Krooninen sairaus

tiivistelmä

KRAS

on mutatoitunut -40% paksusuolen syövän (CRC), ja siellä on rajoitettu tehokkaita hoitoja kehittynyt

KRAS

mutantti CRC. Siksi on tärkeää, että alavirtaan välittäjiä onkogeenisten KRAS edelleen tutkittu. Havaitsimme p190RhoGAP olevan fosforyloidun DLD1 CRC-solulinja, joka ilmentää heterotsygoottinen

KRAS

G13D alleeli, eikä DKO4, jossa mutantti alleeli on poistettu somaattisten rekombinaatiolla. Olemme havainneet, että kaikkialla sitomiskumppanin p190RhoGAP, p120RasGAP (RasGAP), ilmaistaan ​​paljon pienempi tasoilla DKO4 soluissa verrattuna DLD1, ja tämä ekspressio säädellään KRAS. Rescue of RasGAP ilmentymisen DKO4 pelastettiin Rho-reitin aktivaatio ja osittain pelastettiin tuumorigeenisyyden in DKO4 soluissa, mikä osoittaa, että yhdistelmä KRAS ja RasGAP ilmaisu on tärkeää näiden fenotyyppejä. Voimme päätellä, että RasGAP on tärkeä efektori KRAS CRC.

Citation: Organ SL, Hai J, Radulovich N, Marshall CB, Leung L, Sasazuki T, et ai. (2014) p120RasGAP Onko sovittelija Rho Pathway Aktivointi ja tuumorigeenisyystesti että DLD1 peräsuolen syövän Cell Line. PLoS ONE 9 (1): e86103. doi: 10,1371 /journal.pone.0086103

Editor: Juliet Spencer, University of San Francisco, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 lokakuu 2013; Hyväksytty: 05 joulukuu 2013; Julkaistu: 21. 2014

Copyright: © 2014 Organ et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee osaan avustuksia Kanadan Institutes of Health Research MOP-64345 (MST), Cancer Research Society of Canada (MI), ja Ontario terveysministeriön ja pitkäaikaishoidon. SLO tukevat CIHR Banting ja Best Doctoral Research Award. MI omistaa Kanadan Research Chair in Cancer Rakennebiologia. MST on M. Qasim Choksi professuurin Keuhkosyöpä Translational Research. UHN NMR laitos tukee Kanadan Foundation for Innovation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pohjois-Amerikassa, peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin syöpä miehillä ja naisilla. Vuonna 2013, on arvioitu, että yli 100000 uutta tapausta diagnosoidaan Yhdysvalloissa, jolloin yli 50000 kuolemantapausta [1]. Vaikka kuolleisuus peräisin peräsuolen syöpä on vähentynyt 3% viimeisten kymmenen vuoden aikana [1], etäpesäkkeitä, näkyvimmin maksaan, kehittyy 30%: sta 40%: CRC potilaista, ja 50% kuolee CRC toistuminen [2]. Kirurginen resektio on standardi hoitoon alkuvaiheessa CRC, mutta rajoitettu tehokas hoidot ovat käytettävissä kokeneille potilaiden [3]. Kehittäminen CRC liittyy monivaiheinen prosessi, jossa kertymistä sekä geneettisten ja epigeneettisten muutoksia, mukaan lukien muutokset on KRAS reitin [4].

KRAS

aktivoivia mutaatioita esiintyy noin 40-50% CRC, yleisimmät mutaatiot löydettiin kodonissa 12 (-80%) ja kodonin 13 (-20%).

Tällä hetkellä , uusin hyväksytty hoitoja CRC ovat kanssa kohdennettuja epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) estäjien, kuten setuksimabi ja panitumumabia, yhdistettynä kemoterapia. Kuitenkin vain potilaille, joilla on villin tyypin

KRAS

koituu huomattavaa kliinistä hyötyä tästä hoidosta, kuten ne, joilla on

KRAS

mutaatiot eivät näytä merkittävästi eloonjäämishyötyä [5]. Siksi nykyiset tutkimukset pyritään löytämään uusia alavirran efektoreita mutantti

KRAS

joita voidaan käyttää yhdessä estämään signalointi tästä reitin.

aktiivisuutta villin tyypin RAS läheisesti ohjataan perheille GTP-aasin aktivoivat proteiinit (GAP), jotka inaktivoivat RAS helpottamalla hydrolyysin sitoutuneen GTP, ja GTP vaihto tekijät (GEFs), joka vapauttamisen helpottamiseksi hen niin, että RAS voi jälleen sitoa GTP [6]. Suuren perheen RasGAPs, jotka ovat nyt tunnettuja, yksi varhaisimmista tunnistettu ja laajimmin tutkituista on p120RasGAP, tai yksinkertaisesti RasGAP, tuote

RASA1

geenin [7], [8]. Häiriöt

RASA1

geeni hiirissä johtaa alkion kuolleisuutta klo E10.5, koska poikkeava verenkiertoelimistön kehitys [9]. Siirtogeenisen hiiren alkioiden luotu RNAi-välitteinen

RASA1

Knockdown ES-soluissa osoitti, että vakavuus verisuonten vikoja korreloi tason jäljellä RasGAP ilmaisun, ja mosaiikki alkiot kehittävät lokalisoitu vikoja [10]. Yhdenmukaisesti näiden hiiren tutkimusten mutaatiot

RASA1

geeni on yhdistetty familiaalinen kapillaari laskimoepämuodostuma oireyhtymiä, jotka voivat aiheuttaa monenlaisia ​​fenotyyppejä, yleisimmin joka tunnetaan ”portviini tahra” [11] , [12], [13], [14], [15]. Viimeaikaiset proteomiikka analyysi näistä ihovaurioita olivat pysyvästi vähentynyt ilmentyminen RasGAP verrattuna ympäröivään terveeseen kudokseen [16]. Tämä yhdessä viittaa siihen, että

RASA1

keskeinen rooli angiogeneesissä ja verisuonten kehitystä. Vaikka proteiinin modulaatio RasGAP on havaittu useita kasvaimia, mukaan lukien krooninen myelooinen leukemia [17], astrosytooma [18], trophoblastic kasvaimia [19], eturauhassyöpä [20], maksasyöpä [21], ja tyvisolusyöpä [22 ], proteiini tasot eivät välttämättä ole todettu korreloivan RAS aktiivisuutta tai syövän vakavuuden [22], [23]. Siksi rooli RasGAP syövän on vielä selvittämättä.

SH2-SH3-SH2 domain konfiguraatio N-terminaalista aluetta RasGAP on pitkään ehdottanut tutkijat että RasGAP voisi olla rooli signalointi sovitin proteiini, edistämällä, samoin kuin on riippumaton, sen GAP aktiivisuus [7], [24]. Mikä tärkeintä, näillä aloilla havaittiin sitoutuvan tyrosiinifosforyloidulla p190RhoGAP (jota tässä kutsutaan RhoGAP) vastauksena ylävirran kinaasiaktiivisuutta ja soluadheesion [25], [26], [27]. Tämä havainto mikäli ensimmäinen mekanistinen näyttöä yhteys RAS aktivaation ja Rho-reitin signalointi. Ryhmämme on äskettäin todennut, että RhoGAP tulee tyrosiinifosforyloitunutta alavirtaan c-MET signaloinnin DLD1 mutantti

KRAS

CRC solulinjassa [28]. Siksi pyrittiin määrittämään roolia aktiivisen KRAS että RhoGAP-RasGAP vuorovaikutus, ja vaikutus tämän vuorovaikutuksen CRC kasvainsoluissa.

koemenettelytavat

Soluviljely

DLD1 (ATCC, Manassas, VA) on paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinja, joka on heterotsygoottinen G13D

KRAS

mutaatio. DKO4 solut, jotka ovat peräisin DLD1 hajottamalla mutantti

KRAS

alleelin somaattisten rekombinaatiolla [29]. Molemmat solulinjat kasvatettiin rutiininomaisesti Dulbeccon modifioidussa Eagle-media (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS).

Modulation geenin ilmentymisen

RASA1 yli-ilmentävät lentivirusvektorilla rakennettiin käyttäen Gateway uudelleenyhdistelyjärjestelmässä (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA). Entry vektori sisälsi joko CMV-promoottorin tai RASA1 ORF (OpenBiosystems, ThermoScientific, Ottawa, ON) on rekombinoitua Plenti-CMV-GFP-DEST vektori (Addgene plasmidi 19732) luomalla pLentiCMV ja pLentiRASA1. HEK293T-solut transfektoitiin näillä Plenti vektoreita ja lentiviral pakkaus vektorit kuten aiemmin on kuvattu [30]. Viral supernatantit kerättiin, suodatettiin ja käytettiin infektoimaan kohdesolut, kun läsnä oli 4 ug /ml polybreeniä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). 72 tuntia transduktion jälkeen solut lajitellaan GFP: n ilmentymisen. KRAS mutantti yli-ilmentyminen, retroviruksia tuotettiin transfektoimalla Phoenix ekotrooppisille pakkaus solut retrovirusvektorin pBabepuro sisälsi joko villin tyypin KRAS-4B, mutantti

KRAS

konstruktioita, tai tyhjän vektorin käyttämällä FuGENE 6 transfektioreagenssia (Promega, Madison, WI). Retroviruksen supernatantit kerättiin, kuten edellä, ja solut valittiin 0,5 ug /ml puromysiiniä (ICN Biomedicals, Irvine, CA), kunnes ei-transfektoituja ohjaus solut elossa.

immunosaostus ja Western-blottaus

solut hajotettiin 1% Triton-X 100 puskuria (1% Triton X-100, 10% glyseroli, 50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCI2, 10 mM natriumpyrofosfaatti, 100 mM NaF, 10 mM Na

4P

2O

4, 1 mM EDTA, 1 mM natriumortovanadaattia plus täydellinen mini EDTA-vapaata proteaasi inhibiittoritabletti (Roche, Laval, QC), seistä jäillä 10 minuuttia ja sitten kirkastetaan sentrifugoimalla 14000 g: llä 4 ° C: ssa 30 min. proteiinipitoisuus standardointi suoritettiin käyttäen Bradford-proteiinimäärityksellä reagenssia (Bio-Rad, Hercules, CA). Katso immunosaostukset, proteiinipitoisuus tasoittuvat joukossa näytteitä, ja lysaatit yhdistettiin 2-5 ui vasta-aineen ja annettiin rock yön yli 4 ° C: ssa. 30 ui proteiini G PLUS-agaroosi-helmiä (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) yhdistettiin lysaatit ja ravistettiin 1 h ajan 4 ° C: ssa. Immunosaostettiin proteiinit pestiin sitten 3 x hajotuspuskuria, eluoitiin 20 ui 2xSDS näytepuskuria ja keitettiin 5 minuutin ajan. Koko solun lyates normalisoitiin proteiinipitoisuus yhdistettynä 6xSDS näytepuskuriin ja keitettiin 5 minuutin ajan samoin. Lysaatit ladattiin sitten 4-20% gradientti SDS-polyakryyliamidigeelillä (Bio-Rad) ja ajettiin 120 V: Geelit siirrettiin PVDF-membraaneille ennen estetty joko 5%: n kuiva kuorittua maitoa TBST tai 5% BSA TBST: ssä ja 1 tunti huoneen lämpötilassa ja sitten tutkittiin yön yli tarvittaessa vasta-aineen. Westernit koetettiin sopivan sekundäärisen vasta-aineen, reagoimaan ECL prime (GE Healthcare, Piscataway, NJ) ja altistettiin XRAY kalvoa riittävästi aikaa. Vasta-aineita käytettiin suunnattu: RasGAP klooni B4F8 ja antifosfotyrosiinivasta-klooni 4G10 (EMD Millipore, Billerica, MA), p190A-RhoGAP (Cell Signaling, Danvers, MA), GAPDH ja KRAS 4B klooni F234 (Santa Cruz Biotechnology).

Quantitative Real-Time PCR

Kokonais-RNA (1-2 ug) eristettiin solulinjoista ja kudoksista käyttäen Qiagen RNeasy (Qiagen, Hilden, Saksa) ja sen käänteistranskriptoituneet käyttäen Superscript III käänteistranskriptaasia (Invitrogen, Life Technologies, Burlington, ON). 10 ng vastaava cDNA käytettiin kutakin kvantitatiivinen PCR (qPCR) määritys suoritettiin Stratagene Mx3000p Sequence Detection System käyttäen SYBR green 2 x master mix. Käytetyt alukkeet ovat:

GAPDH F – CCCCCACCACACTG,

GAPDH R – GCCCCTCCCCTCTTCAAG

RPS13 F – GTTCTGTTCGAAAGCATTG

RPS13 R – AATATCGAGCCAAACGGTGAA

RASA1 F – GGACGAAGGTGACTCTCTGGAT

RASA1 R – GGAGGAGCGGTCAACGGTAT

KRASF – CAGGCTCAGGACTTAGCAAGAAG

KRASR-TGTTTTCGAATTTCTCGAACTAATGTA

Ennustettu PCR-tuote sekvenssit varmistettiin käyttämällä BLAST tunnustamista kohde- ja ei-kohdesekvenssien. Tulokset analysoitiin käyttämällä delta-delta Ct menetelmä, normalisoi vastaan ​​keskimäärin kaksi taloudenhoito geenejä.

Solumääritykset

Cell laskenta.

5 x 10

3-solut levytettiin täysin seerumivähennysväliainetta, kolmena kappaleena, 5 päivää laskennan 24-kuoppalevyllä. Alkaen 72 tunnin kuluttua pinnoitus, 3 kuoppiin kunkin solulinjan trypsinoidaan ja sitten laskettiin käyttäen Beckman Coulter Z2 solulaskijalla (Beckman-Coulter, Brea, CA).

Soluadheesioanalyysi.

1 x 10

5-solut ympättiin 24-kuoppaiselle päällystetty malja 0,01% PureCol kollageenia (Sigma-Aldrich) 15 minuutin ajan. Kuopat värjättiin 0,2% kristallivioletilla ja lyysattiin 0,1% Triton X-100. Lysaattia luettiin 590 nm: ssä Tecan XFlour4 levylukijalla (Mannedorf, Sveitsi).

Cell motiliteetti määrityksessä.

7 x 10

4 solut maljattiin 70 ui täyden seerumin median kummallakin puolella olevan μ-astia soluviljelyinsertissä (Ibidi, Planegg, Saksa) 24-kuoppaisen soluviljelylevyn levylle ja annettiin kasvaa 72 tunnin ajan tai kunnes yksisolukerros oli saavutettu. Insertti poistettiin ja elatusaine vaihdettiin seerumittomassa DMEM. Vaihekontrasti kuvat hankittiin Zeissin Axio Observer käytettiin ottaa valokuvan 32 x suurennus tässä vaiheessa (aika 0) ja 24 tunnin välein sen jälkeen. Kuva-analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [31]. Image-Pro Plus ohjelmisto (MediaCybernetics, Rockville, MD) käytettiin analysoimaan arpeutumisprosessit määrityksissä. Reuna ja segmentointi suodattimia, joiden suurista pikseli-intensiteetti muunnelmia (solut) vaalea, kun taas tasainen kuva-alueet (haava) ovat tummia. Suodatettu kuva muutettiin sitten binaarikuvan käyttämällä pikselin kynnys ja haavan pinta-ala määritettiin laskemalla summa pikselien osoitettu. Pikseli summa ilmaistiin prosenttia haavan sulkemiseen, jossa nolla pikseliä haava edustaa 100% sulkeutumiseen.

Immunofluoresenssikoe

Lasi kammio diat (BD Biosciences, San Jose, CA) päällystettiin yön 4 ° C: ssa 0,01% kollageenia PBS: ssä. Trypsanised solut suspendoitiin uudelleen DMEM: iin + 5% BSA: ta, maljattiin dioja ja annettiin kiinnittyä yön yli. Objektilasit pestiin sitten kerran PBS: llä ja kiinnitettiin paraformaldehydillä 20 minuuttia huoneen lämpötilassa. Solut permeabilisoitiin 0,01% Tween-20 PBS: ssa 20 min, blokattiin 3% BSA: ta PBS: ssä ja värjättiin 1:300 rodamiinifalloidiinia 1 h huoneen lämpötilassa. Lasipeitinlevyjä levitettiin Vectashield sisältävien DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) tumavärjäystä. Kuvat esitetään tässä otettiin 43 x suurennus immersioöljyobjektiivilinssillä objektiivi Zeiss LSM 700 -konfokaalimikroskoopilla.

CRC Näytekokoelmatodistuksen

Patient kudosnäytteitä saatiin UHN pikajäädytettiin kudospankille hyväksynnän jälkeen UHN tutkimuseettiseltä. Kaikki kudokset kerättiin 30 minuutin kuluessa resektion ja snap-jäädytettiin nestetypessä samoin kuin on formaliinilla ja parafiiniin upotetut (FFPE), ja niiden laatu on varmistettu histologia. Kudokset sisältyy 63 ensisijaista kolorektaalisyövissä ja 30 metastasoituneen kolorektaalisyövissä. Metastaattiset kasvaimet olivat maksan (22 tapausta) ja keuhkoissa (8 tapausta) metastasectomy yksilöitä.

RASA1 mutaation analyysi

cDNA eristettiin potilaan kudoksiin solulinjoja edellä kuvatulla tavalla kokonais-RNA.

RASA1

cDNA amplifioitiin ensin 6 alukkeiden sarjaa kattamaan pituus geenin, ja sekvensointi suoritettiin monistetun DNA: n kanssa, nämä samat vastaavat alukkeita, jotka ovat seuraavat:

F1 – CTCAGCCTGGGGAGCTGAAGG

R1 – TGGAGGAGCGGTCAACGGTATG (bp 2-649) B

F2 – GGCCTCGGGACAGTGGACGA

R2 – GGGCCTCACAAGAAAACTGCAGAC (bp 563-1252) B

F3-AGGTGGGCCGGGAAGAAGATCC

R3-TCCAATCCTCTGCTTGTTCTGGAGT (bp 1131-1823) B

F4-TGGCAGGCCAAACTGTTTTCAGA

R4-TGCTGGCCAGTAGTGTTCGGT (bp 1723-2381) B

F5-CCGAACACTACTGGCCAGCATCC

R5 – TGACACCTTCCATGTAGGGCTCC (bp 2362-2987) B

F6-CGACTCATCTGTCCTGCCATCCT

R6 – CTGGGGCGAAGGCTGCTACC (bp 2825-3277) B

PCR-monistaminen, 0,3 ul kukin eteenpäin ja reverse-alukkeita (50 uM) lisättiin 6 ui cDNA: ta (20 ng /ul), 12,5 ui 2x Taq valitsemalla DNA-polymeraasia, 0,2 ui 25 mM dNTP ja erittäin puhdasta vettä (Sigma-Aldrich) ja kokonaistilavuudessa 25 ui kutakin reaktiota. Pyöräily olosuhteet olivat: 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 39 sykliä, joissa denaturointi 95 ° C: ssa 45 ”, hehkutus 64 ° C: ssa 45”, ja pidennys 72 ° C: ssa 1 min, 10 minuutin inkuboinnin 72 ° C, minkä jälkeen 4 ° C: ssa. 5 ui PCR-tuote tarkastetaan 2% agaroosigeelillä. PCR-tuote puhdistettiin kanssa ExoSAP-IT (Affymatrix, Santa Clara, CA).

vahvistaa sekvensoimalla genomisessa DNA: ssa, samoja menetelmiä käytettiin edellä, käyttäen seuraavia alukkeita ja sekvenssin eksonissa 16 :

F – CGCTGCCAGTTGAGCCGATTACA

R – CTCTGGCATCATTGTGCTACTAAGC

Real-Time NMR GAP aktiivisuusanalyysiä

Merkityt GTPaasi verkkotunnuksen RAS 1-171 ekspressoitiin pET15b vektorit

E. coli

M9-alusta täydennettynä

15N ammoniumkloridia ja puhdistettiin Ni-NTA-affiniteettikromatografialla. His poistettiin trombiinikatkaisun ja monomeerisen GTPaasit puhdistettiin edelleen geelisuodatuksella (Superdex 75) [32], [33]. Näytteet väkevöitiin, ja tarvittaessa vaihdetaan NMR puskuriin (esim, 25 mM HEPES pH 7,0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl

2, 1 mM DTT: tä, ja 10% D

2O).

analyysillä luontainen GTP hydrolyysin, GTP-ladattu näyte valmistettiin inkuboimalla RAS-proteiinin (~ 10 min ajan 37 ° C: ssa tai pidempään huoneenlämpötilassa), kun läsnä on 10-kertainen molaarinen ylimäärä GTP ja 10 mM EDTA: ta [34 ]. Seuraavat vaihto, MgCl

2 lisätään lopulliseen pitoisuuteen 20 mM vakauttaa vasta sitoutuneen nukleotidin, ja näyte johdettiin geelisuodatus- tai suolanpoistopylväässä (PD MidiTrap ™ G-25 (GE Healthcare), joka oli tasapainotettu NMR puskuri poistaa ylimääräinen nukleotidi- ja eluoitunut näyte, joka sitten väkevöitiin nopeasti ja jäädytettiin.

Solut kerättiin kaapimalla mahdollisimman pieneen tilavuuteen (150 ui 10 cm: n levy) lyysipuskuria, kuten on kuvattu Western blotting, sitten poistetaan sentrifugoimalla lyhyen aikaa (16000 g: ssa 30 s), ja solun kokonais-proteiinin supernatantista analysoitiin käyttämällä Bradfordin määritystä reagenssia (BioRad) standardoida proteiinin määrää käytetään jokaisessa määrityksessä. konsentraatio 10-20 ug /ul kokonaisproteiinia lysaattia saavutettu ja 35 ug 3,5 ui lisättiin puhdistettua GTP-sidottu RAS fragmentti.

Tietojen keruu myöhemmin aloitettiin niin nopeasti kuin mahdollista. Puolet elämää reaktiot alun perin arvioitiin silmämääräisesti spektrien sitten osa GDP-sitoutunut GTPaasina läsnä kunakin ajankohtana arvioitiin useista paria huippuja ja tiedot sovitettiin yhteen eksponentiaalisesti vaimenemisfunktiota saamiseksi vaihtoon /hydrolyysinopeudet [35].

RAS aktiivisuuden määritys

Soluja seerumia 24 tunnin ajan, ja sitten määritettiin aktiivisen RAS käyttäen RAS aktivointi kit (Millipore) ohjeiden mukaan. Lyhyesti, solut hajotettiin 1 x MLB lyysipuskuria ja yhtäläiset määrät proteiinia sekoitettiin RAS-sitovan domeenin RAF1 fuusioitu glutathione-

S

-transferase ja kytketty glutationi-Sepharose-helmiin. Sen jälkeen kun keinutuoli 4 ° C: ssa 1 h, helmet pestiin samalla lyysipuskurissa ja suspendoitiin uudelleen 2 x SDS-näytepuskuriin. Western-blottaus eteni edellä kuvatulla tavalla.

ihonalainen tuumorigeenisyystesti määritys

Etiikka ja ohjausjärjestelmästä.

Kaikki käsittelyt tehtiin minimoimiseksi eläinten kärsimyksiä, protokollien mukaisesti hyväksymien Ontario Cancer Institute (OCI) animal Care komitea nojalla eläinten käyttöä protokollan numero AUP 736,9.

Vaikea yhdistää immuunivajavuustila (SCID) hiiriä kasvatettiin päällä ja saatu Ontario Cancer Institute (OCI, Toronto, oN). Miljoona solua injektoitiin ihonalaisesti oikeaan hartiaseudun 4- 6 viikon ikäisiä uros- SCID-hiirten (n = 5-8 per solulinja). Kun kasvaimet olivat kouraantuntuva ne mitattiin 3 päivän välein, kunnes inhimillinen päätepiste saavutettiin, joka oli joko silloin, kun kasvaimet saavuttivat 1,5 cm, tai kun he tulivat haavaumia siihen pisteeseen eläinten kärsimystä. Kasvaimen tilavuus mitattiin käyttämällä kaavaa (pituus x leveys

2) x π /6. Hiiret lopetettiin käyttämällä CO

2, hyväksymä OCI Animal Care komitea, kasvaimet irrotettiin, ja osuudet olivat joko jäädytettiin nestemäisessä typessä DNA ja proteiinin eristäminen tai kiinnitetty formaliinilla parafiiniupotusta ja immunohistokemiallisella värjäyksellä. Tilastollista analyysia, lineaarinen sekoitettu vaikutuksia (LME) mallia käytettiin sisällyttää suuri korrelaatio esiintyy keskuudessa tehdyt mittaukset samalla hiiren. Kaikki kasvaimen tilavuuden mittaukset olivat neliöjuureen transformoitu vakauttaa varianssi, ja Wald p-arvoa on käytetty osoittamaan merkitystä.

Tulokset

menetys RasGAP johtaa menetykseen RhoGAP fosforylaation

lisätutkimuksia roolin RhoGAP fosforylaation DLD1 soluissa, tutkimme sen vuorovaikutukseen RasGAP, yksi sen tärkeimmistä sitoutumispartnerit. Samalla, halusimme tietää, jos menetys mutantti

KRAS

että DKO4 isogeenisiin johdannainen solulinja olisi vaikutusta tähän vuorovaikutukseen. Huomasimme, että RhoGAP voi vain fosforyloitua DLD1 soluissa, ei DKO4, kun koko tasoa RhoGAP pysyvät ennallaan. Tämä fosforyloitu RhoGAP co-immunosaostettiin RasGAP (kuvio 1A). Lisäksi olemme havainneet, että ekspressio RasGAP ei ollut havaittavissa DKO4 solulinjassa (kuvio 1A). On raportoitu, että RasGAP fosforylaatio tapahtuu usein alavirtaan reseptorin tyrosiinikinaasin signaloinnin [18], [36], [37], [38], [39]. Olemme kuitenkin havainneet, että suuret tyrosiinifosforyloituu bändi, joka tulee näkyviin, kun immunosaostus RasGAP oli itse asiassa on ~190 kDa, todennäköisesti edustavat RhoGAP (kuvio 1A), mikä osoittaa, että RasGAP itsessään ei ole erittäin fosforyloitu näissä soluissa.

A) RhoGAP ja RasGAP immunosaostettiin DLD1 ja DKO4 soluja. Immunosaosteita alistettiin Western blotting ja koetettiin täydellistä fosfotyrosiinivasta, RasGAP ja RhoGAP. Western-blottaus kokosolulysaateista (A) ja rt-QPCR (C) käytettiin määrittämään proteiinin kokonaismäärän ja mRNA-tasoja vastaavasti näissä solulinjoissa.

RasGAP ilmentyminen on menetetty DKO4 soluissa

havaittu, että samalla kun DKO4 solulinja ilmaistuna juurikaan ole RasGAP proteiinia verrattuna DLD1, mRNA tasot

RASA1

geeni säilyi 50% alkuperäisestä solulinja (kuvio 1, B C). Suoritimme SNP paneelit tutkia mahdollisia kopioluvun muutoksia näiden isogeenisten solun paria. Olemme löytäneet hyvin vähän eroa kahdessa solulinjassa (määritystuloksia ei ole esitetty). Samanlainen tulos on äskettäin löydetty useita vaihtoehtoisia klooneja (DKO3 ja DKO1) johdettu DLD1 malli [40]. Mikä tärkeintä, ei kopiomäärä eroja havaittiin kromosomi 5q13.3, jotka osoittavat, että lasku mRNA tasolla DKO4 ei johdu kromosomi menetys.

RasGAP mutaatio CRC

Sitten etsittiin mutaatiot, jotka voisivat selittää erot RasGAP ilmaisun tasolla. Olemme sekvensoitiin sekä genomisen DNA: n ja cDNA: DLD1 ja DKO4 soluja. Olemme löytäneet heterotsygoottinen pistemutaatio genomisen DNA: n molemmissa solulinjoissa. Tämä C T siirtyminen on nonsense-mutaatio, joka koodaa R709 * muutos (kuvio 2, A B), joka sijaitsee välillä C2 ja RasGAP domeenit RasGAP. Jos mutatoitu geeni käännetty katkaistun proteiinin, joka on ~77 kDa olisi pitänyt havaittavissa Western blot käyttäen RasGAP vasta-ainetta, joka tunnistaa N-terminaalista osaa proteiinia. Emme kuitenkaan näe bändi tämän kokoisen missään solussa olosuhteissa.

A) Kromatogrammi osoittaa suhteelliset intensiteetit kunkin emäsparin jälkeen Sangerin sekvensointia sekä genomista että cDNA peräisin solulinjoista. B) Kuva sijainnin mutaation RasGAP proteiinin taso. C) RASA1 ekspressiotietojen johdetaan kaikista solulinjoista laajojen instituutin Cancer Cell Line Encyclopedia. Pylväät edustavat keskiarvoa.

Mielenkiintoista on, cDNA sekvensoinnin että DLD1 ja DKO4 solulinjat osoittivat, että DLD1 solulinja oli lähes kokonaan menettänyt ilmentymisen mutatoidun geenin, ekspressoivat ainoastaan ​​villityypin, kun taas DKO4 solulinjaa ylläpidetään 50% kustakin villityypin ja mutantti

RASA1

geenituote (kuvio 2A).

Etsimme läsnäolo C2330T mutaation primaarikasvaimen ja etäpesäkkeitä kudoksia CRC potilasta, mutta eivät pystyneet tunnistamaan tämä mutaatio missään meidän näytteitä. Kuitenkin pystyimme löytää tämä mutaatio kolmessa solulinjoissa päässä Broad-instituutin Cancer Cell Line Encyclopedia (https://www.broadinstitute.org/ccle) [41] on peräsuolen syöpä solulinjoja HRT18 ja HCT15, sekä virtsateiden syöpä solulinja 639 V. Tämä tarkoittaa sitä, että vaikka mutaatio on harvinaista, se on läsnä tiettyjen syöpien. Tämä mutaatio ei myöskään löydetty ihmisen SNP tietokanta, mikä tarkoittaa, että sitä ei löydy koko väestölle.

tutkimiseksi edelleen hypoteesia, että mutatoitunut

RASA1

transkriptio on epävakaa ja mahdollisesti hajonnut, vertasimme mRNA: n ilmentymisen tasot

RASA1

kolmen solulinjoja, jotka sisältävät C2330T mutaation jäljellä syövän solulinjojen Cell Line Encyclopedia. Nämä kolme solulinjat ilmentävät merkittävästi vähemmän

RASA1

kuin suurin osa muista syöpäsolulinjoja tietokannassa (kuvio 2C). Vaikka ei ole ratkaiseva, tämä näyttää osoittavan, että tämä lyhennetty mutaatio voivat näkyä alentuneena mRNA geeniekspression.

Nämä havainnot viittaavat siihen useita tasoja sääntelyn RasGAP, kaikki mahdollisesti seurauksena menetys aktiivisen KRAS in DKO4. Ensimmäinen, täydellinen puuttuminen mutantti p120RasGAP mRNA: n DLD1 solulinja havaita sekvensoimalla osoittaa, että joko mutantti alleeli ei transkriboida mRNA: ksi tässä solulinjassa, tai että mutantti-mRNA on hyvin epävakaa ja hajoaa heti niiden puhtaaksi. Mielenkiintoista on, että vaikka mutantti-mRNA oli läsnä DKO4 solulinjassa, 50%: n lasku yleisen

RASA1

mRNA-tasot havaittuna reaaliaikaisella qPCR viittaavat siihen, että tämä mutantti-mRNA: ta myös hajoaa, mutta ehkä ei niin nopeasti tai yhtä tehokkaasti kuin DLD1.

kaiken kaikkiaan näyttää siltä, ​​että menetys aktiivisen KRAS vuonna DKO4 vähentää painetta solun vakauttaa RasGAP ilmaisua sekä mRNA ja proteiini tasolla; Kuitenkin mekanismi, jolla proteiini tasot RasGAP säännellään näissä solulinjoissa in vielä tuntematon.

asetukseen RasGAP mRNA ilmentymisen KRAS

Täsmennetään roolia häviäminen mutantti

KRAS

in DKO4 pelaa ilmaus RasGAP, me vakaasti yli-ilmennetään pBabepuro (PBP) tyhjän vektorin, vektori, joka sisältää täyspitkän villityyppisen

KRAS

, tai vektori, joka sisältää

KRAS

kanssa pistemutaatiot kodonissa 12 (G12V tai G12D) tai kodonin 13 (G13D), in DKO4 soluissa. Oletimme, että G13D mutaatio on suurin vaikutus vakauttaa ja pelastamiseen RasGAP ilmaisun DKO4, koska tämä mutaatio on se, joka alun perin esiintyi tässä solulinjassa. Kuitenkin useista yrityksistä, olimme vain voi yli-ilmentymisen

KRAS

G12V mutantti geeni tässä solulinjassa (kuvio 3A). Yliekspressio G12V liittyi lisääntymiseen GTP-KRAS, odotetusti (kuvio 3C). Mielenkiintoista, lyhytaikaisella transfektiolla näiden konstruktien osoittivat, että KRAS pystyi yliekspressoituvan jopa 7 päivää transfektion jälkeen kaikki mutantit, mikä osoittaa, että pitkän aikavälin ilmentymisen KRAS rakentaa muiden kuin G12V ei ole sattunut DKO4. Yliekspressio

KRAS

G12V aiheutti merkittävän kasvun

RASA1

mRNA; mutta tämä lisäys ei ole havaittu proteiinin taso (kuva 3, B 0,001, * p 0,05.

edelleen koetin roolia aktiivisen KRAS vuonna RasGAP ilmaisua, me transfektoitiin ohimenevästi DLD1 soluja 11 erillinen shRNAs vastaan ​​

KRAS

. Löysimme merkittävä korrelaatio määrä

KRAS

pudotus ja lasku

RASA1

mRNA: n ilmentymisen verrattuna ei-spesifinen shRNA ohjaus (kuvio 3D). Nämä muutokset ei havaittu proteiinin taso (kuvio 3E). Sen varmistamiseksi, että KRAS shRNA Knockdown ei aiheuta merkittäviä muutoksia epäspesifistä geenejä, kuvio S1A esittää tasot kaksi taloudenhoito geenejä, joita ei vaikuta knockdown. Kuvio S1B esittää Western-blotteja, josta kuvio 3E on peräisin.

Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että menetys aktiivisen KRAS ollut osittaista rooli vakauden ja /tai ekspressiota

RASA1

mRNA, vaikka lisäjärjestelyjä läsnä jotka säätelevät proteiinin ilmentymistä tässä solulinjassa.

RasGAP yliekspressio pelastamiseen RasGAP aktiviteetti

sen määrittämiseksi, jos jokin fenotyyppien johtuvan menetyksen aktiivisen KRAS että DLD1 isogeenisistä solu linjat voidaan selittää menetys RasGAP proteiinin ilmentymisen, me yli-ilmentää RasGAP on DKO4 solulinjassa (kuvio 4A). Huolimatta kyky saada 100-kertainen mRNA yli-ilmentyminen RasGAP on DKO4 solulinjassa, tuloksena proteiinin tasot olivat samankaltaisia ​​kuin endogeenisen ilmentymisen DLD1 soluissa (kuvio 4D).

A) mRNA: n ekspressiota RasGAP jälkeen yliekspression in DKO4 soluissa verrattuna GFP vektorisäätö. B) Reaaliaikainen NMR-analyysi RasGAP toimintaa, osoittaa keskimääräinen nopeus GTP hydrolyysin (B) ja GAP aktiivisuus ajan (C). Jokainen käyrä (C) on peräisin yhdestä edustavasta kokeesta. Virhepalkkien (B): llä standardin keskivirhe (SEM). D) RAS aktiivisuuden määritys osoittaa tasoja aktiivista KRAS jälkeen RasGAP yli-ilmentymisen. Numerot merkitsevät densitometria-arvot tämän blot, joka on tyypillinen kolmesta biologisen rinnakkaista. E) RhoGAP immunosaostettiin solulinjoista, alistettiin Western-blottaus, tutkitaan sitten täydellistä fosfotyrosiinivasta, RasGAP ja RhoGAP.

Voit selvittää yliekspressio RasGAP ollut vaikutusta KRAS toimintaa, RAS aktiivisuusanalyysiä suoritettiin käyttäen Raf-RBD sidottu -agaroosihelmien immunopresipitoivan aktiivinen KRAS (kuvio 4D). Kuten on osoitettu aiemmin [40], KRAS yleinen oli vähemmän aktiivinen DKO4 soluissa verrattuna DLD1 soluihin. Näimme lievää, mutta selvän laskun KRAS aktiivisuuden DKO4 soluissa jälkeen

RasGAP

yliekspressio, mikä osoittaa, että RasGAP pystyy säätelemään villin tyypin KRAS in DKO4. Selventää edelleen roolia RasGAP näissä soluissa, käytimme reaaliaikainen NMR-määrityksessä sen määrittämiseksi, RasGAP toimintaa. Olemme havainneet, että tasot RasGAP aktiivisuus oli yhtäpitävä RasGAP proteiinin ilmentymisen (kuvio 4, B & C). Otteet DLD1 solujen nopeutetun RAS GTP hydrolyysin ~1.8 kertaiseksi, kun taas DKO4 uutteita, jotka oli sovitettu kokonaisproteiinipitoisuus herättänyt vaatimatonta 1,2 kertainen hydrolyysinopeus kasvaa. Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​läsnä perusaktiivisuutta muista RasGAPs. RasGAP yliekspressio DKO4 korotti tätä tasoa takaisin ~1.8 kertaiseksi.