Krooninen sairaus

tiivistelmä

arvioinut valmiudet paklitakselin yksi taksaanien, aiheuttaa kuolemaan kaksi eturauhassyövän riviä, LNCaP ja PC3. Paklitakseli ajoi apoptoottisen reitin LNCaP, mutta ei PC3-soluissa, vastauksena G2 /M pidätykseen. Tarkastelun tasot anti-apoptoottisia proteiineja, paljasti, että Bcl-xl oli paljon suurempi PC3-soluissa kuin LNCaP-soluissa ja Bcl2 voitiin havaita vain PC3-soluissa, ei LNCaP-soluissa. Kaatamalla Bcl-xl parannettu paklitakselin aiheuttama apoptoosin LNCaP, vaikka emme voineet kaataa Bcl-XL tehokkaasti PC3-soluissa. Merkittävästi, vertailu ABT-263, spesifinen inhibiittori Bcl2 ja Bcl-xl, jossa ABT-199, joka on Bcl2 selektiivinen, paljastaa, että vain ABT-263, ei ABT-199, voivat aiheuttaa apoptoosin LNCaP ja PC3-soluissa. Tulokset osoittavat, että Bcl-xl on suojaava rooli paklitakseli-indusoitua apoptoosia in LNCaP ja PC3-soluja, ja sen yli-ilmentyminen aiheuttaa paklitakselin vastus nähdään PC3-soluissa. Mielenkiintoista, yhdistettynä paklitakseliin ABT-263 hoitoon LNCaP ja PC3-solut osoittivat synergististä apoptoosin aktivoitumisen, mikä osoittaa, että ABT-263 voisi parantaa paklitakseli aiheuttaman apoptoosin LNCaP ja voittaa Bcl-xl yliekspressio laukaista paklitakseli aiheuttaman apoptoosin PC3-soluissa. Havaitsimme myös, että aktivointi apoptoosin LNCaP-soluissa oli tehokkaampaa kuin PC3 solujen reaktiota paklitakselille plus ABT-263 tai ABT-263 yksin, mikä viittaa siihen, että apoptoosireittiä PC3-soluissa saattaa olla edelleen eroja että LNCaP jälkeenkin Bcl-xl yliekspressio osuus.

Citation: Wang C, Huang SB, Yang MC, Lin YT, Chu IH, Shen YN, et al. (2015) yhdistäminen Paklitakseli kanssa ABT-263 on synergistinen vaikutus Paklitakseli Kestää syöpäsolujen. PLoS ONE 10 (3): e0120913. doi: 10,1371 /journal.pone.0120913

Academic Editor: Andreas Villunger, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 03 toukokuu 2014; Hyväksytty: 09 helmikuu 2015; Julkaistu: 26 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Grant EX99-9935EI (CHC) National Health Research Institutes of Taiwan; Grant KMU-M103005 (CW) Kaohsiung Medical University. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kehittynyt resistenssi taksaania liittyvän kemoterapian edelleen merkittävä ongelma pahanlaatuisia kasvaimia, jotka osoittavat terapeuttiseen hyötyvät taksaania hoitoa. Syöpäsolut taksaanin vastus saattaa yli-ilmentämään monilääkeresistenssiä geeni koodasi P-glykoproteiinin pumppua lisäämään ulosvirtausta taksaanin, joka johtaa mahdollisimman vähän solunsisäisten taksaanikonsentraatiot [1]. Lisäksi muutos mikrotubulusten ominaisuuksia, lähinnä lisäämällä dynaamista toimintaa mikrotubulusten jälkeen taksaani hoidon, saattaa myös muuttua reagoida taksaaneja ja vähentää niiden tehoa [2,3]. Mutaatioita tubuliinin geenien mikrotubulusverkoston sitoutumiskohta taksaanien voisi muuttaa taksaania sitoutumisaffiniteetin, mikä johti merkittävään menetykseen tehokkuudesta [4,5]. Gain-of-function vastapainoksi apoptoottisia reittejä voi myös edistää monilääkeaineresistenssin syövät [6,7].

erityinen apoptoosin sääntelykäytäntöä syöpäsoluissa voisi olla ratkaiseva tekijä herkkyyttä syöpäsolujen useille monipuolinen solunsalpaajiin [8]. Luonnostaan ​​tai mitokondrioiden apoptoosin esiintyy yleensä syöpäsolujen vastaamaan kemoterapian aiheuttaman solukierron pysähtymisen, mukaan lukien lääkkeen aiheuttama mitoottisiin pidätys [9,10]. BCL2 perhe, joka koostuu kolmesta proteiinien lukien anti-apoptoottiset proteiinit, pro-apoptoottiset proteiinit, ja BH3 vain proteiineja, on olennaista tämän luontaisen apoptoosin [9]. Bcl2, Bcl-xl, Mcl-1 ja Bfl1 ovat anti-apoptoottisia proteiineja. Sekä Bax ja Bak ovat pro-apoptoottisia proteiineja. BH3 vain proteiineja ovat Bad, Bik, Bim, Bid, Noxa, HRK ja BMF. Anti-apoptoottiset proteiinit sisältävät kaikki neljä konservoitunutta sekvenssimotiiveja, Bcl-2-homologia (BH) domeenit, jotka sisältävät BH1-, BH2-, BH3- ja BH4 [10]. Niiden tehtävänä on eheys säilyy mitokondrioiden tukemiseksi solujen selviytymistä. Pro-apoptoottiset proteiinit jakaa omituisesta anti-apoptoottiset proteiinit, erityisesti rakenteellisia ominaisuuksia kaikkien neljän BH alueilla, kun taas ne häiritsevät mitokondrion eheys laukaista apoptoosin. Lopuksi BH3 vain proteiinit on vain BH3 domain jakaa keskenään ja anti-apoptoottisten ja proapoptoottisiin proteiinit [11]. Mielenkiintoista on, että tämä yhteinen BH3 domain on BH3 vain proteiinit muodostavat noin 26-tähteen aminohappoja ja muodostaa amfipaattisen α-heliksin vuorovaikutuksessa ja inaktivoimaan anti-apoptoottiset proteiinit [12]. Se mahdollisesti myös lyhytaikaisesti sitoo Bax ja Bak niiden aktivointi [13].

Viime aikoina useita yhdisteitä on kehitetty BH3 mimeettien apoptoosin eston kautta anti-apoptoottiset proteiinit [12,14]. Toistaiseksi useimmat voimakkaita estäjiä ovat Bad kaltainen BH3 jäljittelijät, ABT-737 ja sen suun kautta aktiivinen analogi, ABT-263 [15-17]. Ne sitoutuvat Bcl-2, Bcl-x L- ja Bcl-w hyvin suurella affiniteetilla, mutta paljon pienempi affiniteetti Mcl-1 tai Bcl2A1 [14,18]. Prekliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että sekä ABT-737 ja ABT-263 voi syrjäyttää pro-apoptoottisten proteiinien anti-apoptoottiset proteiinit, sopusoinnussa BH3 jäljittelevää mekanismi tappaa [19]. Indusoiman apoptoosin ABT-737 kautta BAX tai BAK on ehdotettu olevan paikan tavoite toimintaa [20]. Lisäksi herkkyys soluvasteen BH3 peptidien BH3 vain proteiinien korreloi herkkyyttä solujen uhkaa ABT-737 apoptoosin [21]. Merkittävää on, kliiniset kokeet ABT-263 on suoritettu ja jonkin verran hyötyä on havaittu, erityisesti kroonisen lymfaattisen leukemian [22]. Lisäksi sekä ABT-737 ja ABT-263 voidaan käyttää välineitä mekaaniset tutkimukset apoptoosin [14,23]. Äskettäin uusi ABT, ABT-199, on kehitetty osoitettiin selektiivisyys nimenomaan Bcl2 [24].

Nykyisessä tutkimuksessa selvitimme apoptoottisten reittien eturauhasen syöpäsoluja reaktiota paklitakselille, ABT- 199, ABT-263 ja paklitakselin plus ABT-263, käyttäen LNCaP ja PC3-soluissa. LNCaP ja PC3 edustavat androgen-vasteen ja androgeeni-riippumaton eturauhassyöpä-solulinjaa, vastaavasti. Ensin todettiin, että paklitakseli aiheutti G2 /M pidätys sekä LNCaP ja PC3-soluissa, mutta apoptoosia vain johti LNCaP. Lisäksi havaitsimme Bcl2 ja Bcl-xl yliekspressio PC3-soluissa verrattuna LNCaP-solut, jotka ovat alhaiset ja havaitsemattomia tasoja Bcl-xl ja Bcl2 vastaavasti. SiRNA pudotus anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-xl voimistunutta apoptoosia LNCaP, mutta sitä ei voitu pudotus PC3-soluissa tehokkaasti. Vertasimme kykyä ABT-199 ja ABT-263 apoptoosin ja todettiin, että vain ABT-263, ei ABT-199, voivat aiheuttaa apoptoosin. Olemme myös osoittaneet, että paklitakselin yhdistettynä ABT-263 oli synergiavaikutukset apoptoosia sekä LNCaP ja PC3-soluissa. Tämä viittaa siihen, että ABT-263 voisi parantaa hoitotulosten sekä paklitakseli-herkkä ja paklitakseli-resistenttejä eturauhasen syöpiä. Apoptoosin aktivaatiosta oli tehokkaampi LNCaP-soluissa kuin PC3-solujen reaktiota paklitakselille ja ABT-263 tai ABT-263 yksinään, viittaa siihen, että apoptoosireittiä PC3-soluissa saattaa olla eri kauempana että LNCaP-soluissa, vaikka Bcl-xl on osuus .

Materiaalit ja menetelmät

yhdisteet

Paciltaxel (Sigma-Aldrich), ABT-199 (Selleck) ja ABT-263 (Selleck) hankittiin kaupallisista lähteistä kuten . Yhdisteet liuotettiin DMSO: hon ensimmäisessä ja laimenee viljelyalusta jatkokokeissa.

Soluviljely ja synkronointi

PC3 ja LNCaP-solut ostettiin Bioresource Collection and Research Center (BCRC) Taiwanissa . Solut ympättiin 4 x 10

5-6 x 10

5 solua per petrimaljaan (10 cm) RPMI 1640: ssä, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia, ja niitä kasvatettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Soluja viljeltiin joko ei-synkronisesti tai synkronointi. Synkronointia varten, PC3-solut ympättiin seerumin-rikas RPMI 1640-alustassa, jossa on 2 mM tymidiiniä ja inkuboitiin 19 tunnin ajan. Solut vapautettiin pesemällä kolme kertaa PBS: llä ja uudelleen syötetään tuoretta seerumia rikkaassa alustassa 8 tuntia. Sitten soluja ruokittiin tuoreella alustalla, joka sisälsi 2 mM tymidiiniä 16 tunnin ajan. Solut pestiin PBS: llä kolme kertaa ennen seuraavia vaiheita. LNCaP-soluja nälkiinnytettiin seerumittomassa RPMI 1640-alustassa 48 tuntia sen jälkeen, kun on ympätty seerumin-rikkaassa alustassa 24 tunnin ajan.

Virtaussytometrinen solusyklin analyysi

PC3 ja LNCaP-soluja käsiteltiin paklitakselin ilmoitettuina ajankohtina seuraavan synkronoinnin G1 /S-vaiheessa. Solut kerättiin trypsinisaatiolla ja /tai erotetaan kiinnittynyt ja irrottaa jakeet. Solut sentrifugoitiin, pestiin PBS: llä ja otettiin talteen sentrifugoimalla. Solut kiinnitettiin jääkylmällä 70% etanolilla 30 min, pestiin PBS: llä ja sentrifugoidaan supernatantin. Solut suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 0,05% Triton X-100 ja RNaasi A: ta (40 ug /ml) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan, ja propidiumjodidia (PI) lisättiin solususpensioon loppupitoisuuteen 50 ug /ml vielä 1 tunnin inkuboinnin. Solut otettiin talteen sentrifugoimalla, pestiin PBS: llä ja sentrifugoidaan supernatantin. Lopuksi solut suspendoitiin uudestaan ​​PBS ja analysoitiin virtaussytometrillä (BD Biosciences) ohjelmisto (BD Biosciences).

Immunofluoresenssianalyysi kanssa -konfokaalimikroskoopilla

Noin 5 x 10

4 PC3 ja 1 x 10

5 LNCaP-solut maljattiin steriiliä 18 mm lasipeitinlevyille. Solut synkronoitu olosuhteissa edellä kuvattujen solun synkronointi osassa. Soluja viljeltiin eri yhdisteiden ilmoitettuina ajankohtina kurssia, kiinteä metanolissa (-20 ° C, 10 min) ja rei’itetty 0,1% Triton X100 (25 ° C, 2 min). Soluja blokattiin 3% naudan seerumin albumiinia-TBS ja sitten värjättiin ensisijainen α-Tubulin monoklonaalinen vasta-aine (Sigma-Aldrich), jota seurasi sekundaarisia vasta-aineita, jotka on konjugoitu fluorofori (Invitrogen). Peitinlasit asennettiin kanssa mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää reagenssin DAPI (Invitrogen) ylösalaisin lasilevyille. Konfokaalimikroskopia kuvat saatiin käyttämällä -konfokaalimikroskoopilla järjestelmä (Olympus) ja monistettiin sata kertaa.

Apoptosis Assay

noin 1 x 10

5 PC3-soluja, tai 2 x 10

5 LNCaP-soluja ympättiin 10 cm: n petrimaljaan. Sekä PC3 ja LNCaP-solut synkronoidaan ja osoitetuilla yhdiste hoitoja 48 tuntia. Solut kerättiin trypsinisaatiolla ja erotettiin kiinnittynyt ja irrottaa jakeet. Solut suspendoitiin uudelleen ja värjättiin 100 pl: aan anneksiini V: n sitoutumisen puskuria 100 ug /ml propidiumjodidia ja 100 ug /ml FITC-konjugoitua anneksiini V-vasta-ainetta (Strong Biotech) 15 min huoneenlämmössä ennen FACS-analyysiä.

Immunoblottaus

Solut lyysattiin lyysipuskurissa (250 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1% NP-40, 1 mM EDTA, 10 mM β-glyserofosfaatti, 0,1 mM Na

3Vo

4H, 1 tabletti proteaasi-inhibiittoriseosta, 1 mM NaF, 50 mM HEPES, pH 7,4, 50 ml). Proteiinipitoisuus määritettiin BCA Protein Assay Kit (Pierce). Noin 100 ug proteiinia kuoppaa kohti suoritettiin SDS-PAGE. Elektroforeesin jälkeen, proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Siirretyn membraanit blokattiin 5% (w /v) rasvaton maito tai 5% (w /v) BSA: ta TBS: ssä (0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCI, pH 7,4), jossa oli 0,1% (v /v) Tween 20 ja tutkittiin ensimmäisen vasta-aineen, jonka jälkeen inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (anti-kani-anti-hiiri, Jackson ImmunoResearch) ja visualisointi, jossa havaitseminen (Pierce), jonka filmien kehittäminen. Ensimmäinen vasta-aineita käytettiin tässä tutkimuksessa olivat seuraavat: anti-aktiini-vasta-aine (Millipore), anti-glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) ja -α-tubuliinin-vasta-aine (GeneTex), anti-Bcl-xl-vasta-aine (Abcam), anti-Bak, -Bax, -Bcl2, -Bim, -caspase 3, -caspase 3 (A), – kaspaasi 7 (A), – Mcl-1, poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) ja-PARP (C) vasta-aine (Cell Signaling). Immunoblot kuvat kvantifioitiin määrällinen ohjelmisto (NIH).

Coimmunoprecipitation

kokosoluliuotteista paklitakselin saaneista tai ohjata LNCaP tai PC3-soluja valmistettiin Chaps puskuriin (5 mM MgCl

2, 137 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% CHAPS 20 mM Tris-HCI (pH 7,5)), ja proteaasi-inhibiittorit. Noin 500 ug proteiinit immunosaostettiin Bcl-xl-vasta-aine (Abcam) 4 ° C: ssa 2 tuntia. Immunosaostumat vangiksi 50 ui lietteen proteiini A-magneettiset helmet (Millipore) in Chaps-puskurissa 4 ° C: ssa yön yli. Immunosaosteita sitten talteen magneettinen jalusta ja pestiin kolme kertaa 1%: Chaps puskuria. Immunosaosteita eluoitiin SDS-PAGE-näytepuskuria, tehtiin SDS-PAGE ja sen jälkeen immunoblottauksella.

Bcl-xl, Bim ja Mcl-1 kaataa siRNA

PC3 tai LNCaP-soluja ympättiin 4 x 10

5-6 x 10

5 solua per petrimaljaan (10 cm) 24 tunnin ajan 7 ml: ssa RPMI 1640, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia, ja niitä kasvatettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Bim (Qiagen), Bcl-xl ja MCL-1 (Invitrogen) siRNA esi-inkuboitiin 1 ml: ssa viljelyalustaa ilman seerumia ennen transfektiota, ja sitten 40 ui transfektioreagenssia (Qiagen) lisättiin samaan elatusaineeseen, sekoitettiin vortex ja inkuboitiin 5 ~ 10 min huoneen lämpötilassa, jotta muodostuu transfektion komplekseja. Lopullinen siRNA-pitoisuus oli noin 5 10 nM lisäämisen jälkeen kompleksit tipoittain PC3 ja LNCaP. 24 tunnin kuluttua, PC3 ja LNCaP-soluja käsiteltiin 50 nM paklitakselin ja kerättiin osoitetuissa ajanjaksoista.

Tilastollinen

parillista t-testiä käytettiin osoittamaan tilastollista merkitystä tulosten avulla SigmaPlot 10. ** P 0,01 pidettiin merkittävänä. Tietoja kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta analysoitiin.

Tulokset

Paklitakseli johti mitoottisiin pidätyksen G2 /M niin PC3 ja LNCaP

synkronoitu PC3 tai LNCaP solujen G1 /S käsiteltiin 50 nM paklitakselia eri ajanjaksoista ja korjattu solusyklin analyysi virtaussytometrialla. Huomasimme, että solusyklin eteni PC3-soluissa normaalisti kautta S-vaiheeseen ja pidätettiin ajanhetkellä välillä 8 ja 12 tunnin (Fig. 1A). Koska sen hitaan leviämisen nopeus, LNCaP kesti kauemmin kuin PC3 vastata yhdiste hoitoon, osoittaa solusyklin pysähtymiseen välillä 36 ja 48 h (Fig. 1A).

(A) Flow rianalyysit synkronoitu PC3 tai LNCaP-solut käsiteltiin paklitakselia kautta ilmoitettuun ajanjaksoista. Analyysit tehtiin kolme kertaa ja edustavia histogrammit esitetään. X- ja Y-akselit esittävät DNA-pitoisuutta ja solujen määrä, vastaavasti. (B) Immunofluoresenssi mikroskooppikuva mikrotubulusten synkronoitu PC3 tai LNCaP hoitaa paklitakselia ilmoitettuun ajanjaksoista. Analyysit kahdennettu ja edustavia immunofluoresenssilla micrographs esitetään. a-Tubulin osoitettiin vihreä väri. DNA osoitettiin punainen väri.

Sitten seurataan käyttäytymistä sekä mikrotubuleiksi ja kromosomit immunofluoresenssilla kuvantamisen kanssa -konfokaalimikroskoopilla saman ajan myötä. Havaitsimme, että paklitakseli vaikuttaa mikrotubuleiksi 4 tunnin ja 8 tunnin PC3-soluissa, jotka osoittavat poikkeuksellisen tiheä mikrotubulia jakelu tuman ympärillä (Fig. 1 B). Nämä epänormaalit mikrotubuluksia hävisi voitava suorittaa normaalin karan kokoonpano, jolloin tiheä moninapainen karat 12 h (Fig. 1 B). Paklitakselin LNCaP-soluissa muistutti vaikutus PC3-solut (Fig. 1 B). Kuitenkin, koska pitkän päällekkäisyys ajan LNCaP, epänormaali kara muodostumista LNCaP tapahtui paljon myöhemmin kuin PC3-soluissa (kuvio. 1 B).

tulokset viittasivat siihen, että solut käsiteltiin paklitakseli voisi vielä mennä eteenpäin G2 ja todennäköisesti tulee G2 /M muodostamiseksi viallisen kara-kromosomin monimutkainen, että aiheutetaan sitten solusyklin pysähtymisen tässä vaiheessa.

Paklitakseli ajoi apoptoottisen vasteen kautta kaspaasiriippuvaisen apoptoottisten reittien LNCaP, mutta ei PC3 soluja, vastauksena G2 /M pidättämään

Paklitakseli aiheutti solusyklin pysähtymiseen G2 /M, noin 8-12 tunnin PC3-soluissa ja 36-48 h LNCaP-soluissa. Seuraavaksi tutkimme apoptoottinen vastaukset laukaisi paklitakselia arvioimalla kaspaasi 3 ja kuluminen taso PARP. Tuloksemme paljasti, että paklitakseli aiheuttivat kaspaasi 3 ja PARP hajoamista LNCaP esiintymään ensin 48 tuntia, heti G2 /M pidätys, ja saavuttanut merkittävän tason 72 tunnin (Fig. 2A). Sen sijaan havaitsimme kumpikaan kaspaasi 3 eikä hajoamista PARP PC3-soluissa paklitakseli G2 /M pidätys (Fig. 2A). Niinpä pääteltiin, että paklitakseli aktivoitu apoptoottisen vasteen erittäin vastaa sen vaikutus G2 /M-pidätys LNCaP-soluissa, mutta ei PC3-soluissa.

(A) immunoblot-analyysi solulysaatteja synkronoitu LNCaP ja PC3-soluja käsitelty paklitakselia mainitun ajanjakson kurssien havaitsemiseksi kaspaasi 3 ja PARP sen hajoamistuotetta. (B) immunoblot-analyysi solulysaatteja liimattu tai irrotetaan jakeet LNCaP tai PC3-soluissa, sen jälkeen paklitakselin hoidon ajan kurssia havaitsemiseksi katkaisun muodossa PARP. Kokeet toistettiin kolme kertaa ja edustavia tuloksia on esitetty. PARP (c): pilkkominen muoto PARP.

Paklitakseli kuoli PC3-solujen vain irrottaa aseman

Huomasimme, että paklitakseli ei aktivoinut apoptoottisen vasteen, joka vastaa G2 /M pidätys PC3-soluissa. Mikä on kohtalo PC3 solujen jumissa tässä vaiheessa? Paklitakselikäsittelyn jälkeen, havaitsimme, että jotkut LNCaP tai PC3-soluja irtoaa pohjasta viljelymaljalla. Niinpä me talteen otettuja soluja inkubaation jälkeen yhdisteiden eripituiset kurssia, ja kerätään ja analysoidaan tarttuneet ja irrotettuja soluja erikseen. Tutkimme hajoamisen PARP kiinnittyneen ja irrottaa jakeet LNCaP ja PC3-soluissa eri ajanjaksoista. Pilkkominen muoto PARP ilmestyi noudatetaan ja irrottaa jakeet LNCaP-soluja (kuvio. 2B). Tämä lomake vain ilmestyi irrotettu osa PC3-solujen 48 tunnin (Fig. 2B).

Meillä on myös suoritettu anneksiini V-FITC /PI-värjäys arvioida solukuolemaa LNCaP tai PC3-soluissa. Useimmat noudatetaan PC3-solut pysyivät elossa, kun taas tarttunut osa LNCaP-solut osoittivat merkittävää otosta joutumasta varhaisen apoptoosin (S1 Kuva.). Jotta irrotettu osa, LNCaP ja PC3-solujen ilmestyi myöhään apoptoosin ja nekroosin (S1 Kuva.).

päätteli, että ajoitus varhaisen apoptoosin liimattu osa LNCaP vastaa G2 /M pidätyksen aikana PC3-solut todellakin näyttää resistenssifenotyyppi paklitakseliin hoitoon. Kuolema on irrotettu murto LNCaP ja PC3 näytti liittyvän solun irtoaminen sekä solujen aiheuttamaa stressiä paklitakseli.

Expression of Bim, Bak, Bax, Bcl2, Bcl-xl ja Mcl-1 LNCaP ja PC3-solujen jälkeen paklitakselihoidon

kysyä miksi kaspaasi 3-riippuvaista apoptoosia tapahtuu LNCaP, mutta ei PC3-soluissa, vastauksena G2 /M pidätys, tarkistimme proteiini taso Bim, Bak, Bax, Bcl2, Bcl-xl ja Mcl-1. Tuloksemme osoittivat, että proteiini taso Bim väheni ajan myötä paklitakselikäsittelyn jälkeen LNCaP ja PC3-solut (Fig. 3A). Sen sijaan proteiinia taso Bak, Bax, Bcl-xl ja Mcl-1 ei muuttunut merkittävästi samoissa olosuhteissa (kuviot. 3A ja B). Emme havainneet mitään Bcl2 proteiineja LNCaP-soluissa (kuvio. 3B). Mielenkiintoista on, PC3-solut ekspressoivat merkittävä määrä Bcl2 proteiinien kanssa tai ilman paklitakselihoidolla (Fig. 3B). Sitten verrataan proteiinin tasoon Bim, Bcl-xl ja Mcl-1 välillä LNCaP ja PC3-soluissa. Tulokset on esitetty, että Bcl-xL: n ja Mcl-1 PC3-soluissa on huomattavasti korkeampi kuin LNCaP-soluissa (kuvio. 3C). Siksi yliekspressio Bcl2, Bcl-xl ja Mcl-1 in PC3-soluissa saattaa edistää niiden paklitakseli vastarintaa.

(A) ilmentyminen BH3 vain proteiinia Bim ja proapoptoottisiin proteiinit mukaan lukien sekä Bak ja Bax, LNCaP ja PC3-soluissa. (B) ekspressio anti-apoptoottisten proteiinien, kuten Bcl2, Bcl-xl ja Mcl-1 LNCaP tai PC3-soluja. Immunoblottianalyysi solulysaateista peräisin LNCaP tai PC3-solut käsiteltiin paklitakselia osoittaman ajan. Kokeet toistettiin kolme kertaa ja edustavia tuloksia on esitetty. (C) vertailu Bim, Bcl-xl ja Mcl-1 välillä LNCaP ja PC3 solua /ilman paklitakselihoidolla. Immunoblottianalyysi solulysaateista peräisin LNCaP tai PC3 soluja käsitellään 48 tuntia. Kokeet toistettiin kolme kertaa ja edustavia tuloksia on esitetty. Immunoblotti kuvia Bim, Bcl-xl, Mcl-1 ja α-tubuliinin LNCaP ja PC3 /ilman paklitakselihoidolla kvantitoitiin ImageJ. Lukemat, määritellään mielivaltainen kevyt yksikköä, BIM, Bcl-xl ja Mcl-1 normalisoitu lukemiselle α-tubuliinin näkyvät oikealla puolella. (**) Tilastollisen merkittävyyden kahden readouts.

Bim taso LNCaP tai PC3-solujen vähentynyt dramaattisesti paklitakselikäsittelyn jälkeen, ja korreloi solukuolemaa (Fig. 3A). Kysyimme miksi taso Bim väheni merkittävästi paklitakselikäsittelyn jälkeen. Jälleen me kerätään ja analysoidaan tietoja noudatetaan ja irrotettuja soluja erikseen. Alennettu Bim vain ilmestyi irrotettu osa, mutta pysyi vakiona noudatetaan jae sekä LNCaP ja PC3-solujen paklitakselikäsittelyn jälkeen (S2 Kuva.). Täten alennettu Bim taso ei ehkä liity sen roolia apoptoottisen reitin.

Seuraavaksi kysyimme Bim liittyy paklitakselin aiheuttama apoptoosireitin eturauhassyövissä RNAi Knockdown ja coimmunoprecipitation, koska Bim on main BH3 vain proteiinia tarvitaan paklitakseli aiheuttaman apoptoosin rintasyöpiä [25]. Eroaa rintasyöpiä, tuloksemme osoittivat, että Bim Knockdown eivät voi vaikuttaa paklitakseli aiheuttaman apoptoosin LNCaP (S3 kuvassa.). Lisäksi ei ole merkittävää vuorovaikutusta Bim ja Bcl-xl havaittiin IP (S3 kuvassa.). Nämä tulokset viittaavat siihen, että Bim ei ehkä olennainen BH3 vain proteiinia vastaa paklitakselin indusoiman apoptoosin eturauhassyövissä.

Bcl-xl tai Mcl-1 pudotus parantaa apoptoosin LNCaP-soluissa, mutta ei PC3-solut

kysyä yliekspressio Bcl2, Bcl-xl ja Mcl-1 in PC3-soluissa saattaa edistää niiden paklitakseli vastus, ensin tutkitaan, mitkä niistä voisivat harjoittaa apoptoottisen reitin. Tulokset osoittivat, että Bcl-xl pudotus siRNA lisäsi merkittävästi kaspaasi 3 ja hajoaminen PARP LNCaP-soluissa (kuvio. 4). Mcl-1 pudotus lisäsi myös kaspaasi 3 ja hajoaminen PARP LNCaP-soluissa, mutta sen vaikutus ei ollut yhtä hyvä kuin Bcl-xl pudotus (Fig. 4). Nämä tulokset viittaavat siihen, Bcl-XL voisi olla tärkeä tekijä, joka vaikuttaa paklitakselin aiheuttama apoptoottisen reitin LNCaP-soluissa.

Bcl-xl ja Mcl-1 Knockdown aiheuttama lisääntynyt apoptoosin arvioituna kaspaasi 3 ja PARP hajoaminen LNCaP, mutta ei PC3-soluissa. LNCaP tai PC3-solut transfektoitiin ohimenevästi Bim, Bcl-xl tai Mcl-1 siRNA tai salattu siRNA 24 tunnin ajan. Soluja käsiteltiin /ilman 50 nM paklitakselia 48 tuntia, ja sen jälkeen niille immunoblot-analyysillä. Kaspaasi 3 (a): aktiivinen muoto kaspaasin 3. PARP (c): pilkkominen muoto PARP. Bcl-xl (t): lyhyt altistuminen kuva Bcl-xl. Bcl-xl (l): pitkä altistuminen kuva Bcl-xl. Kokeet toistettiin kolme kertaa ja edustavia tuloksia on esitetty. Vastaavat lukemat immunoblottaustietojen kuvia Bcl-xl, Mcl-1 ja kaspaasi 3 (a) normalisoitu a-tubuliinin LNCaP-soluissa näkyvät alaosassa. Vain pudotus /ilman Paklitakselihoidon kvantitoitiin. (**) Tilastollisen merkittävyyden kahden readouts.

jälkeen suoritettiin samat analyysit PC3-soluissa. Meillä oli vaikeuksia kaatamalla Bcl-x tehokkaasti PC3-soluissa, johtuen todennäköisesti korkea tämän proteiinin (Fig. 4). Sitä vastoin proteiini taso Mcl-1 väheni merkittävästi sen siRNA mutta tämä pudotus ei ollut vaikutusta kaspaasi 3 ja hajoaminen PARP PC3-soluissa (kuvio. 4).

yli-ilmentyminen Bcl-xl vaikutti eniten paklitakseli resistenttien fenotyyppi PC3-soluissa

Koska emme voineet tehokkaasti kaataa Bcl-xl arvioida sen vaikutusta paklitakselin aiheuttama apoptoosin PC3-soluissa, meidän vaihtoehtoinen lähestymistapa oli käyttää ABT -263 kemialliseen knockdovvn Bcl2 ja Bcl-XL samanaikaisesti. Lisäksi käytimme ABT-199, joka on spesifinen inhibiittori Bcl2, erottaa Bcl2: n ja Bcl-xl PC3-soluissa. Käyttämällä ABT-263 aiheuttama hajoamista PARP ja kaspaasi 3 sekä LNCaP ja PC3-solut (Fig. 5A). Kuitenkin vaikutus on ABT-263 LNCaP-soluissa oli noin 3 kertaa suurempi kuin PC3 kannalta kaspaasi 3 aktivaation (Fig. 5A). On merkittävää, ABT-199 ei osoittanut mitään apoptoottista vaikutusta joko LNCaP ja PC3-solut, sulje pois antiapoptoottisena roolia Bcl2 PC3.

(A) ABT-263, mutta ei ABT-199, voisi tehokkaasti laukaista PARP hajoamista LNCaP ja PC3-solujen annoksesta riippuvalla tavalla, mutta se voi vain aktivoida kaspaasi 3 havaittavissa määrin LNCaP-soluissa. Immunoblottianalyysi solulysaateista peräisin LNCaP tai PC3-solut käsiteltiin ABT-199 tai ABT-263 yksinään 48 tunnin ajan eri pitoisuuksilla analysoitiin kuten. Kaspaasi 3 (a): aktivoitu muoto kaspaasi 3 kaspaasi 7 (a): aktivointi muodossa kaspaasi 7. Kokeet toistettiin kolme kertaa ja edustavia tuloksia on esitetty. Lukemien kaspaasi 3 (a) normalisoidaan GAPDH välillä LNCaP ja PC3-solut käsiteltiin 5 uM ABT-263 näkyvät alaosassa. (**) Tilastollisen merkittävyyden kahden readouts. (B) yhdistelmä on 50 nM paklitakselin eri pitoisuuksilla ABT-263 oli synergistinen vaikutus apoptoosia sekä LNCaP ja PC3-soluja. Teho ABT-263 yhdessä paklitakselin LNCaP-soluissa oli korkeampi kuin PC3-soluissa. Immunoblottianalyysi solulysaateista peräisin LNCaP tai PC3-solut käsiteltiin paklitakselia yhdessä ABT-263 tai ABT-263 yksinään 48 tunnin ajan eri pitoisuuksilla analysoitiin kuten. Kaspaasi 3 (a): aktivoitu muoto kaspaasi 3 kaspaasi 7 (a): aktivointi muodossa kaspaasi 7. Kokeet toistettiin kolme kertaa ja edustavia tuloksia on esitetty. Vastaavat lukemat kaspaasi 3 (a) normalisoitu sisäisen valvonnan, α-tubuliinin tai GAPDH LNCaP tai PC3 kanssa LNCaP näkyvät alaosassa. (**) Tilastollisen merkitsevyyden kahden lukemat.

Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että Bcl-xl on tärkein tekijä apoptoosin ja sen yli-ilmentyminen edistää resistenssifenotyyppi paklitakselia hoitoon PC3-soluissa. Lisäksi olemme myös havainneet, että PC3-solut näyttämään osittainen resistenssi ABT-263 hoitoa, jos vaste LNCaP samaan hoitoa pidetään täydellisen vastauksen.

Yhdistelmä ABT-263 paklitakselin osoittautui olevan synergistinen vaikutus on apoptoosia sekä LNCaP ja PC3-solujen

Olemme osoittaneet, että ABT-263 yksinään voidaan ajaa paklitakseli-herkkä ja paklitakseli-resistentit solut kohti apoptoosin, vaikka paklitakseli-herkän LNCaP-solulinjasta osoittaa parempi vaikutus kuin paclitaxel- kestävä PC3-solulinjassa. Arvioimme lisäksi yhdistelmän vaikutus ABT-263 paklitakselin kanssa. On merkittävää, tuloksemme osoittivat, että ABT-263 yhdistettynä paklitakselilla oli synergistinen vaikutus apoptoosia sekä LNCaP ja PC3-soluissa (kuvio. 5B). Teho kuitenkin tämän yhdistelmän hoito oli suurempi LNCaP-soluissa kuin PC3-soluissa (kuvio. 5B).

synergiaa paklitakselin ja ABT-263 aktivoimiseksi apoptoosin osoitti selvästi, että ABT-263 voi ehkäistä Bcl-xl paklitakselin-herkkä ja paklitakseli-resistenttejä eturauhasen syöpäsoluja. Targeting antiapoptooppinen proteiinit on mahdollista parantaa kemoterapiaa eturauhasen syöpiä. Kuitenkin ero apoptoosin aktivoitumisen välillä LNCaP ja PC3-solujen ABT-263 yksin tai ABT-263 yhdistettynä paklitakseliin ehdotti, että apoptoosireittiä PC3-soluissa saattavat vaihdella kauempana että LNCaP jälkeenkin Bcl-xl on osuus.

keskustelu

tutkimuksessamme paklitakseli laukaisi varhain apoptoosin kiinnittyvä osa LNCaP vastauksena G2 /M pidätykseen. Sen sijaan varhainen apoptoosi ei voitu havaita samalla osa PC3-solujen koko ajan myötä, mikä viittaa siihen, että PC3-solut eivät reagoi G2 /M-pidätys aloittaa tämän kuoleman ohjelman. Mielenkiintoista, PC3 solukuolemaa esiintyi irrottaa aseman paklitakselikäsittelyn jälkeen pääasiassa kuolion. Lisäksi Bim taso vain väheni irrotettu osa molempien solujen paklitakselikäsittelyn jälkeen. Onko lasku Bim tasojen liittyy solukuolemaan erillisissä olosuhteissa vielä ratkaisematta. Toinen tutkimus osoitti, että Bim Knockdown eturauhasen ja rintasyövän solujen aiheuttamaa solujen irtoaminen ja lopulta apoptoosin [26]. Emme kuitenkaan ole tarkkailla ilmiötä kyseisessä raportissa.

Onko solun irtoaminen voi tapahtua

in vivo

in antimitoottisena hoitoja on mielenkiintoinen asia, joka on vielä määrittämättä. Loogisesti, syöpäsolut ympäröivät sidekudokset voi olla erittäin vaikea irtautua syöpäkudoksessa jälkeen antimitoottisena kemoterapiaa. Niinpä solukuolema vastauksena G2 /M pidätys Kun tarttunut tila tulee kriittinen piste arvioitaessa, onko solut ovat herkkiä tai resistenttejä paklitakselihoitoa. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että LNCaP-solut osoittavat herkkyyttä paklitakselihoidolla, kun taas PC3-solut vastustuskykyisiä.

osoittivat myös, että yli-ilmentyminen Bcl-xl voi edistää apoptoosia kestävä fenotyyppiä PC3-soluja. Näyttää siltä, ​​että apoptoosin aiheuttamaa signaalia paklitakselihoidolla ehkä ole riittävä vastustamaan yliekspressio anti-apoptoottiset proteiinit, kuten Bcl-xl PC3-soluissa. Tämä keinottelu tukee lisäksi yhdistelmää Paklitakselin ABT-263, joka oli synergistisiä vaikutuksia kaspaasi 3 ja hajoaminen PARP verrattuna paklitakseliin tai ABT-263 yksin.

Eräs tutkimus on todennut että yli-ilmentyminen Bcl-xl korkealaatuista prostatakarsinoomassa liittyy hormonin tulenkestävä fenotyyppi [27].