Krooninen sairaus

tiivistelmä

Trabektediini (Yondelisin, ET-743) on meren johdettu tetrahydroisokinoliinista alkaloidi. Se on alun perin peräisin Karibian meren tunicate

Ecteinascidia turbinata

ja nykyään tuotetaan synteettisesti. Trabektediini tehoaa erilaisia ​​kasvainsolulinjoja kasvaa viljelmässä. Tässä tutkimuksessa keskityttiin vaikutus Trabektediinin soluproliferaatioon, solusyklin etenemistä, apoptoosin ja pallojakaantuminen muodostumista eturauhasen syöpä kantasolut (CSCS). Cluster erilaistumisen (CD) 133

+ korkea /CD44

+ korkea eturauhasen CSCS eristettiin DU145 ja PC-3 ihmisen eturauhassyövän solulinjaa kautta virtaussytometrialla. Tutkimme kasvua estäviä vaikutuksia Trabektediinin ja sen molekyylitason mekanismeja ihmisen eturauhasen CSCS ja ei-CSCS. DU-145 ja PC-3 CSCS käsiteltiin 0,1, 1, 10 ja 100 nM trabektediini 24, 48 ja 72 h ja kasvun inhibitio hinnat tutkittiin käyttäen palloja muodostavan määrityksessä. Anneksiini-V-määritys ja immunofluoresenssilla analyysit tehtiin havaitsemiseksi solun kuolemaan. Pitoisuudesta riippuva vaikutus Trabektediinin on solusyklin arvioitiin myös. Solut altistettiin eri annoksina Trabektediinin 24, 48 ja 72 h vaikutuksen arvioimiseksi Trabektediinin lukumäärästä ja halkaisija pallosia. Tulosten mukaan, trabektediinipitoisuus dun sytotoksisuuden ja apoptoosin IC

50 annosta, mikä johtaa merkittävään kasvuun ekspression kaspaasi-3, kaspaasi-8, kaspaasi-9, p53 ja vähentää ilmentymistä bcl-2 in annoksesta riippuvainen tavalla. Solusyklin analyysit paljastivat, että trabektediini indusoi annosriippuvaisen G2 /M-vaiheen solusyklin pysähtymiseen, erityisesti suurten annosten hoitoja. Kolmiulotteinen kulttuurin tutkimukset osoittivat, että trabektediini vähensi ja halkaisija pallosia of DU145 ja PC3 CSCS. Lisäksi olemme havainneet, että trabektediini häiritsi solu-vuorovaikutuksiin kautta E-kadheriinin in prostasphere DU-145 ja PC-3 CSCS. Tuloksemme osoittivat, että trabektediini estää solujen lisääntymistä ja kiihdyttää apoptoottisia tapahtumia eturauhasen CSCS; ja se voi olla mahdollisesti tehokas terapeuttinen aine eturauhassyöpää vastaan.

Citation: Acikgoz E, Guven U, Duzagac F, Uslu R, Kara M, Soner BC, et ai. (2015) Enhanced G2 /M pidättäminen, kaspaasi Related Apoptoosi ja alennetulla E-kadheriinin Dependent Intercellular Tartunta mukaan Trabektediini eturauhassyövän Stem Cells. PLoS ONE 10 (10): e0141090. doi: 10,1371 /journal.pone.0141090

Editor: Shian-Ying Sung, Taipei Medical University, Taiwan

vastaanotettu: 23 heinäkuu 2015; Hyväksytty: 03 lokakuu 2015; Julkaistu: 20 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Acikgoz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syövän kantasolut (CSCS) hypoteesi toteaa, että kasvaimet sisältävät vain pieni solujen ala- populaation kanssa mahdollisen itseuudistumisen ja erilaistumista. CSCS uskotaan olevan vastuussa kasvaimen aloitus ja ylläpito kasvaimen kasvua ja solujen eloonjäämistä kemoterapian jälkeen johtuen niiden vastustuskyky tavanomaisiin syöpähoitoihin [1]. Vuoden alkupuolella kasvainten kehittymiseen, CSCS voi käydä läpi symmetrinen uudistuva solunjakautumisen kahteen samanlaista tytär CSCS vaan tuottavat suurimman populaatiot kuin CSCS yksipuolinen solunjakautumisen [2]. Suurin osa soluista irtotavarana kasvaimissa on rajoitettu tuumorigeenisemmiksi ja metastaattista potentiaalia verrattuna CSCS. Tehokkaampaa syövän hoitoon, saattaa olla tarpeen kohdistaa sekä CSCS ja ei-CSC populaatioissa.

CSCS on aiemmin eristetty käyttäen CSC-spesifisiä solun pinnan markkereita, kuten CD44, CD133, CD24, α2β1 integriinin ja aldehydin dehydrogenase1. CD133 ja CD44 ovat yleisimmin käytetty solu

–

pintamerkkiaineita tunnistamiseen CSCS. CD133 on jäsenenä pentaspan transmembraanisen glykoproteiinien. Se oli ensimmäinen kuvattu hematopoieettisen ja hermoston kantasolujen /progenitorisolujen ja on myös markkeri CSCS monissa kiinteitä kasvaimia [3, 4]. CD44 on läsnä monen rakenne- ja monikäyttöinen pintaglykoproteiinille. Se liittyi solun tarttumiseen, muuttoliike ja etäpesäkkeiden erilaisten kasvainsolujen ja stemness sääntely CSCS [5]. Aiemmin on osoitettu, että CD44

+ /α2β1

korkea /CD133

+ fenotyyppiä edustavat ehdokas eturauhassyövän kasvaimia synnyttäviä soluissa [6]. Siksi CD133

+ /CD44

+ solut voisivat olla mahdollisia kohteita antituumorisessa terapiassa tulevaisuudessa.

Perinteiset yksikerroksista kaksiulotteinen (2D) soluviljelmätutkimukset ovat onnistuneet selittämään käyttäytymistä CSCS. Toisaalta, in vitro kolmiulotteisia (3D) syöpä malli jäljittelee ominaisuudet in vivo ympäristössä ja tarjoaa siksi paremman mahdollisuuden ymmärtää ratkaiseva syövän kantasolujen mekanismeja ja kehitetään uusia kliinisiä terapeuttisia sovelluksia [7]. In vitro, CSCS yleensä spontaanisti muodostaen kolmiulotteisia soluaggregaateiksi, nimeltään pallosia, jotka edustavat erilaistumista ominaisuudet CSCS ja käytetään edistää kasvaimen sukupolven, etenemistä ja kemoterapian resistenssin useissa tutkimuksissa. On osoitettu, että E-kadheriinin on suuri adheesiomolekyyli välittävä tiukka solu-solu-vuorovaikutus, ja se on korreloitu kompakti sferoidin muodostuminen eturauhassyövän solulinjoissa [8, 9].

Trabektediini on meren tetrahydroisokinoliini alkaloidi. Trabektediini on eristetty Karibian meren tunicate

Ecteinascidia turbinata

ja se on tällä hetkellä tuotetaan synteettisesti [10]. Trabektediini on voimakas sytotoksinen aktiivisuus erilaisia ​​kasvaintyypeissä useissa kiinteiden kasvainten

in vitro

ja

in vivo

. Se käy läpi vaiheen I ja II kliinisissä kokeissa Euroopassa ja Yhdysvalloissa lupaava syöpälääkettä hoitoon erilaisia ​​kasvaimia [11]. Kuitenkin syövän vastaista aktiivisuutta ja vaikutusmekanismi on epäselvä. On osoitettu, että trabektediini sitoutuu N2 asema guaniinit, että pieneen uraan DNA, taivutus DNA kohti suurten uran ja häiritsee useiden transkriptiotekijöiden ja DNA: n korjaus polkuja [11]. On myös tunnettua, että trabektediini aiheuttaa DNA-vaurioita. Tämä muuttaa normaalin toiminnan DNA: n korjaukseen ja transkriptio prosessien tuloksena joiden pidätykseen proliferaatiota, erilaistumista ja solukuolemaa. [11, 12, 13]. Antiproliferatiivista aktiivisuutta Trabektediinin riippuu annoksesta: pieninä pitoisuuksina (1-10 ng /ml), trabektediinia tuottaa solusyklin häiriöiden kanssa Hidastuneen S-vaiheen etenemisen ja kerääntyminen solujen G2 vaiheessa. Suurempina pitoisuuksina (10-100 ng /ml), transkription riippumaton prosessi johtaa apoptoosin aktivointi eri signaalintransduktioreitteihin johon mitokondrion sytokromi-c-julkaisu, JNK ja caspase- 3 aktivointi [14]. Sytostaattinen ja pro-apoptoottista toimintaa Trabektediinin johtuvat aktivointi luontaisia ​​ja /tai ulkoisten apoptoottisia reittejä. Sisäisellä reitillä on ominaista mitokondrion ulkokalvon läpäiseväksi ja vapautumista sytokromi-c sytoplasmaan; menetelmä säätelee Bcl-2-perheen proteiinien. Edellinen työ viittaa siihen, että trabektediini laukaisee sytokromin c vapautumisen mitokondrion joka estää normaalisti Bcl-2 yliekspressio [14].

Viime aikoina kehittyvien todisteita ovat osoittaneet, että CSCS kriittisiä rooleja kehittymistä lääkeresistenssin, etäpesäke ja toistuminen. Näin ollen on tärkeää tutkia ja löytää uusia lääkkeitä, jotka selektiivisesti ja tehokkaasti kohdistaa ja tappaa CSCS. Nykyinen Tutkimuksessa tarkasteltiin vaikutuksia Trabektediinin vuonna CD133

+ korkea /CD44

+ korkea eturauhasen CSCS 2D- ja 3D-kulttuurin järjestelmä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely olosuhteita ja reagensseja

Ihmisen hormoneja ja lääkeresistenttejä eturauhassyövän solulinjoissa, PC-3 ja DU145 oli purchsed American Type Culture Collection (Manasas, VA, USA) ja niitä kasvatettiin RPMI 1640: ssä (

Lonza

,

Basel

,

Sveitsi

) viljelyalustassa, joka sisälsi 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (Gibco Invitrogen Life Technologies, Paisley, UK), 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä ( Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Soluja viljeltiin 25 cm

2 polystyreeniä pulloihin (Corning Life Sciences, UK) ja pidettiin inkubaattorissa 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä nykyisessä 5% CO

2. Kasvu ja morfologia tarkastettiin mikroskooppisesti päivittäin varmistaa solujen terveydelle. Solut jaettiin -jaettuja kun ne olivat noin 80% konfluenssiin. Solut puoliksi yhteen pulloja kerättiin käyttäen 0,05% trypsiiniä (Sigma-Aldrich) ja sentrifugoitiin (Nuve NF200, laboratorio ja sterilointi Technology, Ankara, Turkki) lisäämisen jälkeen RPMI 1640 trypsiiniä inaktivoitumisen. Sentrifugoinnin jälkeen ne suspendoitiin uudelleen elatusaineeseen. Trabektediini saatiin PharmaMar (Madrid, Espanja), ja valmistettiin 2 mM kantaliuosta dimetyylisulfoksidissa (DMSO). DMSO-pitoisuus määrityksessä ei saa ylittää 0,1%, ja ei ollut sytotoksinen kasvainsoluihin. Käytetyt vasta-aineet olivat anti-kaspaasi-3 (laimennettu 1: 100, 3510-100, BioVision, Inc., Milpitas, CA, USA), anti-kaspaasi-8 (laimennettu 1: 100, 250576, Abbiotec, USA), anti- kaspaasi-9 (laimennettu 1: 100; SantaCruz Biotechnology, USA, sc-17784), anti-p53: n (1: 100 laimennettua, 3036R-100, BioVision, Inc.), anti-Bcl2 (laimennettu 1: 100; SantaCruz Biotechnology, USA, sc-135757), anti-E-kadheriini (laimennettu 1: 100, Bios, USA, bs-1519R), vuohen anti-kani-immunoglobuliini G-fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) (1: 100 laimennettua, sc-2012, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) ja kanan kaniinin vastainen immunoglobuliini Alexa fluor

® 594 (1: 100 laimennettua, Invitrogen, USA, A21442).

Fluoresenssi solulajittelutekniikkaa (FACS) B

Ennen korjuu, solulinjoja kasvatettiin kunnes 80% konfluenssiin. FACS (FACSAria, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), solut irrotettiin käyttämällä ei-entsymaattista soluhajotusprosessin liuosta (Sigma-Aldrich) ja suspendoitiin uudelleen Dulbeccon fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (DPBS, Invitrogen, USA). Noin 5×10

4-soluja inkuboitiin vasta-aineen kanssa (laimennettu 1: 100 FACS-pestään 0,5% naudan seerumin albumiinia, 2 mM NaN3 ja 5 mM EDTA: ta) 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Isotyyppi ja pitoisuus-täsmäsi fykoerytriini (PE) -leimattua kontrollivasta-ainetta (Miltenyi Biotec Ltd., Woking, Surrey, UK) käytettiin ja näytteet leimattiin PE-leimatun CD133 /1 (klooni AC133 /1; Miltenyi Biotec Ltd. ) ja FITC-leimattua CD44 (klooni G44-26; BD Biosciences). 3-5 minuutin kuluttua, solut pestiin ja sen jälkeen uudelleen keskeytetty. Solut lajitellaan olevan CD 133

korkea /CD44

suuren kannan (lajittelu solut) ja ei-lajittelu kollegansa käyttäen FACSAria virtaussytometria, post-sort analyysin vahvistamiseksi väestön puhtautta. Lajiteltu solupopulaatioiden viljeltiin kahdessa eri asetuksia, yksikerroksisen 2D kulttuurin tai 3D monisoluisista kasvain sferoidiviljelmiä.

Solun elinkelpoisuus analysoidaan

elinkelpoisuus solujen käsittelyn jälkeen määritettiin käyttäen Muse ™ Count ja Viability kit (Muse ™ Cell Analyzer; Millipore, Billerica, MA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, solut ympättiin kolmena kappaleena 6-kuoppaisille levyille tiheyteen 1 x 10

4cells /kuoppa. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen, solut altistettiin kasvavia pitoisuuksia Trabektediinin (0,1, 1, 10, 100 nM). Sitten levyjä inkuboitiin 37

° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa 24, 48, ja 72 h. Inkuboinnin jälkeen kaikki solut kerättiin ja laimennettiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). 50 ui solususpensiota lisätään tämän jälkeen 450 ui MUSE Count ja Elinkelpoisuus reagenssia (10x laimennosta), inkuboitiin 5 min huoneen lämpötilassa ja analysoitiin käyttäen MUSE- Cell Analyzer. Tulokset esitettiin suhteessa elinkelpoisuus (%) vertaamalla Trabektediinin käsitellyn ryhmän kanssa käsittelemättömiä soluja, elinkelpoisuutta, jonka oletetaan olevan 100%.

Solukuolema analysoi

apoptoottisten solujen jakauma määritettiin käyttämällä MUSE- anneksiini V Dead Cell Kit (Merck KGaA) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, sen jälkeen, kun hoidon trabektediini, kaikki solut kerättiin ja laimennettiin PBS: llä, joka sisälsi 1% naudan seerumin albumiinia (BSA), kuten laimennus puskuriin pitoisuuteen 5×10

5 solua /ml. 100 ui anneksiini V /dead reagenssia ja 100 ui yksittäisten solujen suspensio sekoitettiin mikroputkeen ja pimeässä 20 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sitten solut analysoitiin käyttämällä Muse solu analysaattori (Merck Milipore). Apoptoottisen suhde määritettiin tunnistaminen neljän ryhmissä: (i) nonapoptotic solut, jotka eivät olleet havaittavissa apoptoosia: Annexin V (-) ja 7-AAD (-); (Ii) varhainen apoptoottisia soluja, anneksiini V (+) ja 7-AAD (-); (Iii) myöhään apoptoottisia soluja, anneksiini V (+) ja 7-AAD (+); (Iv) solut, jotka ovat kuolleet kautta nonapoptotic reitin: Annexin V (-) ja 7-AAD (+). Näytteet määritettiin Muse Cell Analyzer (Merck Millipore).

Cell kaarianalyysien

Cell kaarianalyysien tehtiin käyttämällä Muse ™ solusyklin Kitin Millipore mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä, käsiteltiin eri pitoisuuksilla Trabektediinin (0,1, 1, 10, 100 nM); Sitten kerättiin trypsinisaatiolla ja pestiin kahdesti PBS: llä. Solut kiinnitettiin 1 ml: lla 70% kylmää etanolia -20 ° C: ssa 5 h, ja käsiteltiin 200 ul: Muse solusyklin reagenssia ja inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Prosenttiosuus solujen G0 /G1, S ja G2 /M-vaiheisiin laskettiin sitten käyttäen Muse solun analysaattori (Millipore, USA).

Sphere muodostumista ja pesäkkeiden muodostumisen määritykset

Rakeiden muodostuminen potentiaali CD133

korkea /CD44

korkea ihmisen eturauhasen CSCS arvioitiin 3D tarttumattomat kulttuuri kunnossa. Aluksi CD133

korkea /CD44

korkea ihmisen eturauhasen CSCS kasvatettiin ainoana kerroksena, jonka jälkeen ne laskettiin uudelleen suspendoitujen ja päällystetty 1×10

4 solua kuoppaa kohti 6-kuoppalevylle pre-pinnoitettu ohuella kerroksella 3% Noble-agaria (w /v) (Difco Laboratories, Inc .; BD Diagnostic Systems, Detroit MI, USA) RPMI 1640, joka sisälsi 10% FBS: ää ja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Soluviljelyaine vaihdettiin joka 2-3 päivä tuoreella alustalla soluroskan poistamiseksi ja pallosia, jotka eivät hyvin muodostunut. Sen jälkeen, kun alussa monisoluisten kasvaimen sferoidi muodostumista, trabektediini lisättiin eri pitoisuuksina Trabektediinin (0,1, 1, 10, 100 nM) ja inkuboitiin 24, 48 ja 72 tuntia. Lukumäärä ja läpimitta pesäkkeiden kussakin hyvin kuvattiin ja laskettiin päivittäin mikroskoopilla (Olympus BX-51, Olympus, Hampuri, Saksa) ja kuvat edustajan kenttien vangittiin. Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena ja kaikki kokeet suoritettiin kolme kertaa.

immunofluoresenssi

hoidon jälkeen IC

50 annosta Trabektediinin, solut saatettiin lysiini päällystetty peitelaseille, kiinteät 4% paraformaldehydillä 15 minuutin ajan. Sen jälkeen solut tehtiin läpäiseviksi 0,1% Triton X-100: ssa 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, pestiin kolme kertaa PBS: llä, blokattiin PBS: llä, joka sisälsi 5% naudan seerumin albumiinia 1 tunnin ajan ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla vastaan ​​kaspaasi-3, caspase- 8, kaspaasi-9 p53, bcl-2 ja e-kadheriinin yön yli 4 ° C: ssa. Sitten soluja käsiteltiin sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa kosteutetussa kammiossa. Immunovärjättiin Solut asennettu kiinnitysväliaine sisältäviä DAPI ja visualisoitiin fluoresenssimikroskoopilla kameralla varustettu (Olympus BX-51 ja Olympus C-5050 digitaalinen testi).

Tilastollinen

kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä, jonka jälkeen Tukeyn tai Dunett n post hoc-testi. p 0,05 katsottiin osoittavan tilastollisesti merkitsevä ero.

Tulokset

Puhtaus ja lajittelu hinnat CD 133

korkea /CD44

korkea lajitellaan ja ei-lajitellaan alaryhmässä

DU145 ja PC-3 ihmisen eturauhassyövän solut lajitellaan CD133 ja CD44 pinta ilmaisutapoja FACS (kuvio 1A ja 1B). Tulokset osoittivat, että määrien DU-145 CSCS ja ei-CSCS olivat 3,2 ± 5,4% (kuvio 1A) ja 96,8 ± 5,4% (kuvio 1 B), tässä järjestyksessä. PC-3-solut, hinnat olivat 3,9 ± 5,4 lajitteluun soluja ja 96,1 ± 5,4 ei-lajittelu soluissa. Jälkeinen sort analyysi suoritettiin määrittämään puhtaus järjestetty solupopulaatioiden; joka havaittiin olevan 85%.

(A) DU-145 CSCS eristettiin DU-145 ihmisen eturauhasen solulinja. (B) PC-3 CSCS eristettiin DU-145 ihmisen eturauhasen solulinjaan. CD133

korkea /CD44

korkea populaatiot esitetty P6. CD, klusterin eriyttämisen; FACS, fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelua.

Lisääntyvä sytotoksisuus CD133

korkea /CD44

korkea eturauhasen CSCS kanssa trabektediini

vaikutuksen määrittämiseksi Trabektediinin elinkelpoisuudesta ihmisen eturauhasen epiteelisolujen (RWPE-1), eturauhasen syöpäsolujen (DU-145 ja PC-3), eturauhasen CSCS (DU-145 ja PC-3 CSCS) ja bulk väestöstä (DU-145 ei-CSCS ja PC-3 ei-CSCS) altistettiin kasvavia pitoisuuksia Trabektediinin (0,1-100 nM) 24, 48 ja 72 tuntia, ja elinkelpoisten solujen prosentuaalinen näytteissä määritettiin solunelinkykyisyysmääritys.

trabektediini vähentää solun elinkelpoisuus DU145 ihmisen eturauhasen solulinja, DU-145 CSCS ja DU-145 ei-CSCS on aika- ja pitoisuudesta riippuvasti (kuva 2). 24 tunnin kuluttua hoidon, The puoli maksimaalinen inhiboiva konsentraatio (IC

50) arvot Trabektediinin havaittiin olevan 100 nM DU-145 ei-CSCS; kun taas IC

50 arvo Trabektediinin DU-145-solulinjassa ja CSCS ei saatu (kuvio 2A). 48 tunnin kuluttua hoidon, IC

50-arvot Trabektediinin havaittiin olevan 10 nM, 100 nM ja 9,2 nM vastaavasti DU-145-solulinja, DU-145 CSCS ja DU-145 ei-CSCS (Fig 2B). 72 tunnin kuluttua hoidon, IC

50-arvot Trabektediinin havaittiin olevan 1 nM, 9,3 nM ja 1 nM vastaavasti DU-145-solulinja, DU-145 CSCS ja DU-145 ei-CSCS (kuvio 2C) .

Sytotoksisuus määritettiin Muse ™ solu analysaattori. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona 3 Eri kokeiden (± SD) (p 0,001 verrattuna käsittelemättömään kontrolliin).

Trabektediini laski solujen elävyys PC-3 ihmisen eturauhasen solulinja, PC 3 CSCS ja PC-3 ei-CSCS on aika- ja pitoisuudesta riippuvasti (kuva 2). IC

50 arvo Trabektediinin ei voitu saada kaikissa kolmessa ryhmässä 24 tuntia. 48 tunnin kuluttua hoidon, IC

50-arvot Trabektediinin havaittiin olevan 100 nM PC-3-solulinjan ja PC-3 ei-CSCS; kun taas IC

50 arvo Trabektediinin PC-3 CSCS ei saatu (kuvio 2B). 72 tunnin kuluttua hoidon, IC

50-arvot Trabektediinin havaittiin olevan 9 nM, 10 nM ja 8 nM vastaavasti PC-3-solulinjan, PC-3 CSCS ja PC-3 ei-CSCS (kuvio 2C). Vaikka trabektediinipitoisuus vähensi elinkelpoisuuden CSCS ja ei-CSCS pitoisuudesta riippuvalla tavalla, elinkelpoisuutta RWPE-1-soluja oli huomattavasti korkeampi kuin syöpäsolujen altistamisen jälkeen trabektediini, mikä osoittaa, että eturauhassyövän kantasolut olivat herkempiä trabektediini kuin normaalin eturauhasen epiteelin RWPE-1-soluissa.

trabektediini indusoi apoptoottisen solukuoleman sekä CSCS ja ei-CSCS

tutkia solujen apoptoosin, käsittelemättömän tai trabektediini saaneilla DU-145-solulinja, DU -145 CSCS, DU-145 ei-CSCS, PC-3-solulinjan, PC-3 CSCS, PC-3 ei-CSCS altistettiin kasvavia pitoisuuksia Trabektediinin ja arvioidaan Muse ™ anneksiini V ja Dead Cell määritys (kuvio 3 ). Anneksiini V ja kuolleiden solujen analyysi solut voivat erottaa soluja neljään ryhmään, nimittäin elinkelpoinen (anneksiini V: (-) ja 7-AAD (-), varhaisen apoptoosin anneksiini V (+) ja 7-AAD (-), myöhään apoptoosin, anneksiini V (+) ja 7-AAD (+) ja nekroottinen Annexin V (-) ja 7-AAD (+). trabektediini merkittävästi indusoi apoptoosia kaikissa ryhmissä pitoisuutena riippuvaisella tavalla. Tilastolliset analyysit osoittivat merkittävää eroa trabektediini käsiteltyjen solujen verrattuna kontrolliin (p 0,001).

(A) DU-145-solulinja, (B) DU-145 CSCS, (C) DU-145 ei-CSCS, (D) PC-3-solulinjan, (E) PC-3 CSCS, (F) PC-3 ei-CSCS. soluja käsiteltiin 0,1, 1, 10 ja 100 nM trabektediini 48 tuntia. inkuboinnin jälkeen ajan solut kerättiin ja fosfatidyyliseriinialtistuksen eriyttämispolitiikan arvioitiin käyttäen Annexin V protokollaa kuvaavat. Perustuen anneksiini V reaktiivisuus ja intensiteetti 7-AAD fluoresenssi, solut voidaan jakaa neljään ryhmään: kuollut, elää, varhainen apoptoosin ja myöhäinen apoptoosin /kuollut. Trabektediini osoitettiin indusoivan apoptoottista solukuolemaa syöpä kantasoluja pääasiassa kasvu alussa apoptoosin (vihreä), soluja ja näennäinen laski prosenttiosuus eläviä soluja. Trabektediini myös merkittävästi indusoi koko apoptoottisten solujen (keltainen) annoksesta riippuvalla tavalla. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta eri kokeesta. Tilastollinen merkittävyys määritettiin yksisuuntaisen varianssianalyysin, jonka jälkeen Tukeyn tai Dunett n post hoc testi. p 0,05 katsottiin osoittavan tilastollisesti merkitsevää eroa.

Tulokset osoittivat, että trabektediini altistus oli kasvavia määriä johti korkeampiin populaation varhaisten apoptoottisten solujen. Perustuu tietoihin päättelemme, että trabektediini indusoi apoptoottista solukuolemaa kaikissa ryhmissä testattu selvästi lisääntynyt alkuvuodesta apoptoosin 48 tuntia. Trabektediinipitoisuus indusoi koko apoptoottisten solujen DU-145-solulinjassa (kuvio 3A), DU-145 CSCS (kuvio 3B), DU-145 ei-CSCS (kuvio 3C), PC-3-solulinjassa (kuvio 3D), PC-3 CSCS (kuvio 3E) ja PC-3 ei-CSCS (kuvio 3F), annoksesta riippuvalla tavalla.

caspase-3, kaspaasi-8, kaspaasi-9, p53 ja bCL-2 moduloida flavopiridolin liittyvä apoptoosin

immunofluoresenssivärjäystä kaspaasi-3, kaspaasi-8, kaspaasi-9, p53 ja bCL-2 tukivat tulokset ja antoivat tietoa mukana apoptoottisen reitin. DU-145-solulinjassa (kuvio 4A), DU-145 CSCS (kuvio 4B) ja DU-145 ei-CSCS (kuvio 4C) käsiteltiin 10 nM trabektediini johti merkittävään kasvuun immunofluoresenssivärjäyksen kaspaasi-3, kaspaasi-8 kaspaasi-9 ja p53. Sen sijaan, immunofluoresenssivärjäyksen bcl-2 oli selvästi vähentynyt verrattuna kontrolliin. Samanlaisia ​​havaintoja tallennettiin PC-3-solulinjan, PC-3 CSCS ja PC-3 ei-CSCS: immunofluoresenssivärjäyksen kaspaasi-3, kaspaasi-8 ja p53 lisättiin ja immunofluoresenssivärjäyksen bcl-2 aleni. Mitään merkittäviä muutoksia ei havaittu immunofluoresenssivärjäyksen kaspaasi-9.

(A) DU-145, (B) DU-145 CSCS, (C) DU-145 ei-CSCS. Hoidon jälkeen 10 nM trabektediini; kaspaasi-3, kaspaasi-8, kaspaasi-9, p53 ja BCL-2 visualisoitiin käyttäen FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (vihreä). Tumavärjäystä visualisoitiin DAPI (sininen) värjäys. Kuvat edustavat kolmen erillisen kokeen. Mittakaavapalkki tarkoittaa 50 um.

solukierron säätelyssä korkean annoksen trabektediini hoito

Sen arvioimiseksi, onko Trabektediini aiheuttama kasvun estäminen solujen välittyy kautta muutoksiin solusyklin, me tutkittiin, mikä vaikutus Trabektediinin solusyklin jakeluun kuolleiden solujen määrityksessä kit. Kasvu inkubaatioajan suurensi määrän solut G2 /M kaikissa ryhmissä; erityisesti korkea-annoksella (10 ja 100 nM) hoitoja.

48 tunnin kuluttua 0,1 nM Trabektediinin hoidon solupopulaatioiden G0 /G1, S ja G2 /M-vaiheisiin olivat 55,3, 27,6 ja 17,1%, vastaavasti DU-145-solulinjassa, ja 58,3, 23,1 ja 18,6%, vastaavasti DU-145 CSCS. Sen jälkeen 1 nM trabektediinia inkuboinnin osuudet olivat 54,0, 21,2 ja 24,8%, vastaavasti DU-145-solut; ja 50.1, 26,9 ja 23,0%, vastaavasti, DU-145 CSCS. Inkubointi 10 nM trabektediinipitoisuus johti prosenttiosuudet 35,7, 29,8 ja 34,5% vastaavasti DU-145-solulinjassa ja 37,0, 32,5 ja 30,4% vastaavasti DU-145 CSCS (kuvio 5A ja 5B). Kun soluja käsiteltiin 100 nM trabektediinia, prosenttiosuudet kolme luokkaa soluista oli 28,0, 29,5 ja 42,5%, vastaavasti, DU-145-solulinja; ja 38.1, 21.8 ja 40.0%, vastaavasti DU-145 CSCS. In DU-145 ei-CSCS, solupopulaatioiden G0 /G1, S ja G2 /M vaiheet olivat 56,2, 24,4, 19,4%: lla, 48 tunnin kuluttua inkubaation 0,1 nM trabektediini. Prosenttiosuudet kolme luokkaa solujen 1 nM trabektediini inkuboinnin olivat 50,1, 19,3, 30,6%; 10 nM trabektediinia ja 37,2, 22,9 ja 39,9% (kuvio 5C); 100 nM trabektediini 25,5, 29,1, 45,4%: lla sen jälkeen, kun 48 tunnin inkuboinnin.

(A) DU-145, (B) DU-145 CSCS, (C) DU-145 ei-CSCS, (D) PC-3, (E) PC-3 ei-CSCS, (F) PC-3 CSCS. Soluja käsiteltiin 10 nM trabektediini 48 tuntia. Prosenttiosuus solujen G0 /G1, S ja G2 /M-vaiheisiin laskettiin sitten käyttäen Muse solun analysaattorin. Histogrammit edustavasta kokeesta osoittavat vaikutuksen Trabektediinin solusyklin profiili. Erityisesti trabektediinia vaikuttanut merkittävästi solujen G2 /M vaiheessa erityisesti suuriannoksisen hoidon. Data on esitetty tässä on edustava koe toistetaan kolme kertaa samanlaisin tuloksin.

48 tunnin kuluttua hoidon 0,1 nM trabektediini, solupopulaatioiden G0 /G1, S ja G2 /M-vaiheisiin olivat 57,0 , 24,6 ja 18,4% vastaavasti PC-3-solulinjassa, ja 69,4, 12,7 ja 17,8%, vastaavasti PC-3 ei-CSCS. Inkubaatio 1 nM trabektediinia, prosenttiosuudet kolme luokkaa soluista oli 45,8, 25,5 ja 28,6%, vastaavasti PC-3-solulinjassa ja 48,7, 22,9 ja 28,3%, vastaavasti PC-3 ei-CSCS. Inkubointi 10 nM trabektediinia, prosenttiosuudet kolme luokkaa soluista oli 49,5, 17,7 ja 32,7% (kuvio 5D), vastaavasti PC-3-solulinjassa ja 35,8, 31,1 ja 33,0% (kuvio 5E), vastaavasti PC- 3 ei-CSCS. Inkubointi 100 nM trabektediinia, prosenttiosuudet olivat 43,8, 18,9 ja 37,3%, vastaavasti PC-3-solulinjassa ja 28,0, 26,4 ja 45,6% vastaavasti PC-3 ei-CSCS. Samanlaisia ​​havaintoja kirjattiin PC-3 CSCS. Altistuminen näiden solujen trabektediini pitoisuudet 0,1, 1, 10 ja 100 nM 76,4, 62,7, 50,3, 45,8% pidätys G0 /G1 vaihe, vastaavasti; ja 15,0, 22,0, 27,6, 26,3% pidätys (tässä järjestyksessä) S- vaiheessa, ja 8,6, 15,3, 20,9, 27,9% pidätys (tässä järjestyksessä) G2 /M vaiheessa (kuvio 5F). Nämä tulokset osoittivat, että kasvun esto havaittiin kaikissa ryhmissä käsitellään trabektediini liittyy lähinnä G2 /M vaiheessa pidätyksen.

Vertailu pallomainen muodostavien kyky CSCS ja ei-CSCS

DU-145 ja PC-3 CSCS ja ei-CSCS kasvatettiin 3D tarttumattomat viljelyolosuhteissa. Sferoidi muodostumiseen arvioitiin alla faasikontrastimikroskoopilla. CD133

korkea /CD44

korkea ihmisen eturauhasen CSCS (kuvio 6A ja 6B) pystyivät muodostamaan sferoideja; kun taas ei-CSCS epäonnistui (kuvio 6C ja 6D).

A) DU-145 CSCS, B) PC-3 CSCS, (C) DU-145 ei-CSCS, (D) PC-3 ei- CSCS. CD133

korkea /CD44

korkea ihmisen eturauhasen CSCS pystyivät muodostamaan sferoideja; kun taas ei-CSCS epäonnistui.

esto pallo muodostumisen trabektediini

DU-145 CSCS ja PC-3 CSCS muodostettu tumoroids päivänä viisi ja kolme, vastaavasti. Alussa sferoidit inkuboitiin 24, 48 ja 72 tuntia ja solut käsiteltiin 0,1, 1, 10 ja 100 nM trabektediini. Lukumäärä ja läpimitta pesäkkeiden kussakin kuopassa määritettiin päivittäin mikroskoopilla. Mittaukset tumoroid koon ja numerot paljasti annoksesta riippuvan sytotoksisuuden käsiteltiin tumoroids verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. Trabektediinipitoisuus vähensi ja halkaisija pallosia ja DU145 CSCS ja PC3 CSCS annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla (kuviot 7 ja 8). Kasvavia annoksia trabektediinia, lisääntynyt solukuolemaa havaittiin mukana purkamiseen pallosia of DU145 CSCS ja PC3 CSCS.

(A) DU-145 CSCS, (B) PC-3 CSCS. Kyky pallo muodostumisen CD133

korkea /CD44

high DU-145 ja PC-3CSCs on huomattavasti vaimennetaan annoksesta riippuvalla tavalla alusta on pallomainen perustuslain. Sen jälkeen, kun alussa monisoluisten kasvaimen sferoidi muodostumista, trabektediini lisättiin eri pitoisuuksina Trabektediinin (0,1, 1, 10, 100 nM) ja 24, 48 ja 72 tuntia. Merkittävä väheneminen havaittiin halkaisija pallomainen muodostumista. Tulokset edustavat kerättyjen vähintään kolmen kokeen.

(A) DU-145 CSCS, (B) PC-3 CSCS. Sen jälkeen, kun alussa monisoluisten kasvaimen sferoidi muodostumista, trabektediini lisättiin eri pitoisuuksina Trabektediinin (0,1, 1, 10, 100 nM) ja 24, 48 ja 72 tuntia. Määrä pallosia 15-20 satunnaisia ​​kenttien laskettiin ja laskettiin. Trabektediini vähensi pallosia of DU145 CSCS ja PC3 CSCS annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla.

E-kadheriinin ilmentymisen pienentynyt CD133

korkea /CD44

korkea eturauhasen CSCS kanssa trabektediini

roolin tutkimiseksi trabektediinipitoisuus ilmaus E-kadheriinin välittämiä solun-soluadheesion DU-145 ja PC-3 CSCS kasvatettu kolmiulotteisia olosuhteissa in vitro, tutkimme immunofluoresenssivärjäyksen E- kadheriinin. Meidän Immunofluoresenssimääritykset tulokset osoittivat, että käsittelyn jälkeen DU-145 ja PC-3 CSCS IC

50 annosta trabektediinia, E-kadheriinin ilmentymisen merkittävästi laski verrattuna kontrolliin (kuvio 9).

(A) DU -145 CSCS, (B) PC-3 CSCS. Kun monisoluisten kasvaimen sferoidi muodostumista, DU-145 CSCS ja PC-3 CSCS sferoidit hoidettiin trabektediini. Trabektediini häiritsi E-kadheriinin välittämiä solun-solu vuorovaikutusta monisoluisten pallosia DU-145 ja PC-3 CSCS. E-kadheriinin visualisoitiin käyttämällä Alexa fluor

® 594 konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (punainen) Nuclei värjätään DAPI (sininen). Mitta-asteikko: 100 um.

Keskustelu

tutkimus on ensimmäinen osoittaa syöpää ehkäisevä vaikutus Trabektediinin ihmisen eturauhasen CSCS. Viimeaikaiset syöpä tutkimukset ovat paljastaneet, että vähemmistö solujen kasvaimissa bulks vastaa kasvaimen aloittamista, kasvu ja kestävyys perinteisiin hoitoihin. Useimmat syöpälääkkeet tutkitaan, kun tappaminen suurin osa kasvainsolujen lopulta eivät eleminate CSCS, joka aiheuttaa kasvaimen uusiutumisen ja etäpesäke. Siksi huomio on keskittynyt määrittää uusia syöpälääkkeen syövän ehkäisyä ja hoitoa poistamalla CSCS.

Trabektediini on potentiaalia olla tehokas kemoterapeuttinen aine kehittää uusia hoitomuotoja, jotka on kohdistettu erityisesti eturauhasen CSCS. Meidän tiedot viittaavat vahvasti siihen, että trabektediini estää niiden kasvun eturauhasen CSCS annoksesta riippuvalla tavalla, kautta solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin.