasoilla mitattiin ulosteessa, S- ja U 3 geenien (Wif1, ALX-4, ja vimentiinistä) valitaan paneeli 63 geenien; Kras mutaatiot ja seitsemän ja aladominantista bakteeripopulaatioita ulosteessa kvantitoitiin. Kalibrointi arvioitiin kanssa Hosmer-Lemeshowin chi-neliö, ja syrjintä määritettiin laskemalla C-tilastoa (Area Under Curve) ja Net uudelleenluokittelu Improvement indeksi.

Tulokset

Oli 247 yksilöiden (keski-ikä 60,8 ± 12,4 vuotta, 52% miehistä) tutkimusryhmässä, ja 90 (36%) näistä henkilöistä olivat joilla on pitkälle edennyt polyyppeja tai invasiivisia adenokarsinooman. Monimuuttujafunktiokehitettiin malli ikä- ja FOBT johti C-tilastotieto 0,83 [0,77-0,88]. Sen jälkeen kun täydentävät peräkkäisiä (yksi kerrallaan) säätö, WIF-1 metylointi (S tai U) ja ulosteen mikrobiston dysbiosis johtivat nousua C-tilastotieto 0,90 [0,84-0,94] (p = 0,02) ja 0,81 [0.74- 0,86] (p = 0,49), tässä järjestyksessä. Oikaistu yhteisesti FOBT ja WIF-1 metylointi tai ulosteen mikrobiston dysbiosis lisäys C-tilaston oli vielä merkittävämpi (0,91 ja 0,85, p 0,001 ja p = 0,10, vastaavasti).

Johtopäätös

havaitseminen metyloitu WIF-1 joko S tai U on korkeampi suorituskyky tarkkuutta verrattuna guaiac FOBT pitkälle peräsuolen neoplasia seulonta. Toisaalta, ulosteen mikrobiston dysbiosis havaitseminen ei ollut tarkempi. Veren ja virtsan testaukseen voidaan käyttää niille henkilöille haluttomia tehdään ulosteesta testaus.

Citation: Amiot A, Mansour H, Baumgaertner I Delchier J-C, Tournigand C, Furet J-P, et ai. (2014) havaitseminen Metyloidut WIF-1 Gene on tarkempi kuin ulosteen piilevän veren testi peräsuolen syövän seulonta. PLoS ONE 9 (7): e99233. doi: 10,1371 /journal.pone.0099233

Editor: Anthony W. I. Lo, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 03 helmikuu 2014; Hyväksytty: 13 toukokuu 2014; Julkaistu: 15 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Amiot et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Cancéropole Ile de France, CoMiCa 2007-2010 projekti, (Charles Debray yhdistys-ACD); LNCC (French National League syöpää vastaan), CCR INSERM Promotion (2004-2006). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu, tietojen analysointia, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja kilpailijana etujen olemassa I. Sobhani ja Wif1 testi markkeri (rekisteröity patentti), ja JP Carrau varten FOB testissä (johtaja laboratorio).

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on merkittävä syy sairastuvuutta ja kuolleisuutta kehittyneissä maissa. Ilmaantuvuus CRC on kasvanut 3-4% vuodessa vuodesta 1970 [1], [2]. Useimmissa tapauksissa luonnollinen historia CRC sisältää etenemistä polyypit edistyneisiin CRC, joka mahdollistaa varhaisen havaitsemisen oireettomilla potilailla. Seulonta kolonoskopia, ”kulta-standardin menetelmä”, sigmoidoskopiaa, ja tietokonetomografiaa colonography on osoitettu olevan tehokas CRC seulonnan osoittamalla väheneminen CRC ilmaantuvuutta ja kuolleisuutta [3], [4], [5], [ ,,,0],6]. Kuitenkin useimmissa maissa, joista mikään ei tällä hetkellä suositellaan CRC joukkoseulonnan johtuen rajoituksensa, jotka sisältävät suolen valmistelu, korkeat kustannukset, matala sitoutuminen hinnat, ja satunnaisia ​​haittavaikutuksia. Viime vuosikymmeninä on yritetty perustaa invasiivisia testejä CRC seulontaan. Guajakkireak- ulosteen piilevän veren testi (FOBT) on osoitettu vähentävän CRC liittyvää kuolleisuutta kolmessa satunnaistetussa kontrolloidussa tutkimuksissa ja yksi väestöpohjaisen tutkimuksessa [7], [8], [9], [10]. Kuitenkin FOBT on alhainen herkkyys ja hyvin rajallinen vaikutus adenooma-karsinooma siirtyminen todennäköisesti siksi varhainen syövän esiaste tuottaa vain pieninä pitoisuuksina verta ulosteessa [11], [12]. Määrällinen immunokemiallinen FOBT on viime aikoina osoittanut suurempaa herkkyyttä havaita kehittyneen neoplasioihin [13]. On kuitenkin edelleen tarvetta tarkempaan testi parantaa seulonta suorituskykyä.

Useimmissa tapauksissa perinnöllinen geneettiset tekijät tekevät pienen panoksen alttius kehittää CRC, kun tärkeimpiä toimijoita ovat ympäristötekijät [14]. Todellakin, aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että CRC kehitykseen liittyvät ikääntymiseen, mutta myös modernit western elämäntapaan ja ruokavalioon osia [1], [15].

poikkeava metylaatio CpG-rikkaiden sekvenssit (CpG saaret) on epigeneettiset muutos, joka indusoi transkriptionaalisen hiljentämisen tuumorisuppressorigeeneille [16]. Nämä geenin muutokset voidaan saada aikaan kemiallisella ja /tai ympäristöön liittyvät tekijät [1]. Hypermetylaation CpG-saarekkeiden kasvaimen synnyssä on raportoitu kasvainkudoksessa CRC potilailla, sekä syöpää edeltävät leesiot [17]. On tunnettua, että poikkeava metylaatio on olemassa verenkierrossa DNA, kuten löytyy ulosteesta, seerumi, virtsa ja muut kehon nesteet, ja sitä voitaisiin käyttää biomarkkerina syövän seulonnan [18], [19].

viime aikoina mikrobit pesiytyvät ruoansulatuskanavasta, jotka ovat merkittäviä toimijoita biologisissa ympäristöissä, on epäilty pelaa rooleja esiintyminen CRC [20]. Itse asiassa, muutokset luminaalisessa tai liittyvät suoliston mikrobiston ns dysbiosis, on esitetty CRC-potilailla, [21], [22]. Eläinmalleissa osuus bakteerien etiologia CRC on tutkittu, ja on ehdotettu, että ne voisivat toimia läpi tulehduksellinen polkuja, vaikka suora genotoksinen vaikutus bakteereita voitaisiin myös epäilty [23]. Viime aikoina olemme osoittaneet, että uloste elinsiirrot ihmisen potilaalla on CRC mikrobivapaaksi hiiret voivat aiheuttaa kasvaa suolen precancerous tapahtumien kautta isäntä geenin muuttaminen, solujen lisääntymistä ja aineenvaihduntaa limakalvolla [24]. Siksi muutokset ulosteen mikrobiston voitaisiin käyttää biomarkkereita CRC seulontaan.

Tässä tutkimuksessa tutkimme suorituskykyä tarkkuutta uusien seulontatestien CRC kohdistaminen metylaatiotasot paneelin 63 geenien ulosteet , veri ja virtsa, ja koostumus ulosteen mikrobiston arvioitiin qPCR. Jälkimmäiset kokeet verrattiin guaiac FOBT sairaalassa perustuva potilaita, jotka kuuluvat ryhmiin keskimääräinen tai suuri riski CRC.

Potilaat ja menetelmät

Tutkimuskanta

Vuodesta 2003 vuoteen 2007 247 peräkkäistä avohoitopotilaille (keski-ikä 60,8 ± 12,4, 129 miestä), joiden keskimääräinen tai suuri riski CRC (historia syövän sukulaisten, henkilökohtainen aikaisempi polyypit, mitään vatsan tai suoliston liittyviä oireita, tai anemia että tarvitaan kolonoskopia), sisällytettiin näytepankin kokoelma tutkimus. Voidakseen saada osallisuutta potilailla oli oltava ole aiempaa seuraavasti: peräsuolen leikkauksen, kuten tulehduksellinen tai tarttuva vammat suolen, tai tarve hätätilanteessa kolonoskopia. Tutkimus tapahtui kaksi osastoa (Gastroenterology ja Oncology) of opetussairaalassa Pariisin alueella Ranskassa.

Kaksi viikkoa ennen kolonoskopia ja annettuaan kirjallinen suostumus, potilaat olivat mukana tutkimuksessa ja olivat pyydetään tuoreita uloste, virtsa ja verinäytteet 2 viikon sisällä, mutta enintään kolme päivää ennen kolonoskopia. Kaikissa tapauksissa, ulostenäytteitä kerättiin ennen suoliston puhdistamiseen varten kolonoskopia. Mitään erityistä ruokavalion (diabeetikot, kasvissyöjät) ja lääkkeet (diabeteksen lääkkeet, veren kolesterolia, ja laksatiiveja) tänä aikana kirjattiin. Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea Val de Marne Paris-EST alue, joka luvan ilmoittautuminen potilaita kaikissa liittyvät keskuksissa (numero 2004-4 CCPPRB). Kaikki potilaat saivat tietoa tutkimuksesta, sen tavoitteita, ja näytteitä ne antavat. Kaikki tieto oli antanut TypeD kirje kirjoitettu ranskaksi, ja muodollinen kirjallinen suostumus on saatu kolminkertaisessa kopio muodossa; yksi lomakkeen jäljennös säilytettiin potilaan, me säilyttää yhden kopion osastolla kliinisen tutkimuksen (CIC) ja viimeisen kopion säilytettävä promoottori (National Institute of tieteelliselle tutkimukselle-INSERM). Siten muodollinen suostumus oli saatavilla kullekin potilaalle. Yksityiskohtaiset haastatteluja sairaushistoria ja lääkärintarkastuksissa tehtiin.

Guaiac ulosteen piilevän veren testi

guaiac Hemoccult Testi suoritettiin (suoritettiin varmennettu laboratoriossa Ranskan viranomaiset Pariisissa) kaikista aiheista sopiminen liittyä tutkimuksen. Sillä FOBT, 1 näyte ulosteesta 3 peräkkäisen suoliston vaadittiin. Mukaisesti meneillään olevan ohjelman, joka on erityinen ruokavalio (meatless varten 3 päivää) suositeltiin. Aiheet keräsi 3 näytettä itse kotona (käyttäen pakkausta kortin Hemoccult), kirjataan päivämäärä jokaisen suolen mukana, ja lähettää testit postitse. Hemoccult lukema suoritettiin sokeasti sertifioitu teknikot ilman nesteytystä, mukaan protokollien asettaa kansallisen järjestetty seulontaohjelma. Seulonta pidettiin positiivisena, jos Hemoccult testi oli positiivinen (ainakin 1 6 lähtö oli positiivinen).

Seulonta kolonoskopia

Kaikki yksilöt koki kolonoskopia tutkimus nukutuksessa. Oikea ja vasen paksusuolen sivustoja sekä peräsuoleen, olivat täysin tutkittiin kaikilla potilailla. Kolonoskopia Tulokset kirjattiin seuraavat tavanomaista prosessia organisoitua seulontaohjelmaa Ranskassa. Polyyppeja kokonaan poistettu aikana tähystys tutkimuksen avulla mucosectomy tarvittaessa. Kolonoskopia pidettiin kultakantaan menetelmällä. Kolonoskopia löydökset luokitellaan pisimmällä patologisen vaurio löydetty. Advanced kasvaimet mukana kehittynyt adenoomia (adenoomia mittaus 10 mm tai adenoomia, joissa dysplasiaan tai in situ karsinooma) ja invasiivisia CRC (hyökkäys pahanlaatuisia soluja kuin muscularis limakalvoille). Hyperplasic polyypit eivät sisälly, kuten kasvaimet.

kvantitointi metylaation kvantitatiivisella PCR: llä

Yhteensä DNA eristettiin virtsasta, seerumista ja ulostenäytteet käyttämällä Qiamp DNA Mini Kit (Qiagen), ja sitten muunnetaan natriumbisulfiittia ja monistettiin käyttäen lokus PCR-alukkeita, jotka reunustivat MGB koetin. Metylointi tasolla kunkin potilaan määritettiin, kuten ovat kuvanneet Eads et ai [25]. PCR-olosuhteet olivat 94 ° C: ssa 10 minuutin ajan entsyymin aktivoitumisen, 45 sykliä 94 ° C 30 sekuntia ja 60 ° C: ssa 60 sekuntia annealing ja venymä PCR. Olemme vahvistaneet metylointituloksia suoralla bisulfiitti genomista sekvensointia 5% vaikuttaa potilaista tutkittiin niiden kudosten sulkea teknisen artefakti. Paneeli 63-geenien (tuloksia ei ole esitetty), uutettu kirjallisuudessa arvioitiin ensin, ja sitten 3 kiinnostavat geenit (WIF-1, ALX-4 ja vimentiinin) on valittu perustuen niiden erotteleva arvot määritettiin vertailut kasvaimen ja normaali homologisia suolistossa [26]. Tehokkuutta alukkeiden kohdegeenien (Wif1, ALX4 ja vimentiinin) ja siivous geenin (Albumiini BSP) syöttöä varten muunnetun DNA arvioitiin käyttäen sarjalaimennoksia metyloitu muunnetun DNA: n valvontaa, kuten on esitetty kuviossa S1). Jälkeen toteutettavuus koesarjaa suoritettiin 48 potilaan uloste, virtsa ja seeruminäytteet, päätimme mitata vain WIF-1 metylaatiotasoilla validoinnissa asetettu mukaan korkeamman herkkyyden ja spesifisyyden hinnat ja WIF-1-geenin verrattuna ALX- 4 ja vimentiinista. Aluke ja koetin sekvenssit metylaation kohdegeenien ovat taulukossa S1.

Bakteeri analyysi ulostenäytteet käyttämällä kvantitatiivista PCR

Kokonaiset tuoreet ulosteet kerättiin steriiliin laatikot, ja 4 tunnin kuluessa , 10 g pakastettiin -80 ° C: ssa analyysiä varten. Bakteeri-DNA uutettiin eriä ulostetta, ja sen jälkeen lopullinen saostuminen, DNA suspendoitiin uudelleen 150 ul: aan TE-puskuria ja säilytettiin -80 ° C: ssa lisäanalyysiä, kuten aiemmin on kuvattu [26]. Käytimme reaaliaikaisen qPCR tutkimassa eroa bakteeri tiheydet sisällä mikrobiston välillä normaalin ja kehittyneitä kasvainten ja syövän potilaiden ulosteita. Alukkeet ja koettimet, joita käytetään tässä tutkimuksessa on kuvattu muualla [26], ja on esitetty taulukossa S2. Reaaliaikainen qPCR suoritettiin käyttäen ABI 7000 Sequence Detection System ohjelmistoversio 1.2.3 (Applied-Biosystems, Foster City, CA, USA), ja kokonaismäärä bakteerityyppiä päätellä keskiarvostandardi käyrät ja ilmaistaan ​​log10-arvojen, kuten aiemmin on kuvattu [26]. qPCR arvot saatiin potilasta kohden ja kutakin suoliston mikrobiston komponentti. Kompensoida siitä, että ulostenäytteet saattaa sisältää enemmän tai vähemmän vettä, tiedot kunkin ulostenäyte normalisoitiin kuten aikaisemmin on kuvattu [26]. Havaittu taso kullekin erityiselle hallitseva ja osa-määräävän bakteerien vähennettiin kaikista-bakteerien pitoisuus, ja tulokset ilmaistaan ​​log määrän bakteereja grammassa ulosteesta. Nämä määritykset käytettiin vertaamaan koostumuksen suoliston mikrobiston kaikkien aineiden, ja tulokset ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD.

KRAS mutaatio analyysi

DNA: ta monistettiin kaksoiskappaleet PCR kanssa alleeli-spesifinen aluke sarja kattaa eksonit 12 ja 13 Kras geenin [27]. PCR-olosuhteet olivat 94 ° C: ssa 10 minuuttia, 45 sykliä 94 ° C 30 sekuntia ja 60 ° C: ssa 60 sekuntia annealing ja venymä PCR. Kahdet PCR-alukkeita ja koettimia käytettiin: yksi sarja oli spesifinen villialleelin DNA ja toinen joukko edusti mutaatio alleeli. Aluke ja koetin sekvenssit on lueteltu taulukossa S3.

Tilastollinen

Kunkin potilaan ominaisuudet on kuvattu useita (%) ja laadullisia tietoja ja mediaani (kvartiiliväli, IQR) tai keskiarvo (± 1 keskihajonta, SD) kvantitatiivista tietoa niiden jakeluun. Vertasimme lähtötilanteen ominaisuudet potilaista molemmissa ryhmissä (kehittyneet neoplasia ja kontrolliryhmien) käyttäen Pearsonin khiin neliö -testi tai Fisherin testiä laadulliset muuttujat ja Wilcoxonin parametritonta tai Kruskal- Wallis testejä määrällisiä muuttujia. Spearmanin kaksiosaisella testiä käytettiin arvioimaan korrelaatioita.

Kertoimet suhde (OR) ja 95%: n luottamusvälit (CI) kunkin muuttujan arvioitiin käyttämällä erillisiä logistista regressioanalyyseilla. Ulosteen mikrobiston dysbiosis tulokset annettiin 1 SD logaritmiasteikolla tasot laskettiin kullekin kontrolliryhmään. Analyysi oli järjestelmällisesti ikävakioitu arvioida itsenäisesti suorituskykyä tarkkuutta kunkin seulontatestejä. Ikä käsiteltiin jatkuvassa tarkistettuaan normaalius olettamus. Kalibrointi kunkin mallin arvioi Hosmer-Lemeshowin tilastotieto, jossa

p

arvo on suurempi kuin 0,20 osoittaa riittävä sovi. Syrjintä mallimme arvioitiin C-tilastoa (Area Under ROC Curve), joka laskettiin monimuuttuja logistisen regressiomallin. C-tilastot mallien kanssa ja ilman kehittynyt neoplasia verrattiin käyttämällä parametrisen testin kehittämä Delong et al ja sopiva ei-riippumaton data [28]. Resampling bootstrap analyysi 1000 Toistoja lähtötilanteen aineisto suoritettiin arvioimaan 95% CI C-statitistics on monimuuttujatestauksen malleja. Syrjintä kvantitoitiin myös laskemalla Net uudelleenluokittelu Improvement indeksi (NRI) [29].

Kaikki vertailut olivat 2-puolinen ja

p

arvo on alle 0,05 osoitti tilastollisesti merkitsevää eroa . Analyysit suoritettiin käyttäen STATA ohjelmistoversio 12,0 (Stata- Corp, College Station, TX, USA).

Tulokset

Tutkimuskanta

Kaksisataa seitsemänviidettäkymmentä potilasta otettiin mukaan tutkimuksessa. Ominaisuudet tutkimusväestöstä on lueteltu taulukossa 1. Kaikki henkilöt kävivät läpi kolonoskopia täysin tutkimisen oikean ja vasemman paksusuolen ja peräsuolen. Potilaat luokitellaan sitten seuraavasti: terveillä henkilöillä, joilla oli joko normaali kolonoskopiaan (n = 123) tai pieniä adenoomia alle 1 cm (n = 34) on tässä pidetty valvontaa ja potilaille, joilla on kasvain, joilla oli CRC ( n = 66) tai suuri ( 1 cm: n halkaisija) adenoomien (n = 24) olivat tässä pidetään tapauksissa. Keskimääräinen tapaus oli yli 10 vuotta vanhempi kuin keskimäärin ohjaus potilaalle. Ohjaus potilaat harvemmin raportoituja aiemman henkilökohtainen historia polyyppien ja peräsuolen syövän perheensä verrattuna tapauksiin. Kaksi ryhmää olivat yhtä tasapainossa BMI, perussairaus, lääketieteen sisäänoton, ja ruoka hoito (taulukko 1).

Analyysi guajakkipohjainen ulosteen piilevän veren testi Hemoccult

Hemoccult testi ei tulkittavissa 2 tapausta. Kaiken FOBT oli positiivinen 46 potilasta, joista 36 (78%) oli kehittynyt neoplasian, mukaan lukien 33 (72%) CRC. Niistä 199 potilailla, joilla on negatiivinen FOBTs, 146 (73%) potilaista oli normaali colonoscopies tai pieni adenoomia taas 53 (27%) oli kehittynyt neoplasian, mukaan lukien 33 (17%) ja CRC. Siten herkkyys ja spesifisyys FOBT pitkälle kasvaimet olivat 40,4% ja 93,6%, tässä järjestyksessä.

Metyloidut WIF-1, ALX-4, ja vimentiinistä seerumin, virtsan ja ulosteen

metylointi tasot WIF-1, ALX-4 ja vimentiinista geenit ensin arvioitiin ulostenäytteistä. Koko populaatiossa, hypermetylaatiota WIF-1, ALX-4 ja vimentiinin geenien havaittiin 7,3%, 4,5% ja 0,8%, vastaavasti (taulukko 2). Jokaista geeniä (WIF-1, ALX-4 ja vimentiinista), poikkeava metylaatio oli merkitsevästi useammin jos potilailla verrattuna kontrolliryhmän potilaisiin (19,3%

vs.

0,6%, 10,6%

vs.

1,3% ja 32,6%

vs

. 0,0%, vastaavasti) (taulukko 2). Jokaista geeniä, spesifisyys oli yli 98%, mutta on alhainen herkkyys alle 25%. Jotta WIF-1 ja ALX-4-geenit, mutta ei vimentiinista geeni, metylaatio taso oli merkittävästi koholla, jos potilailla verrattuna kontrolliin yksilöiden (kuvio 1).

metylaatio tasot WIF-1, ALX-4, ja vimentiinin arvioitiin sitten virtsaan ja seeruminäytteistä. Wif-1 näytti olevan kaikkein herkimpiä merkki pitkälle neoplasian virtsassa tai seeruminäytteet (52% ja 29%) verrattuna ALX-4 ja vimentiinin (23% ja 15% vs. 4% ja 8%, vastaavasti). Spesifisyys oli suurempi kuin 93% kaikissa tapauksissa. Yhdistelmä virtsan ja seerumin wif-1 metylointi tason johti suurempi herkkyys osuus 60,4% [30].

Metylointi taso WIF-1 arvioitiin sitten virtsassa tai seeruminäytteet koko validointi kohortti, johon kuului 247 potilasta. Hypermetylaatiota WIF-1 havaittiin virtsaan ja seerumin näytteiden 26,7% ja 32,6% tapauksista ja 1,3% ja 1,3% verrokkiyksilöitä, vastaavasti (p 0,001 ja p 0,001). Yhdistelmä seerumin ja virtsan nosti neoplasia havaitsemismäärä 47,8% tapauksissa, verrattuna 2,5% kontrolleissa (taulukko 2). Metylointi taso oli huomattavasti koholla tapauksissa verrattuna kontrolleihin joko seerumista tai virtsasta näytteet (kuvio 1). Eroa ei löytynyt eri vaiheissa peräsuolen syövän mukaan American sekakomitean Cancer luokittelusta.

Ulosteen mikrobiston dysbiosis pitkälle adenoomien ( 10 mm) ja peräsuolen syövän

ulosteen mikrobiston koostumus oli käytettävissä kaikki asiat ja on esitetty taulukossa 3. Kun kyse potilaiden ulosteen mikrobisto dysbiosis leimasi suurempi tiheys kuuluvia lajeja

Bacteroides /Prevotella

ryhmä vs. valvontaa. Ottaen huomioon kaikki henkilöt yhdessä,

Bacteroides /Prevotella

ryhmä ei liittyy ikään (r = 0,09; p = 0,62) tai BMI (r = 0,20 ja p = 0,24).

Kras mutaatio analyysi ulostenäytteissä

Kras mutaatioiden (eksoni 12 ja 13) ulostenäytteissä todettiin 16 (18%) potilailla, joilla on kehittynyt kasvain verrattuna 16 (10%) yksilöt kontrolliryhmässä. Herkkyys ja spesifisyys olivat 17,8% ja 89,8% ja b Kras mutaatioita, vastaavasti. Ei korrelaatio löytyi Kras mutaatiot ja mikrobiston muutokset tai WIF-1 metylointi aina kun katsottiin ulosteessa, veren tai virtsassa.

tarkkuus seulontatutkimuksia tunnistamiseksi kehittyneen neoplasia

Monimuuttujakalibrointi Syrjäisimpien alueiden kunkin parametrin läsnäolo kehittyneitä kasvainten esitetään taulukossa 4. monimuuttuja malli ikä-, miessukupuoli [OR = 2,02; CI95% (1,07-3,82), p = 0,03], historia polyyppien [OR = 0,24; CI95% (,11-+0,55), p = 0,001] ja sukuanamneesissa CRC [OR = 0,50; CI95% (+0,27-+0,95), p = 0,03) on itsenäisesti läsnäoloon liittyviä kehittyneitä neoplasia.

Kun ikä ja tulokset FOBT pidettiin samassa mallissa (malli 1) positiivinen FOBT oli itsenäisesti liittyy kehittyneitä neoplasia. Vastaavalla mallin tulokset virtsan tai seerumin WIF-1 metylointi testi (malli 2), positiivinen WIF-1 metylointi testi oli voimakkaasti yhteydessä kehittynyt neoplasia (alaraja on 95% CI: 18,7). Säätö sekä FOBT ja virtsan tai seerumin WIF-1 metylointi testi (malli 3) osoitti, että virtsan tai seerumin WIF-1 metylointi testi jäi vahvasti sidoksissa kehittyneiden neoplasia (alaraja 95% CI: 14.41), kun taas FOBT ollut enää merkittävä.

Kun ikä ja ulosteen mikrobiston dysbiosis pidettiin vain

Bacteroides /Prevotella

ryhmässä oli kehittynyt neoplasia (malli 4). Kun ulosteen mikrobiston dysbiosis ja tulokset FOBT pidettiin samassa mallissa (malli 5), vain FOBT liittyi kehittynyt neoplasia.

Osuus kunkin mallin laajennettuihin neoplasia ennusteen

sovituksen hyvyys on ennustemalli, joka sisältyy vain ikä ja FOBT oli riittävä (

p

arvo Hosmer Lemeshowin tilastollinen = 0,58). Kuten taulukosta 4, tarkkuutta (arvioitu C-tilasto) kyseisen mallin oli huomattavasti pienempi kuin virtsan ja /tai seerumin WIF-1 metylointi testi (malli 2 lisäsi C-tilaston 8,6%). Tämä parannus (arvioitu C-tilastot ja Net uudelleenluokittelu Improvement Index) oli merkitsevästi korkeampi malli, joka yhdistetään virtsan ja /tai seerumin WIF-1 metylointi testi ja FOBT (malli 3 kasvatti C-tilaston 9,8% ja NRI 22,8%). Testaus ulosteen mikrobiston dysbiosis (malli 4) oli tarkkuus samanlainen FOBT. Yhdistäminen FOBT ja testaus ulosteen mikrobiston dysbiosis ei lisännyt jälkimmäinen tarkkuutta (malli 5 ei lisännyt C-tilaston ja NRI).

Keskustelu

CRC on merkittävä syy kuolleisuuden ja taloudellinen taakka kehittyneissä maissa. Pyrkimys vähentää kuolleisuutta taudin on johtanut kansanterveysjärjestelmien etusijalle massa seulontoja käyttämällä FOBT oireettomilla yksilöitä. Itse asiassa on osoitettu, että FOBTs vähentää CRC-liittyvä kuolleisuus [7], [8], [9], [10]. Vaikka immunokemiallinen mittaus hemoglobiini on osoitettu olevan herkempiä kuin FOBT samanlaisia ​​spesifisyys, suuri määrä henkilöitä, jotka ovat haluttomia suorittaa ulosteen testi voi rajoittaa sen käyttöä. Tehokkuus Tällaisten strategioiden riippuu pääasiassa hyväksynnän ja kustannustehokkuuden Seulontamenetelmän. Tässä asetelmassa, veren ja virtsan testaus voidaan käyttää yksilöiden mahdollisesti halunnut esittää sen ulosteesta testaus.

Tässä tutkimuksessa vertasimme diagnostinen suorituskyky metyloitua WIF-1, erittyvä antagonisti Wnt-signalointireitin , biomarkkerina kehittyneiden kolorektaalisen neoplasian ulosteessa, seerumissa ja virtsanäytteitä. Olemme myös kliinisiä piirteitä seulontaan ja suorittaa mahdollisille FOBTs kuin kultakantaan. Olemme havainneet, että metyloituja WIF-1 oli korkein diagnostinen suorituskyky ennustaa pitkälle neoplasia verrattuna kliinisiä piirteitä, FOBTs ja mikrobiston muutokset, yksin tai yhdistelmänä. Tämä havainto on erittäin kiinnostava, koska huomattava määrä potilaita laskevan suorittamaan FOBT [31].

Niinpä varten FOBT suorituskykyä tässä tutkimuksessa, WIF-1 käytettiin korjata puutteet FOBT koska sen kaltaiset diagnostinen suorituskyky, jossa 47,8% herkkyys ja 97,5% tarkkuus. Kolorektaalisyöpä neoplastiset solut ovat osoittautuneet suurelta paradigman takia heterogeenisyys molekyylitason reittejä osallisena niiden kehittämiseen [32], [33], [34], [35]. Useimmissa tapauksissa alkuperäisen genomisen muuttaminen

APC /Wnt

signalointireittiä seuraa kertyminen lisää kuljettajan mutaatioita [36]. Tämä suhde on johtanut tutkijat uskovat, että yksi DNA-markkeri voi olla arvokas markkeri CRC seulontaan. Tutkimuksessamme seulontaan Kras mutaatioiden ulostenäytteissä on vahvistanut tätä oppia näyttämällä hyvin erityinen, mutta hyvin heikosti herkkä tuloksia. Käyttää ulosteiden DNA paneeli 21 geenimutaatioita osoitti suurempi herkkyys kuin FOBT mutta on merkittävä kustannustekijä rajoitus [12]. Detection of aberrant metylaation on äskettäin osoitettu olevan herkempiä kuin geenimutaatioiden havaitsemiseksi [37]. Lisäksi poikkeava metylaatioita voitaisiin myös havaita verenkierrossa DNA, kuten todettu ulosteessa, seerumin, virtsan ja muiden kehon nesteiden [39]. Tässä tutkimuksessa osoitetaan, että WIF-1 metylointi testi on tarkka merkki kehittyneitä kolorektaalisen neoplasian alustavia arviointeja. Lisäksi olemme osoittaa, että virtsassa tai verinäytteistä voidaan käyttää määrittämään metylointi tasolla. Erityisesti tämä merkintä voidaan käyttää henkilöillä, jotka ovat haluttomia suorittaa ulostetestit. Erityisesti suorituskyky FOBT paljastaa alemman herkkyyden kuin aiemmin raportoitu. Tämä ero voi selittyä valinta ensisijainen tulos, jotka ovat mukana potilaita, joilla on edennyt kasvain, joka on paljon enemmän merkitystä kliinisessä käytännössä ja tutkimuksessa väestö, jotka ovat mukana potilaita, joiden keskimääräinen tai korkean riskin CRC. Tämä ero voidaan selittää laajentamalla tuloksista potilaille, joilla on edennyt kasvain, joka on paljon luotettavampi kliinisessä käytännössä ja tutkimuksessa väestö mukaan lukien potilaat, joilla on keskimäärin suuri riski CRC. Kuitenkin ulottuu tällaisen testin massa seulontaohjelmiin edellyttää lisävalidointia oireettomilla ihmiset sekä kustannustehokkuus analyyseja simulointimalli aiemmin raportoidun [38].

Lisäksi parantaa tarkkuutta laboratoriotutkimukset ennustamiseen neoplasioiden aikana colonoscopies, tutkimme merkkiaineiden mikrobiston, josta on tulossa uusi alue ihmisen sairauksien tutkimuksiin. Osuus suoliston mikrobiston CRC kasvaimien syntyyn on nyt täysin hyväksytty [39]. Suurikapasiteettisten sekvensointitekniikoilla ihmisen microbiome on käytetty tutkimaan muutokset bakteerien fylogeneettisiin ydin kuin terveillä henkilöillä ja CRC potilailla, joko ulosteessa tai limakalvoon liittyvä mikrobiston [21], [22]. Useat bakteerit ryhmät, eli

Bacteroides /Prevotella

[21],

Fusobacterium

,

Faecalibacterium

ja erityisesti

Coriobacteridae

ja

Roseburia laji

[22], on osoitettu liittyvän CRC, ja kokeellisissa malleissa ovat tukeneet tätä syy hypoteesia [24].

Fusobacterium nucleatum

kantojen on osoitettu edistävän peräsuolen syövän synnyn kun hyökkäys epiteelisolujen tuottamalla genotoxin liittyvien suoran DNA-vaurion tai indusoimalla tulehdus [23], [40], [41]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme vahvistaneet erityinen dysbiosis liittyy kehittynyt peräsuolen kasvain ominaista suurempi tiheys kuuluvia lajeja

Bacteroides /Prevotella

ryhmä. Kuitenkin tämä tulos ei parantunut seulonta suorituskykyä FOBT tai WIF-1 testaus. Jatkotutkimuksissa käyttäen syvemmälle sekvensointi menetelmiä ja /tai metagenomic lähestymistapoja ovat perusteltuja, jotta seulontatyökaluna perustuu ulosteen mikrobiston.

Johtopäätös

Tässä tutkimuksessa havaitseminen metyloitua WIF-1 ulosteessa, virtsa- tai seeruminäytteitä on korkeampi diagnoosi tarkkuus havaitsemaan kehittyneet neoplasia verrattuna FOBT (0,90 [+0,84-+0,94] vs. 0,83 [0,77-0,88], p = 0,02). Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään, ovatko muutokset mikrobiston voisi olla biomarkkerit kehittyneiden kolorektaalisen neoplasian, erityisesti käyttämällä ehdokas bakteereja ja metagenomic tutkimuksia. Seerumin ja virtsan WIF-1 metylointi testejä voitaisiin käyttää yksilöt haluttomia käymään ulosteesta testaus ja tulisi nyt arvioida yhteydessä seulonnan.

tukeminen Information

Kuva S1.

tehokkuus alukkeiden kohdegeenien (Wif1, ALX-4 ja vimentiinista) ja siivous geeni (Albumiini BSP) käytetään metylaation kvantifiointiin käyttäen sarjalaimennoksia metyloitu muunnetun DNA ohjaus. Datapisteen kolme itsenäistä analyysiä tehtiin. Yhtälö regressioanalyysin käyrä sekä korrelaatiokerroin on merkitty kunkin kaavion.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0099233.s001

(DOC) B Taulukko S1.

Metyloidut geeni kohdistettuja alukkeita ja koettimia.

doi: 10,1371 /journal.pone.0099233.s002

(DOCX) B Taulukko S2.

Group ja lajikohtaisia ​​16S rRNA kohdistettuja alukkeita ja koettimia.

doi: 10,1371 /journal.pone.0099233.s003

(DOCX) B Taulukko S3.

Kras mutaatio alukkeita ja koettimia.

doi: 10,1371 /journal.pone.0099233.s004

(DOC) B

Kiitokset

Haluamme kiittää M. Goossens , K. Leroy, R. Inchitti, B. Coste, B. Ghaleh-Marzban, O. Montagne, ML. Auriault, MT. Chaumette, S. Vialette, F. Bouabbas, J. Francese, R. Jian, T. Aparicio, D. Abdelrahman, H. Hagège, A. Courillon Mallet, JL. Dupas, R. Benamouzig, M. Cavicchi, Cl. Altman, E. Zrhien, G. Tordjman, F. Venezia, F. Uzzan, D. Gilot, P. De Fleury, M. Algard, M. Prieto, M. Petit, J. Samama, D. Lucienne, JC. Delchier, M. Levy, ja A. Charachon heidän hyödyllistä panosta tässä tutkimuksessa.