Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

nopea kehitys ymmärrystä syövän biologian ovat muuttaneet lääkekehityksessä mikä johtaa hyväksynnän kohdennettujen hoitojen ja kehittämiseen molekyylitestejä valita potilaita, jotka reagoivat hoitoja.

KRAS

asema on noussut negatiivinen ennustaja kliinistä hyötyä anti-EGFR-vasta-aineiden peräsuolen syövän, ja anti-EGFR-vasta-aineiden käyttö rajattiin

KRAS

villityypin kasvaimia. Sen varmistamiseksi laaja saatavuus kasvain molekyyli profiloinnin Ranskan National Cancer Institute (Inca) on perustanut kansallisen verkoston 28 alueellisten molekyyligenetiikan keskuksia. Samalla valtakunnallinen ulkoinen laadun arvioinnin

KRAS

testaus (MOKAECM) myönnettiin analysoimaan toistettavuus ja kustannukset.

Methods

96 cell line DNA: t ja 24 DNA-näytteet parafiiniin kasvainkudoksista lähetettiin 40 ranskalaisissa laboratorioissa. Kaikkiaan 5448

KRAS

tulokset kerättiin ja analysoitiin ja mikro-maksaa tutkimus suoritettiin sivustoja 5 yhteisiä menetelmiä riippumaton ryhmä terveystaloustieteilijöiden.

Tulokset

Tämä työ tarjosi perustason kuvan tarkkuutta ja luotettavuutta

KRAS

analyysi rutiini testausolosuhteita valtakunnallisesti. Inter-laboratorio Kappa-arvot olivat 0,8

KRAS

tulokset eroista huolimatta havaitsemismenetelmiä ja käytön in-house teknologioihin. Spesifisyys oli erinomainen vain yksi väärä positiivinen 1128 FFPE data, ja herkkyys oli suurempi kohdennettuihin tekniikoita verrattuna Sangerin sekvensointia menetelmiä, jotka olivat riippuvaisia ​​paikallista osaamista. Arvioidut reagenssia kustannukset potilasta kohden vaihtelivat € 5,5 € 19,0.

Johtopäätös

Inca on perustanut verkoston julkisten laboratorioiden omistettu molekyyli onkologian testejä. Tuloksemme osoittivat lähes täydellisen sopimuksia

KRAS

testaus valtakunnallisesti huolimatta eri testausmenetelmiä varmistaa kustannustehokkaan yhtäläinen pääsy henkilökohtainen peräsuolen syövän hoidossa.

Citation: Blons H, Rouleau E, Charrier N, Chatellier G, Côté JF, sivut JC, et ai. (2013) Suorituskyky ja kustannustehokkuutta

KRAS

mutaatio testaus metastasoituneen kolorektaalisyövän rutiini Diagnoosi: Tällä MOKAECM Study, Nationwide Experience. PLoS ONE 8 (7): e68945. doi: 10,1371 /journal.pone.0068945

Editor: Anthony W. I. Lo, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu 4 maaliskuuta, 2013 Hyväksytty 4. kesäkuuta 2013 Julkaistu: 25 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Blons et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: MOKAECM tutkimus: Arviointi de la havaitseminen des Mutaatiot de l’onkogeeni KRAS pour le traitement par les Anticorps EGFR des potilaat PORTEURS d’un syövän peräsuolen Métastatique tukivat Ranskan National Cancer Institute (Inca) hanke numero STIC2008 /IC0803 /NI08001. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Hélène Blons, Etienne Rouleau, Nathanaël Charrier, Gilles Chatellier, Jean-François Côté, Jean-Christophe Sivut, Florence de Fraipont, Jean-Christophe Boyer, Jean Philippe Merlio, Alain Morel, Marie-Claude Gorisse, Patricia de Cremoux, Karen Leroy, L’Houcine Ouafik, Jean-Louis Merlin, Delphine Le Corre, Pascaline AUCOUTURIER, Frédérique Nowak, Thierry Frebourg, Jean-François Emile ja Isabelle Durand-Zaleski ilmoittaneet, etteivät ne ole kilpailevia intressejä. Gérard Milano: Ilmoitetut ollessa: konsultti tai neuvoa-antava rooli ”Roche Merck Serono, GSK” (suora rahoitus Hélène Blons) Jean-Christophe Sabourin: Ilmoitettu ollessa konsultti tai neuvoa-antava rooli ”Merck Serono” (suora rahoitus Hélène Blons ) Pierre Laurent-Puig: Ilmoitettu ollessa konsultti tai neuvoa-antava rooli ”Merck Serono; Amgen; Genominen Health; Sanofi; Myriad Genetics ”(suora rahoitus Hélène Blons). Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Uusi hoitomenetelmät, kuten anti-EGFR kohdistettuja hoitomuotoja ja samanaikainen tunnistaminen molekyyli biomarkkerit ja tunnistaa alaryhmien mahdollisesti reagoivien kasvainten oli luonut tarpeen rutiini molekulaarinen syöpiä. Kolorektaalisyövässä, sen osoittaminen, että potilailla, joilla on

KRAS

mutatoitunut kasvaimia ei hyötynyt EGFR monoklonaalisia vasta perustettiin tekniikasta riippumatta käyttää tunnistamaan

KRAS

mutatoitunut kasvainten [1]. Tämä tulos oli nopeasti seurasi direktiivi Euroopan lääkeviraston (EMEA) että rajoitettu käyttö setuksimabin (Erbitux®) ja panitumumabin (Vectibix®) potilaille, joilla on

KRAS

villityypin metastasoitunut kolorektaalisyöpä [2 ].

yli 940000 uutta peräsuolen syöpätapausta maailmanlaajuisesti vuosittain, käyttö anti-EGFR kohdistettuja hoitomuotoja kohtaavat tärkeimpiä kysymyksiä, taloudellisesti yksi: kuka maksaa testiä tai huumeiden ja lääketieteellisen yksi : testin suorittavan? Ranskan julkinen sairausvakuutusjärjestelmä päätti kohdistaa annettava hoito ja peräsuolen syövän mukaisesti EMEA suositusta. Samanaikaisesti Ranskan hallitus ja National Cancer Institute (Inca) ovat perustaneet kansallisen verkoston 28 alueellisten molekyyligenetiikan keskusten toteuttamaan rutiini molekyylitestauksella peräsuolen syövän. Useampi kuin yksi laboratorio voi liittyä yhteen aluekeskus.

Kunkin laboratorion kehittämä

KRAS

testaus mukaan oman asiantuntemuksensa sekä paikallisesti saatavilla välineitä. Testien lukumäärää kasvoi 1100 vuonna 2007 10012 vuonna 2008 ja 17246 vuonna 2009. Siitä lähtien, testien määrää oli vakaa ja peitti odotettu esiintyvyys metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaiden Ranskassa. Perustajan on € 2,5M oli omistettu

KRAS

testaus. Tämä organisaatio tuntui kustannustehokas huomioon maailmanlaajuinen voitto huumeiden kustannuksia. Oli välttämätöntä osoittaa, että

KRAS

testaus tulokset olivat toistettavia välillä molekyyli laboratorioissa. Jokainen laboratorio yhden tai useamman genotyypitysmenetelmää arvioitiin ulkoisen laadunvalvonta-ohjelma, monikeskustutkimus ohjelma:

KRAS

Oncogene Mutaatio tunnistus hoidossa metastasoituneen kolorektaalisyövän hoitoon mukaan EGFR vasta-aineet (MOKAECM). MOKAECM hanke perustettiin ulkoisena laadunvalvonta ja laboratorioiden oli vapaus valita ja kehittää omaa menetelmää

KRAS

testaus.

Aiemmat vertailevia tutkimuksia arvioitiin yksi tekniikka [3]

, [4], [5]. Toiset verrattuna eri tekniikoita yhden testataan tekniikkaa kohti sivustolla. Molemmissa tapauksissa luotettavuutta teknologian käytetään eri asiantuntemusta ei voida arvioida [6] [7]. Kansallinen arviointi

KRAS

mutaatio testaus yhdistää käytännön todellisuutta liittyvät kustannukset arviointi ei ole tehty koskaan asti.

Ensimmäinen tavoite MOKAECM tavoitteena oli arvioida at valtakunnallisesti suorituskykyä on

KRAS

testaus kliiniseen tarkoitukseen (herkkyys ja toistettavuus). Toinen oli arvioida ja verrata liittyvät kustannukset kuhunkin teknologiaan. Koska tämä tutkimus koskee valtion alueella, mukaan lukien kaikki Inka leimattu molekyyli laboratoriot, voimme päätellä kansallisen suorituskyky

KRAS

testaus päässä MOKAECM tutkimuksessa.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimusasetelma

Tämä tutkimus suunniteltiin arvioimaan

KRAS

genotyypitykseen 40 ranskalaisissa laboratorioissa liittyvät yhteen 28 molekyyligenetiikan keskusten avulla solulinjaa ja formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) kasvain näytteet. ADNS olivat keskeisesti valmius ohjata tasalaatuisuuden ja sokeasti lähetetään kaikille osallistujille

KRAS

testaus käyttäen rutiinikäytännön teknologioita. Tulokset lastattiin ja tallennetaan tiettyyn tietokantaan ja analysoidaan tilastotieteilijä (GC) päässä HEGP sairaalasta Clinical Research Unit.

Solulinjat

ATCC Solut linjat (H1573: p.G12A; H358 : p.G12C; A427: p.G12D; LS123: p.G12S; SW620: p.G12V; Lovo: p.G13D, SW46: Wild Type) varta ostettiin tutkimukseen ja

KRAS

G12R, saatiin infektoimalla retroviruksia 292FT soluja vektorilla, joka sisältää

KRAS

c.34G C vaihdosta (JCP).

peräsuolen syövän kudosnäytteistä

Kaksikymmentäneljä kasvaimia leimasi ja valitaan potilaalla, joille kirurginen resektio ja peräsuolen syöpään Ambroise Paré Hospital, (Boulogne-Billancourt, Ranska). Eettisen komitean Ile de France II hyväksyi tutkimuksen ja potilaita ilmoitettiin ja kirjallinen suostumus saatiin mukaan Ranskan lakia. Tutkimus toteutettiin Ranskassa. Diagnoosi paksusuolen adenokarsinooma arvioitiin patologi (JFE) jotka valitsivat FFPE lohkot myöhempää molekyylitason analyysi. DNA: n eristys tehtiin klo Ambroise Paré sairaalan käyttämällä Qiamp DNA Mini Kit (Qiagen). Kasvaimet luonnehdittiin varten

KRAS

kolmella eri labs käyttäen kolmea eri tekniikoita. Nämä laboratoriot valittiin perustuen niiden kokemusten KRAS testaus ja talon validointia käytetty. Valitut näytteet osoittivat ole ristiriitaa.

arviointi soluihin

arviointi soluihin tehtiin hematoksyliinillä, eosiinilla ja safran (HES) liukuu molemmissa päissä FFPE lohkon käytetään DNA: n eristämiseksi. Objektilasit skannattiin Mirax Scan, (Zeiss, Göttingen, Saksa). Validoida kasvain solun sisällön, skannatut kuvat tarkisti seitsemästä itsenäisestä patologia eri keskuksista. Kun poikkeamia havaittiin, dioja tarkistettiin ja päästy yhteisymmärrykseen.

Käytetyt menetelmät

Eri in-house kehitettiin: Sanger suora sekvensointi (n = 15 laboratoriot), alleelinen syrjintä koetin järjestelmät [ ,,,0],8], [9] (n = 13), Snap Shot [10] (n = 7), pyrosekvensointi [11] (n-5), HRM seurasi sekvensointi [12] (n = 5). Yksi laboratorio käytti TheraScreen®: K-RAS Mutaatio Kit kaupallista pakkausta. Viisi laboratorioissa testataan useampi kuin yksi menetelmä.

Kolmekymmentä laboratorioiden toi koko protokolla

KRAS

mutaation havaitsemiseen, ei ollut käytännössä tasalaatuisuuden paitsi laboratorioiden

KRAS

Taqman® antureista (ks Information S1). Yksityiskohtaiset menettelyt alukkeilla kannat ovat saatavilla pyynnöstä.

Tilastollinen lähestymistapa ja data-analyysin

Virheiden määrä määriteltiin summana vääriä positiivisia, vääriä negatiivisia, ei-eläkemaksuihin testejä ja väärä mutaatio calling. Sovitettavaksi perusteet, joita Euroopan EQA, kaikki virheet aluksi katsottiin yhtä merkittävä, vaikka vaikutuksia potilaille voi vaihdella. Kaikki näytteet valittiin ole vahvistusta oletus ja jokainen osallistuja esitti seurauksena, että meidän katsoa loppuraportti lähetetään onkologi. Toisessa vaiheessa me pidettiin kliinisesti merkitsevinä virheitä olevan vääriä positiivisia ja negatiivisia tuloksia ottaen huomioon, että pettäessä uusi näyte pyydettäisiin vaikka tämä aiheuttaa vielä lisää viivettä potilaalle.

onnistumisaste määriteltiin summana oikeilla positiivisilla ja tosi negatiivisia.

arvioidaan sekä toistettavuus (välistä ja niiden sisäistä laboratorio) ja diagnoosi tarkkuus (herkkyys ja spesifisyys) eri tekniikoita

KRAS

genotyypitys. Kunkin mutantin solulinjan oli neljä eri laimennoksia (5%, 20%, 50%, 100%), jossa on kolme rinnakkaista laimennosta kohti. Kaikki tiedot otettiin huomioon.

kuusi tekniikkaa, jota ainakin kaksi laboratoriota, laboratorionväliset toistettavuus arvioitiin käyttämällä yleistys Cohen Kappa tilastojen mittaukseen yksimielisiä useita nopeuksia [13] . Itse asiassa, kukin 96 Näytteiden muodostuu

m

laboratoriot – jossa

m

vaihtelee 2-15 mukainen tekniikka-yhdeksi kahdeksasta toisensa poissulkevia luokkia. Kuten oli epäonnistumisia (kyvyttömyys tekniikka antaa mutaatio asema), laskennassa otetaan huomioon puuttuvat tiedot. Luottamusväli tosi yleistynyt Kappa kerroin laskettiin käyttäen bootstrap rs menetelmää, ottamaan sisäisen klusterin korrelaatio huomioon [14].

arvioimiseksi laboratorionsisäisen toistettavuutta tietyn

KRAS

genotyypityksen tekniikka, me lasketaan Kappa tilastotieto jokaiselle laboratorio, kuten edellä on kuvattu, perustuu kolmena kappaleena erissä. Sitten me tiivistää tulokset antamalla keskiarvo Kappa kertoimia, joiden kantomatka on Kappa kertoimien poikki laboratorioissa.

Diagnoosi tarkkuus havaitsemiseksi kunkin yksittäisen mutaation (kategorinen kultakannasta) arvioitiin kullekin tekniikka ja kunkin laboratorion. Käytetyt materiaalit kahden kierroksen voidaan katsoa kultakantaan aineista (solulinjat, validoitu kasvain DNA: t). Oli mahdollista arvioida herkkyys ja spesifisyys kullekin laboratoriossa solulinjan materiaalia ja FFPE DNA-näytteitä. Kunkin tekniikka, herkkyyttä ja spesifisyyttä mutaation (binary gold standard) laskettiin yhdistämällä tiedot kaikissa laboratorioissa. Suhde estimaattori varianssi aihekokonaisuuksien Binaaridatan jossa otetaan sisäinen klusterin korrelaatiot huomioon käytettiin laskettaessa 95% CI [15]. Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen SAS-ohjelmiston versioon 9.1.

Taloudellinen arviointi

viisi teknologiat verrattiin: ”suora sekvensointi”, ”tilannekuvia”, ”pyrosekvensointi”, ”High Resolution Melting” (HRM ), ”TaqMan®”. Kustannukset arvioitiin näkökulmasta katsottuna laboratoriossa microcosting ja aika-liike tutkimuksia. Arvioimme kiinteät ja muuttuvat kustannukset kunkin viiden teknologiat: työvoima, kulutustavarat (eli reagenssi ja muut kulutustavarat) sekä laitteet ja ulkopuolelle yleiskustannukset. Ostohinta käytettiin tarvikkeiden ja laitteiden kanssa 5 vuoden tasapoistoja ja työ arvostettiin käyttäen palkkasumma [16].

Kustannus Herkkyysanalyysi

Herkkyysanalyysi johti saada alue kustannusten siirtämällä eri parametreja. Parametrit olivat hintoihin (5% ja ± 10%) ja laboratorio määrä säädöksiä (Information S1).

Tulokset

analyysi Cell Line Tulokset

Yhdeksänkymmentäkuusi cell-line DNA näytteet lähetettiin 40 ranskalaisissa laboratorioissa, viisi laboratorioissa käytetty kahta eri seulontamenetelmiä johtavat 4320 raportoitu tuloksia. Koska 6 laboratorioissa ei teknisesti tunnista p.G12R mutaatio (Information S1), The p.G12R näytteitä ei oteta huomioon ja 3780 tulokset lopulta analysoitiin. Tuloksia verrattiin odotettuihin genotyyppien. Maailmanlaajuinen virhemäärä oli 10,6% (399/3780), mikä johtui pääasiassa vääriin negatiivisiin tuloksiin (89%, 357/399). Niistä, 307 testejä vastasi prosentteina kasvainsolujen 5% ja 50 mukana näytteiden korkeampi kasvainsolun suhteilla. 42 jäljellä virheet olivat analyyttistä vajaatoiminta (n = 25; 6%), vääriä positiivisia (n = 2, 0,5%) ja väärä mutaatio (n = 15, 4%). Sekvensointi syntyy kaikki vääriä positiivisia tuloksia ja osoittivat vääriä positiivisia 0,4% (2/540). Väärä mutaatio tehtäviä havaittiin sekvensointiin (0,8%, 11/1260) ja kuva (0,7%, 4/588).

tekniikat suoritetaan yli 2 laboratorioissa, herkkyys vaihteli 76%: sta 96% ja spesifisyys 95%: sta 100% (taulukko 1). Koskevat 5% kasvain näytteissä, alin herkkyys havaittiin jaksotus ja HRM joiden kokonaispituus havaitsemismäärä noin 40% verrattuna 89,7% löytynyt pyrosekvensointi. Tekninen vika oli 1,6% havaittiin Taqman johtuen ei-tulkinta 3 laboratoriot triplikaatit vastaava p.G12V (SW480 100%) homotsygoottisia näytteistä. Laboratorion sisäinen ja laboratorioiden välinen toistettavuus oli lähes täydellinen sopimuksiin ( 0,8 kaikille menetelmät) ja eivät riippuneet mutaatiota tyyppi (taulukko 2).

Analyysi kasvain Näyte Tulokset

Mitä FFPE kudoksia, 1128 data luotiin ja analysoitiin 24 yksittäistä kasvain näytteet (n = 47 menetelmiä, 40 eri laboratorioissa). Maailmanlaajuinen virhemäärä oli 1,8% (20/1128) 1 vääriä positiivisia, 7 vääriä negatiivisia, 9 analyyttinen vikoja ja 3 väärä mutaatio tehtävissä. Yksittäiset kasvainnäytteestä oikea puhelut vaihteli 100%: sta 76,6%, itse asiassa kaikki laboratoriot oikein genotyyppi 16/24 näytteitä ja yksi näyte (

KRAS

p.G12A näyte) tuottamat virheet 11 laboratoriossa. 6 Villityypin näytteessä oli genotyypin yhtä tapausta lukuun ottamatta olivat vääriä positiivisia raportoivat alleeliset syrjintä qPCR perustuva menetelmä, jossa PNA esto. Kolmekymmentäkaksi pois 47 tulosjoukkoja (laboratorio /menetelmä) luotu 0 virhe (68%), 13 teki 1 (28%), 2 teki 2 ja yksi tehty 3 (taulukko 3). Kolme virheet olivat 3 analyyttinen epäonnistumisia käyttäen pyrosekvensointi määritystä. Laboratorio käytetään myös suora sekvensointi yhden väärän negatiivisen tuloksen. Jos kliinisesti merkittäviä muutoksia (väärä positiivinen ja negatiivinen), ja jos parhaat tulokset otetaan huomioon, kun useampaa kuin yhtä menetelmää testattiin, 82,5% laboratorioista ei tehnyt virhettä ja onnistumisprosentti vaihteli 100 91,6. Loput virheet olivat 6 vääriä negatiivisia ja yksi väärä positiivinen 7 laboratorioissa. (Taulukko S1).

kohden Item

Microcosting arvioitiin päällä (n = 10 laboratoriota) Riippumattoman ryhmä terveystaloustieteilijöiden. Kustannukset annetaan per erä testi ja koko testiä kohti (taulukko 4). Ensimmäinen työvoimakustannukset vaihtelivat € 3,7 (TaqMan) ja € 11,4 (snapshot) testiä kohti johtuen erilaisia ​​käsittely- kestot per näyte 7,2 (TaqMan) 22,1 minuuttia (SNaPshot). Pienet erot laboratorioiden samanlaisella tekniikalla havaittiin takia hieman vaihtelua protokollia ja eri laitteiden, jotka vaikuttavat tehokkuuteen ja työvoimakustannukset. Lisäksi näytteiden määrä ajaa erää kohden indusoi myös työvoimakustannusten vaihtelu. Toiseksi, laitekustannukset testiä kohti vaihteli € 1,0 € 9,7 riippuen laboratorioita ja teknologioihin. Suora sekvensointi oli kallein tekniikka on yli 7 € per testi. Pyrosekvensointi, HRM ja TaqMan olivat edullisin teknologioita on alle 2 € per testi. Sequencer, Pyrosequencer ja qPCR lämpösyklerissä syntyy 84% laitekustannuksia. Koneen kohden testiä vaihtelivat keston kulkee, ostohintojen ja näytteiden enimmäismäärän erää kohti.

Kolmanneksi, tarvikkeet palkinnot testiä kohti vaihteli € 5,6 € 19,0. Toistojen lukumäärä, jollaisia ​​käytettyjen reagenssien, tekniset prosessit ja hintaneuvottelut selitti suurimman eroista laboratorioista käyttäen samaa tekniikkaa. Nämä erot olivat erityisen tärkeitä tilannekuvan tekniikkaa. Yksi snapshot laboratorio monistaa kokeiluja ja käyttää kalliimpia reagenssit, joka johtaa kolminkertaisesti korkeampia kuluvia kustannuksia verrattuna toiseen laboratorioon tutkittu.

Kokonaiskustannukset

Kokonaiskustannukset testiä kohden vaihteli € 10,6 € 34,8 ( Taulukko 4). Lisäksi kokonaiskustannukset HRM on otettava huomioon sekvensointi kustannuksia. Noin kaksi kolmasosaa näytteiden havaittiin kuin villityypin KRAS geenien HRM ja ei vaadi sekvensoinnilla. Havaitsimme nousu post ”HRM” sekvensointi kustannukset € 7 € 13 verrattuna suoraan sekvensointiin kustannuksia huolimatta vastaavien teknologioiden. Siksi maailmanlaajuinen kokonaiskustannukset kohti HRM testi vaihteli € 27,0 ja € 28,0.

Kustannus Herkkyysanalyysi

Herkkyys analyysi vahvisti, että TaqMan oli halvempaa kuin muut tekniikat (kuvio 1). Arvioidut kustannukset TaqMan olivat optimaaliset perustapauksessa. Sisällä huonommissa (viisi näytettä erää kohden ja 10% hintojen markup) TaqMan hinnat testiä kohden vaihteli € 15.7 € 20.1. Pyrosekvensointi kustannukset testiä kohti olivat alhaisemmat kuin 20,1 €, jos vähintään 15 näytettä erää kohden ajettiin.

Bleu timantteja harvinainen perustapauksen kustannuksia.

Keskustelu

Käyttö anti-EGFR monoklonaalisia vasta-aineita on rajoitettu 60 70% KRAS villityypin metastasoituneen Kolorektaalituumorien, antaa asianmukaiset tunnistaminen KRAS mutaatioiden keskeinen asia kliinisessä työssä [17], [18]. Lisäksi käytön rajoittaminen EGFR: n estäjien potilaille, joilla on villin tyypin KRAS voi olla mahdollinen ratkaisu kustannussäästöihin [19]. Testaamisen varmistamiseksi saavutettavuus, Inca on myöntänyt 28 alueellista molekyyligenetiikan keskuksia jopa 2,5 M € [20]. Tavoitteena maata laadunvalvonta verkko nimeltään MOKAECM tukemana Inca, oli arvioida eri itse kehitettyä menetelmiä molekyylien laboratorioita KRAS testaus rutiini olosuhteissa. Täällä samanlainen solulinjoja (4296) ja FFPE kasvainnäytteet ADNS (1152) lähetettiin eri osallistujille ja 5448 KRAS -genotyypitystulosten esitettiin ja analysoitiin. Mitä tulee solulinjat testi, virheprosentti oli 10,6%, havaitseminen cutoff vaihtelivat 5 ja 20% ja 86% vääriä negatiivisia liittyivät 5% laimennus. 1152 FFPE näytteen tulokset analysoitiin tässä tutkimuksessa, 68% testin sarjaa (menetelmä /laboratoriot) tunnisti oikein KRAS mutaatiostatuksesta riippumatta kaikissa FFPE näytteissä. Tämä tulos on verrattavissa pisteet raportoitu Euroopan KRAS EAQ järjestelmään (70%) [21]. Äskettäin KRAS mutaation analyysi kolorektaalisyövässä, mielivaltaiset kynnysarvot oikea

KRAS

mutaatio tunnistaminen asetettiin 97% [22]. Ottaen huomioon parhaat tulokset laboratorioiden testaus useampaa kuin yhtä menetelmää, keskimääräinen onnistumisprosentti FFPE näytteissä oli 98,5 ja vaihteli 100-+91,6% (Information S1). Nämä tulokset ovat mukaisesti tutkimuksen tulokset juoksi 10 laboratorioissa Alankomaissa [23]. Lisäksi epäonnistuminen saavuttaa yleinen testaus tapahtuma pisteet vähintään 80% määriteltiin epätyydyttävä kun testataan useampia tapauksia ”Clinical Laboratory Improvement Act of 1988 Ottaen huomioon tulokset kahdesta testaus asetetaan 96% ranskalaisista laboratorioista oli tyydyttävä pisteet yli 80%, joka osoittaa selvästi laatua KRAS testaus Ranskassa huolimatta suuri paneeli menetelmiä. Lisäksi joukossa vuonna 1152 kasvaimissa testattu, vain 20 virhettä raportoitu. Tämän tason virhe on tyydyttävä.

Kansallisesta näkökulmasta, on 1152 kasvaimen testejä tässä tutkimuksessa 20 virheitä (0,017 CI95% [0,01-0,027]) on raportoitu 11 osa kohdistuu yhden näytteen . Siksi korjatun virheprosentti oli 0,7% CI95% [0,03% -0,13%] testiä kohti ja kohti kasvain. Ekstrapolointia ehdottaa, että Ranskassa, ulos 18000 kasvainten analysoidaan vuosittain 54-234 kasvaimia voitaisiin misgenotyped.

genotyypin virheet voivat johtua erilaisista asioista tyypiksi fiksatiivi, säilyttämisen menettelyssä, arvioinnissa kasvain-solun sisällön ja lopulta esityksiä käytetyn menetelmän testaamiseen. Täällä, DNA: n uutto keskitettiin ja kasvainsolujen sisältöä vahvistanut 7 riippumattomien patologia siis vain

KRAS

genotyypitysmenetelmiä verrattiin. Kaikki valitut näytteet oli ensimmäinen validointi niiden KRAS aseman suorittamien kolme vertailulaboratorioiden kolmella eri menetelmällä. Monia erilaisia ​​tekniikoita, mukaan lukien kaupallisesti saatavilla sarjat, on kehitetty ja testattu, mutta puuttuminen tunnustetun vertailumenetelmällä tekee arvioinnin uuden teknologian vaikeaa.

Solun testausta ei välttämättä heijasta normaalirutiineja mutta käytettiin validointitestiä optimaalisissa olosuhteissa verrata herkkyyden ja spesifisyyden eri teknologioiden välillä. Näytteissä on tuumorisolulinja pitoisuus yli 20%, jota voidaan pitää kliinisesti merkittävänä, analyyttiset tulokset osoittivat lähes täydellisen sopimuksia. Näytteissä alle 20%, tulokset olivat heterogeenisiä, erityisesti suoralla sekvensoinnilla. Kokemuksemme mukaan HRM prescreening ei pelasta pieni kasvain pitoisuus näytteissä. Alempi herkkyys sekvensointimenetelmiin verrattuna muihin ei ollut yllätys [24], [25], [26], mutta tuloksemme myös huomauttaa, että suorituskyky voi riippua menetelmän optimoinnista ja asiantuntemuksen taso. Todellakin 7 laboratorioiden sekvensointia tai HRM-sekvensoinnilla oli alhainen virhe pisteet ( 10%) solulinjassa sarja mukaan lukien 5% cell näytteitä eikä virhettä kasvaimen sarjassa. Herkkyys näyttää liittyvän pari – metodologia /laboratorio-kokemus – pikemmin kuin tiukasti menetelmää, siis validointi ja havaitseminen sulku on arvioitava kunkin laboratorion. Kun alhainen herkkyys menetelmien käyttö genotyypin macrodissection sulku on oltava riittävästi valittava ja selkeä preanalytic suositukset on annettava patologeja ennen DNA: n uuttaminen. Riippumatta havaitsemismenetelmä, mutaation tyyppi voivat vaikuttaa herkkyyteen. Määrä virheistä oli noin 3% kanssa p.G12V yli 20% p.G12S ja p.G12A. Allelic määrällisesti 7 solulinjan DNA: ita käyttäen pyrosekvensointi ei antanut mitään asiaa selitys alennettu herkkyys havaita joitakin mutaatioita, ja termodynaamiset seuraukset DNA Sulamiskäyttäytyminen saattaa osittain selittää havainnon. Vuonna FFPE sarjassa virheprosentti oli 20/1128 (1,7%) vs. 399/3780 (10,6%) solulinjoissa, joille virheet olivat lähinnä 5% kasvainsolujen vääriä negatiivisia. Virheprosentti oli 2,6% solulinjojen samanlaisissa kasvaimen sisältöön olosuhteissa (vääriä negatiivisia johtuen 5% näytteistä pois) viittaa siihen, että kudos kiinnittäminen ei ollut esteenä

KRAS

testaus. Kuitenkin kiinnitys voisi hieman vaikuttaa vika tasoilla: 0,8% (9/1128) on FFPE näytteistä vs. 0,6% enemmän solulinjassa DNA: ita (25/3780). Menetelmien käyttö perustuu vahvistus pienten amplikonien voisi olla mahdollista vähentää tasolle kuin osallistumiskyvyn tulokset [27]. Tässä tutkimuksessa perustuvat menetelmät alleeliset perustuvan syrjinnän pieniä palasia vahvistusta ja reaaliaikainen PCR ei osoittanut epäonnistuminen vastaan ​​jopa 4% suoraa sekvensointia menetelmiä. Lopuksi FFPE sarjaan, 14% virheistä havaittiin yhdessä näytteessä, jolle kasvainsolun pitoisuus oli 50%, kun HES tarkastelun mutta kvantifiointiin mutatoituja alleeleja mukaan pyrosekvensointi ehdotti, että mutanttisoluista voisi vain edustavat 20% kaikista. Tämä voisi osaltaan selittää havaittujen erojen tälle näytteelle, mutta myös, että geneettiset variaatiot eivät jakaannu havaita. Yksi FFPE väärä positiivinen näyte tunnistettiin alleelin spesifinen monistuminen kanssa PNA esto. Sitä ei vahvistanut toiseen laboratorioon käyttävät samanlaista tekniikkaa ja sen vuoksi katsottiin, vääriä positiivisia. Lisäksi kliininen arvo mutatoitunut osa-klooni jää osoittanut [28], [29], [30], [31], [32].

kustannusarvion Rajoitukset

Tämä metodologia arvioinnin kustannuksista oli yhdellä kädellä, koska sama riippumatonta työryhmää arvioi kaikki tekniikka suoraan laboratorioissa. Viisi teknologioita tutkittiin microcosting kymmenessä laboratorioissa kolmasosan kaikista Ranskan ”alustoja”, joka suorittaa 25% kaikista

KRAS

mutaatioita testit metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaille Ranskassa vuonna 2009. Vaikka taso todisteiden voisi olla optimaalinen, koska se perustui 2 havaintojen kohti tekniikkaa, alleelinen erottelu käyttäen Taqman oli noin kaksi tai kolme kertaa halvempaa kuin mikään muu tekniikka tutkittu. Kustannukset vaihtelu yhden tekniikan tai välillä tekniikat voivat johtua erilaisista menettelyistä. Itse menetelmät eivät ole täysin samanlaisia, vaikka laboratorioissa käyttävät samanlaista tekniikkaa, ja eriasteista optimoinnin raportoitu. Esimerkkinä oli hallinnassa testausmenetelmää – positiivisten ja negatiivisten kontrollien määrä rinnakkaisnäytteiden ja määrää lisätään toimiin menettelyä kuten geeli kulkeutumista PCR-tuotteiden. Nämä lisäkustannukset arvostettiin. Jotka koskevat kustannusten laitteet saturaatio hypoteesi asetettiin nopeudella kahdeksan tuntia työpäivää kohden viiden vuoden. Tämä voisi olla todellisesta tilanteesta laboratorioita ja arvioidut kustannukset aliarvioitu todellisia kustannuksia laboratorioissa. Lisäksi mukaan kylläisyyttä hypoteesi laitteita, oletetaan, että odotettavissa oleva elinikä koneita oli samanlainen tahansa koneen tietoja ei ollut saatavilla todellisesta elinajanodote koneita. Kaikkiaan microcosting tiedot osoittivat, että ”in-house” teknologiaa kustannukset olivat paljon alhaisemmat kuin kaupallisia pakkauksia, lukuun ottamatta laitteita ja työvoimakustannukset.

Johtopäätös

Ranskan väestöstä oli 65.027.000 asukasta vuonna 2011. Kaksikymmentä kahdeksan alueellista molekyyligenetiikan keskuksissa, joka kattaa kaikki alueet ja koordinoida 46 laboratoriot ovat nyt mukana olevassa analyysissä 16000

KRAS

testaus metastasoituneen kolorektaalisyövän vuosittain. Koko verkko on kansallisesti hallinnoi Inca. Tämä laadunvalvontaohjelmaa oli ensimmäinen maanlaajuinen kokemusta 120 samanlainen analysoiden näytteet 40 eri laboratorioissa. Tuloksemme osoittavat, että kun kliinisesti merkittäviä tuloksia pidetään 82,5% laboratorioiden tunnistettu oikein

KRAS

mutaatiostatuksesta riippumatta kaikissa FFPE näytteissä. Tämä työ viittaa myös siihen, että vaikka kaikki menetelmät sopivat

KRAS

testaus, joiden keskimääräiset kustannukset 35 € per testi ilman preanalytical vaiheet, eroja suhteen herkkyyttä ja kestävyyttä. Valinta menetelmä on todennäköisesti riippuu laitteiden ja teknisen asiantuntemuksensa paikallisesti. Tämä laatu Ohjelma tarjosi perustason kuvan

KRAS

testaus Ranskassa. Se osoitti, että on mahdollista alennettuun hintaan asettaa valtakunnallinen ohjelma, se havaittiin virheitä testausmenetelmiä laboratorioita korostetaan optimoinnin, sisäinen validointi ja laadunvalvonta prosessien käyttämällä suurta paneelia mutaatioiden.

tukeminen Information

Information S1.

yksityiskohdat aineisto ja menetelmät.

doi: 10,1371 /journal.pone.0068945.s001

(DOC) B Taulukko S1.

Näyttää yksityiskohtaiset genotyyppien tietoja FFPE näytteitä laboratorioon (N = 40). Paras

KRAS

tulokset pidettiin laboratorio- käyttämällä useampaa kuin yhtä teknologiaa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0068945.s002

(XLSX) B

Kiitokset

Kiitämme Ranskan National Cancer Institute ja STIC 2008 Audrey DIDELOT, Claire Mulot, Karine Pallier niiden taloudellista ja teknistä tukea. Kiitämme patologien että tarkistetaan 24 HES diat kasvainsolun prosenttiosuuden arviointi Frédéric Bibeau (Centre Val d’Aurelle, Montpellier), Pascale Cervera (Hôpital St-Antoine, Pariisi), Françoise PIARD (CHU de Dijon), Jean-Christophe Sabourin (CHU de Rouen), Jannick Selves (Hôpital Purpan, Toulouse) ja Frédérique Penault-Llorca (Centre Jean Perrin, Clermont-Ferrand).

jäsenet MOKAECM yhteistyöryhmä ovat: Marie-Pierre Gaub; Isabelle Soubeyran; Hugues Begueret; Frédérique Penault-Llorca; Agnès Hardouin; Françoise PIARD; Jean Mosser; Cédric Le Marechal; Chantal Delvincourt; Christine Clavel; Christophe Ferrand; Olivier Schischmanoff; Nathalie Theou-Anton; Antoinette Lemoine-konsoli; Lascols Olivier; Hugues DE;