Krooninen sairaus

tiivistelmä

diagnoosin, suurin osa haimasyövän potilailla esiintyy edennyt sairaus, kun parantava resektio ei ole enää mahdollinen ja nykyiset terapeuttiset hoidot ovat yleensä tehotonta. Parannettu ymmärrystä molekyylikohteista tehokkaan intervention haimasyövän on siis kiireellinen. Met-reseptori tyrosiinikinaasi on yksi ehdokas osallisina haimasyöpä. Erityisesti Met on yli ilmaistaan ​​jopa 80% invasiivisista haimasyövistä mutta ei normaalissa duktaalisessa soluissa korreloi ottaen heikkoa elossaololuku ja lisääntynyt uusiutuminen leikkaushaavan resektion. Kuitenkin toiminnallista roolia Met signaloinnin haimasyövän edelleen huonosti. Täällä käytetään RNA-interferenssiä suoraan tutkia pathobiological tärkeää lisätä Met signalointi haimasyöpä. Osoitamme, että Met Knockdown haiman tuumorisoluissa johtaa vähentynyt solujen eloonjäämistä, solujen invaasiota, ja muuttoliike kollageeni I

in vitro

. Käyttämällä potilaalle tehdä mallin haimasyöpä, tarjoamme

in vivo

todisteita siitä, että Met Knockdown vähensi kasvainten taakka korreloi vähentynyt solujen eloonjäämistä ja tuumoriangiogeneesissa, jossa pieni vaikutus solujen kasvuun. Erityisesti, me raportoimme, että Met signalointi säätelee eritystä angiogeneesiä kemokiini interleukiini-8 /CXCL8. Tuloksemme osoittavat, että interleukiini-8-reseptorien CXCR1 ja CXCR2 eivät ole ilmaisseet haimasyöpäkasvainsoluissa ehdottaa paracrine mekanismi, jonka Met signalointi säätelee interleukiini-8 eritystä uudistaa kasvain microenvironment, uusi havainto, joka voisi olla tärkeitä kliinisiä parantamiseksi tehokkuutta hoitoja haimasyöpään.

Citation: Hill KS, Gaziova I, Harrigal L, Guerra YA, Qiu S, Sastry SK, et ai. (2012) Met Reseptorityrosiinikinaasin Signaling indusoi eritys angiogeenisen Kemokiini interleukiini-8 /CXCL8 in Haimasyöpä. PLoS ONE 7 (7): e40420. doi: 10,1371 /journal.pone.0040420

Toimittaja: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 helmikuu 2012; Hyväksytty: 6 kesäkuu 2012; Julkaistu: 17 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Hill et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Institutes of Health CA-119075 Lae, DK-052067 on CDL, ja CA-118405 SKS K.S.H. tukivat koulutusta avustus NIH /NCI Monitieteinen Training in Cancer Research, T32 (CA117834-03). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on aggressiivinen syöpä mediaani potilaan eloonjäämisprosentti alle vuoden, joten se neljänneksi suurin syy syöpäkuolemista Yhdysvalloissa [1]. Korkea kuolleisuus PDAC potilaiden johtuu useista tekijöistä. Koska tehokkaiden seulontamenetelmiä, 80-85% potilaista on kehittynyt sairaus, joka usein esteenä parantava resektio [2]. Lisäksi standardi hoitoja edenneen taudin ovat pitkälti tehottomia [3], [4]. Näin on kiireellinen tarve ymmärtää molekyyliperustan PDAC kasvun kohteiden tunnistamiseen korkea terapeuttinen arvo. Viimeaikaiset geneettinen analyysi haimatuumorien tunnistettu useita geneettisiä mutaatioita yhteisiä 75-90% potilaan tapauksista tärkeää PDAC aloittamisen ja myöhemmän kehityksen preinvasive haiman epiteelinsisäisen kasvaimet (PanINs 1-3) [5] – [7]. Tästä samaa mieltä, geenitekniikalla hiiri malleja PDAC ovat vahvistaneet roolin geneettisen mutaatioiden aloittamisen ja kehittämisen alkuvaiheessa sairauden. Esimerkkejä ovat PANIN-1 (Kras aktivointi, menetys Notch2) [8], [9], PANIN-2 (toimintakyvyn menetystä mutaatioiden kasvaimen p53 ja p16INK4a) [10] ja PANIN-3 (inaktivointi p53, Smad4 /DPC4 ja BRCA2) [8], [11], [12]. Vastakohtana näille alkuvaiheen preinvasive vaurioita, PDAC on puute määriteltyjen mekanismien.

Useat signalointipolkujen todennäköisesti mukana PDAC. Yksi ehdokas on Met /hepatosyyttikasvutekijä (HGF) signalointia akselilla. Fysiologisissa olosuhteissa, Met-reseptorityrosiinikinaasin ja sen ligandi HGF ilmaistaan ​​matalalla tasolla haiman asinaarisoluissa ja strooman osaston vastaavasti [13] – [15]. Parakriinisen sitoutuminen HGF Met johtaa reseptorin fosforylaation, mikä lisää solun eloonjäämistä ja liikkuvuus [16], [17]. Toisin kuin keuhkojen ja mahalaukun adenokarsinooman jotka aktivoivat mutaatiot pidentävät Met signalointi, kuten voitto-of-function Met mutaatiot ole vielä tunnistettu PDAC. Normaali haiman kanavat ilmaista alhainen Met tasoja. Kääntäen Met on yli-ilmentynyt jopa 80% PDAC tapauksista [18], on vahva indikaattori nousi uusiutuminen ja yleisesti huonon PDAC elossaololuku [13], [19] – [22]. Met ilme on läsnä korkeintaan 29 tuumorigeenisia haiman solulinjoissa erilaisilla geneettiset taustat, mukaan lukien ASPC-1, Panc-1, BxPC-3 ja Suit-2-soluissa [13], [23]. Poikkeuksena on huonosti eriytetty MIA PaCa-2 solulinjaa, joka ei ekspressoi endogeenistä Met [13], [23]. Äskettäin Met pienmolekyylisalpaaja- SGX523 ilmoitettiin kasvun vähentämiseksi ja soluttautumista ihonalaisen haimatuumorien [24] herättämään kiinnostusta Met mahdollisena terapeuttisena kohteena edenneen taudin. Kuitenkin tarkka rooli Met signalointi PDAC on edelleen ratkaisematta.

Tässä tutkimuksessa käytimme RNA-interferenssi vähentämiseen Met signalointia ihmisen haiman ksenografteissa käyttämällä

in vivo

hiiren potilaalle tehdä malli. Met taintumisen (MetKD) solut pysyivät toimivaltainen muodostamiseksi potilaalle tehdä haimatuumorien

in vivo

; kuitenkin, tuloksena MetKD ksenograftit olivat merkittävästi kasvua inhiboivat suhteessa kasvaimia, jotka johtuvat ohjaus soluista, jotka ilmentävät ei kohdistaminen (NT) shRNA. Immunohistokemiallinen analyysi MetKD ksenograftien osoittivat lisääntynyttä apoptoosia mukana alentunut solujen lisääntymisen ja keskimääräinen suonitiheys (MVD kehällä MetKD ksenograftien. Tämän mukaisesti skenaario, osoitamme, että Met knockdown vähentää eritystä interleukiini-8 /CXCL8 (IL-8) , joka on voimakas pro-angiogeeninen kemokiinin, joka toimii parakriininen säätelijänä endoteelisolujen proliferaation, aktivaattori neutrofiilien ja kemoattraktantti fibroblastien ja muiden immuunijärjestelmän solujen [25]. Havaintomme, että Met on ylävirran säätelijä IL-8 eritys on merkittävä ja ehdottaa yksi mekanismi, jonka Met signalointi voisi säädellä haimasyöpä

in vivo

, uusi havainto, joka saattaa tarjota ainutlaatuisia mahdollisuuksia kliinistä interventiota.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Kaikki eläimet hoidettiin mukaisesti toimiston Protection Research riskit (OPRR) ja Eläinsuojelulain suuntaviivoja eläimen protokolla hyväksymä Teksasin yliopiston MD Anderson Institutional animal Care ja käyttö komitea. Tutkimus hyväksyttiin Teksasin yliopiston MD Anderson Institutional Animal Care ja käyttö komitea.

Antibodies, Cell Lines ja huolto

Vasta-aine C-pään Met (C-28 ) hankittiin Santa Cruz Biotechnology. Hiiren monoklonaalinen vasta-aine β-aktiini ostettiin Sigma. Site-specific anti-fosfo tyrosiini vasta-aineita Met Y1234 /1235 olivat Upstate. Vasta-aine, joka on spesifinen solunulkoisen domeenin Met (anti-hHGFR) ostettiin R 1D).

BxPC-3 (A) tai ASPC- 1 (B) solut infektoitiin yhdistelmä lentiviruksen ilmentävät Met pudotus shRNAs (2 tai 5) tai ei kohdistaminen (NT) shRNA käsiteltiin ilman (-) tai (+), HGF ja tutkittiin Western-analyysi pMet (Y1234 /1235) , Met, pErk1 /2, Erk1 /2, Pakt, AKT ja β-aktiinin tasot (n = 3). Virtaussytometria havaittu vähentää Met pinnan ilmentymistä BxPC-3 (C) ja ASPC-1 (D) MetKD solujen suhteessa NT-soluja. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona tilassa +/- SEM (*** p 0,001, ANOVA, n = 3). Alennettu ankkurointi riippumaton kasvu BxPC-3 (E) ja ASPC-1 (F) MetKD solujen pehmeässä agarissa suhteessa NT-soluja (*** p 0,001, ANOVA, n = 3). Met Knockdown oli vain vähäinen vaikutus kasvuun BxPC-3 (G) ja ASPC-1 (H) MetKD solujen suhteessa NT soluihin.

Sen arvioimiseksi, Met signalointi vaikuttaa Tuumorigeenisuustutkimuksissa BxPC- 3 ja ASPC-1-solut, suoritimme ankkurointi riippumaton kasvu määrityksissä pehmeässä agarissa. NT ja MetKD soluja ympättiin 0,4% agaroosia läsnä ollessa tai ilman HGF määrä ja saadut pesäkkeet, joka määritellään klusterin kolme tai useampia soluja pisteytettiin. NT solulinjoissa, HGF-hoito johti merkittävään kasvuun pesäkkeiden lukumäärä läsnä pehmeässä agarissa sopusoinnussa rooli Met signaloinnin kiinnityspisteen riippumattoman solujen kasvun. Toisaalta HGF-käsiteltyjen MetKD solut osoittivat alentunut kyky kasvaa kiinnityskohdassa itsenäisesti pehmeässä agarissa (kuvio 1 E 1F). Me seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus Met Knockdown on HGF-indusoitua proliferaatiota. Mielenkiintoista on, että HGF-indusoitua proliferaatiota ei vaikuttanut Met pudotus on BxPC-3 ja ASPC-1-soluissa (kuvio 1G 1 H).

vaikutus Met pudotus on HGF-indusoitua solumigraatiota tutkittiin käyttämällä haavojen määritys. Kuten on esitetty kuvioissa 2A B (tukeminen Information S1), MetKD solut johdonmukaisesti oli vähentynyt HGF-indusoitua motiliteettia verrattuna NT soluihin. Käyttämällä Matrigel-pohjainen invaasiomääritys, me osoittavat myös, että menetys Met signalointi vähensi merkittävästi invasiivisen fenotyypin BxPC-3 MetKD soluja (kuvio 2C). PDAC on ominaista runsas desmoplastic strooman joka on hyvin rikastettu soluväliaineen komponentteja kuten kollageenia I. Sen seurauksena suoritimme elävien solujen kuvantamistutkimukset mitata eroja HGF aiheuttama muuttoliike ASPC-1 NT ja MetKD solulinjoissa ympättiin kollageenin I (kuvio 2D). Solujen annettiin tarttua 1 h kollageeni I ennen hoidon HGF, jonka jälkeen elävät migraatiota tutkittiin mittaamalla koko reitin pituus vaeltavien solujen yli 2 tunnin ajan. Koska HGF, vertailukelpoinen vaellusreitillä pituudet havaittiin varten ASPC-1 MetKD ja NT solujen (NT: 87,2 um +/- 12,0; MetKD-2: 112,1 um +/- 12,3; MetKD-5: 76,5 um +/- 7.0) (kuvio 2D). Hoidon HGF lisäsi reitin pituus APSC-1 NT-soluja (216,7 um +/- 13,1), korreloi lisääntyneen solun nopeudella (tietoja ei esitetty). Toisaalta HGF hoito MetKD-2 ja MetKD-5-solut eivät johda lisääntynyt reitin pituus (Elokuva S1, Elokuva S2, elokuva S3). Näin ollen Met knockdown johtaa laski ASPC-1 solumigraatio kollageeni I

Serum-köyhdytettyä, konfluentteja NT tai MetKD BxPC-3 (A) tai ASPC-1 (B) solut haavoittui naarmuuntumista, kuusi aluetta on merkitty, ja heti kuvaamisen (0 tuntia) ennen käsittelyä HGF. Identtiset alueet pitkin naarmu oli kuvattu jälkeen 3, 9, 18, ja 24 tunnin ja arvot normalisoitiin alkuperäiseen kokoon tyhjästä 0 tuntia. Solumigraation raportoidaan että% kaventaminen kunakin ajankohtana (*** p 0,001; ANOVA, n = 3). MetKD vähentää BxPC-3 soluinvaasion vasteena HGF suhteessa kontrolliin solut (C). Arvot edustavat kertainen muutos solujen määrä /kentän ja raportoidaan keskiarvona +/- SEM (*** p 0,001; ANOVA, n = 3). Elävien solujen kuvantaminen ASPC-1 MetKD solut maljattiin kollageeni I-pinnoitettu lasipohja soluviljelymaljoille määrä aleni soluvaelluksen vastauksena 100 ng /ml HGF (D). Kuvat kerättiin joka 2. min yhteensä 120 min ja data ilmaistaan ​​keskimääräinen kantomatka +/- SEM per ehto (*** p 0,001; ANOVA, n 30 solua).

Met knockdown heikentää

in vivo

Tumor Growth

pyrittiin tutkimaan seuraus Met häiriintyminen kasvaimen kasvuun

in vivo

käyttäen potilaalle tehdä hiirimallissa haimasyöpä . Koska rajat lajien erot vuorovaikutuksessa hiiren HGF ihmisen Met on raportoitu [31], ensin käytettiin Western-analyysi vahvistaa, että aktivointi ihmisen Met hiiren HGF BxPC-3 ja ASPC-1-soluja. Käyttämällä olosuhteissa, joiden seurauksena maksimaalinen Metin fosforylaatio ihmisen HGF, osoitamme, että ihmisen Met aktivoitiin hiiren ja ihmisen ligandin käyttäen paikkasidonnainen anti-Met fosfo-tyrosiini vasta-aineita ja Western-analyysi (kuvio 3A 0,01 *** p 0,001, ANOVA, kaksi erillistä koetta). Kasvaimen koko mitattiin joka 10 päivää käyttäen

in vivo

bioluminesoiviin Imaging BxPC-3 (C) tai ASPC-1 (D) solut injektion ja raportoidaan keskimääräinen kasvaimen kokoon fotoneja /sec /cm

2 (* p 0,05, ** p 0,01, ANOVA). Edustaja bioluminoivat kuvat näytetään välittömästi ennen ruumiinavausta on 30 päivää (BxPC-3) tai 45 päivää (ASPC-1). Paino ja ilmaantuvuus (%) of BxPC-3 primaarikasvainten (E) ja ASPC-1 (F) ensisijaisen ja etäpesäkkeitä on lueteltu. Vakaa pudotus Met-mRNA BxPC-3 (G) ja ASPC-1 (H) MetKD ksenografteissa vahvistettiin käyttäen qRT-PCR: ää. Data normalisoitiin GADPH ja ilmoitetaan suhteessa vastaaviin NT ohjaus (** p0.01; *** p 0,001, ANOVA, n = 2).

vaikutuksen tutkimiseksi Met pudotus on PDAC kasvuun, käytimme BxPC-3 ja ASPC-1-solujen esi-leimattu tulikärpäsen lusiferaasi seurata kasvaimen taakkaa ei-invasiivisesti [26]. Yhtä suuret määrät MetKD ja NT-ohjaus solut ruiskutetaan kehoon haiman Kateenkorvattomien nude-hiirten ja kasvaimen taakkaa kvantitatiivisesti käyttämällä

in vivo

bioluminesenssi [26]. Voimakas kasvaimen kasvua havaittiin hiirissä injektoitiin kontrolli soluissa, jotka ilmentävät NT shRNA (kuvio 3C 3D). Toisaalta, kasvaimen esiintymistiheys ja taakka väheni merkittävästi hiirissä, joihin injektoitiin MetKD BxPC-3 tai ASPC-1-soluja. Ruumiinavauksessa (40 ja 45 päivää varten BxPC-3 ja ASPC-1 hiiriin on injektoitu vastaavasti), pieniä kasvaimia massat havaita helposti haimasta injektoidaan BxPC-3 MetKD-2-soluissa, mutta ei BxPC-3 MetKD-5-soluissa (kuvio 3C ja 3E). Tämä ei johtunut ongelmia kasvain kylvö, niin pieni kasvain kentät olivat helposti havaittavissa mikroskooppisesti H 3H). Siten menetys Met signaloinnin BxPC-3 ja ASPC-1-solujen heikentää kasvaintaakkaa

in vivo

.

Met Signaling Remodels kasvaimen verisuonistossa

Orthotopic ASPC-1 kasvaimet poistettiin ja käsiteltiin tarkempaa analysointia varten. Immunosaostaminen ja Western-analyysi ihmisen Met että potilaalle tehdä kasvaimissa vahvisti aktivoitumista ihmisen Met miten hiiren HGF

in vivo

(kuvio 4A), vastaa meidän aikaisempiin tutkimuksiin osoittavat aktivoitumista ihmisen Met yhdistelmä hiiren HGF (katso kuva 3A 0,01, *** p 0,001 ; ANOVA). Edustava kenttä kuvia näytetään.

Met Signaling Edistää eritys angiogeenisten tekijöiden

Met signalointi on osoitettu edistävän remodeling kasvaimen verisuonistossa rintasyövän ja kohdun kasvainten säätely VEGF ja alas säätely trombospondiini-1 (TSP-1) [35]. VEGF on voimakas agonisti angiogeneesin, joka aktivoi sekä endoteelisolujen proliferaatio ja migraatio. Oppositiossa TSP-1 estää angiogeneesiä estämällä endoteelisolujen proliferaatiota ja indusoimalla endoteelisolujen apoptoosin.