Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ccs3

lokuksen hiirikromosomi- 3 säätelee ero alttius A /J (A, herkät) ja C57BL /6J (B6, kestävä) hiirilajilla kemiallisesti aiheuttama peräsuolen syöpä (CRC). Tässä raportoimme korkean resoluution asennon kartoitus geenin taustalla

Ccs3

vaikutus. Käyttämällä fenotyyppi /genotyyppi korrelaatio sarjassa 33 ACB /BCA rekombinantti kongeeniset hiirikantojen sekä ryhmissä takaisinristeytysanalyysillä populaatioiden varustettujen ainutlaatuinen yhdistelmä-kromosomien aikajaksolle ja subcongenic kantoja, olemme rajattuja maksimikoko

Ccs3

fyysinen väli on ~2.15 Mb segmenttiin. Tämä aikaväli sisältää 12 selityksin selostukset. Sekvenssointi asentohuimaus ehdokkaiden A ja B6 tunnistettu useita joko matalan prioriteetin koodaus muuttuu tai ei-proteiinia koodaavan variantteja. Löysimme yksilöllinen kopiomäärä variantti (CNV) intronissa 15

Nfkb1

geeni. CNV koostuu kaksi kopiota 54 emäsparin sekvenssin välittömässä läheisyydessä eksonin 15 silmukoitumiskohta, kun taas vain yksi kopio löytyy CRC-alttiiden A. Nfkb1 proteiini (p105 /p50) ilmentyminen on paljon vähäisempi A kasvaimissa verrattuna normaaliin paksusuolen epiteelin analysoituna immunohistokemiallisesti. Tutkimukset ensisijainen makrofageissa A ja B6 hiiriin osoittaa selvästi ero aktivointi NFKB-reitin lipopolysakkaridia (kinetiikka stimulaatiota ja enimmäismäärät fosforyloitua IκBα), jossa on vakaampi aktivointi liittyessä vastustuskykyä CRC. NFKB on aiemmin liitetty säännellä homeostaasin ja tulehdusreaktio suoliston limakalvolla. Aikaväli sisältää toisen asennon ehdokas

Slc39a8

joka ilmentyy differentiaalisesti A vastaan ​​B6 kaksoispisteet ja joka on hiljattain liittynyt CRC kasvaimen aggressiivisuus ihmisillä.

Citation: Meunier C, Van Der Kraak L, Turbide C, Groulx N, Labouba I, Cingolani P, et ai. (2013) Paikantamiseen kartoitus ja Candidate Gene Analyysi hiiri

Ccs3

Locus joka säätelee Differential Alttius karsinogeeni indusoitu peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (3): e58733. doi: 10,1371 /journal.pone.0058733

Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 joulukuu 2012; Hyväksytty: 05 helmikuu 2013; Julkaistu: 14 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Meunier et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkimusapurahoja TJ ja NB Kanadan Cancer Society Research Institute [www.cancer.ca/Research.aspx], Cancer Research Society Inc. [www.src-crs.ca/en-CA] ja Canderel Initiative Program [www.deficanderel.com/3/donate.htm] on Goodman Cancer Research Centre [cancercentre.mcgill.ca/research/]. PG on James McGill biokemian professori. CM sai stipendi tukea ja matkustaa palkintoja McGill Integrated Cancer Research Training Program (MICRTP) ja Peter Quinlan Foundation [www.mcgill.ca/gcc-research/funding/] kautta McGill University lääketieteellisen tiedekunnan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

patogeneesi peräsuolen syöpä (CRC) liittyy peräkkäinen mutaatioiden erityisiä geenejä, mikä aiheuttaa portaittain etenemistä pre-neoplastisia vaurioita täyteen puhallettu adenokarsinooma [1]. Histopatologisia vaiheissa korreloi somaattisten molekyyli- uudelleenjärjestelyjä on kuvattu hyvin [1], [2]. Kuitenkin vasta viime vuosina ja kynnyksellä genomin laajuinen yhdistys tutkimukset on monimutkaisuus vuonna vaikuttavien geneettisten ja ympäristöön vaikuttavat etiologiaa paksu- ja peräsuolisyövän arvostettu [3], [4], [5] , [6].

pieni osa CRC tapauksista ( 10%), selkeä ja erittäin läpitunkeva neste geneettinen tekijä voidaan havaita perinnöllinen syöpien hoitamiseksi, mikä tärkeintä familiaalinen adenomatoottisen polypoosin (FAP), Lynch oireyhtymä (Perinnöllinen ei-polyposis paksusuolen syövän) ja vuorotellen, tulehdukselliset suolistosairaudet (IBD) -sidoksellisia CRC [7], [8]. Toisaalta, suurin osa CRC tapauksissa ( 90%) ovat satunnaisia, joilla ei ole aiempaa suvussa. Etiologia satunnaista CRC sisältyy kaksisuuntainen vuorovaikutus monimutkainen geneettinen komponentti, ja huonosti määriteltyjä ympäristötekijät [3], [6]. Tähän mennessä peräti 16-20 yhteisiä alhaisen penetraation variantit on tunnistettu genomin laajuinen yhdistys tutkimukset (GWAS) ihmisen satunnaista CRC [9], [10]. Lähes puolet näistä loci ovat tiukasti sidoksissa tai alleelista kanssa komponenttien TGFß signalointireitin: Smad7, GREM1, BMP2, BMP4, RHPN2 ja LAMA5 ([11], [12], tarkistetaan [13]). Toisaalta, on ehdotettu, että niin paljon kuin 170 kuten loci voivat myötävaikuttaa CRC alttius ihmisellä [13].

Yli 25%: ssa kaikista syövistä arvellaan liittyvän krooninen infektio, tulehdusta tai muun tyyppisiä tulehdusvasteen [14]. Krooninen tulehdus on hiljattain arvostettu merkittävä tekijä etiologiaa CRC ihmisellä [15], [16], tarkistetaan [13]. Näin ollen potilaat, joita tulehduksellisten suolistosairauksien (IBD) on paljon suurempi riski kehittää koliitti liittyvää (CA) CRC, laajuus koliitin ilmentymä korreloi esiintyvyys CA-CRC [17]. Lisäksi, ei-steroidiset anti-inflammatoriset lääkkeet (NSAID) osoittavat suojaava vaikutus eri syöpien [18]. Mielenkiintoista, useat avaintekijät TGFp välittämän Th17 ja Th1 immuunivastetta väyliä on äskettäin tunnistettu alhaisen penetraation lokusten liittyvät IBD puhkeamiseen, mikä voisi sotkea TGFli signalointi molempiin IBD-sidottu sekä satunnaisia ​​CRC ([15], [ ,,,0],16], tarkistetaan [19], [20]).

hiiri on arvokas kokeellinen malli leikellä monimutkainen geneettinen komponentti ihmisen CRC. Hiiret ovat saatavilla sisäsiittoisia kantoja vahvistettu homotsygoottisiksi eri alleeliset variantit edustavat laaja geneettinen monimuotoisuus on avain geenien ja väyliä merkitystä CRC synnyssä. Lisäksi CRC voidaan indusoida toistettavissa ja hyvin hallitulla tavalla kemiallisella perimän muutoksia kuten azoxymethane (AOM) [21], [22]. Tuloksena kasvaimet muistuttavat niiden ihmisen vastine suhteen histopatologia (poikkeavasta krypta pesäkkeitä sinoomaan

in situ

) ja taustalla geneettisiä muutoksia (mutaatioita

APC

,

Kras

ja

ß-kateniinin

) [23], [24]. Sisäsiittoinen hiirikantoja tuntuvia eroja herkkyydessä karsinogeeni aiheuttama CRC ja klassista sidos analyysit informatiivinen ristit ovat lokalisoitu useita loci jotka säätelevät välistä eroa kantojen välillä herkkyys [25], esimerkiksi

Ccs1

[26],

Ssic1

[27], ja

Ccs2

[28]. Parallel tutkimukset kongeeniset kantoja peräisin BALB /Chea ja STS /A ehdotti joukon lisälokuksia (

SCC1

osoitteeseen

Scc15

) vaikuttavat vastaus karsinogeeni aiheuttamaa CRC [29], [30 ]. Niistä, paikkasidonnainen kloonaus

SCC1

lokuksen johti tunnistamiseen

Ptprj

aiheuttaviin geeni, ja somaattisen uudelleenjärjestelyt sisällä ihmisen homologin

PTPRJ

tunnistettu ihmisen CRC [31], [32].

AOM kemiallisen karsinogeneesin malli, C57BL /6J-kannan (B6) on kestävä muutamia CRC kasvaimia pani 18 viikkoa hoidon aloittamisesta (tyypillisesti 0-5 kasvaimet), kun taas A /J (A) ovat erittäin herkkiä kanssa kasvainten lukumäärää vaihtelee 20-50 [33]. Meidän lab, olemme käyttäneet joukko ACB /BCA rekombinantti kongeeniset hiiri riviä (RCS) johdettu CRC kestävästä B6 ja CRC-altis A geneettisen taustatekijät vastuussa ero herkkyys näiden kantojen AOM aiheuttama CRC. 13 ACB ja 22 BCA kantoja johdettiin systemaattisesti sisäsiitos peräisin kaksinkertainen takaisinristeytysanalyysillä (N3), ja kukin kanta sisältää pienen määrän (12,5%) DNA vanhemmalta vahvistetaan joukko erillisiä kongeeniset segmenttien (kartoitettu genotyypitys) on taustalla (87,5%) toisen vanhemman. Yksittäiset vastus /alttiuslokukset edistää monimutkainen piirre voi eristää yksittäisissä RCS ja voidaan tutkia yksitellen, helpottaa geenin tunnistaminen tutkimuksia. Tämä johti kartoitus kolmen loci (

Ccs3

,

Ccs4

,

Ccs5

) säännellään vastaus AOM aiheuttama CRC näissä kannoissa [33], [34] , [35].

Ccs3

lokus määrää alkuperäisestä alttiutta AOM aiheuttama CRC (ulkonäkö adenoomia), kun taas

Ccs5

lokus säätelee kasvainten lukumäärää sisältämiin eläimiin alttiusalleelien osoitteessa

Ccs3

[ ,,,0],34].

Ccs3

lokus kartoitettiin 14 Mb segmentin keskiosa kromosomi 3. Tämä väli on 94 selityksin selostukset, ja useat näistä geeneistä osoittavat vahvaa ilmaisua paksusuolessa, itse säänneltävä kannan suhteen spesifisiä muoti.

nykyisessä tutkimuksessa olemme tehneet geneettisiä analyysejä ACB /BCA kantoja ja ristit niistä johdetut kaventamaan kokoon

Ccs3

geneettinen väli 2,2 Mb. Olemme lisäksi tunnusomaista geenit ennen määräajan ilmaisun profilointi ja genomisen DNA: n sekvensointi.

Tulokset

rajaukset Ccs3 aikaväli ACB /BCA rekombinantti kongeeniset ja AxB /BXA rekombinantti sisäsiittoisia kantoja

fenotyypitystä alaryhmä 23 ACB /BCA kantojen herkkyyttä AOM aiheuttama CRC aluksi osoitti, että ero alttiutta ja B6 hiirilajilla CRC säätelee yksi lokus nimetty

Ccs3

. Näissä tutkimuksissa

Ccs3

kartoitettiin 14 Mb segmentin keskiosa kromosomin 3 [33]. Paremmin rajata

Ccs3

geneettinen välein, me fenotyypitettiin ylimääräisiä ACB /BCA kannat (on yhteensä 33 kantoja), sekä osajoukko AXB /BXA kantoja (AXB19, AXB24, BXA2, BXA8, BXA12 ), joitakin näistä kannoista varustettujen informatiivinen yhdistelmä-haplotyyppien

Ccs3

alue. Ryhmää hiiriä käsiteltiin 1 viikoittainen annos AOM pistoksena 8 viikkoa, ja 11 viikkoa myöhemmin, eläimet tapettiin, kaksoispisteet kerättiin ja kasvainten pisteytettiin. Kannat stratifioitiin kasvainten määrä havaitaan, joko alhaisen /keskitason (≤10 kasvaimet) tai korkea ( 15 kasvaimet) [33]. Tämä bimodaalisen kanta jakautumiskuvion sitten päällekkäin päälle tiedossa haplotyyppi yhdistelmä ja B6 alleelit distaalinen kromosomissa 3 (

Ccs3

) näissä kannoissa. Yhteenveto kaikista tiedoista ACB /BCA ja AXB /BXA -kantojen on esitetty kuviossa 1A. Tämä analyysi vahvisti kriittinen rooli

Ccs3

alleelien CRC alttius piirre, ja määritettiin lisää kantoja AcB52 ja AcB60 harjoittavan informatiivinen yhdistelmä-haplotypes edelleen rajattu rajat uran proksimaalisessa ja distaalisessa puolin, vastaavasti. Paremmin rajata rekombinaation raja-arvot näissä kannoissa, olemme kehittäneet useita muita informatiivinen markkereita (mikrosatelliittimarkkereita ja SNP markkereita) tällä alueella Genomin DNA-sekvensointi A ja B6 vanhemmat (katso materiaalit ja menetelmät -osiossa). Käyttämällä näitä markkereita, olemme edelleen rajattu rekombinaation raja-arvot on proksimaalinen sivu (AcB52), merkkiaineiden välisen P3-17 (PST. 132,558 Mb) ja P3-19 (PST. 132,562 Mb), ja distaalisen puolella (AcB60) merkkiaineiden välisen D4-11 (pst. 136,18 Mb) ja rs30215915 (pst. 136,20 Mb) (Fig. 1 B). Nämä tutkimukset edelleen pienentää kokoa maksimaalisen fyysisen väli

Ccs3

lokuksen 3,64 Mb (P3-17 on rs30215915).

. Kromosomi 3 haplotyyppien ACB /BCA kannat näkyvät yhdessä niiden vastus (valkoinen) tai alttius (musta) tila AOM aiheuttama CRC (alhaalla nauhat). B6-johdetut kromosomisegmentit näytetään harmaalla (2), kun taas A-haplotyyppien selityksin valkoinen (1). Nuolet (↓) osoittavat avaimen RCS kannat rajata vähintään kromosomi aikaväli

Ccs3

lokuksessa. B. Yksityiskohtainen haplotyypin kartta

Ccs3

locus, kuten määrittely proksimaalisen ja distaalisen rajoja korkean tiheyden SNP genotyypitykseen keskeisillä informatiivinen kongeeniset kantoja (AcB52, AcB60).

korkean resoluution sijoitteluun kartoitus Ccs3 lokukseen jälkeläisten testaus informatiivinen takaisinristeytysanalyysillä hiirten

näissä tutkimuksissa tuotimme (B6xA) F2 eläimiä, jotka genotyypattiin tunnistaa informatiivinen rekombinantit sisällä

Ccs3

aikaväli käyttäen markkereita rs30055788 proksimaaliseen puolella ja rs30215915 distaaliseen puolella. Joukossa joukko 240 F2 eläinten seulotaan tunnistimme 3 informatiivinen rekombinantit nimettiin RecA, recB ja RECC. Kukin yhdistelmä-sitten takaisinristeytettiin päälle sekä B6 ja tausta, ja useita jälkeläiset yksittäisistä ristit olivat sitten genotyypitettiin merkkiaineiden aikaväli ja fenotyypitettiin herkkyyttä CRC (Fig. 2A, 2B). Tässä analyysissä jälkeläiset takaisinristeytysanalyysillä yksittäisten Rec hiiri (A, B, C) ja joko A tai B6 vanhemmat näkyvissä sekoitus yhdistelmä-haplotyyppien alueella yhdistelmillä homotsygootista A tai B6 alleelien tai heterotsygoottisuuden A /B alleeleista (Fig. 2B). Sitten verrataan genotyyppi rekombinantti kromosomien kanssa fenotyypin A ja B6 backcrosses niistä johdetut (Fig. 2A, 2B). Vanhempien valvonta kehitetty korkea kasvain numeroita (X = 45,5; Fig. 2A), kun taas B6 kontrollit olivat alhaiset (X = 1,0; p 0,0001). Progeny testaus recB ja RECC takaisinristeytettiin B6 osoitti yhteenlaskettu kasvaimen numerot näissä hiirissä samanlainen B6 valvonnan yhteisymmärryksessä homotsygoottisiksi B6 haplotyyppien distaaliosuudesta aiemmin määritellyt

Ccs3

alue. Kääntäen, jälkeläisten testaus RecA ja recB ylittää A osoitti kasvaimen numerot näillä eläimillä, jotka eivät olleet tilastollisesti eroavat havaittiin vanhempien A on määräysvalta (vaikka recB XA olivat väli), kanssa homotsygoottisiksi A-alleelin on distaalinen osa on

Ccs3

(Mb134.0-136.2). Lopuksi, havaitsimme kolmannen ryhmän eläinten näytetään väli kasvainten lukumäärää välillä että näiden kahden vanhempien ääripään (X = 8,5;

p

0,001 joko vertailun); näitä olivat RecA x B6 (genotyyppi BB proksimaalisesta /AB distaalinen; genotyyppi AB proksimaalisen /AB distaalinen), recB X B6 (AB proksimaalisten, AB distaalinen), recB XA (AA proksimaalisesta /AB distaalinen), ja RECC XA (AB proksimaalisten, AB distaalinen). Tässä ryhmässä eläimiä, oli voimakas korrelaatio väli kasvainten lukumäärää ja heterotsygoottisuuden A /B haplotypes distaaliseen osaan

Ccs3

intervalli, sopusoinnussa yhteistyössä hallitseva malli perintö

Ccs3

alleelit olemme aiemmin raportoitu [33]. Yhdistetty vaikutus A /A, A /B ja B /B-alleelien distaaliseen osaan

Ccs3

on esitetty kuviossa 2C. Nämä kokeet edelleen pienentää kokoa

Ccs3

väliaika ~2.15 Mb, koska rajoiltaan proksimaalisen puolella vastavuoroinen rekombinaatioon RecA ja recB (vuonna rs31197594 ja rs52356981 välein) ja distaalisessa puolella rekombinaatioprosessin tapahtuma AcB60 (vuonna rs31197594 ja rs30215915 väli) (kuviosta. 1).

. Sen jälkeen AOM hoito, kaksoispisteitä leikeltiin, kiinteät ja kasvainten määrä pisteytettiin (yksittäisten hiirien esitetty ”•”). Ohjaimet ja takaisinristeytysanalyysillä hiirillä vastaava avain rekombinantit (Rec A, Rec B ja Rec C), missä jalostettu A /J (merkitty A) ja C57BL6 /J (merkitty B). Hiiret ryhmitellään haplotyypin

Ccs3

lokuksen ja yhdistelmä eläimet kuljetetaan eri haplotyypin kuhunkin puolet

Ccs3

välein. Ryhmät näytetään kasvaimen numerot tilastollisesti eri muodossa A vanhempien ryhmä tunnistetaan (#). B.

Ccs3

haplotyyppi distaaliseen kromosomissa 3 kunkin ryhmän hiirten fenotyypitettiin paneelissa (A) näkyy mustana (B6), valkoinen (A /J) tai raidallinen (hetero-). Katkoviivat esittävät välin ensimmäinen tunnistettu RCS (nuoli) sekä heikentää geneettistä välein

Ccs3

ehdotti jonka rekombinaatiotapahtumalla Rec A ja Rec B välillä markkereita rs31197594 ja rs52356981, sen proksimaalinen sivu (laatikko ). Distaalinen raja arvioitiin kokeista rekombinantti kongeeniset kannat Kuvio 1B. C. Aggregaatti genotyyppi /fenotyyppi korrelaation yhdistettyä takaisinristeytysanalyysillä hiirten alennettua

Ccs3

välein (Mb134.0-136.2).

Sijainti-ehdokkaita Ccs3 lokuksen

Euroopan ~2.15 Mb

Ccs3

aikaväli sisältää 12 koodaavat geenit, yhtä mikro-RNA (

Mir1895

), sekä useita pitkän ei-koodaavat RNA: t (lincRNA) ja yksi retroposoni (Fig. 3A , ja dataa ei näytetty). Sekvenssi 2,15 Mb segmentin verrattiin A: n ja B6 käyttämällä viite genomin sekvenssejä saatavilla Sanger-instituutti [36], ja täydellinen luettelo kaikista eksoni, introni ja geenien välinen variantteja on esitetty taulukossa S1. Ei ole SNP jotka erottavat A ja B6 joko

Mir1895

(pst 133903469-133903547) eikä myöskään lincRNAs ja retroposoni osoitteessa asemissa 134810372-134810477 (105 nt), 135099190-135100723 (1537 nt), 135158617 -135158847 (231 nt), 135188928-135189496 (569 nt), 135390302-135391702 (1401 nt), 135626423-135626782 (360 nt) in Ensembl aineistot. Siksi on epätodennäköistä, että nämä ei-koodaavat RNA: t ovat vastuussa

Ccs3

vaikutus, vaikka osuus tällaisen ei-koodaavat RNA: t eivät voi vielä virallisesti voida sulkea pois. Joukossa 12 selityksin koodaus geenien välillä (

Cxxc4

,

Tacr3

,

Cenpe

,

Bdh2

,

Nhedc2

,

Nhedc1

,

Cisd2

,

Ube2d3

,

Manba

,

Nfkb1

,

Slc39a8

,

BANK1

), useita nukleotidin variantteja erottaa A ja B6 (taulukko 1, taulukko S1), jossa on yksi ei-synonyymi aminohapon variantit löytyy Manba (L844F) ja BANK1 (A375M). Manosidase beta (Manba) on lysosomaalisen entsyymin inaktivaatio, joka aiheuttaa beta-manosidosis, joka on lysosomaalinen laaja kirjo neurologisten osallistumisen [37]. Näin ollen, patologinen muunnos tässä geenissä ei todennäköisesti aiheuta alttiutta CRC. Sen sijaan A375M muunnos BANK1 (B-solujen rakennustelineet proteiinin ankyriinitoistot) on konservatiivinen substituutio, joka vaikuttaa jäännöksen ei-konservoituneita BANK1 sukulaisten (tuloksia ei ole esitetty), ja siten on epätodennäköistä, että patologinen.

.

Ccs3

lokus sisältää 12 selityksin selostukset, missä asennossa, suunta transkription (nuoli), ja asema viite SNP markkereita näkyvät. B. asema pitkän kantaman monistuksen tuotteita, joita käytetään syvän sekvensointi

Nfκb1

on esitetty mittakaavassa yhdessä kannan 25 koodaus- ja ei-koodaavan eksonin

Nfκb1

. Asema 54 emäsparin introni poisto yksilöity A /J näytetään. Se vastaa menetystä suora 54 emäsparin toisto, joka on läsnä kahtena kappaleena B6 (harmaalla), joka itse koostuu 3-toistorakenne (tunnistetaan nuolin sekvenssin yläpuolella). Asento kopioluvun variantti suhteen eksonia 15 geenin on osoitettu, yhdessä projektio eksonin 15 käännetty sekvenssin ennustettu proteiinin rakenteesta. Ennustettu p50 ja IκBγ osia proteiinin on esitetty, yhdessä Rel-homologiadomeeni (RHD), ankyriiniproteiinista-toistoja (ANK), kuolindomeeni (DEAD) ja glysiini-rikas alue (G), joka erottaa p50 ja p105 (kutsutaan IκBγ).

Olemme aiemmin raportoitu RNA-transkripti profilointi tutkimuksissa verrataan geenien ilmentymistä

Ccs3

intervalli sekä A vs. B6 normaali limakalvo, ja normaali limakalvo vs. kasvaimia A hiiristä [33]. Re-sekvensointi kaikkien selityksin koodaus eksonit ja eksoni /intronirajoista on käynnistetty geenien näyttämällä korkean ilmentymisen normaalissa paksusuolen limakalvon (

Cisd2, Ube2d3

,

Nfκb1

ja

Slc39a8

). Koska sen etukäteen yhdessä paksusuolen epiteelin homeostaasin, ja tulehdusreaktio

in situ

,

Nfκb1

geeni meidän Hiiren varastossa sekvensoitiin kokonaisuudessaan (130 kb). Tämä yhdistetty analyysi ole yksilöinyt nukleotidin variantteja, jotka vaikuttivat konsensus silmu- sekvenssit (taulukko S1), poikkeuksena on kopioluvun variantti (CNV), joka koostuu 54 emäsparin elementti sijaitsee 13 nukleotidia alavirtaan 3’silmukoitumiskohta eksonin 15 ( kuva 3B). Tämä elementti on läsnä kahtena kappaleena B6 perimän DNA mutta yksi kappale puuttuu vastaavassa asemassa A. kahdennettu 54 emäsparin elementti löytyy B6 on itsessään osa toistuvaa DNA motiivi koostuu 3 lähellä-to-identtisten DNA toistot joka sisältää 3’silmukoitumiskohta on

Nfκb1

eksonin 15. B6 genomin (Fig. 3B). Poistaminen yksi kahdesta 54 emäsparin elementit A häiritsee eheyden 3-repeat motiivi löytyy B6 DNA. Vaihtelevuus määrän niitä lähellä-to-identtisten DNA toistot ehdotti mahdollinen siirtyminen toisen järjestyksessä konformaatiossa tässä risteyksessä eksonin 15 /introni 15 genomisessa DNA: ssa ja /tai edeltäjä RNA. Todellakin, alustava analyysi sekundäärisen rakenteen DNA-fragmentin yli 350 bp ulottuu 3-repeat motiivi osoittaa, että läsnä oletetun pseudoknot B6 hiirissä (Fig. 4A), joka on poissa A genomisesta DNA: sta (Fig. 4B). Lisäksi 54 emäsparin-elementti, yksi kopio, joka puuttuu A, näyttää rajat lajien sekvenssin samankaltaisuus hiiriä, ihmisen ja useita muita lajeja (Kuva. 5A), mikä viittaa mahdolliseen konservoituneen rooli tämän osan ja siihen liittyvien sekundaarinen rakenne poikki useita lajeja. Kiinnostavaa, näyttää olevan merkittävä sekvenssin säilyttäminen intronin 15 eri lajeissa, kun taas nukleotidisekvenssi ja ennustettu

Nfκb1

eksonin 15 aminohapposekvenssi osoittaa huonoa rajat lajien säilyminen (Fig. 5A, 5B). Erityisasema, jolla tämä CNV säätelisi Nfkb1 funktio tutkittiin mutta toistaiseksi ole selkeää mekanismia on tunnistettu (katso keskustelu).

pknotsRG työkalu [77] käytettiin synnyttämään toissijaisia ​​rakenteita 350 nukleotidin segmentti ulottuu 3-toista rakennetta B6 (A) ja poistetaan variantti ominaisuus A /J (B). Parittomia emäksiä on merkitty sininen, keltainen emäkset tunnistaa nukleotidin mukana pseudoknot rakenteissa. Tämä analyysi identifioi pseudoknot taidokkain molekyylin sisäisten täydentävyys joka on keskeytyksiä A /J muunnos alleeli.

. ClustalWkohdistusohjelmaa (EBI) on

Nfκb1

introni 15 sekvenssejä eri lajeista (katso vasemmalla rinnastuksen). Viittaus Hiiren sekvenssi B6 on esitetty päälle, mukaan lukien yhden kirjaimen aminohappo- koodia polypeptidin segmentin koodatun eksoni 15. genominen sekvenssi A on esitetty juuri niin kuin on esitetty. 3B, mukaan lukien poistetut 54 emäsparin päällekkäisyyttä ( ”—”) ja 3-repeat DNA motiivi menee päällekkäin 3 ’silmukoitumiskohta eksonin 15 (nuolet). Sekä hiiren sekvenssit (B6 ja A) on kohdistettu vastaaviin rotta, koira, hevonen ja ihmisen genomin sekvenssejä. Säilyttäminen kunkin hiiren nukleotidin edustettuina tummennetut alalaidassa korkea (musta) alhainen (valkoinen) taso säilyttäminen. B.

Nfκb1

cDNA koodaa eksoni 13 eksoni 17 (näkyy muodossa vuorottelevat alleviivattu ja säännöllinen formaatin kutakin eksoni) hiiren ja ihmisen geenit on kohdistettu. Vähiten konservoitunut osa sekvenssin koodaaman eksoni 15, joka sekvenssi on lihavoitu. Konservoituneen nukleotidin poikki sekvenssi tunnistetaan (*).

Aktivointi NFKB Pathway

Tutkimme myös aktivoitumisen NFKB väylän A ja B6 kantoja, käyttäen standardia LPS induktio määritystä ensisijainen makrofageissa (BMDM). Induktio NFKB makrofageissa ja suolen epiteelisolujen on hyvin samankaltainen suhteessa induktiosignaaleja jotka ovat aktiivisia sekä soluissa (LPS /TLR4; NOD1 /peptidoglykaanisynteesin; TNFa /TNFa-R) ja aika kinetiikka [38]. BMDM altistettiin LPS, ja eri ajankohtina, solut hajotettiin ja analysoitiin Western blot: n ekspressiota varten p50 ja p105 Nfκb1 isoformit, kokonais- ja phospohorylated (p-) Iκbα sekä koko ja fosforyloitu IKB-kinaasi, (p -) Iκkβ (Fig. 6). Nämä kokeet osoittivat samanlaisia ​​ekspressiotasot Nfκb1 p50 ja p105-proteiineja, ja yhteensä Iκkβ. Nämä tasot pysyivät samanlainen koko hoidon kesto. Kuitenkin aktivointi NFKB reitin LPS oli paljon voimakkaampaa B6 kuin A makrofageissa, määritettynä ulkonäkö aktivoitua p-Iκkβ ja samanaikainen väheneminen Iκbα pitkin havaitseminen p-Iκbα, suunnattu hajoamista. B6-makrofagit, NFKB aktivointi tapahtui nopeammin ja oli tehokkaampaa kuin A BMDM (kinetiikka ulkonäkö ja koko määrä p-Iκbα ja p-Iκkβ). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset tunnistaa heikommat NFicB aktivointi A soluja verrattuna B6 soluihin vastauksena stimulaatiolle mikrobien LPS.

Luuytimen johdettujen makrofagien valmistettiin A (

Ccs3

S

) ja B6 (

Ccs3

R

) hiiriä ja stimuloitiin, kun läsnä oli lipopolysakkaridia (LPS). Osoitetuilla aikavälein (minuutteina, on esitetty yläosassa), solut otettiin talteen, hajotettiin ja kokonaisproteiinin uutteet valmistettiin. Näytteet erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja analysoitiin immunoblottaus vasta-aineita NFKB (p50, P105), kokonais- ja phospohorylated (p-) IκBα sekä kokonais- ja fosforyloitu IKB kinaasien (p-) IKKα /β ja β- aktiini kuten latauskontrollina. Molekyylipaino yksittäisten proteiinien on esitetty oikealla puolella kunkin koottu paneeli, joista jokainen on tyypillinen 3 itsenäistä koetta.

ilmentäminen Nfκb1 p105 /p50-proteiinien normaalin limakalvon ja kasvaimia A /J

tutkittiin ekspressiota Nfκb1 p105 esiaste immunohistokemiallisesti käyttämällä vasta-ainetta (katso materiaalit ja menetelmät), joka tunnistaa sekä p105 ja p50 Nfκb1 tuote. Tässä analyysissa mukana samoja osia sekä normaali limakalvo, dysplastisia vauriot ja kehittyneempi adenokarsinoomista joko intramucosal tai protubing suolistossa, jotka kaikki saatiin ruumiinavauksessa A hiiristä 18 viikkoa hoidon jälkeen. Useat edustavat kuvat on esitetty kuviossa 7. normaali limakalvo, NFKB-proteiinin värjäys näkyy kryptissa, pääasiassa ytimet suolen epiteelisolujen (IEC), ja sitä voidaan myös havaita alaryhmästä lamina propria soluja. Tämä värjäytyminen ei juuri esiinny viereisillä alueilla kudoksen hyperplasiaa /adenoomien (Fig. 7 f /h), sekä kohdissa, joissa edelleen kehitetty kasvaimia (adenokarsinooman) nähdään suolen onteloon (kuvio 7b /d). Nämä tulokset osoittavat menetykseen Nfκb1 proteiinin ilmentymisen pahanlaatuisten vaurioiden alhainen ja dysplasiaan havaittu A /J-hiirissä.

edustaja immunohistokemiallisella värjäyksellä (IHC) ja p105 /p50 Nfkb1 proteiinin kasvaimia ja viereisten paksusuolen epiteelin hiiristä kuljettavat homotsygoottinen A /J-haplotyypin Ccs3. 5-kertainen suurennus (a, c, e, g) ja vastaavat 20-kertainen suurennus (b, d, f, h) on esitetty viiden edustavan kasvaimia.

Keskustelu

viime vuosina genomin laajuinen yhdistys tutkimukset (GWAS) ovat suunnattu vaikuttava joukko geneettisiä tekijöitä CRC alttius ihmisillä [4], [5]. Lisäksi se tunnustetaan yhä, että ympäristötekijät, kuten ruokavalion, elämäntapaa ja mikrobikasvuston voi edistää moduloida penetrance tai expressivity geneettisten pre-disposition. Panos yksittäisten geenien CRC herkkyys voidaan arvioida asiaa hiiren malleissa, joissa sekä geneettiset ja ympäristötekijät voidaan ohjata [6]. Samoin ”eteenpäin geneettinen” leikkelyn ero alttiutta puhdaslinjojen kantojen CRC voi tunnistaa uuden geenin vaikutuksia, merkitystä, jotka voidaan myöhemmin tutkia ihmisen CRC [21].

Nykyisessä tutkimuksessa olemme pienentänyt

Ccs3

on ~2.15 Mb, koko mukautuvia asentohuimaus kloonaus [39]. Tämä väli on 12 selityksin selostukset, joista 6 on ilmaistu suolistossa (Fig. 3A). Yksi niistä koodaa p105 Nfκb1, vahva sijoitteluun ehdokas ja keskeinen osa NFKB signalointi. Vaikka monet polymorfisia variantteja tunnistettiin A: n ja B6 varten geenien välillä, ei ilmeisesti patologisia missense- tai nonsense variantteja tunnistettiin niiden koodaavat alueet. Immunohistokemiallinen värjäys (IHC) paljasti vahvan ydinvoiman Nfκb1 ilmentymistä normaalissa paksusuolen epiteelin, kun taas vieressä kasvaimia samassa kudoksessa ilmaisi hyvin alhainen Nfkb1 proteiinia (Fig. 7). Tämä viittaa siihen, että paksusuolen kasvainten synnyssä liittyy alas-säätely P105 Nfκb1 meidän hiirimallissa AOM aiheuttaman CRC. Lisäksi olemme havainneet poisto lähellä

Nfκb1

eksoni 15 A hiirillä. 54 emäsparin introni poistetaan karttoja sisällä 3-yksikkö toistaa rakenne, joka menee päällekkäin 3 ’silmukoitumiskohta on

Nfκb1

eksoni 15. Vastaava sekvenssi intronin 15 esitetään merkittäviä rajat lajien suojelun, ja segmentin vaikuttaa poisto ennustetaan muodostavat hyvin stabiilin sekundaarinen rakenne häiriintyy A-genomissa. DNA-elementtejä on läsnä intronit tiedetään vaikuttavan RNA-prosessoinnin sekvenssin osia [40] tai toissijaisia ​​rakenteita, jotka voidaan sitoa dsRNA sitovat proteiinit [41], [42]. Lisäksi toissijainen DNA rakenne kuten ssDNA hiusneulasilmukoita voi myös vaikuttaa DNA-proteiini tunnustamisesta [43], geenien ilmentyminen ja DNA rekombinaationa [44]. Hiusneulat muodostettu DNA toistot on liitetty useita geneettisiä häiriöitä [45], [46], [47]. Tärkeää on, proteiinin ilmentyminen tutkimukset LPS-käsitellyn ensisijainen makrofageissa A ja B6 hiiriin osoittaa ero aktivoitumisen NFKB reitin näissä soluissa. Kun seuranta ajasta riippuvat aktivointi ja maksimaalinen kertymistä aktivoitu p-Iκkβ ja p-Iκbα suunnattu hajoamista olemme huomanneet, että vankempi aktivointi NFKB reitin liittyy merkittävä väheneminen herkkyys CRC. Siksi lähentyminen geenikartoitusta tietojen saattamista

Nfκb1

sisällä ~2.15 Mb välein

Ccs3

tunnetut roolia NFKB väylän homeostaasiin suolen limakalvon (katso jäljempänä), havaittu menetys NFKB p105 /p50-proteiinin ilmentyminen kasvaimissa verrattuna normaaliin limakalvoon, havaittu ero aktivaation tämän reitin eläimillä eri

Ccs3

haplotypes, ja kun läsnä on erottavaa geneettinen muutos geenin, yhdessä kohta on

Nfκb1

kuin erittäin vahva ehdokas

Ccs3

vaikutus.

Nfκb1 on jäsen NFKB perheen transkriptiotekijöiden, jotka jakavat aminopään DNA: ta sitovan ja dimeroituminen Rel homologiadomeeni. Siltä puuttuu kuitenkin transkription aktivaatiodomeenina (TAD) ja tukeutuu hetero- TAD sisältävien NFKB perheenjäsenet (p65 /RelA, RelB, c-Rel) transkription aktivoimiseksi [48]. Nfκb1 syntetisoituu p105 esiaste.