Krooninen sairaus

tiivistelmä

Koska kehitys sekvensointitekniikan, somaattisesti mutatoitunut syöpäantigeenejä tai neoantigeenien, ovat nyt helposti tunnistettavissa ja niistä on tullut pakottavia tavoitteita immunoterapiassa. Erityisesti neoantigeenin kohdistetut rokotteet ovat osoittautuneet lupaaviksi useissa esikliinisiä ja kliinisiä tutkimuksia. Tähän mennessä, neoantigeenin kohdistetut rokotteen tutkimukset ovat mukana kasvainten poikkeuksellisen suuri mutaatio rasitteita. On edelleen epäselvää, onko neoantigeenin kohdistetut rokotteet on laajasti sovellettavissa syöpiä väli alhaisen mutaatio taakkaa, kuten munasarjasyöpä. Tilanteen korjaamiseksi, me arvioitava johdannainen hiiren munasarjakasvain malli ID8 voitaisiin kohdistaa kanssa neoantigeenin rokotteilla. Suoritimme koko exome ja transcriptome sekvensoinnilla ID8-G7 soluissa. Havaitsimme 92 somaattisista mutaatioista, joista 39 oli puhtaaksi, joiden mutaatiot. Sillä 17 alkuun ennustettu MHC-luokan I sitova mutaatioita, me immunisoidut hiiret ihonalaisesti synteettinen pitkä peptidirokotteita koodaavan asiaa mutaatio. Seitsemän 17 rokotteiden aiheuttamaa vankka mutaatio-CD4 ja /tai CD8 T-soluvasteita. Kuitenkaan yksikään rokotteiden pitkäaikainen eloonjääminen kasvain hiiret joko ennalta ehkäisevää tai terapeuttista ympäristössä. Lisäksi yksikään neoantigeenin spesifisten T-solulinjojen tunnustettu ID8-G7 kasvainsoluja

in vitro

, mikä osoittaa, että vastaava mutaatiot eivät aiheuta

bonafide

MHC-esittelyyn epitooppeja. Lisäksi bioinformatiikan analyysi Cancer Genome Atlas paljastivat, että vain 12% (26/220) ja HGSC tapauksista oli ≥90% todennäköisyys kätkeminen ainakin yksi aito, luonnollisesti prosessoida ja esitellä neoantigeenin vs. 51% (80/158) ja keuhkosyövässä. Meidän havainnot korostavat rajoituksia soveltaa neoantigeenin kohdistettujen rokotteiden kasvaintyypeille välituotteen /alhainen mutaatio rasitteita.

Citation: Martin SD, Brown SD, Wick DA, Nielsen JS, Kroeger DR, Twumasi-Boateng K, et al. (2016) Low Mutaatio Burden munasarjasyövässä saattavat rajoittaa Utility neoantigeenin-Kohdennettu Rokotteet. PLoS ONE 11 (5): e0155189. doi: 10,1371 /journal.pone.0155189

Editor: Ali A. Ashkar, McMaster University, Kanada

vastaanotettu: 1 maaliskuu 2016; Hyväksytty: 25 huhtikuu 2016; Julkaistu: toukokuu 18, 2016

Copyright: © 2016 Martin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki sekvensointi tiedot ovat vapaasti saatavilla NCBI Sequence Lue Archive, Liittymisnumero: SRP069102. Kaikki muut tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Kanadan Institutes of Health Research (SDM, RAH, BHN) (MOP137133, 201110GSD-277623-204857), http : //www.cihr-irsc.gc.ca; United States Department of Defense (RAH, BHN) (OC110435), https://www.defense.gov/; Kanadan Breast Cancer Foundation (SDM, RAH, BHN), https://www.cbcf.org, ja British Columbia Cancer Foundation (RAH, BHN), https://bccancerfoundation.com. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

somaattisesti muuntunut syöpäantigeenejä tai ”neoantigeenien”, ovat houkuttelevia immunoterapia tavoitteita, jotka ovat viime aikoina saataville takia kehitys seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) tekniikat [1,2]. Toisin kuin syöpä /kivekset (CT) tai erilaistumista antigeenejä, jotka on koodattu iturataan, neoantigeenien ovat kasvain rajoitettu eikä niitä ilmaistu kateenkorvassa tai muita pahanlaatuisia kudoksia. Siksi suuren affiniteetin neoantigeenin-reaktiiviset T-solut paeta negatiivisen valinnan kateenkorva, ja on-target /off-kasvain toksisuuksien minimoidaan. Panos neoantigeenien onnistuneen immunoterapia käy yhä ilmeisemmäksi. Kliiniset vasteet anti-PD-1 [3] ja -CTLA-4 [4,5] vasta-aineita on liittynyt korkea mutaatio kuormalla, mikä viittaa siihen, että neoantigeenien voi olla merkittävin kohdeantigeeneja taustalla onnistunut immuuni tarkistuspiste saarto. Lisäksi on yhä enemmän näyttöä siitä, että neoantigeenin spesifisten T-solujen usein pohjana onnistuneen hoidon kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL) [6]. Ensimmäisessä julkaisi kliinisen tutkimuksen tietoisesti kohdistaa NGS-tunnistettu neoantigeenin, otto- siirto lähes klonaalinen populaatio neoantigeenin-reaktiivisten T-solujen johti regressioon etäispesäkkeellisestä kolangiokarsinooma [7]. Koska valtaosa mutaatioita, ja siten neoantigeenien, ovat ainutlaatuisia yksittäisille potilaille, terapeuttinen kohdistaminen neoantigeenien tarvitaan yksilöllinen lähestymistapa [1,2,8-13]. Vaikka tämä ollut huomattava este aikaisemmin, tällaiset lähestymistavat ovat yhä toteuttamiskelpoisia nykyajan yksilöllisiä onkologian [14-16].

mutaatio aiheuttaa mutantti neoantigeenin useita kriteerit on täytettävä : a) mutaatio on läsnä sisällä peptidi, joka on jalostettu vanhemman proteiinin solunsisäinen antigeeni koneet; b) mutantti peptidi on sitoutua riittävällä affiniteetilla MHC; ja c) potilaan immuunijärjestelmän ohjelmistossa on T-soluja sisältäviä riittävällä affiniteetilla ja spesifisyydellä, että mutantti-epitoopin. Tämän seurauksena nämä kriteerit, vain pieni osa mutaatioiden aiheuttavat aitoja T-soluepitooppeja. Esimerkiksi

in silico

analyysi kaikista mahdollisista 9mers sarjasta virus proteomeja paljasti, että mediaani 2% (alueella 0,07%: sta 10,4%) peptidien sitoutua tiettyyn HLA-alleelin, jonka IC50 500 nM [17]. Lisäksi toinen tutkimus viruksen epitoopit, todettiin, että vain 8% peptidien sidottu MHCI IC50 100 nM edusti aito epitooppeja, eli ne olivat luonnollisesti käsitelty, esitettiin MHCI, ja tunnustettu autologisten CD8 T-solujen [18]. Näiden tietojen voisi ennustaa, että vain pieni osa mutaatioista aiheuttavat aitoja neoantigeenien. Koska määrä somaattisten pistemutaatioiden ihmisen kasvaimissa voi vaihdella viiden suuruusluokan sisällä ja välillä kasvaintyypeissä [19,20], näkökulmasta neoantigeenin kuorman, jotkut syövät ovat luonnostaan ​​enemmän immunogeenisiä kuin toiset. Todellakin, bioinformatiikan analyysi Cancer Genome Atlas (TCGA) data paljasti, että lisääntynyt pistemutaatio ja neoantigeenin rasitteita liittyy lisääntynyt sytotoksisten T-solujen tunkeutuminen [21,22], mikä korostaa suhdetta neoantigeenin kuorman ja immuunijärjestelmän tunnustamista kasvaimia.

Useat tutkimukset ovat käyttäneet NGS tietoja systemaattisesti arvioida tunnustamista somaattisten pistemutaatioiden CD4 ja CD8 TIL. Alustavat tutkimukset tehtiin melanoomaa potilailla, jotka olivat vastanneet Checkpoint saarto tai otto- T-solujen hoidon. Anywhere 0-3 neoantigeenien kirjattiin potilasta kohden [10,13,23,24]. Koska ihosyövän satama mediaani 130 ei-synonyymi pistemutaatiot [25], nämä havainnot viittaavat siihen, että vain pieni osa mutaatioista aiheuttavat aitoja neoantigeenien. Kahdessa tutkimuksessa syöpäkasvainten ovat käyttäneet NGS tunnistamiseen neoantigeenin reaktiivisia T-soluja kattavasti ennen mitään immunoterapiaa annostellaan. Ryhmämme sekvensoitiin primääristen ja uusiutuvien kasvainten kolmelta HGSC potilaiden ja tunnistaa yhden neoantigeenin-reaktiivisten T-solujen klooni TIL yhdeltä potilaalta; yhdistämällä tiedot kaikista kolmesta potilaasta osoittaa, että 1,3% (1/79) mutaatioiden johti aito MHCI epitooppeja [12]. Lisäksi tutkimus 10 ruoansulatuskanavan kasvaimet kätkeminen on yhteensä 1452 mutaatioiden, 18 mutaatiot (1,2% koko), joita CD4 tai CD8 TIL (vaihteluväli 0-3 tapausta kohti) [26]. Siten nämä kaksi jälkimmäistä tutkimukset osoittavat, että noin 1% pistemutaatioita aiheuta neoantigeenien jotka saavat aikaan spontaani TIL vasteita.

katsoo edellä tutkimukset perustuivat analyysiin ennestään T-soluvasteita, toiset ovat tutkineet missä määrin neoantigeenin-spesifisiä T-soluvasteita voidaan pohjustaa rokottamalla. Itse asiassa ihmisen rokote tutkimukset osoittivat, että T-soluvasteita voidaan esiin vastaan ​​mutaatioiden yhteistä kuljettajan geenejä, mukaan lukien pistemutaatioiden KRAS [27] ja p53 [28], ja raja-arvot, sekvenssien fuusio onkoproteiini BCR-ABL [29]. Jossa NGS, voidaan laajentaa tämän lähestymistavan yli vakiintuneiden, yhteinen mutaatioita koko komplementin somaattisten mutaatioiden yksilön tuumorin (kutsutaan mutanome). Soveltamalla MHC sitova algoritmit mutanome dataa, voidaan suunnitella yksilöllisiä rokotteita, jotka kohdistuvat parhaiten ennustettu mutantti epitooppien tietyllä kasvain. Neoantigeenin-erityisiä rokotteita perustuvat tähän lähestymistapaan ovat osoittaneet terapeuttista tehoa hiirimalleissa melanooma, karsinooma, ja karsinogeeni aiheuttama sarkooma [30-33]. Tähän mennessä tällaiset prekliinisissä tutkimuksissa on suunnattu kasvaimia sisältäviä tahansa 949-4285 nonsynonymous mutaatioita [30-33]. Sen sijaan ihmisen kasvaimista sisältävät mediaani vain 44 ei-synonyymi mutaatioita [20], herättää kysymyksen siitä kasvaimista väli alhaisen mutaatio rasitteita kannekelpoisten neoantigeenin kohdistetun rokotus.

Luja vakavien karsinooma ( HGSC) on yleisin histologinen alatyyppi munasarjasyöpä, ja pitkän aikavälin eloonjäämisprosentti eivät ole parantuneet yli 30-40% 30 viime vuoden aikana [34]. Vastaavia muita syöpiä, läsnä ollessa kasvaimeen infiltroivien T-solujen vahvasti sidoksissa eloonjäämisen HGSC [35], joka on innoittanut pyrkimyksiä kehittää immuuni-hoitoja tähän sairauteen [36]. Useat ehdokas kohdeantigeeniä on tunnistettu, mukaan lukien p53 [37], WT-1 [38], NY-ESO-1 [39], Mesothelin [40], ja folaatin reseptorin [41]. Nämä edustavat itse antigeenejä, joihin sovelletaan kysymyksiä immunologisen toleranssin ja autoreactivity. Lisäksi terapeuttinen kohdistaminen näiden antigeenien rokotteilla [37,38], tai CAR T-solujen [42] on tuottanut vain satunnaisesti vastauksia HGSC tasalla. Näin ollen mahdollisuus hoitaa HGSC kanssa neoantigeenin-erityisiä rokotteita on vakuuttava sekä immunologisen ja kliinisen kannalta. Toisin erittäin mutatoitu pahanlaatuisten kasvainten, kuten melanooman, HGSC on todettu satama mediaani vain 40 missensemutaatioita per kasvain [25], asettamalla se hyvin lähellä mediaani ihmisen syöpien [20]. Siten HGSC on ihanteellinen sairaus testaamiseen sovellettavuutta neoantigeenin kohdistettujen rokotteiden pahanlaatuisia kasvaimia, joiden välissä on mutaatio kuormia.

Tämän vuoksi suoritimme prekliinisissä rokote -tutkimukset johdannainen hiiren munasarjasyöpä malli ID8. ID8 linja on käytetty laajasti tutkia biologisia ja immunologisia ominaisuuksia munasarjasyöpä [43-45]. Se syntyi spontaanisti muutosta normaalin hiiren munasarjojen pinnan epiteelisolujen (OSE) solut aikana serial

in vitro

passage [46]; Näin ollen, ei ollut odotettavissa, satamaan suuri määrä mutaatioita havaittu syöpää aiheuttavaksi aiheuttama kasvain. Vaikka useimmat ihmisen HGSC arvellaan syntyvän distaalisen munanjohtimen erittävien epiteelisolujen [34], OSE johdettu ID8 line aiheuttaa aggressiivinen, levitetään laajalti syöpiä, jotka ovat patologisesti ja histologisesti samankaltainen kuin ihmisen HGSC [43,46]. Linja on herkkä immuuni tarkistuspisteen saarto [45] ja otto- T soluterapiaa [47], joten se houkutteleva, jolla arvioidaan uusien T-solujen perustuvia immunoterapian. Suorittamisen jälkeen koko exome ja transcriptome sekvensoinnilla johdannainen ID8 linja, me arvioitu järjestelmällisesti kaikki tunnistetut nonsynonymous mutaatioita kohteina ennalta ehkäisevää ja terapeuttista rokottamista. Vertasimme havaintonsa 220 ihmisen HGSC tapauksissa tietojen avulla Cancer Genome Atlas (TCGA). Meidän tulokset osoittavat, että suhteellisen pieni mutaatio kuormituksen sekä ID8 kasvaimia ja ihmisen HGSC on suuri haaste varten neoantigeenin-rokotteiden.

Menetelmät ja materiaalit

Exome ja RNA sekvensoinnilla

Kirjasto rakentaminen, sekvensointi, ja bioinformatiikan analyysi tehtiin vuoden Michael Smith Genome Sciences Centre. Genomi-DNA uutettiin viljeltiin ID8-G7 kasvainsolujen ja normaalien C57BL /6-pernasolua. DNA valmistettiin exome valinnan mukaan valmistajan protokollan Agilent SureSelectXT Reagent Kit HSQ (Cat # G9611A), ja DNA: ta rikastettiin exomes käyttäen Agilent SureSelectXT Kaikki Mouse eksoni Kit (Cat # 5190-4641). 100 bp, pariksi lopussa sekvensointi suoritettiin käyttäen Illumina HiSeq2000 alustan. Sen jälkeen RNA, mRNA rikastettiin käyttäen Miltenyi Biotec μMACS mRNA Isolation Kit (Cat # 130-090-276) ja muunnetaan ksi käyttäen Invitrogen Superscript kaksijuosteinen cDNA Synthesis Kit (Cat # 11917-010). cDNA leikattiin, pää kiillotettu, ja ligoitiin adapterit, jota seuraa 100 bp: pariksi loppuun sekvensointi Illumina HiSeq2000 alustan.

bioinformatiikka- analyysi

100 bp: pariksi lopussa lukee exome-sekvensointi kartoitettu hiiren viite genomi (mm9) käyttäen Burrows-Wheeler Aligner (BWA) [48]. Duplikaatteja merkitty käyttämällä Picard MarkDuplicates (versio 1.102), ja SNV ja indeleitä tunnistettiin käyttämällä Samtools (versio 0.1.18) pileuppi ja VarFilter [49]. Vaihtoehdot olivat selityksin käyttäen Annovar [50], ja silmämääräisesti käyttäen Integrated Genomics Viewer (IGV) (versio 2.3.32) [51]. Kaikki variantit löytyy dbSNP138 poistettiin. RNA-seq lukee linjattu genomin-plus-liittymissä viite (mm9) käyttäen BWA, ja lukee että kartoitettu liittymät olivat repositioned kuten suuren aukkoja sisältävä genomista linjaukset. Lukee visualisoitiin käyttäen IGV onko RNA-sekvensoinnilla lukee sisälsi mutatoituja alleeleja, jotka mainitaan exome sekvensointi tietoja. Bam sekvensointi tiedostot ovat saatavilla NCBI sekvenssi lukea arkiston seuraavin hakunumero: SRP069102. Jos sekä RNA exome sekvensointi sisältyviä tietoja muunnelma, joka ei ollut läsnä C57BL /6 exome sekvensointi tietoja, variantti pidettiin kasvain-spesifisen mutaation. Ennustettu sitoutumisaffiniteetti H-2Kb ja H-2Db mutatoidun peptidien määritettiin käyttäen NetMHCpan2.4 [52].

Hiiret ja kasvaimen solulinja

C57BL /6-hiiriä hankittiin Jackson Labs ja ylläpidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa. Kaikki hiiri pöytäkirjat hyväksynyt Animal Care antavan komitean yliopistossa Victoria (luvan numero: 2011-032 (2)), seuraavat Kanadan toimikunta Animal Care ohjeita. Adoptiovanhemmat solujen siirto pernasolujen naisten OT-I siirtogeenisiä hiiriä (Jackson Labs), jotka sisältävät T-solut tunnistamaan kanan ovalbumiinin (OVA)

257-264-epitooppia SIINFEKL käytettiin positiivisina kontrolleina syöpäkasvaimia sisältävistä kokeiluja [53]. Hiiren nisäkasvainviruksen MMTV /

neu

OT-I /OT-II

siirtogeenisiä hiiriä käytettiin isäntinä in kasvain kokeissa [54]. Nämä hiiret ovat suvaitsevaisia ​​kuin SIINFEKL epitooppiin johtuen ilmentymisen OT-I epitoopin (SIINFEKL) merkitty päälle

neu

geenin rintaepiteelisolulinja kudoksessa. ID8 kasvainsolut [46] oli anteliaasti lahjoitti Drs. Paul Terranova ja Katherine Roby vuonna 2001 ja muutettiin talon ilmaista SIINFEKL epitooppihäntäisille rotan

neu

onkogeeni. ID8-G7 kasvainsoluja [47] kasvatettiin High Glucose DMEM (Hyclone: ​​SH30022.01), jota oli täydennetty 5% FBS: ää (Gibco: 12483-020), 2 mM L-glutamiinia (Hyclone: ​​SH30034.01), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Hyclone: ​​SV30010), 50 pm β-merkaptoetanolia (Sigma: M6250), ja 1X insuliini Transferrin Seleeni (ITS) (Corning: 354351).

Rokotukset

Six kahteentoista viikkoa vanhoja naaraspuolisia C57BL /6 villityypin (WT) tai MMTV /

neu

OT-I /OT-II

hiiret nukutettiin ja ihon alle istutettiin kylkeen käyttäen 27 G: n neulaa. Kukin siirrostus koostui 25-50 ug peptidiä (Prolmmune) tai 100 ug kanan ovalbumiinin (OVA) (Sigma cat # A5503) ja 10 ug poly (l: C) (Amersham: 27-4732), sekoitettiin yhteensä 300 ul steriiliä PBS (Gibco: 20012-027). Terapeuttista rokotus kokeissa hiirille annettiin päivittäin rokotukset päivinä 3-6 päivää tuumorin istuttamisen jälkeen. Kaikkien muiden rokotus kokeissa hiirille annettiin päivittäin rokotukset päivinä -28–25 ja -7 -4 joko kasvaimen istutuksen tai lopetetaan hiiriin päivänä 0.

kasvain mouse kokeita

ID8-G7 kasvaimen solut irrotettiin levyiltä käyttämällä trypsiiniä, pestiin 3 kertaa steriilillä PBS: llä, ja suspendoitiin uudelleen steriiliin PBS: ään 10

7 solua /ml. Solususpensio (10

6 solua 100 ul: ssa) injektoitiin vatsaonteloon kunkin hiiren. Hiiriä tarkkailtiin ja lopetettiin heti ensimmäisen vatsan turvotus johtuu askites kertymistä. Nekropsiassa kaikki hiiret, joissa vatsan turvotus sisälsi erittäin levitetään kasvaimia. Adoptiiviseen siirtokokeet, OT-I siirtogeenisiä hiiriä tapettiin ja pernasoluja käsitelty puristamalla splenosyyttejä läpi 100 pm nylon suodatin, hajottamalla punasoluja ACK lyysipuskuria (Lonza: 10-548E), ja laskemalla elävät pernasolujen trypaanisini värjäys . OT-I pernasoluja (10

5 solua 100 ui) injektoitiin häntälaskimoon saajahiiret, jota seurasi rokottamista 100 ug OVA ja 10 ug poly (l: C) neljän peräkkäisen päivän.

IFN-γ ja IL-2-ELISPOT määrityksiä

sopusoinnussa miata suuntaviivojen [55], ELISPOT määritykset suoritettiin käyttäen validoituja, normaaleja protokollia. Rokotettu naaras hiiret lopetettiin käyttäen isofluoraanilla ja pernat käsitellään välittömästi yksisolususpensioi- painamalla läpi 100 um näytöt täydellisessä RPMI (RPMI + HEPES (Bibco: 22400-089), johon oli lisätty L-glutamiinia, β-merkaptoetanolia, penisilliiniä ja streptomysiiniä , natriumpyruvaattia (Hyclone: ​​SH30239.01) ja 10% FBS: ää). Punaiset verisolut lyysattiin käyttäen ACK-hajotuspuskuria, ja tuoreita pernasoluja laskettiin guava-sytometrillä käyttäen Viacount (Cat #: 4000-0130). Pernasolut laimennettiin 5 x 10

6 tai 10

7 eläviä soluja /ml (yleensä välillä 75-85% pernasoluja elinkelpoisia) täydellisessä RPMI. ELISPOT-levyt (MSIP, Millipore: MSIPS4W10) päällystettiin 10 ug /ml anti-hiiri-IFN-γ (mAb AN18, Mabtech: 3321-3-1000) tai IL-2 (Mabtech: 3441-2H) sieppausvasta-aineena ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Levyt pestiin ja blokattiin 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa, 5% CO

2 täydellistä RPMI. 2 tunnin kuluessa hiiret uhrataan, 5 x 10

5-10

6 elävää, käsitellään pernasolut lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja niitä stimuloitiin 0,002-20 ug /ml osoitettujen peptidien, pelkkä väliaine, 5 ug /ml konkanavaliini A: (Sigma: C5275) positiivisena kontrollina tai suspensiot 10

5 kasvainsolujen /hyvin. Viljelmiä inkuboitiin 20 tuntia 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Levyt pestiin, 1 ug /ml toissijaisen vasta-aineen (biotinyloitu anti-IFN-γ: mAbR4-6A2, Mabtech: 3321-6-250, tai biotinyloitua anti-IL-2: Mabtech: 3441-2H) lisättiin, ja levyjä inkuboitiin 2 tuntia 37 ° C: ssa. Levyt kehitettiin käyttäen Vector Labs Vectastain ABC Elite Kit (Cat #: PK-6100) ja Vectastain AEC substraattireagenssia (Cat #: SK-4200) mukaan valmistajan protokollaa ja sai automaattisella levyn lukijaa (AID) käyttäen valmiiksi parametreja, jotka on validoitu useiden kokeissa.

Solunsisäinen sytokiinien värjäyksellä (ICS) ja solujen lajittelu

Hiiret rokotettiin ja lopetettiin kuten edellä on kuvattu. Tuore pernasoluja (2 x 10

6 solua /1 ml /kuoppa) inkuboitiin 20 ug /ml samaa alkuperää mutantin peptidin, tai pelkkä väliaine, 24-kuoppaisille levyille. ICS pernasoluja inkuboitiin 2 tuntia 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. GolgiPlug (BD: 51-2301KZ) lisättiin, ja soluja inkuboitiin vielä 11 tuntia. Sitten solut prosessoitiin valmistajan protokollan avulla FoxP3 /transkriptiotekijä Värjäys Set (eBioscience, Cat #: 00-5523). Lyhyesti, solut kerättiin ja värjättiin 30 minuuttia kiinnitettävissä elinkelpoisuuden väriainetta (0,5 ul /1 ml näytettä) (eF780, eBioscience: 65-0865-18), pestiin ja värjättiin 30 minuuttia pinta-vasta-aineita (CD4-V450 1/200, BD: 560468; CD8-PE 1/500, TONBO Biosciences: 50-0081-U100, MHCII-FITC 1/200, eBiosciences: 1250166), kiinteät ja läpäiseviksi ja värjättiin 30 minuuttia IFN-γ-vasta-aineita (IFN-γ -APC 1/200, eBiosciences: 17-5743). Analyyttinen virtaussytometrillä suoritettiin BD FACSCalibur-virtaussytometrillä ja analysoitiin käyttäen FlowJo (vX.07). Solujen lajittelu, solut kerättiin 24-kuoppaisille levyille 24 tunnin kuluttua stimulaatiosta peptidillä. Solut suodatettiin 40 uM nailonsuodattimelle, värjättiin elinkelpoisuutta väriaine-eFluor780 (0,5 ul /1 ml liuosta), pestiin, ja värjättiin pinta-vasta-aineita (CD4-V450 1/200, CD8-V500 1/50, BD: 560776; MHCII -FITC 1/200, 41BB-PE 1/100, BioLegend: 107105, OX40-APC 1/100, BioLegend: 119409). Solut lajiteltiin käyttäen BD Tulva -solulajittelijalla, ja lajitellaan soluja laajennettiin 100 U /ml IL-2 (eBiosciences: 34-8021) täydellisessä RPMI.

neoantigeenin ennustaminen on TCGA keuhkosyövän ja HGSC aineistot

TCGA mutaatio merkintätiedostoja oli jäsennetty, ja HLA-alleelit ennustettiin RNA-seq tiedot HGSC, keuhkon adenokarsinooma (LUAD), ja keuhkojen okasolusyöpä (LUSC) kasvaimet, kuten aiemmin on kuvattu [21]. SNVs olivat edelleen suodattaa vaatimalla vähintään yksi luettuna RNA-seq bam tiedosto on mutatoitunut perusta. Samtools v0.1.17 käytettiin ote lukee kattaa mutaatio-sivuston indeksoitu bam tiedostoja, ja mukautetun python käsikirjoituksen tarkistetaan mutatoidun pohja. Epitooppi ennusteita tehtiin kaikkien 8-11mer peptidien suhteen autologisiin

HLA-A

alleeli (t) käyttäen NetMHCpan v2.8 [52]. IC 50-arvo 100 nM käytettiin kynnys soittaa korkealla affiniteetilla epitoopit [18]. Koska vain

HLA-A

alleelien kutsuttiin johtuen haasteet vaativat yksiselitteisesti

HLA-B

ja

C

alleelien 50bp sekvensointi tiedoista TCGA, arvot kerrottuna 3 osuus 3 HLA loci (

HLA-A

,

B

,

C

). Arvioida todennäköisyyttä potilaan tietyn määrän ennustetaan neoantigeenien joka sisältää ainakin yhden aito neoantigeenin, haimme havainnot tutkimus, jonka vain 8% sitoutuvien peptidien MHCI IC 50 100 nM osoittautunut aitoja (ts. 92% ei ollut aito) [18]. Laskimme mahdollisuus potilaan sisältää 0 immunogeeninen mutaatioita kaavalla 0,92

N, jossa ”N” on yhtä suuri kuin määrä ennusti neoantigeenien. Vähentämällä yhdestä, saavuimme prosentin todennäköisyydellä potilaan N ennustettu neoantigeenien joka sisältää ainakin yhden aitoja neoantigeenin.

Tulokset

tunnistaminen ja validointi kasvainspesifisten mutaatioita ID8-G7 kasvainlinjaan

tavoite opiskelee munasarjasyöpä malli, jossa on neoantigeenin ohjelmistoon samankaltainen kuin ihmisen kasvaimista, tutkimme muunnelma ID8 kasvainlinjaan (ID8-G7). Koska ID8 rivi kertyi

in vitro

serial passage, sitä ei odoteta satama suuren määrän mutaatioita löytyy karsinogeeni aiheuttama kasvain. Koska muutosprosessi tapahtunut kokonaan

in vitro

ja ilman mitään immunologista paine, päättelimme se olisi voinut herättäneet neoantigeenien kanssa luonnottoman suuren MHC affiniteetit. Sen sijaan ID8-G7 line koki yhden kierroksen

in vivo

passage syngeenisessä (C57BL /6), immuunivaste on hiiri [47], joka olisi voinut johtaa ohjelmistoon neoantigeenien joka muistuttaa enemmän kasvaimia alkaen immunokompetenteille munasarjasyöpä potilaille. Vaikka tämä saattaa ovat poistaneet kuvaamaan joitakin immunogeenisiä, tarpeettomiksi mutaatioita (eli matkustajan mutaatiot), mitään olennaisia ​​kuljettajan mutaatioita olisi pitänyt säilyttää. Tarjota positiivinen kontrolli antigeenimäärää ID8-G7 viiva ilmaisee CD8 T-soluepitoopin SIINFEKL kuin kimeerinen konstrukti rotta

neu

proteiinia (Neu

OT-I /OT-II) [47] . Isäntinä, käytimme

MMTV /neu

OT-I /OT-II

siirtogeenisiä hiiriä, jotka ovat suvaitsevainen SIINFEKL [54]. Intraperitoneaalisen injektion jälkeen otetaan

MMTV /neu

OT-I /OT-II

hiirissä ID8-G7 kasvainlinjaan aiheuttaa aggressiivinen, levitetään laajalti syöpä, tyypillisiä laajat askites [47]. Kuitenkin, lähes täydellinen regressio edenneen taudin voidaan saavuttaa adoptiivinen siirto SIINFEKL-spesifisten CD8-T-soluja (OT-I-T-soluja), jotka osoittavat herkkyyttä ID8-G7 kasvainten immunologista säätelyä [47]. Siten ID8-G7 mallia hyvin ohjattu järjestelmä arvioimiseksi neoantigeenien kohteina immunoterapiassa.

Exome sekvensointi suoritettiin genomi-DNA: ta sekä ID8-G7 kasvaimen solulinja ja C57BL /6-hiiren pernasoluja. Lisäksi RNA-seq suoritettiin ID8-G7 kasvainlinjaan. Exome sekvensointi syntyy 127 miljoonaa lukee että kartoitettu viittaus hiiren genomin, jolloin keskimäärin 89-kertainen kattavuus. Parilliset-end RNA-seq syntyy 158 miljoonaa kartoitettu lukee (sekvensointi bam tiedostot ovat saatavilla NCBI sekvenssi lukea arkiston seuraavin hakunumero: SRP069102). Poistamisen jälkeen variantit läsnä joko kontrolli hiiren genomiin tai dbSNP138 tunnistimme 92 ei-synonyymi kasvainspesifisiä koodausta variantteja (kuvio 1). Näistä 42 variantteja oli läsnä vähintään 1 lukea sisällä RNA-seq dataa, joka osoittaa, että ne litteroitiin (S1 taulukko). Me ulkopuolelle ei-sense mutaatioita, koska näillä ei odoteta aiheuttavan T-soluepitooppeja. Tämä jätti 39 ei-synonyymejä, puhtaaksi, missense- tai insertio /deleetio (Indel) vaihtoehdot (kuvio 1). Aminohapposekvenssit kattaa mutaatiot kysyttiin käyttäen epitooppiennustamisen ohjelmistoa (NetMHCpan2.4 [52]). Käyttämällä rento sulku IC 50 1500 nM, tunnistimme 17 mutaatioiden ennustetaan johtaa ainakin yksi MHCI sitova epitooppi, ja nämä olivat kehittyneet rokotusta kokeissa (taulukko 1). Yksi ylimääräinen ennustettu MHCI sitova mutaatio (geenin 1110021LRik) ei voida arvioida vaikeuksien vuoksi syntetisointi vastaava peptidi. Kaikki kohdennettujen mutaatioiden luokitella keskimääräisen affiniteetin sideaineet, koska niiden ennustettu IC50 tulokset vaihtelivat 103-1160 nM (taulukko 1).

Mutaatiot tunnistettiin koko exome sekvensointi ja ilmentyminen arvioitiin käyttäen RNA-seq. Epitooppi ennustaminen suoritettiin käyttäen NetMHCpan2.4 [52]. Alkaen 92 mutaatioiden perimän DNA 17 mutaatiot peptidit ennustettiin sitoutuvan MHCI (IC50 1500 nM) on edennyt myöhemmissä kokeissa.

Jokainen mutaatio, joka löydettiin peptidin ennustetaan sitoutuvan H-2Kb tai H-2Db- IC50 1500 nM selityksin. Esittää jokaisen mutaation on aminohapposubstituutio, ennustettu korkein sitova epitooppi, joka sitoo pisteet sitova H-2-alleelin RNA-seq lukea count tukee mutatoitunut ja villityypin alleeli, ja 29mer peptidi rokotuksissa.

induktio mutaation-reaktiivisten T-solujen peptidi rokotus

Voit selvittää, onko jokin 17 ennustetun neoantigeenien olivat immunogeenisiä, naiivi C57BL /6-hiiret rokotettiin 29mer peptidien mutatoitu tähde Keski asentoon. Käyttämällä 29mer peptidejä, solunsisäinen antigeeni käsittely voi mahdollisesti tuota mutaation sisältävän epitoopin 15 aminohappoa tai vähemmän. Kunkin ryhmän hiiret rokotettiin yhden 17-mutantin peptidien ja 10 ug poly (l: C) neljän peräkkäisen päivän kuten aikaisemmin on kuvattu [56], joita seuraa neljä ylimääräistä päivittäin rokotukset kolme viikkoa myöhemmin. T-soluvasteita arvioitiin IFN-γ ELISPOT. Tämä rokotusohjelma esiin vankka T-soluvasteita 29mer peptidejä koodaavat SIINFEKL sekä mutantti Spas1, hyvin tunnettu kasvain neoantigeenin päässä TRAMP-C2 kasvainmuoto [57] (S1 Kuva). Kun käytetään kohdistaa ID8-G7 kasvain-mutaatioita, rokotus herättivät T-solu vasteita 11/17 mutantti peptidit (kuvio 2). Näiden 11 mutantin peptidit, ristireaktiivisuutta villityypin (WT) versio peptidin arvioitiin titraamalla WT ja mutanttien peptidien IFN-γ-ELISPOT-määrityksissä. Sillä 4/11 mutaatioita, T-solut vastasivat mutantti ja WT peptidien pitoisuudet vastaavat pitoisuuksia, mikä osoittaa korkea ristireaktiivisuus (kuvio 3). Jäljellä 7/11 mutaatioita, T-solut osoittivat 100-kertainen herkkyyden mutantti peptidin verrattuna WT peptidi. Solunsisäinen sytokiini värjäys paljasti, että 5/7 näistä vastauksista mukana sekä CD4 ja CD8 T-solujen (kuvio 4), jossa CD4-T-solujen hallitsee vastauksia 4/5 tapauksissa. Loput 2/7 vasteet välittämää CD4 T-solut yksinään. Näin ollen, 7/17 (41%) mutantti peptidien aikaansaama mutaatio-spesifisen T-soluvasteen rokotuksen jälkeen, ja useimmat vasteet hallitsi CD4 T-soluja. Nämä seitsemän mutaatioiden eteni lisätutkimuksia.

Hiiret (n = 3 ryhmää kohti) rokotettiin päivittäin päivinä 0-3 ja 21-24 kanssa mutantti 29mer peptidit (50 ug, yksi peptidi ryhmää kohti) ja poly (I: C) (10 ug). Päivänä 28 hiiret lopetettiin ja pernasoluja (10

6 solua /kuoppa) stimuloitiin in kahtena mutantti 29mer peptidit (20 ug /ml) tai media, ja arvioidaan IFN-y-ELISPOT. Positiivinen kontrolli hiiret rokotettiin 29mer peptidi (long-SIINFEKL), joka sisältää tunnettuja OVA

257-264-epitoopin. A. Yksitoista 17 mutantti peptidien aikaansaama vankka T-soluvasteita. Dots edustavat vasteita yksittäisissä hiirissä, ja edustavat keskimäärää kolme hiirille. Katkoviiva osoittaa kynnyksen positiivisuus (3 x maksimi tausta pernasolua pelkässä elatusaineessa määritettiin post-hoc). B. Edustavia ELISPOT kuopat 3 rokotetuilla hiirillä mutantti Cul2 peptidin ja stimuloidaan kahtena kanssa mutantti Cul2 peptidin tai median yksin.

Hiiret (n = 2 per ryhmä) rokotettiin kuten kuvassa 2. päivänä 28 hiiret lopetettiin ja pernasoluja (5 x 10

5 solua /kuoppa) stimuloitiin in kahtena titrattujen pitoisuuksia mutantti- tai villityypin 29mer peptidien IFN-γ-ELISPOT-kuoppiin. Dots ja edustavat keskimäärää ja erilaisia ​​vastauksia, vastaavasti.

Hiiret (n = 2 per ryhmä) rokotettiin kuten kuvassa 2. Päivänä 28 pernasoluja kerättiin rokotetuista hiiristä, inkuboitiin yön yli väliaineessa, joka sisälsi ilmoitetun mutantin peptidejä tai pelkkä väliaine, ja analysoitiin virtaussytometrialla. Solut aidatulla elinkyvystä ja puute MHCII ilmaisun (aktivoitu hiiren T-solut ovat MHCII negatiivinen). Prosenttiosuus IFN-γ-erittävien CD8- ja CD4-T-solujen määritettiin. A. Esimerkki seka T-soluvasteen (CD8

Top ja CD4

alhaalla

) mutanttiin Dync1h1 29mer peptidi versus pelkkä väliaine. B. Yhteenveto tietojen 7 mutantti peptidejä ja positiivisen kontrollin peptidi pitkän SIINFEKL. Baareja ja pisteet edustavat keskiarvoa ja yksittäisiä vasteita, vastaavasti.

Ennaltaehkäisevä ja terapeuttisia rokotuksia kasvaimen kantavien hiirten

Sen testaamiseksi, onko rokote-aktivoitu mutaation-spesifisten T-solujen voivat aiheuttaa regressiota ID8-G7 kasvaimia, hiirillä, joilla on kolme päivän ikäisiä kasvaimia rokotettiin neljän peräkkäisen päivän yksittäisten mutantti peptidien ja poly (l: C). Kuten odotettua, 9/10 positiivisen kontrollin hiiriä, jotka on jalostettu ACT OT-I seurasi rokotuksen OVA ja poly (l: C) pysyivät kasvaimettomina 80 päivää post kasvaimen istutuksen (Kuva 5a).