Krooninen sairaus

tiivistelmä

leveys HER2 ilmaisun ensisijainen ihmisen munasarjan syövät edelleen kiistanalainen, kyseenalaistavalle sen soveltuvuutta universaali antigeeni tässä maligniteetti. Näiden ongelmien ratkaisemiseksi, suoritimme laajan HER2 ilmentymisanalyysiä laajalla paneelissa primaarikasvainten vakiintuneiden ja lyhytaikaisia ​​ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa. Perinteiset immunohistokemiallista (IHC) analysoidaan eri tuumorikohdat 50 tapauksessa korkealaatuisesta munasarjojen serous karsinoomat paljasti HER2 yli-ilmentymisen 29% arvioitiin sivustoja. Kuitenkin herkempi osoitusmenetelmiä kuten virtaussytometrialla, western blot-analyysi ja q-PCR paljasti HER2 ilmentyminen tuoreiden kasvainsoluissa johdetut askites tai kiinteiden kasvainten sekä kaikki vakiintunut ja lyhytaikaiset viljellyt syöpäsolun linjat. Syöpäsolut yleensä ilmaistu HER2 korkeammalla tasolla kuin että löytyy normaaleissa munasarjojen pinnan epiteelisolujen (OSE) soluja. Näin ollen, geenitekniikalla ihmisen T-solut ilmentävät HER2-spesifisiä kimeerisiä antigeenin reseptori (CAR) tunnistaa ja reagoida kaikkia vahvistettu tai ensisijainen munasarjasyöpäsoluja testataan vähän tai ei lainkaan reaktiivisuutta vastaan ​​normaaleja OSE soluja. Lopuksi kaikki ihmisen munasarjan syövistä ilmaista immunologisesti havaittavia määriä HER2, mikä osoittaa, että IHC mittaus aliarvioi todellisen taajuus HER2-ilmentävien munasarjojen syöpiä ja voi rajoittaa potilaiden pääsyä muuten kliinisesti merkittävä HER2-kohdistettuja hoitomuotoja.

Citation : Lanitis E, Dangaj D, Hagemann IS, Song DG, Best A, Sandaltzopoulos R, et al. (2012) Primary Human Munasarjojen epiteelisyöpäsolujen Laajasti Express HER2 at immunologisesti-havaittavia määriä. PLoS ONE 7 (11): e49829. doi: 10,1371 /journal.pone.0049829

Toimittaja: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 heinäkuu 2012; Hyväksytty 17. lokakuuta 2012 Julkaistu: 26 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Lanitis et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: munasarjasyöpä Research Fund, Sandy Rollman munasarjasyöpä Foundation, National Institutes of Health (1R21CA152540) ja yhteisen Fox Chase Cancer Center ja University of Pennsylvania munasarjasyövän SPORE (P50 CA083638). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ErbB2:

proto-onkogeenin koodaa transmembraanisen proteiinin tyrosiinikinaasin reseptori osallistuu kehittymistä ja etenemistä moniin syöpiin, mukaan lukien munasarjasyöpä [1], [2]. Säädeltyyn HER2 signalointi munasarjasyöpä (OvCa) tulokset joko geenimonistuksen tai yli-ilmentymisen ja johtaa nopeampaan solujen kasvuun [3], parannetun DNA korjaukseen [4] ja lisääntynyt pesäkkeenmuodostusta [5]. Yli-ilmentävät HER2 liittyy suurentunut etenemisen ja kuoleman erityisesti naisten kanssa FIGO vaiheen I ja II OvCa [6]. Ei kuitenkaan ole havaittu korrelaatiota välillä läsnä yli-ilmentävät HER2 ja FIGO vaiheessa, mikä viittaa siihen, että aktivaatio yli-ilmentävät HER2 on laaja ja se voi esiintyä sekä alussa ja lopussa vaiheessa taudin [7]. Nämä ominaisuudet näyttäisi tehdä HER2 houkutteleva molekyyli kohdennettuja immunoterapioiden naisilla, joilla HER2-positiivinen munasarjasyöpä, jossa luonnossa esiintyvät CD4

+ ja CD8

+ T-solu vasteita on havaittu [8].

HER2-proteiinin ilmentyminen on yleisimmin havaittu kautta semikvantitatiivinen IHC analyysi parafiiniin kudoksiin käyttämällä vakiintuneita protokollia käytetään arvioitaessa rintasyöpäpotilaiden harkitaan anti-HER2 Herceptin (trastutsumabi) käsittely [9]. Se, missä määrin HER2 ilmaistaan ​​OvCas edelleen kiistanalainen, koska määrä HER2-positiiviset OvCas raportoitu kirjallisuudessa vaihtelee 4,9%: sta 52,5% [6], [7], [10], [11], [12] , [13], [14], [15]. Kuitenkin yhdessä tekemää tutkimusta Hellström et al., Kaikki kasvainsolulinjoja, jotka muodostetaan

in vitro myynnissä maassa kiinteä kasvain tai askites ilmaistuna HER2 viittaa valikoivan kasvun etu HER2-positiiviset syöpäsolut kulttuuri [16 ]. Yksi vakiintunut solulinja osoitettu olevan herkkä HER2-suunnattu vasta-aine-riippuvainen soluvälitteinen sytotoksisuus (ADCC), kuitenkin HER2 ilmaisun ja ADCC herkkyys ei ole arvioitu peräisin olevilla soluilla fysiologinen munasarjat. Lisäksi HER2 ilmentymisanalyysiä hyödynnetään virtaussytometria ainoana havaitsemismenetelmä ja rajoittui melko harvoissa tapauksissa, luottaen raskaasti in vitro soluviljelmässä.

Nykyisessä tutkimuksessa, perustettiin munasarjasyövän solulinjoissa, ensisijainen lyhyen aikavälin viljellyt solulinjat ja tuoretta munasarjasyöpäsoluja peräisin askites ja kiinteä kasvain arvioitiin näytteet HER2-ilmaisun käyttämällä erilaisia ​​osoitusmenetelmiä, kuten kvantitatiivinen PCR (q-PCR), western blot-analyysi, ja virtaussytometrialla, ja ekspressiotasoja verrattiin vastaava tasot normaaleissa munasarjan pintaan epiteelisoluja. Edelleen, immunologisesti aktiivinen tasot HER2 mitattiin käyttämällä ihmisen T-soluilla, jotka oli geneettisesti muokattu ilmaista HER2-spesifisiä kimeerisiä antigeenin reseptori (CAR). Anti-HER2-CAR T-soluja arvioitiin niiden kyvyn tunnistaa HER2-ilmentävät OvCas ja normaalit solut. Tuloksemme osoittavat, että kaikki OvCa näytteet ilmaista HER2, ja että tämä taso ilmaisun riittää herättämään immuunitunnistusta.

a.

Immuunivärjäytyminen esittää alueellista monimuotoisuutta HER2 ilmentymisen korkea-asteen papillaarinen serous munasarjan adenokarsinooma. HER2 ilmentymistasot arvostellaan 0-3 asteikolla (pisteet 0 = havaita, pisteet 3 = voimakas värjäytyminen). Alkuperäinen suurennus on 200 ×.

B.

Heatmap esimerkki HER2 ekspressiotason 50 primaarinen ja metastaattinen munasarjakarsinooman tapauksissa kuten tekee IHC värjäystä.

C.

Frekvenssijakauma sivustoilta ilmentävät HER2 tasoilla alueella pisteet 0 3. keskimääräinen lukumäärä arvioidaan sivustoja tapauksissa huomaamaton tai havaittavissa HER2 ilmentyminen oli samanlainen (4,2 vs. 3,7 vastaavasti;

P

= 0,19).

D.

Frekvenssijakauma joko ensisijainen tai metastaasien ilmentävät HER2 tasoilla alueella pisteet 0 3. useammin primaarituumorin sivustoja ilmaistaan ​​HER2 (36%; 30/84) verrattuna metastaasien (24 %, 27/111) ja oli korkeampi keskimääräinen HER2 ilmaisun pisteet (0,37

vs.

0,21,

P

= 0,04). Tilastollisesti merkittävää eroa ei havaittu verrattaessa ekspressiotasot yksi ensisijainen ja metastaasien jotka ilmaisivat HER2 millään tasolla (1,03

vs.

0,86,

P

= 0,26).

P

arvot laskettiin käyttäen parittomia Studentin t-testi analyysi.

Materiaalit ja menetelmät

Syöpäsolut ja Lines

luovuttajat solminut University of Pennsylvania Institutional Review Board (IRB) -hyväksytty kliininen protokolla ja allekirjoittivat tietoon perustuvan suostumuksen ennen kasvain tai verinäytteen. Kiinteitä kasvaimia tai normaali munasarjojen näytteitä, näyte kuutioiksi RPMI-1640, pestiin ja sentrifugoitiin (800 rpm, 5 minuuttia, 15-22 ° C), ja suspendoitiin uudelleen entsymaattisesti (0,2 mg /ml kollagenaasia ja 30units /ml DNaasi RPMI-1640) yli yön kierto huoneenlämpötilassa. Askites kokoelmat pestiin ja kryosäilytetään ennen tutkimusta. Lyhytaikaiset viljellyt ensisijainen linjoja ystävällisesti Dr. Richard Carroll yliopistossa Pennsylvanian [17]. Vakiintunut ihmisen munasarja- ja rintasyövän solulinjat, CEM ihmisen T-solu lymfoblastien solulinja ja 293T-solulinja hankittiin (ATCC). Normaali menettää tavallisesti-4 ja menettää tavallisesti-6 solulinjat ystävällisesti tri Birrer Dana-Farber /Harvard Cancer Center [18] ja 398 solulinja oli lahja tohtori Lin Zhang yliopistossa Pennsylvanian [19]. 293T-soluissa, ja kasvainsolulinjoja pidettiin täydellisessä väliaineessa; RPMI-1640 (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% (v /v) lämpö-inaktivoitua FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia, ja 100 ug /ml penisilliiniä ja 100 U /ml streptomysiiniä.

a.

ErbB2

mRNA tasot munasarjasyövän solulinjoissa Q-PCR: llä.

ErbB2-

mRNA-tasoja munasarjasyövän solulinjoissa ovat suhteessa, että ErbB2-CEM-soluissa. Kaikki munasarjasyövän solulinjoissa ilmaista

erbB2

mRNA. B-aktiini käytettiin endogeenisen geenin valvontaa. Tulokset esittävät keskiarvoja ± SD kolminkertaisista kuopista. Keskimääräinen, suhteellinen

ErbB2

mRNA ilmaisun keskuudessa vakiintunut ja lyhytaikaisia ​​OvCa solulinjoissa ei ollut tilastollisesti erilainen (

P

= 0,45).

P

laskettiin käyttäen parittomia Studentin t-testi analyysi.

B.

Havaitseminen pinta HER2-proteiinin ilmentymisen (täytetty histogrammit) ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa virtaussytometrialla; isotyypin vasta-ohjaus (avoimet histogrammit).

C.

Western blot-analyysi HER2-proteiinin ilmentymisen edustavissa jotka ilmentävät ero määriä HER2. HER2 proteiini ilmentyy vaihtelevia määriä kaikissa munasarjan solulinjat testattiin. B-aktiini käytettiin kontrollina.

immunohistokemia

Institutional Review Board hyväksyntä saatiin. Me haetaan levyjä 50 peräkkäisen Metastasoivassa papillaarisen vakavien munasarjasyöpä (FIGO vaihe II B ja edellä), joille ensisijainen resektio meidän laitos vuosina 2005 ja 2008. Kalvot tarkistettiin ja selityksin ja parafinoidut kudosblokeista valittiin rakentaa kudosta microarray on ensisijainen ja etäpesäkkeitä. 206 yhteensä kasvain talletukset (ensisijainen sivustoja ja etäpesäkkeet) olivat edustettuina jono. Keskimäärin 3,7 kohdetta sisällytettiin potilasta kohden. Yleisimmät metastaasien mukana omentum, vatsakalvon (esim umpikujan varrella), kohdun herakalvoon ja suolen seinämän. Kunkin lohkon, kolmena kappaleena 0,6 mm ytimiä kasvaimen asetettiin kudoksen microarray. 5 um parafiinileikkeet värjättiin kaniinin anti-ihmis-HER2-vasta-aine (Dako) standardimenetelmien mukaisesti. HER2 ilmentyminen kunkin ytimen teki valomikroskoopilla 200 kertaisella suurennuksella käyttäen puoli- kvantitatiivista asteikolla välillä 0 3. Ytimet osoittaa alle 10% kasvain ei sijoitettiin. Jokaisen kasvainpaikkaa, lopputulos oli keskimääräistä pisteiden kaikkien arvioitavissa ydintä.

kvantitatiivinen PCR

RNA eristettiin käyttäen RNA helppo (Qiagen). cDNA tuotettiin 1 ug RNA käyttämällä First Strand Ready-To-Go helmiä (GE Healthcare). Reaaliaikainen PCR suoritettiin kolmena rinnakkaisena käyttäen Applied Biosystem alukkeina

ErbB2

ja B-aktiini.

ErbB2

mRNA syöpäsoluissa normalisoituivat B-aktiini, ja verrattuna CEM, ja esitetään kertainen

ErbB2

mRNA-tasolla. Tietojen hankinta ja analysointi suoritettiin Applied Biosystem ohjeiden.

.

ErbB2

mRNA kvantitointi in CD45-köyhdytettyä ensisijainen askites syöpäsoluja. SKOV-3 ja CEM käytettiin positiiviset ja negatiiviset HER2-ilmentävä solulinja ohjaa vastaavasti. Palkit esittävät keskiarvoa ± SD arvoista kolmen kuopan.

B

.

ErbB2

mRNA kvantitointi in CD45-köyhdytettyä ensisijainen kiinteän kasvaimen soluihin. Ei merkittävää eroa keskimääräisessä

ErbB2

mRNA-tasolla ei havaittu vatsaonteloon sekä kiinteitä kasvaimia (

P

= 0,46).

C.

Surface HER2 ilmaisu (kiinteä histogrammit) edustavista Ber-Ep4

+ CD45

– aidatulla vatsaonteloon sekä kiinteä kasvain johdettuja syöpäsolujen seurattiin virtaussytometrialla; isotyypin vasta-ohjaus (avoimet histogrammit). Ei ole merkittävää eroa HER2-proteiinin tason välillä havaittiin askitesta tai kiinteitä kasvaimia peräisin olevat solut (

P

= 0,95).

D.

Western blot-analyysi HER2-proteiinin ilmentymistä irtotavarana kiinteän kasvaimen lysaatit. B-aktiini käytettiin endogeenisen geenin valvonta. OVCAR-3 ja CEM käytettiin positiivisina ja negatiivisten kontrollien HER2 ilme. P-arvot laskettiin käyttäen paritonta Studentin t-testiä varten.

virtaussytometria

Hiiren anti-ihmis-CD3, CD4, CD8, CD45, CD69, CD107a ja CD107b mAb: t (

BD Biosciences) B käytettiin fenotyyppianalyysillä. 7-AAD käytettiin elinkelpoisuuden värjäystä. HER2 pinnan ilmentyminen arvioitiin käyttäen biotiini-konjugoitu anti-HER2-affibody (Abcam), jota seurasi PE-leimatulla streptavidiinilla. Anti-HER2-CAR pinnan ilmentyminen arvioitiin käyttäen ihmisen rekombinantti-HER2-Fc-kimeeran seurasi PE-konjugoitu anti-huIgG. Hankinta ja analyysi suoritettiin käyttäen BD FACS CANTO II kanssa DIVA ohjelmisto.

a.

ErbB2

mRNA määritysrajan normaaleissa OSE soluissa (398, menettää tavallisesti-4, menettää tavallisesti -6 ja 1744) Q-PCR: llä. SKOV-3 ja CEM käytettiin positiivisia ja negatiivisia HER2 ilmentämissolulinjat vastaavasti. Palkit esittävät keskiarvoja ± SD-arvo kolmen kuopan.

B.

Pinta HER2-proteiinin ilmentymisen (kiinteä histogrammit) normaalit munasarjaepiteelisoluilla virtaussytometrialla; isotyypin vasta-ohjaus (avoimet histogrammit).

C-D.

Vertailu

ErbB2

mRNA ja proteiini tasoilla munasarjasyöpä askites, kiinteä kasvain ja normaali OSE soluissa. (

C

) Vertical sirontakuvaajiin että

erbB2

mRNA askites, kiinteä kasvain ja normaali OSE määritetty q-PCR. Keskiarvo kussakin ryhmässä on merkitty vaakasuora viiva.

P

= 0,0498 verrattaessa

erbB2

mRNA vesivatsanes- vs normaali OSE soluissa;

P

= 0,0210 verrattaessa

erbB2

mRNA kiinteissä kasvaimissa vs normaali OSE soluissa. (

D

) Vertical sirontakuvaajiin proteiinin tasot askites, kiinteä kasvain ja normaali OSE määritettiin virtaussytometrialla. Keskimääräinen kunkin ryhmän on merkitty vaakasuora viiva

P

= 0,0616 verrattaessa HER2 proteiini vesivatsanes- vs normaali OSE soluissa;

P

= 0,1749 verrattaessa HER2-proteiinin kiinteitä kasvaimia vs normaali OSE soluissa.

P

-arvot laskettiin käyttäen paritonta Studentin t-testiä varten.

Western-blottaus

yksisoluiset kerrokset pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja lyysattiin RIPA-puskuria (50 mM Tris-HCI (pH 7,0), 1,0% NP-40, 0,1% deoksikoolihappoa, 30 mM Na-

3Vo

4, 1 mM PMSF). Lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla ja kvantitoitiin käyttäen Nanoorange Kit (Invitrogen). 15 ug kokonais-proteiinia per kaista erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ennalta valettu gradientilla (4-15%) geeleissä (Bio-Rad) 120 V: ssa 60 minuutin ajan. Proteiini siirrettiin geelistä Immobilon-P siirto kalvo 30 minuuttia, estettiin yön yli 5% maito /PBST ja siirrettiin käyttäen 1 ug /ml hiiren anti-humaani-HER2-mAb (klooni 3B5, BD Biosciences). Membraanit pestiin 3 x PBST: llä ja niitä blotattiin HRP-konjugoidulla anti-hiiri-vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. B-aktiini havaittiin käyttäen anti-ihmis-B-aktiini-HRP (1:30,000). Kalvoja inkuboitiin ECL Plus (GE Healthcare) 5 minuutin ajan ja altistettiin elokuvien 15-30 sekuntia.

. Kaavioesitys Anti-HER2 Kimeeriset Antigen Reseptori (CAR) konstruktio sisälsi CD3ζ sytosolin verkkotunnuksen yksin (C6.5-z). C6.5, anti-HER2-scFv; VL, variaabelikevytketjun; L, Linker; VH, variaabeliraskasketju; TM, kalvonläpäisevä alue. C6.5 scFv CAR lauseke (harmaa histogrammit) havaittiin ihmisen CD4

+ ja CD8

+ – aidatulla T-solujen rekombinantti ihmisen HER2-Fc kimeerisen proteiinin 10 päivän kuluttua transduktion, verrattuna trandusoidun T-soluja (avoin histogrammit ). Prosenttiosuus CAR transduktion ilmoitettu.

B.

Anti-HER2 CAR transdusoidut T-solut tuottavat IFN-γ nimenomaan stimulaation jälkeen ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa. CAR transdusoidut tai trandusoidun T-soluja viljeltiin yksinään (ei mitään) tai stimuloitu yön yli ihmisen HER2

+ perustettu ja lyhytaikaisen munasarjasyövän solulinjoissa tai HER2

– ohjauslinjat CEM ja MDA468. IFN-γ kvantitoitiin soluvapaissa supernatanteista ELISA: lla.

C.

Anti-HER2 CAR T-solut erittävät IFN-γ stimulaation jälkeen HER2

+ ensisijainen askites (vasemmalla) tai kiinteän munasarjojen (keskellä) syöpäsoluja. Pieniä määriä IFN-γ havaittiin stimulaation jälkeen normaalin munasarjan pintaepiteelisolujen 398, menettää tavallisesti-4, menettää tavallisesti-6 tai 1744 (oikealla). Sytokiinipitoisuudet (pg /ml) on ilmoitettu keskiarvona ± SEM kolmen kuopan.

Anti-HER2-CAR Hakemisto Rakentaminen

PCR-tuotteet, jotka sisältävät C6.5Y100KA HER2-scFv: [20] ystävällisesti toimittanut Silvana Canevari (Instituto Nazionale dei Tumori, Italia) ja kloonattiin sitten pCR2.1-TOPO-vektoriin käyttäen Topo TA Cloning Kit (Invitrogen). C6.5 scFv [21] DNA-sekvenssi, kehitettiin edellä mainittu plasmidi käyttäen QuikChange Multi kohdennettu mutageneesi Kit (Stratagene). Lopullinen plasmidia käytettiin templaattina PCR-monistuksen 795 bp C6.5 scFv-fragmentti käyttäen seuraavia alukkeita: 5′-GCGGGATCCATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGGGGCA-3 ’(BamHI on alleviivattu) ja 5′-GCGGCTAGCCGCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCC-3’ (Nhel on alleviivattu ). Tuloksena saatu PCR-tuote digestoitiin BamHI: llä ja Nhel: llä ja ligoitiin kolmannen sukupolven itse inaktivoiva lentiviraalinen ekspressiovektori pCLPS sisältää CD3ζ signalointi CAR-sekvenssi, jolla on siirtogeenin ilmentymistä ohjaa CMV-promoottori. Saatu rakenne nimettiin pCLPS-C6.5-z.

C6.5 CAR T-solut degranulate ja ilmaista T-solujen aktivaation markkereiden vasteena HER2-spesifisen stimulaation. C6.5 CAR T-soluja viljeltiin ilman kohdesoluihin (ei mitään) tai osoitetuilla HER2-negatiivinen tai positiivisten vakiintunut ja ensisijainen kasvainsolun tavoitteita tai normaali OSE soluja 5 tuntia samalla värjätty anti-CD107a, b-vasta konjugoitu FITC. Inkubointijakson jälkeen, T-solut värjättiin CD8- ja CD69 ja analysoitiin virtaussytometrialla.

Rekombinantti Lentivirus Production

Korkean tiitterin replikaatiopuutteisten lentivirusvektoreita tuotettiin ja väkevöitiin, kuten aikaisemmin kuvatulla tavalla [22]. Lyhyesti, 293T-solut transfektoitiin 7 ug VSV-G-plasmidi, 18 ug pRSV.REV plasmidia, 18 ug pMDLg /p.RRE plasmidi, ja 15 ug pCLPS-C6.5-z siirto plasmidista käyttämällä Express In (Open Biosytems). Viral Supernatantti kerättiin 24 tunnin ja 48 h transfektion jälkeen. Viruspartikkelit konsentroitiin ultrasentrifugoimalla 3 h 25000 rpm Beckman SW28 roottorissa (Beckman Coulter), ja suspendoitiin uudelleen 0,4 ml: aan RPMI: tä.

T Cell Transduk-

Ensisijainen ihmisen T-solut hankittiin Human Immunology Core University of Pennsylvania eristettiin vapaaehtoisten verenluovuttajien seuraavat leukafereesejä negatiivisella valinnalla. Kaikki näytteet kerättiin alle yliopistossa Institutional Review Board-hyväksytty protokolla, ja kirjallinen suostumus saatiin jokaisen luovuttajan. T-solut stimuloitiin täydellistä väliainetta, jossa anti-CD3: n ja anti-CD28-mAb päällystettyjä helmiä (Invitrogen) ja transdusoidaan rekombinantti-CAR-koodaavan lentivirus on MOI ~5-10, kuten on kuvattu [22].

sytokiinien vapautumisen määritykset

1 x 10

5 T-soluja viljeltiin yhdessä 1 x 10

5 kohde- solua per kuoppa kolmena kappaleena 96-kuoppaisille pyöreäpohjaiseen levyissä lopullisessa tilavuudessa 200 ui täydellistä väliainetta. Jälkeen 20~24 h, cell-free supernatantit analysoitiin läsnä IFN-γ käyttäen joko ELISA Kit (Biolegend) tai Sytokiini Bead Array (BD Biosciences), mukaan valmistajan ohjeiden.

jyvästen häviämisen Assay

määritys suoritettiin, kuten on kuvattu [23] pienin muutoksin. 1 x 10

5 T-soluja viljeltiin yhdessä 1 x 10

5 kohdesoluja 100 ul media per kuoppa 96-kuoppaisen levyn kolmena kappaleena. Ohjaus viljelmät sisälsivät T-soluja yksinään. Anti-CD107a ja anti-CD107b Ab (10 ul /kuoppa) tai IgG1 konjugoituna FITC: tä (BD Biosciences), ja 1 ul /näyte monensiinia (BD Biosciences) lisättiin kulttuurin ja inkuboitiin 5 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Solut pestiin kahdesti PBS: llä, värjättiin ilmentymisen CAR, CD8 ja CD69: n ja analysoitiin virtaussytometrialla, kuten yllä on kuvattu.

krominvapautusmäärityksestä

51Cr release määritykset suoritettiin, kuten on kuvattu [24]. Kohdesoluja leimattiin 100 uCi

51Cr 37 ° C: ssa 1,5 tunnin ajan. Target solut pestiin kolme kertaa PBS: ssä, suspendoidaan uudelleen elatusaineeseen 1 x 10

5 elävää solua /ml ja 100 ui kuoppaa kohti 96-kaivo V–pohjalevy. Efektorisolut pestiin kahdesti elatusaineessa ja lisättiin kuoppiin annettuun suhteissa. Levyjä nopeasti sentrifugoitiin laskeutua soluja, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa 18 tunnin ajan, minkä jälkeen supernatantit kerättiin, siirrettiin LUMAR-levyn (Packard) ja laskettiin käyttäen 1450 Microbeta Liquid Scintillation Counter (Perkin-Elmer). Spontaani

51Cr release arvioitiin kohdesoluissa inkuboidaan pelkällä väliaineella. Maksimaalinen

51Cr: n vapautuminen mitattiin kohdesoluja inkuboitiin SDS lopullinen pitoisuus on 2% (v /v). Spesifisen lyysin prosentti laskettiin (kokeellinen – spontaani lysis /maksimaalinen – spontaani lysis) kertaa 100.

Tilastollinen analyysi

GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software) käytettiin tilastollisia laskelmia.

P

0,05 arvoja pidettiin merkittävänä. R-squared arvot (R

2) laskettiin käyttäen lineaarista regressiota kautta Microsoft Excel.

Tulokset

immunohistokemiallinen toteaminen HER2 Expression munasarjasyövässä

HER2 ilmentyminen arvioitiin 50 tapauksessa korkealaatuisesta munasarjojen serous karsinoomat käyttäen immunohistokemiallista (IHC) analyysi kudos microarray (TMA). Yksittäisissä tapauksissa vaihteli lukumäärän suhteen kasvaimen sivustoja saatavilla analyysiä varten. Kaikki tapaukset sisälsivät ainakin yhden ensisijaisen vauriokohdan vaikka useimmissa tapauksissa (96%) oli sekä ensi- että ≥1 metastaattinen sivuston käytettävissä. Monta näytettä, oli ≥2 (62%) tai ≥3 (42%) metastaasien saatavilla TMA. Mukaan IHC pisteytys, HER2 ilmentyi eri tasoilla joukossa 50 tapausta vaihtelevat havaita (pisteet 0) voimakkaalle värjäys (pisteet 3 +; kuvio 1A). Positiivinen HER2 ilme millä tahansa tasolla havaittiin 26 tapauksessa (52%), kun taas ei HER2 ollut havaittavissa myös muualla 24 tapauksessa (kuvio 1 B). Ulos 26 tapausta ilmentävät HER2 yhdessä tai useammassa paikassa, vain 6 (23%) ilmaistuna HER2 lainkaan sivustoja IHC; Tällöin painotettiin kohti korkeampia HER2 ilme. Useimmissa tapauksissa, jotka ilmensivät HER2 tahansa sivuston (20/26) oli ristiriitainen ilmaisu (havaittavissa verrattuna ei havaita) yhdessä tai useammassa tuumorikohdissa. Keskimääräinen lukumäärä arvioidaan alueilla oli samankaltaista joukossa 26 tapausta, jossa havaittavissa HER2 ja 24 tapauksissa ilman havaittavaa HER2 (4,2 vs. 3,7, tässä järjestyksessä; viljelyalusta

P

= 0,19). Heterogeenisyys kuviointi HER2-proteiinin ilmentymisen kesken eri sivustoja yksittäistapauksissa oli läsnä useita malleja: havaittavissa kaikissa (6/50); havaittavissa ensisijainen mutta havaitsematon etäpesäkekasvainten (8/50); havaittavissa metastaattisen mutta havaitsematon primaarikasvaimen (5/50); havaita ainakin yksi ensisijainen ja yksi metastaasien (7/50). 195 tuumorikohdissa arvioitu, 138 (71%), ei näkynyt havaittavissa olevaa HER2 ilmentymistä (kuvio 1C). Viisikymmentäseitsemän (29%) oli positiivisia HER2 ilmaisu; 25% (49/195), jossa on 0≤1 HER2 pisteet; 2,5% (5/195) ja 1≤2 HER2 pisteet; ja 1,5% (3/195) ja 2≤3 HER2 pisteet. Suurempi taajuus primaarituumorin sivustoja ilmaistaan ​​HER2 (36%; 30/84) verrattuna metastaasien (24%, 27/111) ja oli korkeampi keskimääräinen HER2 ilmaisun pisteet (0,37

vs.

0,21,

P

= 0,04; kuvio 1 D). Joukossa ensisijainen ja metastaasien jotka ilmaisivat HER2 millään tasolla, ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa ilmaisun tasolla (1,03

vs.

0,86,

P

= 0,26). Lopuksi IHC avulla voidaan todeta HER2 ilmaisun 29% kaikista sivustot ja noin puolet kaikista kehittyneiden OvCa testataan.

HER2 on ilmaistuna Kaikki munasarjasyöpä Solulinjat

Suhteellisen alhainen herkkyys IHC analyysi voi vaikuttaa havaitsemisen vähäisessä määrin proteiinien ja siksi vääristelevät todellista taajuutta syöpien, jotka ilmentävät HER2. Paremmin arvioida HER2 ilmaisun OvCa, 12 perustettiin ja 7 lyhytaikaisia ​​OvCa solulinjoja mitattiin

ErbB2

-mRNA-tasojen q-PCR, ja verrattiin havaittu CEM, ihmisen T-solu lymfoblastien kaltaisia solulinja, josta puuttuu HER2 ilmaisun [25]. Kaikki OvCa solulinjat ilmensivät

ErbB2:

mRNA, vaikkakin eri tasoilla (kuvio 2A). Lisääntynyt

ErbB2

mRNA ilmaisun suhteessa CEM ohjaus, vaihteli 63- ja 6614-kertaiseksi perustettu linjat ja 40- ja 1088-kertaisesti lyhytaikaisia ​​ensisijainen solulinjoissa. Keskimääräinen, suhteellinen

ErbB2

mRNA: n ilmentymisen keskuudessa vakiintunut (815-kertainen) ja lyhytaikaisia ​​OvCa solulinjoissa (372-kertainen) ei ollut tilastollisesti erilaisia ​​toisistaan ​​(

P

= 0,45).

ErbB2

mRNA ei havaittu CEM ohjauslinjan, mutta oli havaittavissa alhaisilla tasoilla ohjaus rintasyövän linja, MDA468, joka ilmaisee

ErbB2

mRNA muttei pinta HER2-proteiinia [25] .

HER2-proteiinin ekspressiota tutkittiin perustettu ja lyhyen aikavälin ensisijainen tuumorisolulinjat värjäämällä ei-läpäiseviksi solujen erittäin herkkä anti-HER2-affibody [25], on korkea affiniteetti ligandiin n solunulkoista domeenia vastaan ​​HER2 , jota seurasi virtaussytometria-analyysin. Edustaja histogrammit osoittavat perustettu OvCa, jotka ilmentävät korkea, keskinkertainen tai matala pinnan taso HER2-proteiinia, ja negatiivinen kontrolli solulinjoja, joilla ei ole havaittavaa HER2 ilmentymistä (kuvio 2B). Kaikki vahvistettu (n = 12) ja lyhyen aikavälin (n = 7) OvCa testatut solulinjat osoittivat HER2-proteiinin pinnalla ilmenemisen (taulukko 1). Useimmat solut vahvistettu (97,7 ± 1,3%) ja lyhytaikaisia ​​linjat (88,9 ± 4,8%) ilmaistuna HER2-proteiinia, jolla on korkeampi prosenttiosuus perustettu linjat (

P

= 0,03) (taulukko 1). Mean HER2-proteiinin tasot mitattiin spesifisellä fluoresenssin keskimääräinen intensiteetti (MFI) tiettyjä kehityssuuntia kohti ollessa suurempi pysyviä solulinjoja (1906 ± 1221 FIU; fluoresenssin intensiteetti yksikköä) verrattuna lyhytaikaisia ​​solulinjoissa (594 ± 165 FIU), mutta eivät olleet merkittävästi erilaiset (

P

= 0,43) (taulukko 1), mikä on yhdenmukaista mRNA tuloksia. HER2-proteiinia ja

ErbB2

mRNA ekspressiotasot kaikilta OvCa solulinjat korreloi merkitsevästi (R

2 = 0,83; laskettu käyttämällä lineaarista regressio). Cellular HER2-proteiinin ilmentyminen vahvistettiin Western blot -analyysillä (edustavia näytteitä esitetty; kuvio 2C).

Broad HER2 ilmentäminen Ensisijainen Munasarjasyöpä näytteet

Koska

in vitro

kulttuuri voi valikoivasti rikastaa HER2-ilmentävien OvCa solujen [16], mittasimme HER2 ilmentymistä sivistymätön kasvainsoluissa johdettu suoraan ensisijainen vatsakalvon OvCa askites tai juuri resekoituun kiinteitä kasvaimia. Kasvainsolujen askites tai kiinteän kasvaimen näytteet rikastettiin magneettinen ehtyminen CD45

+ leukosyyttien ja arvioitiin suhteellinen

ErbB2-

mRNA-tasot kautta q-PCR: llä (kuvio 3A, B). Kaikki ensisijainen sivistymätön tuumorisoluja testattiin (n = 22) ilmaisi

ErbB2

mRNA tasoilla alueella 35- 1225 kertaa suurempi kuin CEM-soluja. Ei merkittävää eroa keskimääräisessä

ErbB2

mRNA-tasolla ei havaittu vatsaonteloon sekä kiinteitä kasvaimia (477

v

s. 583, tässä järjestyksessä;

P

= 0,46). Virtaussytometria suoritettiin käyttäen anti-HER2-affibody osoitti, että ei-läpäiseviksi kasvainsoluja (BerEp4

+ CD45

-) kaikissa ensisijainen askites (n = 22) ja kiinteän kasvaimen näytteitä (n = 10), ilmaistuna pinta-HER2-proteiinia, joskin vaihtelevia määriä kanssa havaitsemiseen

ErbB2

mRNA q-PCR (taulukko 2; edustavia tietoja kuvassa 3C). Ei ole merkittävää eroa HER2-proteiinin tason välillä havaittiin askitesta tai kiinteitä kasvaimia peräisin olevia soluja (7209 ± 1197 FIU

vs.

7407 ± 2531 FIU, vastaavasti;

P

= 0,95), kanssa mRNA tuloksia. Western blot-analyysi suoritettiin koko kasvaimen lysaatit osoitti myös kaikkialla läsnä ilmentymistä HER2 perusterveydenhuollossa kiinteiden kasvainten (edustavia näytteitä kuvassa 3D).

Havaittavissa HER2 ilmentäminen Normaali munasarjaepiteelisoluilla

kolme kuolemattomaksi munasarjojen pintaepiteelissä solulinjoja (OSE) ja yksi ensisijainen sivistymätön solun näyte (1744) johdettu normaalista munasarjat testattiin HER2 ilme. Kaikki normaalit OSE solut ilmensivät alhaisia ​​

ErbB2-

mRNA, joka vaihteli 35-kertaiseksi 217-kertaa suurempi kuin CEM kontrollisoluja (128 ± 5,5; kuvio 4A). Virtaussytometria (kuvio 4B) ja Western blot-analyysi (ei esitetty) osoitti, että kaikki normaalit OSE solut ilmentävät matalan vielä havaittavia määriä HER2-proteiinia. Menettää tavallisesti-6 ja menettää tavallisesti-4 solulinjat ilmensivät korkeampia proteiinin tasoja kuin 398 linja ja 1744 normaalin munasarjan mallin mukaisesti mRNA tuloksia.

Seuraavaksi vertasimme

ErbB2

mRNA ja proteiini tasoilla normaaleissa OSE soluissa, pahanlaatuiset ensisijainen vatsaonteloon sekä kiinteä kasvain-johdettu kasvaimen solut (kuviot 4C-D). Vatsaonteloon sekä kiinteä kasvain näytteet ilmaistaan ​​yleensä korkeampia

ErbB2

mRNA ja proteiini verrattuna OSE soluihin, vaikka lomitus ilmentymistaso oli olemassa ryhmissä. Vatsaonteloon sekä kiinteät kasvaimet ilmaisivat merkittävästi enemmän

ErbB2

mRNA kuin OSE soluja (askites, 483 ± 319-kertainen,

P

= 0,0498; Solid kasvain, 583 ± 330-kertainen,

P

= 0,0210; OSE, 128 ± 93-kertainen). HER2-proteiinin tasot olivat korkeampia vesivatsanes- (5825 ± 1202-kertainen) ja kiinteä kasvain näytteet (7407 ± 2531-kertainen) verrattuna normaaliin OSE (1429 ± 111-kertaiseksi), mutta matalan tilastollista merkittävyyttä (Askitesta

v

s. OSE

P

= 0,0616; Solid

vs.

OSE

P

= 0,1749). Vaihtelu HER2 ekspressiotasot OSE näytteissä oli rajoitettu, mikä mahdollistaa luotettavan erottamisen kasvaimen näytteitä, jotka yli-ilmentävät HER2: ta. Vertailun vuoksi, 75% (9/12) ja askites ja 90% (9/10) kiinteät kasvaimet ilmaisivat korkeampia HER2 verrattuna OSE, ja 91% (20/22) ja askites ja 80% (8/10) kiinteä kasvaimia oli korkeammat HER2-proteiinin tasot kuin normaalit OSE soluissa.

HER2-spesifisten T-solut tunnistavat kaikki munasarjasyöpäsolulinjoihin

Kimeeriset antigeenin reseptorit (CAR) yhdistää vasta-aineen spesifinen pinta-antigeenin kanssa efektori aktiivisuus T-lymfosyyttien [26]. HER2-specific CAR-ilmentäviä T-soluja voidaan käyttää voimakas annoksesta riippuvaa

in vitro

antituumorivaikutus HER2-positiiviset kohdesoluja [20], [25]. Tutkia, missä määrin laajoja HER2 ilmentymistä OvCa antaa herkkyys HER2 kohdistetun immunoterapian ihmisen luovuttaja-T-solut geneettisesti muunnettu ilmentämään anti-HER2 CAR (C6.5) [27], mikä suuntaamalla niitä pintaa HER2, ja testattu tietyn aktiivisuus OvCas. C6.5 CAR-konstrukti koostuu C6.5 scFv liittyy CD8a sarana ja läpäisevä alue, jota seuraa solunsisäinen CD3ζ signalointi domain (C6.5-z; kuvio 5A). Ensisijainen ihmisen CD4

+ ja CD8

+ T-solut tehokkaasti transdusoitiin CAR käyttäen lentivirusvektoreita kanssa transduktiotehoja toistettavasti 60% (kuvio 5A). Yhteistyössä kulttuuri, anti-HER2 CAR T-solujen tunnustettu ja vastasi stimulaatiota kaikkien vahvistettu (n = 10) tai lyhyen aikavälin (n = 4) ihmisen OvCa soluja, mutta ei vastaan ​​CEM ja MDA-468-solulinjoja puuttuu HER2 ilme (Kuvio 5B).