Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mahasyöpää (GC) on yksi johtavista syistä syövän kuoleman maailmassa. Rooli histonideasetylaasi- 4 (HDAC4) erityisissä solujen ja kudosten tyyppejä on tunnistettu. Kuitenkin sen biologisia rooleja kehittämisessä mahasyövän jäävät paljolti hyödyntämättä. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) ja western blot käytettiin ekspression analysoimiseksi HDAC4 kliinisessä näytteistä. siRNA ja yli-ilmentyminen HDAC4 ja siRNA p21 käytettiin tutkimaan funktionaalisia vaikutuksia lisääntymiseen, siirtomaa muodostuksen adenosiini-5′-trifosfaattia (ATP) määritys ja reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) sukupolvi, solusyklin, apoptoosia hinnat, ja autophagy määrityksiä. HDAC4 oli säädelty vahvistavasti mahasyövässä kudosten ja useat mahasyövässä solulinjoissa. Lisääntyminen, pesäkkeiden muodostumisen kyky ja ATP tasolla parannettiin vuonna HDAC4 yli-ilmentymiseen SGC-7901-soluissa, mutta esti vuonna HDAC4 pudotus SGC-7901-soluissa. HDAC4 Knockdown johti G0 /G1 vaihe solujen pidätys ja aiheutti apoptoosin ja ROS lisäys. Lisäksi HDAC4 havaittiin estävän p21 ilmentymistä mahasyövän SGC-7901-soluja. p21 Knockdown dramaattisesti heikennetty solujen lisääntymisen esto, solusyklin pysähtymisen, apoptoosia edistäminen ja autophagy ajan sääntelyn HDAC4-siRNA SGC-7901-soluissa. Olemme osoittaneet, että HDAC4 edistää mahalaukun syöpäsolun etenemisen välittyvä tukahduttamista p21. Tuloksemme antavat kokeellisen perustan ymmärtäminen pro-kasvain mekanismi HDAC4 hoitona syöpään.

Citation: Kang Z-H, Wang C-Y, Zhang W-L, Zhang J-T, Yuan C-H, Zhao P-W, et ai. (2014) histonideasetylaasi- HDAC4 Edistää mahasyövän SGC-7901 solut eteneminen kautta p21 tukahduttaminen. PLoS ONE 9 (6): e98894. doi: 10,1371 /journal.pone.0098894

Editor: Wei-Guo Zhu, Pekingin yliopiston Health Science Center, Kiina

vastaanotettu: 12 helmikuu 2014; Hyväksytty: 08 toukokuu 2014; Julkaistu 4. kesäkuuta 2014

Copyright: © 2014 Kang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Health Department of Jilin (nro 2012z119). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on neljänneksi yleisin maligniteetti ja toiseksi suurin syy syövän kuolemaan maailmanlaajuisesti [1]. Aasian ja Etelä-Amerikan maissa on korkeampi esiintyvyys GC kuin Yhdysvalloissa ja Länsi-Euroopassa [2]. Useimmat kohdennettuja hoitomuotojen keskittyvät endoteelikasvutekijä (VEGF) ja epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) liittyviä merkkejä pitkälle GC. Yhdisteitä vastaan ​​uusia kohteita, kuten mTOR [3], c-Met (hepatosyyttikasvutekijän reseptori) [4], ja HDAC: t, ovat myös tutkimuksen.

histonideasetylaasi- 4 (HDAC4), joka on luokkaa II HDAC, tiedetään esiintyvän erillisiin transkription corepressor komplekseja. HDAC4 on kriittinen osa DNA-vaurio vastereitissä joka toimii kautta 53BP1 [5]. HDAC4 tukahduttaa ilmentymisen sykliiniriippuvaisen kinaasi-inhibiittorin p21 (tunnetaan myös nimellä p21WAF1 /CIP1) ihmisen syöpäsoluja kautta SP1-riippuvainen, p53-riippumattoman mekanismin [6]. HDAC4 edistää kasvua koolonkarsinoomasoluissa kautta tukahduttaminen p21 [7]. Inaktivointi HDAC4 pieniä häiritseviä RNA tai HDAC-inhibiittorit tukahduttaa neuronisolukuolemaan [8].

rooli HDAC4 tietyissä soluissa (HeLa (kohdunkaulan syöpä), U373 (gliooma), OVCAR (munasarjan), T98G ( gliooma), HCT116 (peräsuolen), NHA (astrocytic) ja SKBR3 (rinta)) ja kudokset (aivokuori, kiveksissä, eturauhasessa ja epidermaalinen kerros ihoa) on yhä selvä [9]. Kuitenkin tarkka mekanismi HDAC4 mahasyövän ei ole määritetty. Siksi Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida ensin ekspressiotasoja HDAC4 ihmisen mahasyövän kudoksissa ja solulinjoissa. Toinen vaikutus HDAC4 mahalaukun syövän solulinjoissa tutkittiin käyttäen yli-ilmentymisen ja pudotus. Lopuksi tutkittiin, HDAC4 oli suhde p21 mahalaukun syöpäsoluja. Yhdessä tavoitteenamme oli löytää onko HDAC4 on biologinen rooli GC kehitykseen ja valottaa taustalla mekanismi.

Materiaalit ja menetelmät

kudosnäytteitä

Kaksikymmentäyhdeksän pariksi ensisijainen mahakarsinoo- kudosten ja etäinen normaali mahan kudoksissa kerättiin potilailta (ikä: 58.46 ± 9,17 vuotta) aikana rutiinia terapeuttinen kirurgian osastolla ruuansulatuskanavan leikkauksen, ensimmäinen sairaalan Jilin University. Kaikki näytteet saatiin tietoisen suostumuksensa mukaisesti Helsingin julistuksen ja hyväksynyt Human eettisen komitean ensimmäisen sairaalan Jilin University ja Jilin University, PR China. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta osapuolilta.

Solulinjat ja kulttuuri

Ihmisen mahalaukun syövän solulinjoissa SGC-7901, AGS, ja BGC-823 ja normaali mahan epiteelin solulinja GES olivat saatu American Type Culture Collection (Manassas, VA), ja niitä viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Stable transfektoitu solulinja ja lyhytaikaisella transfektiolla

täyspitkä HDAC4 fragmentti monistettiin käänteistranskriptio PCR GES soluista käyttämällä spesifisiä alukkeita, kuten on aiemmin kuvattu [10], ja insertoitiin BamHI-ja Hindlll-kohtiin pcDNA3.1 (+ ) (Clontech, Hampshire, UK). PcDNA3.1 (+) – HDAC4 plasmidi varmistettiin sekvenssianalyysillä vahvistaa ilman mutaatioita. SGC-7901-solut ympättiin 6-kuoppalevyille ja transfektoitiin pcDNA3.1 (+) – HDAC4 ja pcDNA3.1 (+) – vektorit, vastaavasti, käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ohjeiden mukaisesti tarjotaan jonka valmistaja on 24 tuntia ilman antibioottia valintaa. Sitten soluja viljeltiin alustassa, joka sisälsi 400 ug /ml G418: aa (Sigma, St. Louis, MO), kunnes kaikki solut ei-transfektoidut ohjaus kulttuuri tapettiin.

SGC-7901-solut ympättiin 6-kuoppalevyille ja transfektoitiin sitten ei-kohdistuksen siRNA tai siRNA suunnattu ihmisen HDAC4 tai p21 (Santa Cruz) käyttäen Lipofectamine 2000 ohjeiden mukaisesti valmistajan antamia. Stretch kokeet suoritettiin soluilla 48 tai 72 tuntia transfektion jälkeen.

RNA: n eristys ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) B

Yhteensä RNA eristettiin kudoksista tai soluista TRIzol reagenssilla ( Invitrogen), ja reverse transkriptiot suoritettiin käyttäen Takara RNA PCR kit (Takara, Dalian, Kiina) seuraten valmistajan ohjeita. Kvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttäen SYBR Green Esiseos Ex Taq (Takara, Japani) on reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Eppendorf, Saksa). Suhteellinen ilmentyminen suhde kunkin pariksi kasvain- ja ei-kasvainkudoksessa laskettiin 2

-ΔΔCT menetelmällä.

Cell laskenta kit-8 (CCK-8) analyysissä

proliferaatiot n SGC-7901-soluja arvioitiin käyttäen CCK-8 määritys (Beyotime, Jiangsu, Kiina) protokollan mukaisesti valmistajan suosittelemia. Lyhyesti, soluja viljeltiin 96-kuoppalevylle konsentraatiossa 2000 solua per kuoppa. 0, 1, 2 ja 3 päivää transfektion jälkeen solujen lisääntymisen määritys suoritettiin lisäämällä 10 ui CCK8 liuosta kuhunkin kuoppaan, mitä seurasi inkubointi 37 ° C: ssa 2 tuntia. Absorbanssi mitattiin ELISA-lukijalla aallonpituudella 450 nm.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

Lyhyesti, HDAC4 yli-ilmentyvä ja -knockdown SGC-7901-soluja ympättiin kolmena kappaleena (1000 solua 60 mm viljelymaljalla) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa kahden viikon ajan, jolloin muodostuu klooneja. Solut pestiin PBS: llä, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 minuutin ajan, ja värjättiin kristallivioletilla (0,5% kristalliviolettia, 1% paraformaldehydiä ja 20% metanolia PBS: ssä) 30 minuutin ajan. Pesäkkeet kullakin levyllä laskettiin, ja solujen eloonjääminen ilmaistiin prosentteina elossa olevien pesäkkeiden määrä on kontrollilevyt.

Solusyklianalyysiä

Solut kerättiin ja varovasti resuspendoitiin yhden solun suspensiot Fluoresenssi solulajittelu- (FACS) puskurissa (PBS, joka sisälsi 2% FBS: ää). Solut pestiin kahdesti PBS: llä ja fiksoitiin kylmässä 70% etanolia yön yli. Sitten solut pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä, suspendoitiin uudelleen RNaasi A: liuosta ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Suspensioon lisättiin 0,05 mg /ml propidiumjodidia (Beyotime), jota seurasi inkubointi 4 ° C: ssa 30 minuuttia ja analyysi käyttäen FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA).

Cell apoptoosimäärityksessä

Propidiumiodide (PI, 1 ug /ml) ja anneksiini V-FITC: tä (1 ug /ml) käytettiin määritettäessä solun apoptoosin. Lyhyesti, solut trypsinoitiin ja inkuboitiin PI ja anneksiini V-FITC: llä 15 minuuttia 37 ° C: ssa. Näytteet havaita käyttämällä FACS Calibur virtaussytometrillä. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Solunsisäinen adenosiini-5′-trifosfaattia (ATP) tasot määrityksessä

Solunsisäiset ATP-tasot määritettiin käyttäen bioluminesenssi [11]. Lyhyesti, solut hajotettiin ja sentrifugoitiin noin 15000 g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Sitten supernatantit sekoitettiin ATP-määritys sekoitus käyttöliuos (Sigma), ja valon määrä mitattiin välittömästi luminometrillä (Thermo Scientific Luminoskan Ascent, Walthan, MA). Luminesenssi data normalisoitiin näytteen proteiinipitoisuus (mitattu käyttäen BCA-määrityksellä).

reaktiivisen hapen (ROS) mittaus

Generation solunsisäisten ROS tutkittiin käyttäen 6-karboksi-2 ’ , 7’-dikloorifluoresiinidiasetaattia (H

2DCFDA). Lyhyesti, 5 x 10

4 solut maljattiin 60 mm: n annoksia ja annettiin kiinnittyä yön yli. Solut värjättiin 5 uM H

2DCFDA 30 min 37 ° C: ssa ja sitten kerätään, ja fluoresenssi analysoitiin fluoresenssi spektrometri (Flex StationII 384, Molecular Devices) 485 nm: ssä (eksitaatio) ja 538 nm ( päästö). Cellular hapetin tasot ilmaistiin suhteellisena DCF fluoresenssi näytettä kohden proteiinia määrät (BCA-menetelmällä). Joissakin kokeissa soluja esikäsiteltiin 10 mM

N

-acetylcysteine ​​(NAC) ennen analyysiä ROS: n syntyminen.

Western blot-analyysi

Solut hajotettiin IP lyysipuskuria (Beyotime), denaturoitu 10 minuutin ajan 95 ° C: ssa, hierretään insuliiniruiskul-, ja päätti SDS /PAGE-geeleillä. Sen jälkeen immunoblottauksella, kalvot blokattiin ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla PBS /0,1% Tween-20, jossa 5% rasvatonta kuivamaitoa. Vastaan ​​suunnattuja vasta HDAC4, p21, LC3, Beclin 1, Atg 7, Caspase 3, 9, Bcl-2, Bax ja anti-β-aktiini ostettiin kaikki Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz). Kemiluminesenssiosoitusta määritettiin käyttäen ECL havaitseminen (Pierce, Rockford, IL, USA). Tulokset analysoitiin käyttäen Määrä Yksi ohjelmisto saadaan optinen tiheys suhde kohde-proteiinin p-Actin.

Immunofluoresenssi

solut maljattiin peitinlaseilla, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (Sigma- Aldrich) 10 min ja tehtiin läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 /PBS: ää. Solut blokattiin 1% BSA: lla 1 h, minkä jälkeen inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa anti-LC3-vasta-aineen, ja sitten soluja inkuboitiin FITC-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (Beyotime) 1 h. Tumat värjättiin 4,6-diamino-2-fenyyli (DAPI; Sigma). Fluoresenssi kuvantaminen tehtiin näkyväksi käyttämällä konfokaali laserskannaus mikroskooppi (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa).

Tilastollinen

Kaikki tiedot edustavat vähintään kolmen erillisen kokeen. Tiedot esitetään keskiarvoina ± S.E.M. Tilastollinen merkitsevyys laskettiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA) tai Studentin t-testiä ryhmien välillä käyttäen GraphPad Prism 5 tilasto-ohjelmalla.

P

arvojen 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

HDAC4 ilmaisu oli säädelty vahvistavasti mahasyövässä kudoksissa ja solulinjoissa

Ensin analysoidaan HDAC4 ilmentyminen kaksikymmentä yhdeksän pariksi mahasyövän ja viereisen ei-tuumorikudoksista by qRT-PCR-analyysi ja western blot. Olemme havainneet, että HDAC4 oli merkitsevästi säädellään ylöspäin mahakarsinoo- kudoksessa (kuviot 1A, B ja C,

** P

0,01,

*** P

0,001). Lisäksi useat mahasyövän solulinjoja analysoitiin myös. Havaitsimme korkeampi ilmentyminen HDAC4 kolmella mahasyövässä solulinjoissa (AGS, BGC-823 ja SGC-7901), verrattuna normaaliin mahalaukun epiteelin solulinja (GES) (kuviot 1D ja E,

* P

0,01). Näin ollen meidän tulokset osoittivat, että HDAC4 ilmentyminen oli säädelty sekä mahalaukun syövän kudoksissa ja solulinjoissa.

mRNA: ta ja proteiinia tasot HDAC4 analysoitiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä (qRT-PCR) ja western blot normaaleissa kudoksissa (Nor) tai mahalaukun syöpä kudoksiin (GC) (A) ja (B) (n = 29). Densitomet- analyysi HDAC4 kuvassa. 1B (C). MRNA ja proteiini tasot HDAC4 analysoitiin normaaleissa mahan epiteelisolut (GES solut) ja useita mahasyövän solulinjoissa, mukaan lukien AGS, BGC-823 ja SGC-7901-soluissa (D) ja (E) (n = 4). Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SEM

* P

0,05,

** P

0,01,

*** P

0,001.

Euroopan HDAC4 ilme oli onnistuneesti myötä- tai säädellään ylöspäin SGC-7901-solujen

pcDNA3.1 (+) ekspressiovektoria käytettiin yli-ilmentämään HDAC4 in SGC-7901-soluissa tutkiakseen sen tehokkuutta kasvun säätelijänä. Sen jälkeen, kun vakaa transfektion, ilmaus HDAC4 mRNA oli runsaampaa pcDNA3.1 (+) – HDAC4 soluja kuin ei-transfektoituja soluja tai negatiivinen kontrolli (NC) SGC-7901-soluissa (kuvio 2A,

** * P

0,001), mikä oli yhdenmukainen tulos western blot-analyysi (kuvio 2B).

HDAC4 ilmentyminen määritettiin SGC-7901-soluja transfektoitiin tyhjällä vektorilla (NC) tai HDAC4 (A ) ja (B). HDAC4 ilmentyminen määritettiin SGC-7901-soluja transfektoitiin siRNA oligojen kohdistaminen HDAC4 (si-HDAC4) tai salattu siRNA (si-NC), jonka qRT-PCR: llä ja western blot (C) ja (D) (n = 4). Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SEM

*** P

0,001.

arvioimiseksi geenin hiljentäminen tehoa ihmisen HDAC4-siRNA, laajuus HDAC4-proteiinin ilmentyminen mitattiin HDAC4-siRNA transfektio ja 48-h itämisaika ihmisen mahasyövän solulinja SGC-7901. Reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti, että HDAC4 siRNA-infektio johti 36,3% pudotus on HDAC4 mRNA tasoilla (kuvio 2C,

*** P

0,001). Western blot-analyysi osoitti, että HDAC4 proteiini oli merkittävästi vähentynyt (kuvio 2D), mikä on yhdenmukaista sen mRNA: n vähentämiseen. Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että HDAC4 siRNA voisi merkittävästi tukahduttaa endogeenisen HDAC4 ilmaisua.

HDAC4 edistetään solujen lisääntymisen ja pesäkkeiden muodostumista

Seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus HDAC4 solujen kasvuun. Soluproliferaatiota tutkittiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (CCK-8), ajanhetkellä 24, 48 ja 72 tuntia. Kasvukäyrät osoitti, että kun HDAC4 oli yli-ilmentyminen in SGC-7901-solujen, solujen kasvu nousi 1,5-kertaiseksi verrattuna verrokkiryhmään päivänä 3 (kuvio 3A,

* P

0,05,

∧∧P

0,01). Lisäksi pesäkemuodostusta näytetään dramaattinen kasvu on 2-kertaisesti pesäkkeitä numero, kun SGC-7901-soluja transfektoitiin pcDNA3.1 (+) – HDAC4 suhteessa NC ryhmään (kuviot 3B ja C,

** P

0,01).

kasvukäyrä (

* P

0,05 ja

∧∧P

0,01 verrattuna NC ryhmä) (A), klooni muodostuminen (B) ja (C) ja suhteellinen ATP tasolla ja ROS sukupolven (G) in SGC-7901-soluja transfektoitiin tyhjällä pcDNA3.1 (+) – vektorin (NC) tai HDAC4. Kasvukäyrän (

∧P

0,05 verrattuna si-NC ryhmä) (D), klooni muodostuminen (E) ja (F) SGC-7901 transfektoitujen solujen siRNA oligoilla kohdistaminen HDAC4 (si-HDAC4) tai salattu siRNA oligo (si-NC). Vaikutus antioksidantti

N

-acetylcysteine ​​(NAC) suhteellisiin ATP tasolla ja ROS sukupolven SGC-7901 transfektoitujen solujen si-NC tai si-HDAC4 (H). Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SEM

* P

0,05,

** P

0,01,

∧P

0,05,

∧∧P

0,01.

tutki myös vaikutukset HDAC4 alassäätö in SGC-7901-soluissa. CCK-8 määritys ja pesäkemuodostusta osoitti, että HDAC4 alassäätöä tukahdutetaan leviämisen kyky (kuvio 3D,

∧P

0,05) ja pesäkkeiden muodostumista numerot SGC-7901-solujen (kuviot 3E ja F,

** P

0,01). Yhteenvetona nämä tiedot osoittivat, että HDAC4 voisi olla kasvun edistäjänä SGC-7901-soluissa.

HDAC4 lisääntynyt ATP-tasot ja laski ROS sukupolvi

Nostamalla ATP tasot HDAC4 yli-ilmentävät solut oli havaittujen verrattuna NC SGC-7901-soluissa (kuvio 3G,

* P

0,05). Lisäksi ATP taso aleni HDAC4 pudotus soluissa (kuvio 3H,

* P

0,05).

Koska solunsisäinen ROS sukupolvi voi liittyä mitokondrioiden, me tutkittiin lisäksi HDAC4 voi stimuloida ROS sukupolven SGC-7901-soluissa. Tulokset osoittavat, että merkittävä väheneminen ROS sukupolvi havaittiin pcDNA3.1 (+) – HDAC4 SGC-7901-soluissa verrattuna NC SGC-7901-soluissa (kuvio 3G,

∧P

0,05). Samaan aikaan vaimentaminen HDAC4 voimakkaasti aktivoitua ROS sukupolven SGC-7901-soluissa (kuvio 3H,

** P

0,01). Esto ROS tuotanto käyttäen antioksidantti NAC estivät merkittävästi ROS sukupolvi (kuvio 3H,

∧P

0,05). Tämä esto ROS esikäsittelemällä solut NAC myös merkittävästi estänyt ATP menetys HDAC4-siRNA SGC-7901-soluissa (kuvio 3H,

∧P

0,05).

Alas -regulated HDAC4 ilmaisu pidätettiin solut G0 /G1 vaihe

down-regulation of HDAC4 nähtiin selvää osuuden kasvu solujen G0 /G1 vaihe (78,74% verrattuna 49.92% NC-siRNA ryhmä). Myös vastaava väheneminen solujen S-vaiheeseen (12,94% verrattuna 34,61% NC-siRNA ryhmä) (kuvio 4A). Kvantitoidaan solusyklin jakelu tulokset osoittavat, että HDAC4 pudotus merkittävästi indusoi SGC-7901 solua G0 /G1 pidätyksen ja S faagi eston (kuvio 4B,

* P

0,05,

** P

0,01). Näin ollen, nämä tulokset viittaavat siihen, että HDAC4 tasolla voitaisiin säädellä solusyklin etenemisen.

Virtaussytometrianalyysi kuvattu solusyklin etenemistä SGC-7901-soluissa, kun knockdovvn HDAC4 (A) ja solusyklin profiilit analysoitiin kvantitoimiseksi soluun cycle jakelu (B). SGC-7901-soluja transfektoitiin sekoitetun ohjaus (si-NC) tai HDAC4 siRNA-oligot (si-HDAC4) apoptoosin arvioitiin virtaussytometrialla käyttämällä anneksiini V-FITC /PI (C). Expression of pro- ja anti-apoptoottiset proteiinit ja kaspaasien 3 ja 9 analysoitiin western blot (D). Solut immunovärjättiin anti-LC3 vasta-aineita (FITC, vihreä) ja tumat värjättiin DAPI (sininen), ja analysoitiin konfokaalimikroskopialla (E). Western blot-analyysi Atg7, Beclin 1 ja LC3 proteiinin ekspressiotasot SGC-7901-soluja transfektoitiin sekoitetun ohjaus (si-NC) tai HDAC4 siRNA-oligot (si-HDAC4), käsiteltiin tai ei ole 3-MA (F). Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SEM

* P

0,05,

** P

0,01.

Euroopan alassäädetty HDAC4 ilmentymisen aiheuttaman apoptoosin ja autophagy

Tutkia onko alassäädetty HDAC4 aiheuttama solujen kasvun inhibitio oli yhteydessä solujen apoptoosia, seurauksena alassäädetty HDAC4 solujen apoptoosiin arvioitiin virtaussytometrialla käyttämällä anneksiini V-FITC /PI kaksoisvärjäystä. Havaittiin, että apoptoosin kasvoivat selvästi HDAC4-siRNA SGC-7901-soluissa verrattuna NC-siRNA ryhmä (kuvio 4C). Olemme edelleen vahvisti apoptoosin kautta kaspaasi-3 ja 9 Western blot. Analyysi paljasti, että alassäädetty HDAC4 lisääntynyt pilkkominen kaspaasien-3 ja 9 verrattuna NC-siRNA ryhmä. Ekspression anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-2 ja pro-apoptoottista proteiinia, Bax myös määrällisesti. Bax /Bcl-2-suhde oli merkittävästi lisääntynyt HDAC4-siRNA SGC-7901-soluissa verrattuna NC-siRNA ryhmä (kuvio 5D).

Expression p21 analysoitiin western blot SGC-7901-soluissa transfektoitu tyhjällä pcDNA3.1 (+) – vektorin (NC) tai HDAC4 ja salattu siRNA ohjaus (si-NC) tai HDAC4 siRNA-oligot (si-HDAC4) vastaavasti (A). P21 mRNA taso analysoitiin qRT-PCR SGC-7901 transfektoitujen solujen si-NC, si-HDAC4 yksin tai yhdessä siRNA p21 (si-p21) (B). Solu kasvukäyrä mitattiin CCK-8 määritys (

* P

0,05 verrattuna si-NC ryhmä,

∧∧P

0,01 verrattuna si-HDAC4 ryhmä) (C) . Suhteellinen ATP-tasot ja ROS: n syntyminen (D). Solusyklin analyysi (E, F). Apoptoosi määritettiin western blot (G) ja virtaussytometria käyttämällä anneksiini V-FITC /PI (H), vastaavasti. Autophagy arvioitiin immunofluoresenssilla (I) ja Western blot (J) vastaavasti SGC-7901-soluja transfektoitiin si-NC, si-HDAC4 yksin tai yhdistelmänä si-p21. Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SEM

* P

0,05.

** P

0,01,

*** P

0,001.

Sen tutkimiseksi, alassäädetty HDAC4 aiheuttama autophagy in SGC-7901-soluissa, me ensin tutkinut solunsisäinen lokalisaatio LC3 in HDAC4-siRNA SGC-7901-solujen immunofluoresenssianalyysin avulla käyttämällä fluoresoivia vasta-aineita LC3. Erityinen pistemäinen jakelu endogeenisen LC3 havaittiin kuin pistemäistä pisteinä vihreän fluoresenssin HDAC4-siRNA SGC-7901-soluissa verrattuna NC-siRNA ryhmä (kuvio 4E), mikä osoittaa, että autophagy aiheutettiin keinona selviytymisen. Solunsisäisen jakautumisen LC3 merkittävästi inhiboi autophagy-spesifinen estäjä 3-MA HDAC4-siRNA SGC-7901-soluja (kuvio 4E). Sitten autophagy liittyvät proteiinit Atg7, Beclin 1 ja suhde LC3-II LC3-I analysoitiin western-blotilla. Havaitsimme, että ekspressiotasot Atg7, Beclin 1 ja LC3-II olivat kaikki merkittävästi lisääntynyt HDAC4-siRNA SGC-7901-soluissa verrattuna NC-siRNA ryhmä (kuvio 4F). Atg7, Beclin 1 ja suhde LC3-II LC3-I laski selvästi HDAC4-siRNA SGC-7901-solut, joita oli käsitelty 3-MA verrattuna NC-siRNA ryhmä (kuvio 4F).

Euroopan alassäädetty HDAC4 ilmentyminen esti solun kasvua p21 ylössäätöä

Koska hoito ihmisen syöpäsolujen HDAC-estäjien johdonmukaisesti johtaa säätely ylöspäin p21 ilmaisun, sykliiniriippuvainen estäjä, joka on vakiintunut tavoite HDAC-inhibiittorit [6], [7], [12], etsimme onko yli-ilmentymisen tai knockdovvn HDAC4 voi vaikuttaa p21 sääntelyä ja spekuloida mekanismi HDAC4 välittämää kasvun edistämiseen mahasyövässä soluissa.

Kuten kuviossa 5A, ylös-säätely HDAC4 dramaattisesti johti vähentynyt p21-proteiinin ilmentymisen. Sen sijaan, HDAC4 down-regulation johtanut lisääntyneeseen p21 ilmentymistä (kuvio 5A). Sitten tutki p21 Knockdown voi vaikuttaa solujen kasvuun ja apoptoosin SGC-7901 solut, joissa HDAC4 poistettiin. SGC-7901-soluja kotransfektoitiin siRNA HDAC4 ja siRNA p21. P21 mRNA taso oli merkittävästi vähentynyt HDAC4-siRNA SGC-7901-solujen jälkeen p21 taintumisen (kuvio 5B,

** P

0,01,

*** P

0,001). p21 Knockdown dramaattisesti heikennettyjä soluproliferaatiota esto in HDAC4-siRNA SGC-7901-soluissa (kuvio 5C,

* P

0,05, ∧∧

P

0,01). ATP oli kasvanut, mutta solunsisäinen ROS sukupolvi laski siRNA-p21-HDAC4 ryhmässä verrattuna siRNA HDAC4 ryhmä (kuvio 5D,

* P

0,05,

** P

0,05). Immunoblottaus osoitti, että määrä Bcl-2 oli huomattavasti korkeampi, mutta Bax oli alhaisempi siRNA-p21-HDAC4 soluissa (kuvio 5G). Solu apoptoosin laski selvästi siRNA-p21-HDAC4 SGC-7901-soluissa verrattuna siRNA HDAC4 ryhmä (kuvio 5H). Havaittiin myös, että p21 Knockdown voisi pelastaa lisääntyneestä autophagy rytmittävät fluoresoivia täpliä (kuvio 5I) ja Atg 7, Beclin 1 ja LC3II proteiinien ilmentyminen SGC-7901-solujen aiheuttama siRNA HDAC4 (Kuva 5J). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että alas-säätely p21 voivat jäljitellä vaikutusta HDAC4 yli-ilmentymisen ja saattaa olla tärkeä välittäjäaine HDAC4 välittämää SGC-7901 solujen kasvun edistämiseksi.

Keskustelu

Lukuisat HDAC estäjät, jotka on osoitettu estävän proliferaation ja erilaistumisen indusoimiseksi tai apoptoosin kasvainsoluissa, tutkitaan kliinisissä tutkimuksissa joko syöpälääkkeiden tai yhdessä muiden hoitoon [13]. Korkea ekspressio HDAC1 /2 havaittiin mahalaukun karsinooma kudoksissa [14]. Tutkimuksessamme osoitimme että HDAC4 ilmentyminen oli säädelty vahvistavasti mahasyövässä kudoksissa ja solulinjoissa

in vitro

. HDAC4 alassäätö in SGC-7901-solujen tukahdutetaan solujen lisääntymistä ja pesäkkeiden muodostumista numerot, pidätettiin solusyklin ja indusoi apoptoosin riippuvainen aktivaatio caspases 3 ja 9, joka on sopusoinnussa antiproliferatiivisia ja proapoptoottiset vaikutuksia HDAC-estäjien ihmisen syöpäsolulinjoissa [15] sekä aiemmin raportoitu havainto, että HDAC4 alassäätöä vähentää klonogeeniset selviytymisen ja indusoi apoptoosin HeLa-soluissa [5]. Proproliferative vaikutus HDAC4 mahalaukun syöpäsoluissa on sopusoinnussa aiemmin raportoituun luokan I HDAC: ien, HDAC1, -2, ja -3 [16]. Näin ollen, esto HDAC4 toiminta voi olla potentiaalinen terapeuttinen lähestymistapa hoitoon mahasyövässä.

Autophagy on oleellisesti proteiinien hajoaminen järjestelmän solun oma lysosomeihin. Erilaisia ​​stressi signaaleja, kuten ravinteiden nälkään tai hoidon eri syöpälääkkeiden, stimuloivat autophagy prosessi [17]. Autophagy on yleensä ominaista läsnäolo autophagosomes ja kasvu lohkeaminen LC3 [18]. Rooli autophagy prosessissa solukuoleman on kiistanalainen, mutta on vahvistettu, että ylikuulumisen apoptoosin ja autophagy on välttämätöntä ohjelmoidun solukuoleman [19]. Tutkimuksessamme induktio autophagy in HDAC4-siRNA SGC-7901-soluissa on osoituksena pistemäinen kuvio LC3 immunovärjäyksen ja kertymistä biokemiallinen tunnusmerkki proteiinien autophagy (Atg7, Beclin 1 ja LC3) western blot -analyysillä. Autophagy esto estäjä 3-MA vaimensi autophagy induktion HDAC4-siRNA SGC-7901-soluissa. Niinpä spekuloitu autophagy tapahtui, voivat suojata SGC-7901 syöpäsoluihin indusoiman apoptoosin HDAC4 pudotus.

p21-proteiini, joka tunnetaan myös nimellä sykliinistä riippuvaisen kinaasin (CKD) estäjä 1, säätelee G1 vaiheen etenemistä solusyklin . p21 on usein väärin säädellään ihmisen syövissä, ja se voi toimia kasvaimia estävänä tai onkogeenin [20]. Ne, joilla on p21-positiivisia ja p53-negatiivinen syövät ovat huomattavasti korkeammat eloonjäämiskäyrien mahalaukun syöpä [21], kun taas menetys p21 ilmaisun ohella lisääntynyt p53 tunnistus liittyy huonoon ennusteeseen ja pieneni eloonjäämisen mahasyövän [22]. Yhdenmukainen jolloin p21-proteiini alassäädetty mahalaukun syövän kudoksissa [23], havaitsimme, että HDAC4 edistää mahasyövässä solujen lisääntymistä ja kasvua, välittämän tukahduttamisen p21 mahalaukun syöpäsoluissa, ja mukana on lisääntyminen ATP-tasot ja tukahduttamisesta ROS sukupolvi. Siksi tutkimme, p21 oli tärkeä välittäjänä HDAC4 välittämää SGC-7901 solujen kasvun edistämiseksi. Tässä tutkimuksessa, HDAC4 pudotus merkittävästi indusoi lisääntyneen ilmentymisen p21-proteiinin, kun taas HDAC4 yli-ilmentyminen väheni merkittävästi ilmentymistä p21-proteiinin SGC-7901-soluja. Nämä tiedot ymmärtää, että p21 voisi olla alavirran kohde HDAC4. Toiminnalliset analyysit osoittivat alas-säätely p21 voivat jäljitellä vaikutus HDAC4 ilmentymisen vaikutus SGC-7901 solujen kasvun edistämiseksi. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että HDAC4 alassäätöä voisi edistää SGC-7901 apoptoosia jopa säätelevä p21 ilme. p21 voisi olla kasvaimia estävä in kehittymistä ja etenemistä mahalaukun syövän, jonka ekspressio voi auttaa valvoa erilaisia ​​pahanlaatuisia käyttäytymistä mahasyöpä. Kuitenkin Ilmiön merkitystä HDAC4 sääntelyn p21 ilmentymisen on myös tarkasteltava siinä yhteydessä, että on olemassa useita keskeisiä tekijöitä ja polkuja, jotka mahdollisesti ilmentymisen moduloimiseksi p21 mahasyövän.

Yhteenvetona havaintomme ovat paljasti tärkeä merkitys HDAC4 valvonnassa ihmisen mahasyövän solulinja SGC-7901 kehitykseen säätelemällä p21, mikä viittaa siihen, että muuttaminen HDAC4 ilmaisun ja /tai toiminta voi olla tärkeä tapahtuma aikana mahasyöpä. Johtopäätöksenä nämä havainnot tunnistaa HDAC4 tärkeänä säätelijänä leviämisen mahasyöpä kautta tukahduttaminen p21

in vitro

.