Krooninen sairaus

tiivistelmä

V-Raf Hiiren sarkooma Viral Oncogene Homologi B (BRAF) mutatoitunut keuhkosyöpä on melko aggressiivinen ja on vastustuskykyinen tällä hetkellä käytettävissä olevat hoidot. Tuoreessa vaiheen II tutkimuksessa potilaille, joilla on BRAF-V600E ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), BRAF V600E estäjä osoittivat todisteita aktiivisuutta, mutta 30% tästä valitun ryhmän eteni hoidon aikana, mikä osoittaa tarvetta kehittää vaihtoehtoisia strategioita. Testasimme kahta eri vaihtoehtoja parantaa tehoa vemurafenib (BRAF V600E estäjä) in BRAF mutatoitunut NSCLC. Ensimmäinen vaihtoehto oli lisäksi erlotinibin että vemurafenib onko yhdistelmä säädetty synergiaa. Toinen oli aiheuttaa MEK esto (alavirtaan RAF) kanssa trametinib (MEK estäjä). Olemme havainneet, että yhdistelmä vemurafenib ja erlotinibin ei ollut synergististä inhibitiota p-ERK signalointi BRAF-V600E soluja. Vemurafenib aiheuttanut merkittävää apoptoosia, G1 pidätyksen ja säätelyä BIM in BRAF-V600 soluissa. Trametinib oli tehokas yksittäisenä aineena BRAF mutatoitunut soluissa, joko V600E tai ei-V600E. Lopuksi yhdistelmä vemurafenib ja trametinib aiheutti pienen mutta merkittävän apoptoosin lisääntyminen sekä merkittävä säätelyä BIM verrattuna joko yksittäisenä aineena. Siten vihjaten mahdollisuutta käyttämällä monimuotoiset hoitomuoto on tässä potilasryhmässä. Tärkeää on, trametinib yksin aiheutti ylössäätely p-AKT in BRAF kuin V600 muuntunut soluja, vaikka tämä vaikutus oli mitätöidä yhdistelmällä. Tämä havainto viittaa siihen, että yhdistelmä MEK estäjän kanssa BRAF estäjä on tehokkaampi kliinisessä puitteet potilaille, joilla on BRAF mutatoitunut NSCLC.

Citation: Joshi M, Rice SJ, Liu X, Miller B, Belani CP (2015) Trametinib tai ilman Vemurafenib in BRAF mutaation ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 10 (2): e0118210. doi: 10,1371 /journal.pone.0118210

Academic Editor: Santosh Patnaik, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat |

vastaanotettu 10 syyskuuta 2014; Hyväksytty: 9. tammikuuta 2015 Julkaistu: 23 helmikuu 2015

Copyright: © 2015 Joshi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

suurin osa potilaista ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) diagnosoidaan myöhemmin ja tällä hetkellä saatavilla hoitoja, kuten kemoterapiaa ja sädehoitoa näyttävät olevan riittämättömiä pelaajan tätä tappavaa tautia. Läsnäolo aktivoiva mutaatio kasvutekijän reseptorin (EGFR) liittyy korkea hoitovaste ja parantaa etenemistä elinaika (PFS) käyttämällä EGFR tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) [1-3]. Erlotinibin: n ja gefitinibin ovat ensimmäinen sukupolvi TKI jotka aiheuttavat palautuvan estämisen tyrosiinikinaasidomeeniin EGFR. Erlotinibi alun perin hyväksytty kliiniseen käyttöön kehittynyttä NSCLC toisella rivillä asetus perusteella myönteiset tulokset vaiheen 3 BR.21 tutkimuksessa [4]. Faasi 3, kuten OPTIMAL (erlotinibin verrattuna kemoterapian ensilinjan hoitoon potilailla, joilla on kehittynyt EGFR-mutaatio-positiivinen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä) [5] ja IPASS (IRESSA Pan Asia Study) [6], on selviä parannuksia vasteluvuissa ja etenemistä elinaika (PFS) ensimmäisen sukupolven TKI ensimmäisellä rivillä asetus verrattuna perinteisiin platinaa kemoterapiaan. Tämä on jo johtanut käytön EGFR TKI kuin ensilinjan hoitoa potilaille NSCLC kätkeminen herkistäviä EGFR mutaatio vastakohtana tavanomainen yhdistelmä kemoterapiaa. Vastaavasti BRAF (v-Raf hiiren sarkooma viruksen onkogeenin homologi B1) mutaatio voi ohjata myös kasvainten kehittymistä NSCLC. Mutaatiot

BRAF

geeni on taajuus ~2-3% NSCLC [7,8]. V600E mutaation eksonissa 15 käsittää noin 50% kaikista BRAF mutaatioita, kun taas ei-V600E BRAF mutaatiot muodostavat loput 50% [9].

BRAF mutantti NSCLC arvellaan olevan aggressiivinen ja näyttää resistanceto tällä hetkellä käytettävissä olevat hoidot [10]. Vemurafenib on suun kautta BRAF inhibiittorin selektiivinen V600E mutaatio, ja se on osoittautunut tehokkaaksi hoidettaessa pitkälle melanoomapotilailla, joilla on sama mutaatio. On todisteita, joiden mukaan BRAF-inhibiittorit, käytetään yksinään NSCLC kanssa BRAF-V600E positiivinen mutaatio, osoittavat vain vaatimaton hyöty ilman täydellinen vaste, 40% osittainen vaste, ja 30% taudin etenemiseen hoidon aikana [11]. Vaikutus MEK (MAPK /ERK-kinaasin) estoon BRAF mutantti NSCLC ei ole tutkittu perusteellisesti ja tuoreessa tutkimuksessa kävi ilmi, että yhdistelmä BRAF estäjän (dabrafenib) ja MEK estäjä (trametinib) oli myös tehokas hoidettaessa kehittynyt melanooma [12 ]. Trametinib on suun kautta MEK estäjä äskettäin hyväksynyt Food and Drug Administration (FDA) hoidossa käytettäväksi metastaattisen melanooman potilaalla on BRAF-V600E ja BRAF-V600K mutaatioita, jotka perustuvat tuloksiin Kliinisen tutkimuksen Flaherty

et al.

, osoittaa merkittävää etua sekä ilman taudin etenemistä ja kokonaiselinaika [13].

prekliinisen ympäristössä, reseptorityrosiinikinaasin (RTK) eston on määräävä vaikutus tukahduttamisesta fosfoinositidi 3-kinaasi (PI3K ) signalointireitin. Yksi resistenssin RTK inhibition KRAS mutantti solulinjoissa on aktivoimalla RAS signalointireitin [14]. Koolonsyövän solulinja, jossa on BRAF V600E mutaation osoitettiin paeta vemurafenib inhibition aktivoimalla epiteelin kasvutekijän reseptorin (EGFR); kuitenkin, hoito näiden solujen vemurafenib ja EGFR-inhibiittoria, estää vemurafenib kestävyys ja indusoiman apoptoosin [15]. Oletamme, että mutaatio BRAF koulutusjakson aiheuttaa hyper-aktivoitumisen ERK ja siten yhdistäen EGFR esto kanssa BRAF esto olisi hyötyä. Olemme myös esitetyt onko MEK estäjä trametinib olisi herkistää BRAF mutatoitunut villityypin (WT) EGFR NSCLC solujen BRAF inhibitiolle vemurafenib. Oletimme, että BRAF-V600E solut on rajoitettu herkkyys BRAF estäjä, koska aktivointi MAPK-reitin [12]. Näin ollen, trametinib voisi lisätä tehosta BRAF inhibiittorin BRAF mutatoitu NSCLC. Kestävyys BRAF estäjien välittyy useiden mekanismien asiakkuutta aktivoituminen MAPK-reitin [16-19]. Trametinib kohdistuu MEK, joka on alavirtaan BRAF että MAPK-reitin. Näin ollen yhdistämällä trametinib kanssa BRAF estäjä, joko vemurafenib tai dabrafenib, olisi tehokkaampaa. Tavoitteena oli tutkia, trametinib ja vemurafenib voisivat tehdä yhteistyötä tukahduttaa ERK /MAPK signalointireitille in BRAF mutantti NSCLC solulinjoissa. Vertasimme tehoa yksittäisinä aineina, vemurafenib tai trametinib, kuin yhdistelmä vemurafenib plus trametinib in BRAF mutatoitu NSCLC solulinjat, HCC364 [V600E-BRAF, WT EGFR] ja H1755 [ei-V600E, G469A BRAF mutantti, WT EGFR ].

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat, reagenssien ja vasta-aineiden

A549, H460, H1755 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manasses, VA). Ottaa huomioon, että HCC364 solulinja saatiin tri Adi F. Gazdar n tutkimuslaboratoriossa, University of Texas, Southwestern Medical Center (Dallas, TX) [20]. Kaikki solut viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, streptomysiiniä ja penisilliiniä, 37 ° C: ssa, 5% CO

2. BRAF V600E ja G469A mutaatiot HCC364 ja H1755-soluissa, vastaavasti, vahvistettiin käyttäen tilannekuvan fragmenttia analyysimenetelmä protokollan mukaisesti kehittämän Su et al. (S1 Kuva.) [21]. Vasta-aineet hankittiin Cell Signaling Technologies (Danvers, MA). Erlotinibin, vemurafenib ja trametinib saatiin Selleckchem (Houston, TX).

Solulisääntyminen ja pitkän aikavälin kasvun määrityksissä

Solut ympättiin 1×10

4 solua per kuoppa 96 kuoppaiset kudosviljelymalja. Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin erlotinibin, trametinib, vemurafenib, tai niiden yhdistelmien kuten kuviossa legendoja. Dimetyylisulfoksidi (DMSO) käytettiin ajoneuvon ohjaus. Solujen lisääntyminen mitattiin 48 tai 72 tunnin kuluttua lääkehoidon avulla Cell Titer 96 vesipitoiset-radioaktiivista soluproleferaatiomäärityksessä (Promega, Madison WI) mukaan valmistajien protokollaa. Suhteellinen kannattavuus laskettiin kunkin kuopan vähentämällä tausta-absorbanssi ennen normalisointia vehikkelikontrolliin käsitelty kuoppiin.

Pitkän aikavälin kasvu määritykset suoritettiin ymppäämällä solut 1500 solua kuoppaa kohti 12-kuoppalevyllä. Lääkkeet lisättiin suoraan kuhunkin kuoppaan seuraavana päivänä, ja tuoreella väliaineella, jossa lääke lisättiin jälkeen 4 päivää. Jälkeen 7 päivää, solut pestiin PBS: llä, kiinnitettiin 2% paraformaldehydillä 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa (RT), inkuboitiin 70% etanolilla 5 minuutin ajan, ja sitten värjättiin 0,1% trypaanisinisellä 60 minuutin ajan RT: ssä. Sen jälkeen värinpoisto PBS kolme kertaa, kuoppiin skannattiin. Sen jälkeen väriaine liuotettiin 1% SDS: ää ja absorbanssi mitattiin 590 nm: ssä kolme 100 ul: n eriä kustakin kuopasta on Synergy HT-levylukijaa (BioTek, Shoreline WA). Taustaa absorbanssi kaivosta ilman soluja vähennettiin kokeissa, ja kokeelliset arvot normalisoitiin ajoneuvon käsittelyä.

immunoblottaustesti

Proteiinit kerättiin solujen hajotuspuskuria, joka sisälsi 40 mM Tris.Cl pH 7,6, 1% Triton X-100, 1% deoksikolaatti, 150 mM NaCl: a plus proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorin cocktailit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 4 ° C: ssa 30 minuuttia. Kokonaisproteiinin määrä määritettiin BCA Kit (Thermo Scientific, Waltham MA), ja yhtä suuret määrät proteiinia erotettiin läpi 10% SDS-PAGE-geeleillä, elektro- PVDF, ja blokattiin 5% NFDM. Estetty membraaneja inkuboitiin yön yli primaarisilla vasta-aineilla, joissa on asianmukaiset HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen, ennen kemiluminesenssiosoitusta.

Virtaussytometria

Apoptoosi määritettiin värjäämällä solut FITC-leimatun anneksiini-V ( BD Pharmingen, San Jose CA)) ja ViaProbe (7-AAD, BD Pharmagen) ennen analyysiä on Calibur virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Jose CA). Solut ympättiin kolmena rinnakkaisena päälle 6-kuoppalevylle, ja seuraavina päivinä soluja käsiteltiin osoitetuilla lääkkeillä. Paklitakseli käytettiin positiivisena kontrollina apoptoosin kokeissa. Kaksikymmentäneljä 48 tunnin kuluttua hoitoja, kelluvat solut ja kiinnittyneet solut kerättiin sitten värjättiin anneksiini-V-FITC: llä ja 7-AAD: 1x anneksiini V-sitomispuskuria (BD Biosciences) 30 minuuttia huoneenlämpötilassa pimeässä. Fluoresenssi mitattiin virtaussytometrillä, ja tuloksena saadut tiedot analysoitiin WinMDI 2,8-ohjelmisto (Scripps Institute, https://facs.scripps.edu/software.html).

Solusyklianalyysiä suoritettiin etidium- diumbromidivärjäyksellä. Solut ympättiin kolmena rinnakkaisena päälle 6-kuoppalevyllä päivää ennen lääkehoitoa. 24 tunnin kuluttua, ytimet otettiin talteen ja värjättiin hypotonisessa lyysausliuosta (7 mM natriumsitraattia, 0,2% Triton X-100) ja etidiumbromidia (50 ng /ml) ja RNaasi A: ta (50 ug /ml) 30 minuuttia tumma. Fluoresenssi mitattiin Calibur Flow Cytometer. Hankitut tiedot analysoitiin ModFitLT 3.2 ohjelmistoa (Verity Software House, Topsham ME).

Tilastollinen

tilastollista merkitystä erot kahden ryhmiä tai joukossa useita ryhmiä analysoitiin kaksipuolisella parittomia Studentin t-testejä (yhtäläistä vaihtelut), jota toteuttaa Excel 2007 (Microsoft Corp., Redmond WA). Kaikki esitetyt tiedot ovat keskiarvo ± SEM kolminkertaisten arvoista kolmesta erillisestä kokeesta. * P 0,05, ** p 0,01, ja *** p 0,001 verrattuna kontrolliryhmään. Independent Studentin t-testejä tai yksisuuntaista ANOVA käytettiin vertaamaan jatkuvia muuttujia näiden kahden ryhmän välillä tai enemmän kuin kaksi ryhmää. Tulokset katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä p 0,05. Sytotoksiset synergia analysoitiin ja piirrettiin käyttämällä CalcuSyn-ohjelmisto (Biosoft, Cambridge UK) ja ilmaistiin yhdistelmä indeksin LC99 (eli pitoisuus, joka on tappava 99% soluista). Lisävahvistusta saatiin vuonna 5×5 matriisi käyttämällä CellTiter-Glo määritys ja Bliss lisäaineen mallin analyysi.

Tulokset

Expression of p-ERK ja p-AKT signaalit NSCLC soluissa

vapautuminen sekä RAF /MAPK ja AKT /mTOR signaalinvälitysreittien ajatellaan kriittinen rooli syövän synnyssä ja syövän etenemisen NSCLC [22]. Lukuisat osat näistä signalointipolkujen voivat toimia molekyyli tavoitteet syöpähoitojen, mutta se on tärkeää tietää läsnäoloa poikkeamia syöpäsoluissa kliinisiin epäsuorasti [23]. Ensin määritetään perustason ilmentymistä fosforyloidun (p) -AKT ja p-ERK 1/2 meidän solulinjoissa (Fig. 1A). Fosforyloitu ERK-signaali havaittiin kaikissa 4-solulinjat, joita käytetään kokeissa, mikä viittaa siihen, että ERK-reitin on tärkeä rooli syövän kehityksen KRAS tai BRAF mutatoituja soluja. Lääkkeet, jotka kohdistuvat tämän reitin voi osoittautua tehokkaaksi. Kuitenkin p-AKT on heikosti havaittavissa BRAF mutatoitunut solujen HCC364 ja H1755 verrattuna A549 ja H460-solulinjoja, kuten on esitetty kuviossa. 1A. Tämä saattaa viitata, että AKT signalointireitille ei välttämättä toisteta ratkaiseva rooli BRAF mutatoitunut soluissa.

V: Western blot fosforyloidun AKT ja ERK signaloinnin natiivi käsittelemätöntä solulinjoissa ([+] muuntunut; [-] villi tyyppi). Kaikki kaistat ovat samasta geelistä ja tauko luotiin sisältämään vain asiaan solulinjat B: A549, H460, H1755 ja HCC364 solulinjoja käsiteltiin D (DMSO) tai osoitettu lääkkeet, E (erlotinibi), V (vemurafenib), ja EV (erlotinibi-vemurafenib) analysoitiin 72 h kuluttua jonka MTS-määritys. IC50 Vemurafenib vuonna HCC364 oli 0,8 uM. C: Western blot eri NSCLC solulinjojen, joka osoittaa muutoksia p-ERK, p-AKT ja PARP ajoneuvon D (DMSO), E (erlotinibi) 1,6 uM, V (vemurafenib) 1,6 uM, EV (erlotinibi + vemurafenib) 1.6 /1.6, uM 24 tunnin kuluttua hoidosta. D: Apoptoosi virtaussytometrialla 48h jälkeisen hoidon D (DMSO), E (erlotinibi) 1,6 uM, V (vemurafenib) 1,6 uM, EV (erlotinibi /vemurafenib 1,6 /1,6 uM). Western blot, post 48h, tukemalla PARP pilkkominen V ja EV HCC364 mutta ei H1755 soluja.

Erlotinibi ja vemurafenib

tehoa yhdistelmähoidon erlotinibin ja vemurafenib. Yhdistelmä EGFR suunnattu monoklonaalinen vasta-aine (setuksimabi) ja BRAF (vemurafenib) inhibitio oli osoittanut tehoa paksusuolen syövän solujen BRAF-mutaatio [15]. Olemme pyrkineet selvittämään, onko samanlainen käsite yhdistää BRAF ja EGFR estoja voitaisiin tehokkaasti NSCLC solulinjoissa. A549, H460, H1755 ja HCC364 soluja käsiteltiin vaihtelevilla pitoisuuksilla erlotinibin, vemurafenib, tai yhdistelmä erlotinibin ja vemurafenib (5-kertainen sarjalaimennoksia yksittäisinä aineina ja 2,5 kertaisia ​​1: 1-suhteessa yhdistelmän). Soluproliferaatiomäärityksiä osoitti, että vain HCC364 solut olivat herkkiä vemurafenib ja yhdistelmä vemurafenib ja erlotinibin ei ollut tehokasta (Fig. 1 B). H1755-solut olivat vähemmän herkkiä vemurafenib ja mitään merkittävää synergiaa ei havaittu yhdistelmä erlotinibin ja vemurafenib. Vemurafenib oli tehoton KRAS mutatoitunut (A549, H460). Lisäksi puute synergiaa erlotinibin ja vemurafenib vahvistettiin käyttäen Bliss menetelmää (S2 Kuva.) [24].

kasvaimia synnyttävän opasteiden hoidon jälkeen 24 tuntia yhdistelmällä vemurafenib plus erlotinibin (1,6 uM /1.6 uM) analysoitiin immunoblot-määrityksellä (Fig. 1 C). Vemurafenib vähentynyt fosforylaatiota ERK vuonna HCC364 soluissa vain ilman lisääntyminen myöhemmin aktivoidaan AKT. Tämä havainto viittasi siihen, että puute synergiaa erlotinibin ja vemurafenib nähdään lisääntymismäärityksissä johtuu ERK-AKT suhde nähdään paksusuolensyöpä eikä ole läsnä HCC364 soluissa. Tämä todennäköisesti ei liity valintaa EGFR estäjän (setuksimabista vs. erlotinibi). Vemurafenib yksin aiheuttama aktivoituminen ERK signaloinnin ei-BRAF muuntunut solut, A549 ja H460. Mitään merkittävää muutosta aktivoitu ERK todettiin H1755 soluissa vemurafenib hoitoa. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että yhdistelmä vemurafenib ja erlotinibin johti vähenemiseen aktivoitu AKT in KRAS mutatoitunut soluissa (Kuva. 1 C).

Lopuksi arvioidaan muutokset apoptoosin jälkeen erlotinibin ja vemurafenib hoitoja yksin tai yhdessä . HCC364 solut olivat herkkiä vemurafenib-indusoitua apoptoosia ja PARP pilkkominen, kun taas H1755-solut olivat resistenttejä (Fig. 1 D). Mekanismi apoptoosin arvioitiin immunoblot-määritykset 48 tunnin kuluttua hoidon vemurafenib, ja se aiheutti lisääntymisen BIM (pro-apoptoottiset), verrattuna DMSO: hon. Väheneminen MCL-1 (anti-apoptoottinen) oli havaittu myös vemurafenib mutta mitään muutosta ei havaittu Bcl-x (anti-apoptoottiset), BCL-2 (anti-apoptoottiset), BAK (proapoptoottisten), ja BAX ( proapoptootti-) verrattuna DMSO (S3 kuvassa.).

Effect of monoterapiana vemurafenib in BRAF mutatoitunut NSCLC solulinjoissa. Käyttäen pitkän aikavälin kasvun määrityksessä vemurafenib havaittiin olevan tehokas BRAF-V600E mutatoituja HCC364 solujen eikä ei-V600E BRAF mutatoitu H1755-solut (Fig. 2A). Sitten halusimme arvioida tarkemmin molekyylimekanismin taustalla antituumorivaikutus. Analysoimme muutoksia solusyklissä 24 tuntia hoidon jälkeen vemurafenib sekä HCC364 ja H1755-soluissa. Vuonna HCC364 soluissa, vemurafenib aiheutti merkittävän määrän lisääntyminen G1 solujen myöhemmän väheneminen S-vaiheessa olevien solujen, tukee G1 pidätys V600E mutatoituja soluja. Vemurafenib oli kuitenkin tehoton aiheuttaen G1 lohko H1755-soluissa (kuvio. 2B). Immunoblottaus osoitti muutoksia solusyklin proteiineja HCC364 soluissa, sen jälkeen kun vemurafenib hoidon lukien, downregulation CDK2 ilmaisun ja säätelyä p21 ja p27 ilmaisuja (Fig. 2C).

V: Pitkän aikavälin kasvu määrityksessä 7 vuorokautta vehikkelillä-D (DMSO), vemurafenib 50 nM, 500 nM, 5000 nM sekä HCC364 ja H1755-soluissa. HCC364 solut olivat herkempiä vemurafenib. * P 0,05; *** P 0,001 verrattuna DMSO. B: Cell kaarianalyysien virtaussytometrialla 24 jälkikäsittelyä DMSO, V (vemurafenib) in HCC364 ja H1755 soluja. Solusyklivaiheista osoittaneet ovat G1, S ja G2 vaihe. V indusoi solusyklin pysähtymisen HCC364 soluissa, mistä on osoituksena kasvu G1 ja vähentynyt merkittävästi S-vaiheen. C: Western blot 48 tunnin kuluttua hoidon tukemiseen näyttöä G1 pidätys, joka osoittaa lisääntymistä p27 ja lasku CDK2 V (vemurafenib) verrattuna D (DMSO). Mitään vaikutusta ei havaittu H1755 soluissa. Kaikki kaistaa HCC364 ja kaikkia kaistaa H1755 ovat samasta geelistä. Katko on luotu poistamaan erlotinibiin käsitelty kaistaa.

Trametinib ja vemurafenib

Effect of yhdistelmän hoidon trametinib ja vemurafenib. Hoito yhdistelmällä MEK estäjän ja BRAF estäjä on ollut tehokas kehittyneen melanooman kanssa BRAF-V600 mutaation mutta vaikutus MEK estäjän tai tämän kaltaiset yhdistelmänä ei ole tutkittu in BRAF mutatoitunut NSCLC [12]. Analysoimme jos lisäämällä trametinib että vemurafenib osoittaisi mitään tehoa BRAF mutatoitunut soluissa, H1755 ja HCC364. Trametinib oli tehokkaampi inhiboimaan kasvua seitsemän päivän kuluttua molemmissa solulinjoissa verrattuna vemurafenib, mutta näiden kahden yhdistelmä lääkkeiden ei merkittävästi erilainen kuin trametinib yksinään (Fig. 3A, B). Arvioimme eroja solusyklin sekä BRAF mutantti NSCLC-solujen jälkeen 24 tunnin hoidon DMSO, vemurafenib, trametinib ja yhdistelmä (Fig. 3C). Sekä vemurafenib ja trametinib olivat tehokkaita aiheuttaa G1 pidätys osoituksena merkittävä kasvu G1 vaiheessa ja lasku S-vaiheessa olevien solujen verrattuna DMSO hoitoon. Kuitenkin yhdistelmä ei ollut tehokkaampi kuin joko yksittäisillä aineilla yksin. Solusyklin pidätys havaittu virtaussytometrisesti HCC364 soluissa vahvistettiin immunoblottimäärityksessä solusyklin proteiineja 24 tunnin kuluttua hoidon vastaavien aineiden kanssa. Se osoitti downregulation CDK2 kanssa säätelyä p21 ja p27 kanssa vemurfenib, trametinib ja yhdistelmä verrattuna DMSO: hon (Fig. 3d). Kuitenkaan ei ollut eroa huomata, että soluissa, joita käsiteltiin trametinib, vemurafenib, tai yhdistelmä trametinib plus vemurafenib ilmaisuissa CDK2, p21 tai p27 näissä soluissa (kuvio. 3D). Lisäksi olemme ei havainnut mitään eroa pJAK2 ja pSTAT3 ilmauksia (S4 Fig.) Mielenkiintoista, H1755-solut eivät osoittaneet samanlaista suuntausta CDK2 tai p21 ja p27 huolimatta G1 pidätyksen ja lasku S-vaiheessa nähty virtaussytometrillä ( kuva 3D). Tämä saa meidät uskomaan, että on olemassa toinen mekanismi, joka osallistuu G1 pidätys, joka on riippumaton CDK2 downregulation näissä soluissa.

A, B: Pitkän aikavälin kasvu määrityksessä 7 päivää hoidon jälkeen ajoneuvon DMSO (D ), V (vemurafenib) 1 uM, T (trametinib) 1 uM ja TV (trametinib + vemurafenib, 1 uM kutakin) in HCC364 (A), ja H1755-soluja (B). C: Cell kaarianalyysien virtaussytometrialla vuonna HCC364 ja H1755-solujen 24 tunnin kuluttua hoidon D, V 0,5 uM, T 0,5 uM, TV 0,5 /0,5 uM. D: Western blot jälkeen 24h H1755 ja HCC364 kohdellaan kuin C. (*** p 0,001 verrattuna DMSO).

tutkia edelleen apoptoottisen vaikutuksen vemurafenib ja trametinib yhdistelmän BRAF mutatoitunut NSCLC soluja. Trametinib indusoi apoptoosia sekä BRAF mutatoituja soluja linjat. Yhdistelmä vemurafenib ja trametinib aiheuttanut huomattavasti korkeampi apoptoosin kuin joko ainoana lääkkeenä HCC364 ja H1755 (Fig. 4A). Apoptosis seuraava erilaisten annosten trametinib hoidon varmistettiin läsnäolo PARP lohkaisu HCC364 soluissa, kun taas väheneminen PARP nähtiin H1755 soluissa ilman läsnäoloa pilkkoa PARP (Fig. 4B). Esiintyminen apoptoosin päätelmää tukevat säätelyä proapoptootti- proteiini, BIM, niin HCC364 ja H1755 solujen käsittelyllä trametinib. Yhdistelmä aiheutti suurempaa lisäystä BIM verrattuna trametinib yksin. Tämä havainto viittaa siihen, että yhdistelmä vemurafenib ja trametinib on parempi apoptoosin edistämiseksi kuin trametinib yksin BRAF mutatoitunut solujen (Fig. 4C). Mitään merkittäviä muutoksia ei havaittu ilmentyminen BCL-2, Bcl-x L, MCL-1, BAX ja BAK.

V: Apoptoosi virtaussytometrialla, 48h jälkeinen hoito ajoneuvo-D (DMSO), V ( vemurafenib 1 uM), T (trametinib 1 uM), TV (trametinib + vemurafenib 1/1 uM) in HCC364 ja H1755 soluja. (* P 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001). B: Western blot pilkkoa PARP HCC364 ja H1755, 48 h hoito D (DMSO) ja vaihtelevia annoksia vemurafenib (0,25, 0,5, 1 uM) ja trametinib (0,25, 0,5, 1 uM) C: Western blot, joka osoittaa muutoksia ERK, AKT, BIM, PARP pilkkominen, 48h jälkeinen hoito ajoneuvon D (DMSO), V (vemurafenib 1 uM), T (trametinib 1 uM), TV (trametinib + vemurafenib 1/1 gM) in HCC364 ja H1755 soluja. Nelikaistainen hoidettiin kahtena kappaleena kullekin solulinjojen ja vasta vasemman 4 kaistaa kunkin solulinjat on esitetty kuvassa.

Trametinib yksittäisenä aineena BRAF mutatoitunut NSCLC. MEK estäjä, selumetanib on osoitettu downregulate ERK signalointi prekliinisissä keuhkojen malleissa, joissa KRAS muuntunut NSCLC, mutta vastaavaa vaikutusta ei ole osoitettu BRAF mutatoitunut NSCLC [25]. Halusimme vertailla onkogeenisel- signaalin muutokset johtuvat käyttöön BRAF estäjä, MEK estäjä tai yhdistelmä sekä BRAF-mutatoitunut NSCLC. Muutokset onkogeenisiä signaaleja arvioitiin suorittamalla immunoblot-määrityksellä voidaan arvioida muutoksia apoptoosin signaaleja sekä solujen vemurafenib vs. trametinib vs. yhdistelmä 48 tunnin käsittely 1 uM annoksella yksittäisinä aineina ja 1: 1-suhteessa yhdistelmän, 1: 1 uM annokset kutakin. Havaitsimme, että hoito trametinib aiheutti merkittävän suppression fosforylaatioon ERK verrattuna DMSO: ssa tai vemurafenib yksin sekä HCC364 ja H1755-solut (Fig. 4C). Yhdistelmä trametinib ja vemurafenib ei ollut parempi kuin trametinib yksin. Lisäksi havaitsimme, että Pakt ei kohonnut HCC364 solujen käyttämällä joko yksittäisinä aineina tai yhdistelmänä (p-AKT on heikosti havaittavissa HCC364 soluihin ja ilmentyminen ei muuttunut-immunoblot ei ole esitetty). Kuitenkin nähtiin lisääntyminen p-AKT lausekkeen käyttö monoterapiana trametinib ei-V600E BRAF mutatoituja H1755-solujen ja kiinnostavasti yhdistelmä trametinib ja vemurafenib ei osoittavat kasvua p-AKT verrattuna DMSO: hon, mikä viittaa siihen, että ehkä p-AKT reitti voi olla tärkeä rooli vastustuskyvyn hoidon monoterapiana trametinib. Trametinib on myös tehokas aiheuttaa apoptoosia sekä HCC364 ja H1755-solut (Fig. 4A). Lisäksi trametinib aiheutti myös G1 pidätetty molemmissa BRAF mutatoitunut soluja (Fig. 3C). Vaikka muutokset solusyklin proteiineja, downregulation CDK2 ja säätelyä p21 ja p27 ilmaisuja, oli nähnyt vain HCC364 soluissa.

Keskustelu

BRAF polku on tärkeä rooli kasvainten synnyssä NSCLC, BRAF-inhibiittorit, vemurafenib ja dabrafenib ovat osoittaneet vain vähän tehoa BRAF-V600E mutantti syöpiä [11,13]. Huolimatta kohteekseen tietyn mutaation käyttö dabrafenib, NSCLC kanssa BRAF-V600E mutaatio on johtanut vain 40% vaste yhdessä pettymyksen 30% sairauden eteneminen [11]. Nämä tulokset heijastelevat sitä, että BRAF esto ei yksin ihanteellinen hoitovaihtoehto ja uudempia strategioita optimoitu ja tehokasta hoitoa tämän valikoidulle joukolle potilaita ovat perusteltuja. Tätä olettamusta tukee myös Kliinisessä tutkimuksessa melanooman osoittaa merkittävä etu ilman taudin etenemistä yhdistelmällä dabrafenib plus trametinib vs. dabrafenib yksin [12]. Meidän in-vitro kokeiden teki vahvistaa vemurafenib estää tehokkaasti kasvua, vähentää ERK signalointi, ja aiheuttamaan apoptoosin BRAF V600E mutantti solulinja HCC364, kun taas ei-V600E BRAF mutantti solulinjaa, H1755, ei ollut yhtä herkkä. Prahallad

et al.

, Ovat osoittaneet lisääntynyttä aktiivisuutta yhdistetyn hoito EGFR estäjän setuksimabin kanssa vemurafenib linkittämällä ERK ja AKT signalointi välityksellä CDC25C vuonna BRAF mutatoitunut koolonkarsinoomasoluissa [15]. Kuitenkin meidän tulokset kertovat, että yhdistelmä erlotinibin ja vemurafenib ei ole tehokas NSCLC soluissa. Vaikka emme kyenneet havaitsemaan CDC25C vuonna BRAF mutantti solulinjoissa HCC364 (V600E) ja H1755 (ei-V600E), nämä solut eivät reagoineet ERK esto tiiviimmän AKT aktivointi viittaa siihen, että ERK ja AKT signalointi ei ole linkitetty kautta CDC25C näissä soluja.

Vemurafenib pystyi moduloida apoptoosia liittyviä proteiineja ja solukierron [26,27]. Olemme havainneet, että hoito vemurafenib johti vähentyneeseen tasoja anti-apoptoottista proteiini MCL-1 ja kohonneet pro-apoptoottisen proteiinin BIM NSCLC solulinjoissa. MCL-1 tappio kasvun myötä BIM [28-30], johtaa apoptoosin induktioon, ja kohonneeseen BIM voi myös aloittaa apoptoosin [31-33]. Lisäksi solusyklin liittyvä proteiini, CDK2, säädeltiin vähentävästi taas solusykliä inhiboivan proteiineja, p21 ja p27, oli upregulated seuraavat vemurafenib hoidon HCC364 soluissa, mikä johtaa kasvun pysähtymisen. Me spekuloida, että nämä proteiinien ilmentyminen muuttuu todennäköisesti liittyvät alhaisempaa ERK [34,35], koska samanlainen vaikutus havaittiin käsittelemällä trametinib (Fig. 3d). Tämä vahvistaa oletusta, että modulaatio BIM ja MCL-1 liittyvät alhaisempaa ERK in HCC364 soluissa. Valitettavasti H1755, BRAF-ei-V600E soluja, osoitti G1 solusyklin pysähtymisen riippuu downregulation ERK käsittelemällä trametinib. Solusyklin pysähtymisen tapahtunut ilman muutoksia solusyklin proteiineja, CDK2, p21 ja p27. Tämä viittaa siihen, että H1755-solut voivat olla eri mekanismi, joka osallistuu G1 pidätys riippumaton CDK2 tarkistaa vaiheessa solusyklin.

tulokset osoittavat trametinib on tehokas aiheuttaa apoptoosia sekä BRAF V600E ja ei-V600E mutatoituja soluja. Trametinib oli voimakas laskeva ERK signalointi BRAF mutanttisoluja, ja tämä tukahduttaminen on suurempi, trametinib verrattuna vemurafenib jopa BRAF V600E mutatoitunut soluja. Pitkän aikavälin kasvu määrityksen tulokset osoittavat myös, että trametinib on parempi teho ainoana lääkkeenä verrattuna vemurafenib vuonna BRAF V600E soluissa, mutta tämä voisi olla seurauksena lyhyempi puoliintumisaika vemurafenib [36,37]. Mielenkiintoista on, että hoito yhdellä aineella trametinib aiheutti säätelyä AKT signaloinnin BRAF ei-V600E soluissa vain, mikä viittaa mahdollisesti paeta mekanismi resistenssin kehittyminen hoito MEK-inhibiittorin. Tämä voi antaa käsityksen resistenssin kehittymistä MEK-inhibiittoreita. Akt-reitin ei näytä voimistuvan, kun BRAF ei-V600E soluja käsiteltiin yhdistelmällä trametinib ja vemurafenib, mikä viittaa siihen, että yhdistelmähoito voi olla parempi kummankin yksittäisinä aineina tässä ryhmässä samoin. Mekanistinen suhde ERK esto ja AKT aktivoinnin BRAF mutantti NSCLC MEK estäjä on edelleen arvioitava. Osoitimme myös ensimmäistä kertaa, että yhdistelmähoito aiheutti merkittävän kasvun säätely BIM sekä V600E ja ei-V600E solut, ovat siten merkittävä rooli apoptoosin [31]. Yhdistelmä hoito aiheutti myös pieni, mutta merkittävä augmentation apoptoosin BRAF mutatoitunut soluissa verrattuna ainoana lääkkeenä, mikä viittaa perustelut käyttämällä yhdistelmää BRAF ja MEK estäjä tässä valittu ryhmä. Lisäksi yhdistelmä trametinib ja vemurafenib voisi vastustusta trametinib yksin ja siten parempi kuin monoterapiana trametinib. Lupiinin et ai. ovat korostaneet mahdollista mekanismia vastus BRAF-V600E muuntunut NSCLC solujen BRAF estäjä [38]. Kaksi diskreetti molekyylitason mekanismeja hankkimalla BRAF estäjän resistenssin kuuluvat menetys täyspitkä in BRAF-V600E yhdistettynä ilmaus poikkeava muoto BRAF-V600E joka säilyttää RAF polku riippuvuutta ja perustava autokriininen EGFR signalointi ohjaavat c-Jun-välitteisen EGFR ligandi ilme. Meidän tulokset tukevat hypoteesia BRAF- mutaation riippumaton MAPK-reitin, joka johtaa resistenssin kehittyminen BRAF estäjä käsiteltäessä BRAF-V600E mutatoitu NSCLC. Lisäksi sivuvaikutuksena ja toksisuusprofiili (19% ihon okasolusyöpä in BRAF estäjä arm

vs

. 7% yhdistelmähoitoa saaneilla melanoomapotilaissa) suosii yhdistelmähoito [12].