Krooninen sairaus

tiivistelmä

asetus geeniekspression on yksi monista rooleista ehdotetaan stressin aiheuttama nukleotidin diadenosine tetrafos- (Ap

4A). Olemme tutkineet tätä suoraan vertaileva RNA-Seq analyysi KBM-7 krooninen myelooinen leukemia solut ja KBM-7-soluissa, joissa

NUDT2

Ap

4A hydrolaasi geeni oli häiriintynyt (NuKO solut), aiheuttaen 175-kertainen solunsisäisten Ap

4A. 6288 differentiaalisesti ilmentyvien geenien tunnistettiin

P

0,05. Näistä 980 oli säädelty ja 705 säädellä vähentävästi NuKO solut kertamuutosta ≥ 2. Ingenuity

® Pathway Analysis (IPA

®) käytettiin osoittamaan näiden geenien tunnettuihin kanoninen reittejä ja toiminnallinen verkoissa. Väylät liittyy interferoni vastauksia, hahmontunnistuksen reseptorit ja tulehdusta sijoitettiin korkealle alassäädetty geenit taas liittyvät toiminnot MHC-luokan II antigeenejä olivat näkyvästi joukossa ylös geenien, joka muutoin näytti vähän organisaatiosta merkittävä funktionaalinen geeni sarjaa. Tryptofaani hajoamista oli myös vahvasti alassäädetty kuin oli lukuisia geenejä tiedetään olevan osallisena kasvaimen edistämisen muissa järjestelmissä, joissa roolit epiteelin-mesenkymaalitransitioon, leviämisen, invaasio ja metastaasi. Toisaalta jotkut proapoptoottisten geenejä sääteli. Major ylävirran tekijät ennustivat IPA

® geenien säätely alaspäin mukana NFKB, STAT1 /2, IRF3 /4 ja SP1, mutta mitään merkittäviä sääteleviin tekijöihin geeni ylössäätöä tunnistettiin. Mahdolliset mekanismit geenisäätelyn välittämiä Ap

4A ja /tai

NUDT2

häiriöt sisältävät sitoutumisen Ap

4A on HINT1 co-repressori, autokriinisen aktivointi purinoceptors mukaan Ap

4A, chromatin remodeling, vaikutukset NUDT2 tappio transkriptio vakautta, ja esto ATP-riippuvaiset sääntelyyn tekijät, proteiinikinaaseiksi mukaan Ap

4A. Tämänhetkinen näyttö suosii viimeinen näistä todennäköisimpänä mekanismi. Riippumatta, tulokset viittaavat siihen, että NUDT2 proteiini voisi olla uusi syövän kemoterapia-kohde, jossa sen esto mahdollisesti kohdistamaan voimakas anti-kasvain vaikutuksia useiden eri reittejä, joihin liittyy etäpesäkkeiden invaasio, immunosuppressioon ja apoptoosin.

Citation: Marriott AS, Vasieva O, Fang Y, Copeland NA, McLennan AG, Jones NJ (2016)

NUDT2

Häiriöt Kohottaa Diadenosine tetrafos- (Ap

4A) ja down-regulation Immuunivasteen ja Cancer Promotion Genes. PLoS ONE 11 (5): e0154674. doi: 10,1371 /journal.pone.0154674

Toimittaja: Francisco J. Esteban, University of Jaén, Espanja

vastaanotettu: 9. joulukuuta, 2015 Hyväksytty: 18 huhtikuu 2016; Julkaistu: 4. toukokuuta 2016

Copyright: © 2016 Marriott et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat analysoidut tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja. Lisäksi kaikki datatiedostot ovat saatavilla ArrayExpress tietokannasta (tulonumero E-MTAB-4104).

Rahoitus: Tätä työtä tukivat North West Cancer Research (https://www.nwcr.org) lupanumeroita CR968 AGM, NJJ ja NAC; CR891 NAC; ja NWCR tutkimus apurahan numero BR879 NAC (www.nwcr.org). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Nudix hydrolaaseja säännellä tasoilla erilaisia ​​kanonisia ja muunnettujen nukleotidien ja joitakin ei-nukleotidi fosforyloidun substraattien sekä osallistuvat olennaisia ​​prosesseja, kuten mRNA decapping [1, 2]. Yksi parhaista tutkittu on nisäkkäiden NUDT2. Tämä entsyymi on eristetty monista lähteistä [3, 4] ja sen pääasiallinen alustan uskotaan olevan diadenosine 5 ’, 5’ ” –

P

1,

P

4-tetrafos- (Ap

4A). Eläinsoluissa, Ap

4A voidaan syntetisoida useimmat aminoasyyli-tRNA-syntetaasit, DNA ligaaseina tulikärpäsen lusiferaasi ja asyyli-CoA syntetaasien samalla edelleen erilaisia ​​entsyymejä pystyy tekemään niin kasveissa, sienet ja bakteerit [5-7 ]. Synteesi edellyttää yleensä siirto AMP asyyli-AMP tai entsyymi-AMP reaktio välituotteen ATP tunnustaja. Se voi myös hajota useiden entsyymien lisäksi NUDT2, mukaan lukien FHIT [8], aprataxin [9] ja ei-spesifisiä fosfodiesteraaseja [3]. Kuitenkin NUDT2 uskotaan olevan pääasiassa vastuussa siitä, että alhaisen tason solunsisäisten Ap

4A [10-12].

lisääntyminen Ap

4A johtuvat aktivointi synteesin esto hajoamisen tai molemmat on liitetty useita solunsisäisiä prosesseja. Genotoksinen, lämpö- ja muut rasitukset johtaa lisääntyneeseen Ap

4A [13-17] ja niin Ap

4A on liitetty säätelyyn DNA: n replikaation jälkeen DNA-vaurioita ja edistää apoptoosin [17-19]. Ap

4A voidaan esittää myös vastauksena ulkoiseen ligandeja ja toimimaan solunsisäinen toinen messenger [20-22]. Se toimii myös ekstrasellulaarisen messenger kautta vuorovaikutuksessa useiden P2-tyypin reseptorit [23]. Ap

4A on myös ligandi useiden proteiinien, mukaan lukien multiproteiinikompleksissa, joka sisältää DNA-polymeraasi-α [24, 25], proteiini-kinaasien [26-28], urasiili-DNA-glykosylaasi [29], proteiini chaperones [30] The HINT1 tuumorisuppressori [31], 5′-nukleotidaasia II [32], CBS verkkotunnuksen proteiinit [33, 34] ja CFIm25 [35], mutta useimmiten merkitys tämä sitoutuminen ei ole selvä. Erityisen kiinnostavia, on kuitenkin mahdollista, että Ap

4A voi toimia transkription sääntelijä. On ehdotettu, että kohonnut taso Ap

4A indusoitiin syöttösolut ulkoiset tekijät aktivoi ekspressiota osajoukko geenien ohjataan MITF ja USF2 transkriptiotekijöiden sitoutumalla ja siirtämällä estävä HINT1 proteiinin näistä tekijöistä [ ,,,0],10, 31, 36].

sen määrittämiseksi, onko transkription sääntelyä Ap

4A rajoittuu suhteellisen vähän geenejä tai on laajempi, olemme analysoineet transcriptome poistogeenisen johdannaisen KBM- 7 krooninen myelooinen leukemia (KML) solulinjassa [37], jossa solunsisäinen taso Ap

4A on suurennettu 175-kertaisesti häiriöitä

NUDT2

geeni (KBM-7-NuKO, viitataan jäljempänä kuten NuKO). Nämä solut osoittavat syvällisiä muutoksia geenien ilmentyminen verrattuna kanta- KBM-7 solulinja, joissa on yhteensä 6288 merkittävästi erilaisesti ilmentyvien geenien (DEGS) tunnistettu. Kekseliäisyyttä

® Pathway Analyysi käytettiin korostamaan geenin verkkojen ja aineenvaihdunnan sekä signaloinnin vaikuttavia reittejä, paljastaen alas-säätely interferoni, tulehdus- ja synnynnäisen immuunivasteen ja ajan säätely, joihin osallistuu MHC luokan II antigeenejä. Lisäksi monet kaikkein vaikuttaa voimakkaasti geenit ovat rooleja edistämisessä syövän etäpesäkkeiden ja invaasio, viittaa siihen, että NUDT2 voivat tarjota uutta, pleiotrooppista tavoite syövän kemoterapiaa.

Materiaalit ja menetelmät

Cells

KBM-7 viite kloonin B (tuotenumero. P00174E07) ja KBM-7-NuKO johdannainen (P01289H04), jossa

NUDT2

geeni on inaktivoitu retrovirusgeeninkuljetusta-trap lisäys [ ,,,0],38] saatiin Haplogen ja pidettiin 37 ° C: ssa 5% (v /v), CO

2 /ilma Isocoves Modified Eagle Medium (IMEM, Sigma), johon oli lisätty 10% (v /v) sikiön seerumia ( Sigma), 2 mM L-glutamiinia (Sigma) ja 100 ug ml

-1 penisilliini-streptomysiiniä (Sigma).

mittaus Ap

4A ja johdannaiset

taso intrasellulaarisen Ap

4A Logaritmivaiheessa KBM-7 ja NuKO solut määritettiin kuten aiemmin on kuvattu käytettäessä herkkää luminometrisellä määritys pienin muutoksin käytettäväksi suspensiosoluille [17, 39]. Solut kerättiin suspensiosta sentrifugoimalla 500

g

5 min ja käytettiin nukleotidin uuttamalla. Ap

4A mitattiin myös kasvualustassa supernatantti näistä soluista, joka suodatettiin 0,2 um Millipore-suodattimen, poistettiin proteiinit 10% TCA: lla, määritettiin sitten kuten edellä. ADP-ribosyloi johdannaisia ​​Ap

4A (ADPR-Ap

4A) erotettiin ioninvaihtokromatografialla ja tunnistetaan ja analysoidaan kuten aikaisemmin on kuvattu [17].

Kasvunestymistutkimus määrityksissä

Solut (2 x 10

5) ympättiin 25 cm

2 pulloissa, jotka sisälsivät 7 ml kasvualustaa. Kemiallisia aineita lisättiin todettava ja soluja kasvatettiin 96 tunnin ajan 37 ° C: ssa, minkä jälkeen viljelmät sentrifugoitiin 500

g

5 min, solut suspendoitiin uudelleen tuoreeseen elatusaineeseen, ja laskettiin käyttäen hemosytometriä. Keskimääräinen määrä normalisoitiin solumäärät käsittelemättömän kulttuurin.

RNA-Seq analyysi: cDNA-kirjaston valmistelu ja sekvensointi

kolme riippumatonta näytettä kokonais-RNA valmistettiin sekä KBM-7 ja NuKO solut. RNA uutettiin käyttäen Qiagen RNeasy mini pakki QIAshredder, ja määrä ja laatu määritettiin käyttämällä Nanodrop ja Agilent Bioanalyzer. Kullekin kuusi näytettä, 10 ug RNA: ta oli DNaasi-käsitelty käyttäen Ambion TURBO DNA-

™ kit ja sen jälkeen puhdistettiin käyttämällä AMPure XP helmiä. 2 ug DNaasi-käsitelty kokonais-RNA alistettiin sitten rRNA ehtyminen käyttäen Ribo-Zero Gold (Human /hiiri /rotta) kit ja puhdistettiin uudelleen Ampure XP helmiä. Onnistunut ehtyminen arvioitiin käyttäen Qubit fluorometriä ja Agilent 2100 Bioanalyzer ja kaikki köyhdytettyä RNA: ta käytettiin RNA-sekvenssi kirjastoon valmisteen käyttäen ScriptSeq v2 protokollaa. Seuraavat 15 sykliä monistusta kirjastot puhdistettiin käyttämällä Ampure XP helmiä. Jokainen kirjasto kvantifioitiin käyttäen Qubit ja kokojakauma arvioidaan käyttämällä Agilent 2100 Bioanalyzer. Lopulliset kirjastot yhdistettiin ekvimolaarisissa määrissä käyttäen Qubit ja Bioanalyzer tiedot. Määrä ja laatu kunkin altaan avulla on arvioitu Bioanalyzer ja qPCR käyttämällä KAPA kirjaston kvantifiointi pakki Illumina alustat Rochen LC480II Light Cycler mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Templaatti-DNA denaturoitiin protokollan mukaan kuvattu Illumina CBOT käyttöohjeet ja ladattiin pitoisuudessa kaksikymmentäyksi. Sekvensointi suoritettiin yksi kaista sellaisen Illumina HiSeq 2000 version 3 kemian tuottavien 2 x 100 emäsparin pariksi lopussa lukee. Laadunvalvontaa ylläpidettiin 1% PhiX piikki-in.

bioinformatiikka- analyysi RNA-sekvenssi data

Basecalling ja de-multiplexing indeksoituja lukee kunkin näytteen kirjasto tehtiin käyttäen CASAVA 1,8. 2 (Illumina). Raw fastq tiedostoja käsiteltiin käyttäen Cutadapt 1.2.1 [40] kanssa vaihtoehto ”-O 3” määritetty poistettavaksi sovitin sarjoissa 3 bp tai enemmän. Lukee olivat edelleen lohkottu käyttämällä Sirppi 1,200 poistaa heikkolaatuiset emäksiä ja lopuksi lukee 10 kp poistettiin. TopHat2 aligner versio 2.0.10 [41] käytettiin kohdista lohkottu R1-R2 lukea paria ihmisen viittaus genomin kokoonpano GRCh38, joka sisältää 64253 geenejä. Oletus parametrejä käytettiin paitsi kirjaston tyyppi vaihtoehto, joka oli asetettu ”FR-secondstrand” kaikkien näytteiden pakkauksen käytetty tuotti toisen juosteen kirjaston tyyppi (R1 odotetaan kartta 5′- → 3 ’lohkon ja R2 3’→ 5 ’säie). Lukee yhdenmukaistaa vertailutasoon useammassa kuin yhdessä asennossa heitettiin pois ja FKPM arvot (fragmentteja kohti kiloemästä transkriptio miljoonasosaa lukee kartoitettiin) laskettiin. Differential geenien ilmentymisen analyysi tehtiin R ympäristössä käyttäen särmäysautomaatin paketti [42]. Laskenta data normalisoitiin poikki kirjastoja käyttäen Trimmatut Mean M-arvot (TMM) menetelmää särmäysautomaatin oletusparametrit. Tagwise hajonta parametrit arvioitiin ja käytettiin sitten log

2fc (log

2 kertaluokkamuutos) estimointi ja testaus särmäysautomaatin käyttäen todennäköisyys suhde (LR testi) [43].

P

liittyvät arvot log

2fc säädettiin useita testejä käyttäen False Discovery Rate (FDR) lähestymistapa [44]. Merkittäviä DEGS määriteltiin ne, joilla on FDR-oikaistu

P

arvo 0,05. Kaikki alkuperäiset RNA-Seq tuotettuja tietoja tässä tutkimuksessa on toimitettu EMBL-EBI ArrayExpress tietokannassa hakunumerolla E-MTAB-4104.

RT-PCR-analyysi valituista geeneistä

RNA suoritettiin käyttäen Qiagen RNeasy mini kit QIAshredder ja cDNA syntetisoitiin käyttämällä Bioline Tetro cDNA-synteesin kit, sekä mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Jälkeen cDNA kvantitoitiin PCR: llä käyttäen Maxima SYBR Green master mix (Thermo) ja StepOnePlus ™ Real Time PCR -järjestelmää (Applied Biosystems). Alukkeet hankittiin Sigma ja ne on lueteltu S1 taulukossa. 2

-ΔΔCt menetelmää käytettiin määrittämään suhteellinen transkriptipitoisuuksissa käyttäen taloudenhoito GAPDH-geenin normalisoinnista [45].

Pathway analyysi

Genes osoittaa ≥ 2-kertainen ylös- tai alassäätöä kanssa FDR-oikaistu

P

arvo 0,05 analysoitiin käyttämällä QIAGEN Ingenuity

® Pathway Analyysiohjelmisto (IPA

®, QIAGEN, Redwood City, https://www.ingenuity.com), jotta liittää ne eri toiminnallisia verkkoihin. IPA

® käyttää manuaalisesti kuratoi Ingenuity® Knowledge Base, joka sisältää tietoja useista geenin ja proteiinin ilmentyminen, vuorovaikutus ja merkintä tietokantoja kuten ehjä, BIND ja MIPS, sekä julkaistusta kirjallisuudesta [46]. Käytimme myös IPA tunnistamiseen liittyvät toiminnallisesti geeneihin, jotka vastaavat tiettyjä kanoninen polkuja, jotka olivat erittäin merkittäviä tietoja asettaa kokoelmasta 200 kuratoitu aineenvaihdunnan, solu-signalointikaskadissa ja sairauteen liittyvän reittejä. Fisherin testiä itsenäisyyden käytettiin laskea todennäköisyys, että assosiaatiota geenien aineisto ja kanonisen polku voidaan selittää sattumalta yksin. Lopuksi, käytimme IPA ylävirtaan säädin analyysi tunnistaa tekijät, jotka voivat ohjata geenien ja reitit korostettu verkon analyysin tarjota kokeellisia hypoteeseja geenien sääntelyn Ap

4A.

Tulokset

taso Ap

4A KBM-7-NuKO solujen

vanhempi KBM-7 linjaa tässä tutkimuksessa käytetty sisältää

BCR-ABL1

geenin fuusio ja mahdollisesti inaktivoivat mutaatiot

TP53

ja

Notch1

, mutta siitä puuttuu toinen yhteinen geneettinen poikkeamia löytyy myelooinen maligniteettien [38]. Se ilmaisee enemmistön selityksin proteiinien monenlaisia ​​signalointipolkujen, joten se soveltuu solulinjan tätä tutkimusta varten. Täydellinen puuttuminen NUDT2 proteiinin NuKO

NUDT2

disruptant vahvistettiin Western-blottauksella (kuvio 1). Vakaan tilan pitoisuus solunsisäisen Ap

4A stressaamattomista nisäkässoluissa on tyypillisesti välillä 0,1-1,0 pmol /10

6 solua (0,05-0,5 uM), tarkka määrä on laji- ja riippuvaista solutyypistä [17, 47]. Log vaihe KBM-7-soluissa oli tasolle 0,21 ± 0,02 (

n

= 3) pmol /10

6 solua. Kuitenkin NuKO johdannainen oli 175-kertainen kohonnut taso 36,9 ± 0,3 (

n

= 3) pmol /10

6 solua, joka tarjoaa selvin vielä, että Ap

4A on tärkeä NUDT2 alustan

in vivo

ja että tämä entsyymi on keskeinen rooli ylläpitää matalan taustan taso Ap

4A. Huomaa, että Ap

4A sisältö on 1 pmol /10

6 solua vastaa suunnilleen solunsisäiseen pitoisuutena 0,5 uM jos tasaisesti jakautunut [17], joten taso NuKO soluissa on noin 20 uM. Siitä, onko tämä korkea taso ja siitä johtuvat muutokset soluissa raportoitu tässä ovat biologisesti merkityksellisiä, olemme aikaisemmin mitattu jopa 20 uM Ap

4A DNA: n korjaukseen-viallisten solujen käsitelty mitomysiini C [17], kun keskittymä peräti 775 uM on raportoitu FCεR1-aktivoitu syöttösoluista [31]. Kromatografinen analyysi Ap

4A alkaen NuKO soluista osoitti, että noin 35% oli läsnä muodossa ADP-ribosyloi johdannaiset (ADPR-Ap

4A), pääosin mono-ADPR-Ap

4A (kuvio 1 ). Olemme aiemmin osoittaneet, että ADP-ribosylaatio Ap

4A PARP1 ja PARP2 kiinalaisen hamsterin EM9 soluissa ja hiiren alkion fibroblasteissa tapahtuu vasteena DNA-vauriolle [17]; vaikuttaa kuitenkin siltä, ​​että korkea Ap

4A tässä sovelletaan konstitutiivinen ADP-ribosylaation.

nukleotidin uutetta NuKO soluista tehtiin ioninvaihtokromatografialle ja jakeet analysoitiin luminometrically varten Ap

4A, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Upotus: näyte rekombinantti NUDT2 ja teiiniuutteissa KBM-7 ja KBM-7 NuKO solut altistettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja sen jälkeen nitroselluloosa blotit tutkittiin läsnäolo NUDT2 kanin polyklonaalista anti-NUDT2 (Santa Cruz), jota seurasi detektio HRP-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG ja ECL visualisointi (ECL Select, GE Healthcare). Hiiren β-aktiini havaittiin HRP-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG: tä (Santa Cruz).

RNA-sekvenssi ja ero geeniekspressioanalyysiä

Ap

4A on raportoitu aktivoida transkriptio osajoukkojen geenien ohjataan transkriptiofaktoreiden MITF ja USF2 [31, 36]. Ottaen huomioon tämän, ja tutkimaan edelleen fenotyypin

NUDT2

Knockout soluja, me tehtiin vertaileva analyysi transcriptomes KBM-7 ja NuKO solujen RNA-Seq tunnistaa degs. Keskimäärin 46,1 miljoonaa paria 100 emäsparin pariksi lopussa lukee näytettä kohden syntyy joka tasataan viittaus ihmisen genomin. Tasaus tulokset on koottu taulukkoon 1, osoittaa määrä ja prosenttiosuus lukee kartoitettiin jokaisesta näytteestä. Mapping prosenttiosuudet kuusi näytettä olivat välillä 80,2 ja 81,3%. 31177 (48,5%) on 64253 viite-geenit oli ainakin yksi luku linjassa, kun taas 33076 geenejä ei ollut lukea linjassa mistä tahansa kuudesta näytteestä.

ero geeniekspressioprofiilit kahden solutyyppien havainnollistetaan Principal Component Analysis (PCA) käyrä log2 geeniekspression data kuviossa 2A. Kolminkertaisten näytteiden kunkin solutyypin on ryhmitelty ja poispäin toisistaan, mikä osoittaa korkea ero geenin ilmentymisen välillä. Lisäksi heatmap Pearsonin korrelaatiokertoimet kuvassa 2B osoitti, että ekspressioprofiileja kolmesta näytteestä saman solutyypistä oli paljon tiiviimmin korreloivat kuin näytteet erilaisia ​​solutyyppejä, jotka osoittavat, että vaikutus

NUDT2

knockout geenien ilmentymisen oli paljon voimakkaampaa kuin vaikutuksen mitään teknistä tai biologista vaihtelua näytteiden välillä. Heatmap näyttää myös erittäin korkea korrelaatio (R 0,99) keskuudessa näytteet samoilta solutyypistä. Näin voimme päätellä, että ero geenien ilmentymisen havaittiin tässä tilastollisesti erittäin vankka.

(A) PCA käyrä log2 geeniekspression data osoittaa 2

nd ja 3

rd pääkomponenttia. (B) Heatmap visualisointi Pearsonin korrelaatiokertoimet log

2-geenin ilmentymisen näytteiden välillä. Kolme näytettä villityypin KBM-7 solut leimataan WT1-WT3 ja niillä, KBM-7-NuKO solujen KO1-KO3. (C) MA graafinen esitys, jakelu keskimääräinen geeniekspressiotasot (log

2Counts Per Million kartoitettu lukee) vastaan ​​log

2 kertamuutosta (KO

vs

WT) yksittäisten geeni vastauksia. Alhainen ilmentyminen geenit (log

2CPM -5) ovat värillisiä oranssi. Merkittävät ilmentyvät eri geenit (DEGS) ovat punaisia; geenejä ei muutu ilme on väriltään musta.

Niistä 31177 lukee kartoitettu (S2 taulukko) yhteensä 6288 DEGS tunnistettiin

P

-arvo (FDR-oikaistu ) 0,05, joista 2550 oli säädelty ja 2285 alassäädetty kanssa kertamuutosta ≥ 1,2 (kuvio 2C ja S3 taulukko). MA juoni Kuviossa 2C on esitetty varsin symmetristä jakautuminen ylä- ja alas geenien kaikilla ilmaisua. Näistä geeneistä, 980 oli säädelty ja 705 alassäädetty taitettavalla muutos ≥ 2. Kummassakin tapauksessa, 88%: lla oli FPKM ≥ 0,3 yhden tai molemmat WT ja KO aineistoja. 40 voimakkaimmin alas- ja ylöspäin-säänneltyjen selityksin geenit on esitetty taulukoissa 2 ja 3. Huomaa, että monet näistä geeneistä oli nolla luku- laskee joko WT tai KO aineistoja tarvitsematta lisätä pienen nolla-offset pseudocount jonka särmäysautomaatin ohjelmiston laskemiseksi log

2fc [42].

RNA-Seq analyysi validoitu suorittamalla reaaliaikaisia ​​qRT-PCR valikoima geenejä, jotka edustavat eri vaikuttaa väyliä (kuva 3). Nämä tulokset vahvistivat suuntaan asetuksen (ylös tai alas) kaikille geenien tutkittu. Muutoksen suuruus oli myös samanlainen useimpien geenien, jonka korrelaatiokerroin on 0,83 kahden aineistoja (kuvio 3, upotus). Kuitenkin jotkut geenit nolla-arvo FPKM yhden näytteiden RNA-Seq analyysi, käyttöä pseudocount menetelmä EDGER laskemiseksi kertamuutokselle on johtanut merkittävästi erilainen arvo, esim.

GFRA1

ja

TNF

. Kuitenkin laskemat arvot särmäysautomaatin käytetään seuraavissa keskusteluissa, koska ne ovat saatavilla kaikkien geenien ja ovat edelleen hyvä suhteellinen osoitus muutoksesta ilmaisua. Sen osoittamiseksi, että havaittu ero geenien ilmentyminen korreloi ainoastaan ​​kasvanut Ap

4A sijaan liittyvän ADPR-Ap

4A johdannaisia, qRT-PCR-analyysi suoritettiin myös RNA uutetaan NuKO kasvatettujen solujen läsnä ollessa 100 nM KU-0058948, joka on PARP1 ja PARP2 estäjä, joka estää synteesin ADPR-Ap

4A lajit [17]. Tulokset olivat hyvin samanlaisia ​​kuin saatiin puuttuessa KU-0058948 (kuvio 3), joka osoittaa, että nämä geenit ainakin ADPR-Ap

4A ei ole syy differentiaalikaavojen. Funktio ADPR-Ap

4A, jos sellainen on, on edelleen epäselvä.

qRT-PCR-analyysi suoritettiin valittu RNA: iden KBM-7 ja NuKO solujen läsnä ollessa ja puuttuessa 100 nM PARP inhibiittori KU-0058948 käyttäen alukkeita luetellaan S1 taulukossa kuvatulla Materiaalit ja menetelmät ja log

2 kertamuutosta ilmentymisessä piirretty vieressä saadut RNA-Seq analyysi. Upotus: yksinkertainen korrelaatio juoni log

2-kertaiseksi-ilmentymisen muutosten saatu RNA-Seq (

x

-akselin) ja qRT-PCR ilman PARP inhibiittori (

y

akselilla ).

Ingenuity

® Pathway Analysis

jotta voitaisiin sijoittaa geenin ilmentymisen tiedot biologiseen yhteydessä Ingenuity

® Pathway Analysis (IPA

® ) ohjelmistoa käytettiin määrittää DEGS tunnettuihin kanoninen reittejä ja toiminnallisia verkostoja, jotta voidaan ennustaa biologisten toimintojen transkription muutosten. Yksinkertaisuuden vuoksi alustava analyysi sisälsi vain geenejä, jotka olivat ylös- tai alaspäin säätelee ≥ 2-kertainen (

P

0,05); kuitenkin jos läsnä tuloksena polkuja ja verkostoja, geenit ylös- tai alaspäin-säätelee ≥ 1,2 katsottiin myös olevan mahdollisesti kiinnostaa, koska ei ole biologista perustetta cut-off-arvo 2. Todettiin, että degs kartoitettu useita reittejä, joilla on merkittävä rikastamiseen pisteet (-log (

P

-arvo)) (S4 taulukko). Top sijoittui sisällä sekä ylä- ja alassäädetty geenin sarjat olivat signaalinvälitysreittien liittyvät koskemattomuutta ja tulehdus. Väylät liittyy ensisijaisesti luontaisen immuunivasteen, kuten aktivointi interferoni sääntelyn tekijöitä (IRFs) hahmontunnistuksella reseptorit (PRRS), ja tulehdus oli nimenomaan rikastettu alassäädetty geenit taas liittyvät toiminnot MHC-luokan II antigeenejä olivat erityisiä että joukko up-geenien (taulukko 4). Hallitsevuus näistä reiteistä, että aineisto voi heijastaa myeloidinen luonnetta KBM-7 solulinja [37]. Näitä reittejä käsitellään yksityiskohtaisesti alla.

interferonivastetta ja synnynnäisen immuniteetin.

Interferonit ovat tärkeitä välittäjiä synnynnäisen immuunivasteen, joka esitetään alustava elintärkeä puolustus vastaan ​​hyökkääviä taudinaiheuttajia (virukset , bakteerit, alkueläimet) seuraava vuorovaikutus taudinaiheuttajan komponenttien PRRS solujen eri osastoissa. Ne voivat myös estää soluproliferaatiota, moduloida mukautuva immuunivastetta, ja on pro- tai tulehdusta, riippuen yhteydessä [48-51]. Toimittaminen joukko 4835 DEGS kanssa kertaluokkamuutos ≥ 1.2 on Interferome tietokantaan (v2.01) [52] paljasti osajoukko ainakin 1038 DEGS tiedetään säätelevän tyypin I IFN (IFNa ja IFNp) muissa järjestelmissä. Noin puolet näistä kanssa limittäin joukon 944 näyttää tunnetaan sääntelyn tyypin II IFN (IFNy). Jotkut (56) osoittivat myös tyypin III (IFNλ) sääntely 15 Näiden mahdollisesti ainutlaatuinen tyyppi III (S5 taulukko).

Kuvio 4 esittää IPA

® kanoninen koulutusjakson aktivoituminen interferonireseptorit (IFNRs ) tyypin I ja tyypin II interferonit, esimerkkejä geenien havaittiin differentiaalisesti ilmaistut tässä tutkimuksessa esiin. Suurin osa toiminnoista on tämän reitin olivat alassäädetty, jossa ilmaus

IFNB

on kaikkein vaikuttaa voimakkaasti (15-kertainen, S3 taulukko). JAK-STAT signalointireittien ovat keskeisiä interferonivastetta. Tyypin II interferoni signalointia, aktivoitu STAT1 homodimeerit sitoutuvat GAS (interferoni-gamma aktivoitu Sequence) promoottorin ja indusoi geenin ilmentymisen, kun taas tyypin I signalointi sisältää yhdistelmän STAT1-Stat2 heterodimeerejä IRF9 (interferoni vastekerroin 9), jotka muodostavat ISGF3 (Interferon stimuloidun Gene tekijä), joka sitten sitoutuu ISRE (interferonistimuloitu Response Element) promoottori.

STAT1

,

Stat2

ja

IRF9

olivat kaikki alassäädetty (1,4-, 1.8- ja 3.7-kertaiseksi), kun taas reitin vaimentimet

SOCS1

ja

PTPN2

oli säädelty (1,2-1,4-kertainen). Vaikka erikseen lievää yhteenlaskettu vaikutus muutos voi kuitenkin olla merkittävä. Kohonneet

SOCS1

ja

PTPN2

osoittavat myös, että ei ole vain yleinen suppressio geeniekspression mutta negatiivinen palaute kautta näiden geenien on säilynyt. Useat STAT-ohjattu geenejä, jotka alassäädetty ovat itse aktivaattoreita edelleen IFN muuniresponssigeeneinä, esim.

IRF1

,

IRF7

ja

IRF9

(1.2-, 3.8- ja 3.7-kertaiseksi).

Down-geenien ovat vihreitä, up-geenien punaisella. Värin voimakkuus vastaa kertaluokkamuutos; rohkea rajojen esiin geenejä 2-kertainen muutos ilmaisun. Rivit vastaavat fyysisiä vuorovaikutuksia ja nuolet toiminnallisten suhteita proteiineja. Yhtenäiset viivat ja nuolet merkitsevät suoria suhteita ja pisteviivat ja nuolet merkitsevät epäsuorat suhteita. Toiminnalliset suhteet sisältävät translaation jälkeisiä modifikaatioita, jotka liittyvät transkription säätelyyn, proteolyysi tai co-ilmaisua. Flat arrowheads osoittavat eston.

kanoninen polku Kuviossa 5 korostetaan roolit kolmen RIG-1 kaltainen helikaasin PRR synnynnäisen immuunivasteen, RIG-1 (DDX58), MDA5 (IFIH1) ja LGP2 (DHX58) aktivoinnissa

IFNB

stimulaation jälkeen viruksen kaksijuosteinen RNA: t ja antama palaute IFNP ilmenemistä näiden PRR. Kaikki kolme reseptoria geenejä alassäädetty (3.1-, 2.3- ja 3.0-kertaiseksi) (S3 taulukko) in NuKO soluissa. Lisäksi

IFITM2

ja

IFITM3

, jonka tuotteet rajoittaa sellaisen monet virukset [53], ja kaikki neljä viruslääkkeiden iFit perheenjäsenet, jotka sitovat viruskomponentteja (

IFIT1

2

,

3

ja

5

) [54] ovat alassäädetty välillä 1.6- ja 6.8-kertainen. Muut alassäädetty antiviraalisia geenejä ovat

PKR

,

GBP1

ja

TLR10

[55-58] (S3 taulukko).

selitykset symboleita kuin kuviossa 4.

sytokiinisignaloinnin, tulehdus ja NF-KB: n.

interleukiini-1 (IL-1) signalointi on merkitty IPA

® kuin alkuun alassäädetty polku (taulukko 4), joiden ilmentyminen tärkeitä proinflammatoristen jäsenten IL-1 superperheen [59]. Esimerkiksi mRNA: t IL-1β, sen reseptorin IL-1R1 ja lisävaruste proteiinin IL-1RAP pienenevät 1,5-, 11.7- ja 1,2-kertaiseksi, kun taas IL-18, IL-18R1 ja IL-18RAP ovat alhaalla 2.3-, 3.0- ja 4.0-kertaiseksi. Expression of pro-inflammatoristen

IL32

vähentää myös 5-kertaiseksi, kun taas ekspressio Tuumorinekroositekijä (

TNF

tai

TNFa

), joka voi aktivoida sekä tyypin I IFN ja tulehduksellinen välittäjänä NF-KB, säätyy alas 30-kertainen (S3 taulukko). Kanoninen johtava väylä transkription aktivaatio NF-KB: n avulla IL-1, TNFa ja muut ligandit on esitetty kuviossa 6. NF-KB: n kompleksi on tärkeä välittäjä tulehdus- ja immuunivasteiden ja vastaa PRRS ja pro-inflammatoristen sytokiinien [ ,,,0],60]. Se voi toimia synergisesti STAT signalointi lisääntyneeseen induktion kohdegeenien johtuvat koordinoida sitoutumisen tilastoja ja NF-KB: n kaasu- ja NF-KB: n promoottorit. P50 ja p52 komponenttien NF-KB monimutkainen ja

RELB

transaktivoijaproteiinia ovat kaikki alassäädetty kuten monet osat signalointireittejä, jotka johtavat NF-KB: n aktivoitumisen.

on tunnettua, että tyypin I IFN ja TNF voi vastavuoroisesti tukahduttaa toistensa ilmaisua, ja on ehdotettu, että muutokset rajat sääntely näiden reittien saattavat vaikuttaa tasapainon mahdollisten tuhoisaa ja suojaava tehtävä näiden sytokiinien synnyssä autoimmuunisairauksien tulehdussairaudet, kuten systeeminen lupus erythematosus (SLE) ja nivelreuma (RA) [61]. IPA

® yksilöi signalointia RA kuin kärkipään vaikuttaa kanoninen koulutusjakson (taulukko 4) ja luettelo DEGS liittyy RA ja SLE esitetään S6 taulukossa. Vaikka muutokset olivat vähäisiä ilmaus muulla sytokiinireseptorit saattaa olla tulehdusta edistävä (esim

IL10RA

ja

IL23R

), kokonaiskuva on yksi tulehduksen vaimeneminen kohonnut Ap

4A, jossa säätely alaspäin NF-KB: n signaloinnin mukana voimakkaasti.

Up-säänneltyjen kanoninen reittejä ja MHC luokan II antigeenejä.

KBM-7-solut voidaan pitää kehittymätön esiasteita ammattikäyttöön antigeenejä esitteleviä soluja, kuten makrofagien ja dendriittisolujen ja lähes kaikki top 20 sääteli kanonisen reittejä merkitty IPA

® liity liittyviä toimintoja adaptiivisen immuunivasteen, mukaan lukien antigeenin esittelyn, OX40 signalointi, hyljinnän ja B-solujen kehitys (taulukko 4 ja S4 taulukko). On kuitenkin syytä korostaa, että tämä on pitkälti siksi nämä reitit kaikkiin sisältyy yksi merkittävimmistä säädelty geeni asetetaan, indusoituvia luokan II MHC-antigeenejä (MHC-II). MHC-II molekyylit ovat keskittyneet lähinnä esitystapaa peräisin olevia antigeenejä solunulkoisten patogeenien johtaa CD4 + T auttajasolujen pohjustus ja vasta-aineiden tuotannon B-solujen [62]. Lähes kaikki luokan II alatyyppi geenit osoittavat merkittävää kasvua ilmaisua, joidenkin osoittaa suurta kasvua, esim.

HLA-DOA

47-kertaiseksi ja

HLA-DPA1

12-kertaiseksi. Siten missä määrin nämä kanoninen reittejä voidaan pitää ajan säädellään kokonaisuudessaan on avoin kysymys.

Kuitenkin, lisäksi MHC-II, useita muita geenejä mukana edistämiseen näkökohtien *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P