Krooninen sairaus

tiivistelmä

androgeeniablaatio hoito on ensisijainen hoito metastaattisen eturauhassyövän. Kuitenkin 80-90%: lla potilaista, jotka saavat androgeeniablaatio hoito lopulta kehittyä toistuva kasvaimia 12-33 kuukautta hoidon jälkeen mediaani kokonaiselinaika aikaa 1-2 vuoden kuluttua uusiutumisen. LNCaP on yleisesti käytetty solulinja perustettiin ihmisen imusolmukkeesta metastaattisen vaurion eturauhasen adenokarsinooma. Olemme aiemmin perustettiin kaksi uusiutunut androgeenireseptorin (AR) -rikas androgeenista riippumaton LNCaP alalinjoja 104-R1 (androgeenien köyhdytetty 12 kuukautta) ja 104-R2-solut (androgeenireseptorin köyhdytetty 24 kk) AR-positiivisten androgeeniriippuvaisen LNCaP 104-S solut. LNCaP 104-R1 ja 104-R2 jäljittelee AR-positiivinen hormoni tulenkestävät uusiutunut kasvaimia saavilla potilailla androgeeniablaatio hoitoa. Androgeenien hoito stimuloi proliferaatiota 104-S-soluissa, mutta aiheuttaa kasvun hidastumisen ja G1 solukierron pysähtymisen 104-R1 ja 104-R2 soluissa. Olemme tutkineet proteiinin ilmentyminen profiilin ero LNCaP 104-S vs. LNCaP 104-R1, 104-R2, PC-3, ja DU-145-soluissa sekä tutkittiin herkkyys näiden eturauhassyövän solut eri kemoterapiaa huumeiden ja pienimolekyylisiä estäjiä. Verrattuna 104-S-soluissa, 104-R1 ja 104-R2-solut ilmentävät korkeampia proteiinin tasoja AR, PSA, c-Myc, Skp2, BCL-2, P53, p-MDM2 S166, Rb, ja p-Rb S807 /811 . 104-R1 ja 104-R2-solut ilmentävät suurempi suhde p-Akt S473 /Akt, p-EGFR /EGFR ja p-Src /Src, mutta pienempi suhde p-ERK /ERK kuin 104-S-soluissa. PC-3 ja DU-145-solut ilmentävät korkeampia c-Myc, Skp2, Akt, Akt1, ja fosfori-EGFR mutta vähemmän fosfo-Akt ja fosfo-ERK. Yliekspressio Skp2 lisääntynyt vastus LNCaP kemoterapiaa huumeita. Paklitakseli, androgen, ja estäjien PI3K /Akt, EGFR, Src, tai Bcl-2 näyttävät olevan mahdollisia valintoja edenneen eturauhasen syöpiä. Tutkimuksemme tarjoaa perustelut kohdistamista Akt, EGFR, Src, Bcl-2, ja AR signalointi kuin kohtelu AR-positiivisten uusiutunut eturauhasen kasvaimia jälkeen hormonihoito.

Citation: Lin H-P, Lin C-Y, Hsiao P-H, Wang H-D, Sheng Jiang S, Hsu J-M, et al. (2013) ero Protein Expression Profile ja kemoterapiaa huumeita Response Eri Progression vaiheet LNCaP alilinjat ja muut ihmisen syöpäsolujen. PLoS ONE 8 (12): e82625. doi: 10,1371 /journal.pone.0082625

Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia

vastaanotettu: 16 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 25 lokakuu 2013; Julkaistu: 05 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia CS-101-PP-14 ja CS-102-PP-14 (National Health Research Institutes), NSC 99-2320-B-400-015-MY3 ja NSC 101-2325-B-400-014 ( National Science Council), ja DOH101-TD-C-111-004 (Department of Health) Taiwanista Yhteisöpatenttituomioistuimen ja DOH102-TD-M-111-102001 (Department of Health, Taiwan) ja HJK. SYL tukee DOH101-TD-C-111-004. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Vastaava kirjailija Dr. Chih-Pin Chuu on PLoS One toimitusneuvosto jäsen, olemme kuitenkin vahvistaa, että tämä ei muuta meidän noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Uusimpien tilastojen 2008 (GLOBOCAN 2008-versio 1.2 ), eturauhasen syöpä on toiseksi yleisin diagnosoitu syöpä miehillä ja viidenneksi yleisin syöpä yleistä maailmassa. Tilastoihin American Cancer Society arvioi, että 238590 uutta tapausta eturauhassyövän on diagnosoitu ja noin 29720 ihmistä kuolee eturauhassyöpään-erityisiä kuolemista Yhdysvalloissa vuonna 2013. esiintyvyys eturauhasen syöpä kasvaa tasaisesti lähes kaikissa maissa [1]. Eturauhassyöpä diagnosoidaan hyvin harvat alle 50 vuotta. Noin 85% potilaista on diagnosoitu ovat yli 65-vuotiaita [1]. Leikkaus on usein onnistunut elimeen rajoittunut eturauhassyöpä. Androgeeniablaatio hoidon ehdottama tohtori Charles B. Huggins, on ensisijainen hoito metastaattisen eturauhassyövän. Kuitenkin useimmat saavat eturauhassyöpäpotilaat androgeenireseptorin Ablaatiohoitoa lopulta kehittyy toistuvia, kastraatio vastustuskykyisten kasvainten 1-3 vuotta hoidon mediaani kokonaiselinaika aikaa 1-2 vuoden uusiutunut [2,3]. Ei ole tehokasta tavanomaista hoitoa relapsoituneen kehittyneen eturauhasen syöpiä. Kemoterapia yleensä haetaan metastaattisen hormonia tulenkestävä eturauhassyöpä [4]. Yleisesti käytetty kemoterapeuttisten eturauhasen syövistä ovat etoposidi, paklitakseli, vinblastiini, ja mitoksantroni. Etoposide ja mitoksantronilla ovat tyypin II topoisomeraasin estäjät [4,5]. Vinblastiini sitoo tubuliinia ja estää kokoonpano mikrotubulusten [4]. Paklitakseli häiritsee sukkularihmaston kokoonpano, kromosomi erottelu, ja solunjakautumisen. Paklitakseli myös stabiloi mikrotubulusten polymeeri ja suojaa sitä purkamista [4]. Kemoterapia lääkehoitojen aiheuttaa lasku PSA, röntgenkuvaus vaste, parantaminen kipua, ja parantaminen virtsateiden oireiden alaryhmässä potilaiden [4]. Nämä lääkkeet osoittavat vähän vaikutusta pitkittää säilymiseen [4]. Toivottuja sivuvaikutuksia näistä kemoterapeuttisista aineista ovat myrkyllisiä kuolemia, aivohalvauksia, tromboosi, neutropenia, turvotus, hengenahdistus, pahoinvointi, väsymys [4]. Vaihtoehtoisia hoitomuotoja tarvitsevien.

LNCaP on yleisesti käytetty solulinja perustettiin ihmisen imusolmukkeesta metastaattisen vaurion eturauhasen adenokarsinooma [6]. LNCaP-solut ilmentävät androgeenireseptorin (AR) ja prostataspesifisen antigeenin (PSA). Aiemmin olemme viljeltiin androgen-herkkien LNCaP 104-S-solujen androgeenin-köyhdytettyä olosuhteissa

in vitro

jäljittelemään saaville potilaille androgeeniablaatio hoitoa [7-9]. Useimmat 104-S-solut kuolivat 3 kuukauden kuluttua. Pieni solupopulaatio nimetty 104-R1 ilmennyt vasta 10 kuukautta. Nämä solut lisääntyvät säännöllisesti puuttuessa androgeenireseptorin [7-9]. Kahdeksantoista kahteenkymmeneen kuukauden kuluttua androgen ehtyminen, 104-R1 solut syntyi nopeammin kasvava väestö soluja kutsutaan 104-R2 soluissa [7-9]. Siirtymävaiheen 104-S-soluissa 104-R1 ja 104-R2 solujen mRNA ilmaisu, proteiinia runsaus, ja transkriptionaalista aktiivisuutta AR kasvua useiden taittuu [7-14]. Leviämisen 104-R1 ja 104-R2-solujen on androgeenista riippumaton, mutta on tukahdutti fysiologiset pitoisuudet androgeenien [7-9,11-14]. Androgeenien hoito estää c-Myc ja Skp2, näin saa G1 solusyklin pysähtymisen 104-R1 ja 104-R2 soluissa. Meidän LNCaP eturauhassyövän etenemisen malli jäljittelee kliinisissä tilanteissa, joissa AR-positiivisten eturauhasen kasvaimia uusiutua seuraavien androgeenideprivaatio [13,15,16]. PC-3 ja DU-145-solut kuuluvat NCI60 ja olivat AR-negatiivisia syöpäsolujen perustettu ihmisen eturauhasadenokarsinoomaa metastaattinen luu- [17] ja aivoissa [18], tässä järjestyksessä. Meillä on siis käytetty LNCaP etenemisen malli, PC-3, ja DU-145-soluja tässä tutkimuksessa luonnehtimaan ero proteiinin ilmentymisen profiili välillä androgeeniriippuvaisten ja androgeeni-riippumaton eturauhassyöpä solu. Tutkimme profiilia 33 eri proteiineja, jotka liittyvät solukierron säätelyssä, solun selviytymisen, Akt signalointi, ja epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) signalointi 104-S, 104-R1, 104-R2, PC-3, ja DU-145 solut. Vertasimme myös erilainen herkkyys näiden eturauhasen syöpäsolujen hoitoon useita kemoterapiaa huumeiden ja pienmolekyylisalpaajien mitkä huumeiden tai inhibiittori on tehokas ehkäisemään leviämisen edenneen eturauhassyövän soluissa. Meidän havainnot viittaavat siihen, että Akt, EGFR, Src, Bcl-2, ja AR signalointireitteihin ovat mahdollisia terapeuttisia kohteita AR-positiivisten kastraation kestävä eturauhasen syöpiä.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

LNCaP eturauhasen syöpäsolun alilinjat (104-S, 104-R1, ja 104-R2-solut) ja PC-3 olivat lahjoja Dr. Shutsung Liao (University of Chicago, IL, USA). LNCaP 104-S, 104-R1, ja 104-R2 soluja tuotetaan LNCaP FGC klooni (ATCC CRL-1740). Nämä LNCaP alalinjoja ja PC-3-soluja on kuvattu edellisissä julkaisuissa [7-12,14,19-24]. DU-145-solut hankittiin Bioresource Collection ja Research Center (Hsinchu kaupunki, Taiwan). Nämä solulinjat siirrostettiin ja ylläpidetään kuten aiemmin on kuvattu [7-12,14,19-24]. R1881 (17β-hydroksi-17α-methylestra-4,9,11-trien-3-oni) ostettiin Sigma-Aldrich (Sigma, St. Louis, MO, USA).

Chemicals

EGFR estäjä Gefitinibi (IRESSA, ZD-1839) ja Src-estäjällä Saracatinib (AZD0530) ostettiin Selleckchem (Houston, TX, USA). Bcl-2-estäjä ABT 737 (CAS 852808-04-9) ostettiin Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). Muut yhdisteet hankittiin Sigmalta.

proliferaatiomääritystä

Suhteellinen solujen määrä analysoitiin mittaamalla DNA-pitoisuus solulysaateista fluoresoivalla värillä Hoechst 33258 (Sigma), kuten aikaisemmin on kuvattu [10,14 , 19,20,22-25]. Keskiarvo ja keskihajonta edustaa keskimäärin octuplicate (8 kuoppaa) edustavan kokeen.

Virtaussytometrinen analyysi

Solut ympättiin tiheydellä 5 x 10

5-solut 10 cm: n annoksia 10 ml: ssa väliainetta 24 tuntia. Sen jälkeen kun oli viljelty 96 tuntia, kun läsnä on eri pitoisuuksia androgeenin, solut poistettiin trypsiinillä ja kiinnitetään 70% etanolilla PBS: ssä yli yön -20 ° C: ssa. Kiinnitetyt solut pestiin PBS: llä, käsiteltiin 0,1 mg /ml RNaasi A: PBS: ssä 30 minuutin ajan, ja suspendoitiin sitten 50 ug /ml propidiumjodidia PBS: ssä. Solusyklin profiilit ja jakaumat määritettiin virtaussytometrianalyysin solujen käyttäen BD FACScan-virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Solusyklin jakelu analysoitiin käyttämällä ModFit LT ohjelmistoa (Verity Software House, Topsham, ME, USA) kuvatulla [8,9,14,20,22,23,25].

reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio reaktio

RNA eristettiin ja spesifiset mRNA kvantitoitiin edellä kuvatulla [10-12,19,21,26]. Sekvenssit alukkeiden ja koettimien androgeenireseptorin (AR) ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) on kuvattu aiemmin [9,12,26]. Primer ja koetinsekvenssit käytetään PSA kvantifiointiin kuvannut Gelmini et al [27]. Kaikki transkriptipitoisuuksissa normalisoituivat GAPDH tasolle kussakin näytteessä.

Western-blottaus-analyysi

Solut näytteitä hajotettiin SDS hajotuspuskuria (240 mM Tris-asetaatti, 1% SDS, 1% glyserolia, 5 mM EDTA, pH 8,0, 0,1 mM ditiotreitoli), joka sisälsi proteaasi-inhibiittorit 1 mM 4- (2-aminoetyyli) bentseenisulfonyyli (AEBSF), 0,8 uM aprotiniinia, 40 μMbestatin, 14 uM E-64, 20 uM leupeptiiniä, 15 um pepstatiini A (Sigma -Aldrich, P8340) ja fosfataasiestäjät cantharidin, bromotetramisole ja mikrokystiini- LR (Sigma-Aldrich, P2850). Proteiinit erotettiin 8-12% SDS-PAGE-geeleissä ja ekspressiotasot proteiineja määritettiin Western-blottauksella käyttäen seuraavia vasta-aineita: Akt2, β-aktiinin ja GAPDH olivat Novus (Littleton, CO, USA). Yhteensä Akt, fosfo-Akt: n Ser473: n, fosfo-Akt: n Thr308, phodpho-p42 /44 MAPK Thr202 /Tyr204, EGFR, p-MDM2, p53, Src, fosfo-Src Tyr527, Rb, ja p-Rb Ser807 /811 oli peräisin Cell Signaling (Danvers, MA, USA). Rasvahappo nopaliinisyntaasin (FAS), AR ja c-Myc-vasta-aineita ostettiin Epitomics (Burlingame, CA, USA). Skp2, p21, ja p27-vasta-aineita ostettiin Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). PSA oli peräisin DAKO (Elostrup, Tanska). Bcl-2 oli BD (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Bad, MDM2, Akt1, p42 /44 MAPK, fosfori-EGFR Tyr1173, fosfori-EGFR Tyr1148, fosfori-EGFR Tyr1086, fosfori-EGFR Tyr1069, fosfori-EGFR Tyr1045, ja fosfori-EGFR Tyr 845 oli Milliporesta (Billerica, MA, USA). α-tubuliinin oli Sigmalta. β-aktiini, α-tubuliinin, ja GAPDH käytettiin latauskontrollina. Piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-kani-anti-hiiri-IgG-vasta-aineita olivat Santa Cruz. Signaali piparjuuriperoksidaasilla leimattuja sekundaarisia vasta-aineita havaittiin tehostetulla kemoluminesenssin reaktio (ECL Western blotting havaitseminen kit) (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). GAPDH, α-tubuliinin, ja β-aktiini käytettiin lastaus valvontaa. Intensiteetti bändejä eri proteiinien määrä määritettiin Epson Stylus TX130 käyttäen YK-SCAN-IT geeli 6.1 ohjelmisto.

sekvensointi AR ligandisitoutumisdomeeni LNCaP alilinjat

Yhteensä-RNA eristettiin RNeasy Mini (Qiagen, Venlo, Hilden, Saksa). cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA: sta käyttäen RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Waltham, Massachusetts, USA). Koodaava sekvenssi ligandia sitovan domeenin AR monistettiin KOD-plus kit (TOYOBO, Osaka, Japani), käyttämällä alukeparia 5′-ctgaaactacaggaggaagg-3 ’(eteenpäin) ja 5′-tgcagaggagtagtgcagag-3’ (taaksepäin) . Monistaminen suoritettiin käyttämällä touch-down terminen protokolla: 8 sykliä, joissa 94 ° C 15 s, 55-47 ° C: ssa 30 s (laski hehkutus lämpötila 1 ° C per sykli), 68 ° C 1 min, minkä jälkeen 35 sykliä 94 ° C 15 s, 47 ° C: ssa 30 s, 68 ° C 1 min, ja viimeinen pidennysvaihe 68 ° C: ssa 3 min. PCR-tuotteet puhdistettiin geelissä (FAVORGEN, Ping-Tung, Taiwan) ja suora sekvensointi DNA Sequencer. Sekvensointi tiedot on talletettu GenBank (esittämiselle ID: 1664456; BankIt1664456 Seq1 KF720403; BankIt1664456 Seq2 KF720404; BankIt1664456 Seq3 KF720405).

Data Analysis

Data esitetään keskiarvo +/- SD vähintään kolmen kokeen tai ne edustavat kokeita toistettiin ainakin kolme kertaa. Studentin t-testi (two-tailed, parittomia) käytettiin arvioimaan tilastollinen merkitsevyys tulokset runsaudenmäärityksessä kokeissa. Excel-apuohjelma ED50V10 käytettiin laskettaessa puoleen maksimaalisesta estävä pitoisuus (IC

50).

Tulokset

androgeeni vastaus LNCaP alilinjat

Suurin ero välillä LNCaP 104-R1 tai 104-R2 solujen niiden vanhempien 104-S-soluissa on vaste androgen hoitoon. Hoitoon LNCaP 104-S solujen fysiologinen pitoisuus androgeenireseptorin (0,1, 1, 10 nM R1881) [28] stimuloi solujen lisääntymistä. Kuitenkin androgeenin hoito tukahdutti leviämisen 104-R1 ja 104-R2-solujen (kuvio 1A). Ilman androgen, kasvuvauhti 104-R1 ja 104-R2-soluissa oli 1,8-2,3 taittuu korkeampi kuin 104-S-solut (kuvio 1A). Androgeenien hoito (0,1, 10 nM R1881) kasvatti solupopulaation S-vaiheessa ja vähensi solupopulaation G1 vaiheeseen 104-S-soluissa. Kuitenkin androgeenireseptorin vähentynyt solupopulaatio S-vaiheessa ja aiheuttanut G1 solukierron pysähtymisen sekä 104-R1 ja 104-R2-solut (kuvio 1 B). IC

50 R1881 laskettuna tukahduttaa 104-R1 ja 104-R2-soluissa oli 14,9 ja 13,2 nM, vastaavasti. PC-3 ja DU-145-solut eivät ilmaise AR ja eivät reagoi androgen hoitoon, emme näin ei sisältynyt PC-3 ja DU-145-solut näissä kokeissa.

leviämisen LNCaP 104-S, 104-R1, ja 104-R2 kasvavien solujen 10% CS-FBS DMEM 0, 0,1, 1 tai 10 nM synteettisiä androgen R1881 96 tunnin ajan määritettiin 96-kuoppaisilla leviämisen mittaus kokonais-DNA: kuoppaa kohti käyttämällä Hoechst 33258 fluoresenssin . Suhteellinen solujen määrä normalisoitiin kuin 104-S-soluissa ilman R1881 hoitoa. Triple tähdellä (***) edustaa solujen määrä on tilastollisesti merkitsevästi erilainen (P 0,001) verrattuna samaa solutyyppiä ilman R1881 hoitoa. Pylväät edustavat keskiarvoa 24 rinnakkaista; palkit kuvaavat keskihajontaa. (B) Cell cycle jakelu LNCaP 104-S, 104-R1, ja 104-R2-soluja käsiteltiin 0, 0,1, ja 10 nM R1881: ssa 96 tuntia, määritettiin virtaussytometrialla. Tähdellä (*), kaksinkertainen tähdellä (**), ja kolminkertainen tähtiä (***) osoittavat tilastollisesti merkitsevä ero

P

0,05,

P

0,01, ja

P

0,001, vastaavasti, verrattuna samaa solutyyppiä ilman R1881 hoitoa.

ilmentäminen AR ja PSA-mRNA LNCaP alilinjat

Kuten edellisessä havaintojen [7-9,14], 104-R1 ja 104-R2-solut ilmentävät korkeampia AR mRNA kuin 104-S-soluissa, kun androgeeni on poissa (kuvio 2A). Lisäksi havaitsimme, että 0,1 nM R1881 lisääntyneen ilmentymisen AR-mRNA: n kaikkien 104-S, 104-R1, ja 104-R2-soluissa, kun taas 10 nM R1881 kasvoi ainoastaan ​​AR-mRNA: n 104-S ja 104-R1-solut (kuvio 2A ). Transkriptionaalista aktiivisuutta AR 104-S, 104-R1, ja 104-R2-soluissa verrattiin tarkastelemalla androgeeni induktion mRNA: n ilmentymisen AR kohdegeenin prostataspesifisen antigeenin (PSA). PSA-mRNA: n tasot nousivat kanssa R1881 hoidon annosriippuvaisesti, mutta oli paljon suurempi 104-R1 ja 104-R2-soluja kuin 104-S-soluissa (kuvio 2B). Hoitoon 104-S-soluissa 0,1 nM R1881 aiheutti 2,3-kertainen PSA mRNA. Kuitenkin R1881 0.1 nM aiheutti noin 6,3 ja 9,0-kertainen PSA mRNA 104-R1 ja 104-R2-soluissa, vastaavasti. Käsittely 10 nM R1881 aiheutti 6,8-kertainen PSA-mRNA: n 104-S-soluissa, mutta aiheutti noin 22,1 ja 32,0-kertainen PSA-mRNA: n 104-R1 ja 104-R2-soluissa, vastaavasti (kuvio 2B). Kun R1881 oli poissa, PSA mRNA taso oli suurempi 104-R1 ja 104-R2 soluja kuin, että 104-S-soluissa. PC-3 ja DU-145-solut eivät ilmaise AR ja eivät reagoi androgen hoitoon, emme näin ei sisältynyt PC-3 ja DU-145-solut näissä kokeissa.

Expression of AR (A) ja PSA (B) mRNA: n havaittiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n 104-S, 104-R1, ja 104-R2-soluja käsiteltiin 0, 0,1, ja 10 nM R1881 96 tunnin ajan. Tähdellä (*), kaksinkertainen tähdellä (**), ja kolminkertainen tähtiä (***) osoittavat tilastollisesti merkitsevä ero

P

0,05,

P

0,01, ja

P

0,001, vastaavasti, verrattuna samaa solutyyppiä ilman R1881 hoitoa. Numero merkki (#) ja (###) ilmaisevat tilastollisesti merkitsevä ero

P

0,05 ja

P

0,001, vastaavasti, 104-R1 tai 104-R2-soluja verrattuna 104-S-soluissa ilman R1881.

AR ligandisitoutumisdomeeni LNCaP alilinjat

LNCaP-solut ilmentävät mutantti AR (T877A), joka näyttää rento ligandia sitova spesifisyys [29,30]. Koska 104-R1 ja 104-R2-solut osoittivat suurempi androgeeni vastaus (kuvio 2B), päätimme jos on muita mutaatioita 104-R1 ja 104-R2 soluissa kuin T877A. Sekvensointi cDNA LNCaP 104-S, 104-R1, ja 104-R2-soluissa (kuvio 3A, 3B), ehdotti, että kaikki kolme LNCaP alalinjoja sisältävät mutaation T877A on AR. Ei ollut muita mutaatio 104-R1 ja 104-R2 soluissa verrattuna niiden vanhempien 104-S-soluissa. Suurempi androgeeni vaste voi johtua suurempi AR ekspressiotaso 104-R1 ja 104-R2-solut (kuvio 2B).

järjestys LBD AR 104-S, 104-R1, ja 104-R2 soluiksi eteenpäin aluketta (A) ja reverse-alukkeen (B) näytettiin. Punainen nuoli osoitti pistemutaatio T877A on LBD AR LNCaP.

profilointi solukierron säätelyssä proteiinien LNCaP alilinjat, PC-3, ja DU-145-solut

Protein ilmentymistaso AR on suurempi LNCaP 104-R1 ja 104-R2 verrattuna LNCaP 104-S-soluissa ilman androgen. Hoito sekä 0,1 ja 10 nM synteettistä androgeenireseptorin R1881 hieman lisääntynyt AR proteiineja kaikissa LNCaP alilinjat (kuva 4). DU-145 ja PC-3-solut eivät ilmennä AR (kuva 4). Kaikki kolme LNCaP alilinjat muttei DU-145 ja PC-3-solut ilmentävät PSA proteiineja. Androgeenien indusoi tuotantoa PSA-proteiinia. PSA-proteiinin taso oli paljon suurempi 104-R1 ja 104-R2 soluja verrattuna 104-S-soluissa, kun sitä käsiteltiin 10 nM R1881. Käsitellään 0,1 nM R1881 vain indusoi PSA ilmentyminen 104-R1 ja 104-R2-soluissa, mutta ei 104-S-soluissa. Induktio kertainen PSA-proteiinin androgeenien hoito oli samanlainen induktion kertaiseksi PSA-mRNA: n (kuvio 2B, kuvio 4).

Proteiinin ilmentymistä AR, PSA, c-Myc, Skp2, p21

CIP1, p27

Kip1, Bcl-2, Bad, p53, MDM2, fosfori-MDM2 Ser166, Rb, fosforia Rb Ser807 /811, GAPDH, α-tubuliinin, ja β-aktiini LNCaP 104-S, 104-R1, ja 104-R2 soluja käsiteltiin 0, 0,1 tai 10 nM R1881 96 tunnin ajan analysoitiin Western-blottauksella. GAPDH, α-tubuliinin, ja β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Kokeet toistettiin kolme kertaa. Nämä proteiinit tutkittiin myös PC-3 ja DU-145-solujen puuttuessa androgen. Numerot ovat määrällisesti bändejä yksittäisten proteiinin kvantifioidaan ImageJ ja YK-SCAN-IT geeli 6.1 ohjelmisto.

Kun androgeeni on poissa, 104-R1 ja 104-R2 solut ilmensivät korkeampia tasoja c-Myc , Skp2, BCL-2, P53, fosfori-MDM2 Ser166, Rb, ja fosfori-Rb Ser807 /811 mutta vähemmän p27

Kip proteiineja verrattuna 104-S-soluissa. Androgeenin hoito lisäsi proteiinin ilmentymistä Skp2, c-Myc, Rb, ja fosfo-Rb Ser 807/811, ja P53 104-S-soluissa mutta väheni ilmentymistä näiden proteiinien 104-R1 ja 104-R2-soluja. Expression of P27

Kip väheni androgen 104-S-soluissa mutta aiheutettiin 104-R1 ja 104-R2 soluissa. Androgeenien hoito laski P21

Cip runsaus kaikissa LNCaP alilinjat. BCL-2-proteiinin ilmentymistä 104-R1 ja 104-R2-soluissa oli korkea, mutta BCL-2-proteiinia oli tuskin havaittavissa 104-S-soluissa. Androgeenien hoito laski BCL-2 in 104-R1 ja 104-R2 soluissa. MDM2 in 104-S-solujen kasvoi hieman androgeenien, mutta eivät vaikuttaneet androgen 104-R1 ja 104-R2 soluissa. BAD -proteiiniekspressio ei vaikuta androgeenien käsittely 104-R1 ja 104-R2 LNCaP alalinjoja (kuva 4). 0,1 nM R1881 hieman vähentynyt HUONO proteiinin 104-S-soluissa. DU-145 ja PC-3-solut ilmaistu korkeampi c-Myc ja Skp2 mutta pienempi p27

Kip verrattuna 104-S-soluissa, kun androgen oli poissa. Verrattuna 104-S-soluissa, DU-145 solut ilmensivät korkeampia p53 ja alemman BAD proteiinia. PC-3-solut ilmaistu korkeampi BCI-2, fosfo-MDM2 S166, Rb, ja fosfori-Rb S807 /811 mutta pienempi BAD, P53, ja MDM2 verrattuna 104-S-soluissa.

profilointi Akt ja EGFR signalointi proteiineja LNCaP alilinjat, PC-3, ja DU-145-solut

Akt ja epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) signalointi on merkittäviä rooleja säätelevät leviämisen ja etenemisen eturauhassyöpä. Verrattuna 104-S-solut, 104-R1 ja 104-R2 solut ilmensivät korkeampia proteiinin tasoja Akt2 ja fosforylaation tyrosiinien on EGFR (Tyr 1173, Tyr 1148, Tyr 1069, Tyr 1045, ja Tyr 845), mutta ilmaistuna pienempi proteiinin tasot Akt, Akt1, fosfo-EGFR-Tyr 1086, fosfo-Akt: n Thr308, fosfo-p42 /44 MAPK Thr202 /Tyr 204, Src, fosfo-Src Tyr527, ja EGFR (kuvio 5). Androgeenien hoito lisäsi proteiinin ilmentymistä Akt2 kaikissa kolmessa alilinjat sekä fosfo-EGFR Tyr 1148, Tyr 1069, Tyr 1045, ja Tyr 845 104-S-soluissa. Androgeenien laski fosfo-Akt Ser473, fosfo-Akt Thr308, ja fosfori-p42 /44 MAPK Thr202 /Tyr 204 104-S soluissa, mutta ei 104-R1 ja 104-R2 soluissa. Androgeenien lisääntynyt hieman fosforylaatioon Akt (Thr308 ja Ser473) in 104-R1 ja 104-R2 soluissa. Proteiinin ilmentyminen koko Akt, Akt1, p42 /44 MAPK, ja EGFR ei vaikuttanut androgen hoitoon. Verrattuna 104-S-soluissa, DU-145 ja PC-3-solut ilmaisivat suurempi Akt ja Akt1- ja samantasoinen p42 /44 MAPK. Kuitenkin proteiinin taso fosfo-Akt T308 ja S473 sekä fosfo-p42 /44 MAPK oli hyvin alhainen DU-145 ja PC-3-solut. Vaikka PC-3-solut ilmaisivat vähemmän Src-proteiinia, fosfori-Src Tyr527 oli suhteellisen korkea PC-3-solujen verrattuna 104-S-soluissa. Proteiini taso fosfo-EGFR Tyr1045 ja Tyr845 oli suurempi DU-145 ja PC-3 verrattuna 104-S-soluissa.

proteiinin ilmentymistä koko Akt, Akt1, Akt2, fosfo-Akt Ser473, fosforia Akt Thr308, p42 /44 MAPK, fosfori-p42 /44 MAPK Thr202 /Tyr204, EGFR, ja eri fosforylaatiokohdan tyrosiinin (Tyr1173, Tyr1148, Tyr1086, Tyr1069, Tyr1045, ja Tyr845) LNCaP 104-S, 104-R1, ja 104-R2 soluja käsiteltiin 0, 0,1 tai 10 nM R1881 96 tunnin ajan analysoitiin Western-blottauksella. Sama GAPDH, α-tubuliinin, ja β-aktiini, kuten on esitetty kuviossa 3 käytettiin loading ohjaus. Nämä proteiinit tutkittiin myös PC-3 ja DU-145-solujen puuttuessa androgen. Kokeet toistettiin kolme kertaa. Numerot ovat määrällisesti bändejä yksittäisten proteiinin kvantifioitiin ImageJ.

Huomasimme mielenkiintoisen havainnon, kun normalisoitu fosfo-proteiinin Akt, EGFR, ja Src niiden kokonaisproteiinipitoisuus runsaus. 104-R1 ja 104-R2-solut ekspressoivat suhteellisen korkea suhde fosfo-Akt /Akt, fosfo-Src /Src, fosfo-EGFR /EGFR, mutta pienempi suhde fosfo-ERK /ERK (taulukko 1). Under kasvaa ehto (0,1 nM R1881 varten 104-S; 0 nM R1881 varten 104-R1 ja 104-R2-solut), suhde fosfo-Akt /Akt, fosfori-Src /Src, ja fosfori-EGFR /EGFR 104-R1 ja 104-R2-soluissa oli 1,6-2-kertainen, 2,2-3,9, ja 1,7-10 kertaa suurempi. Suhde p-Akt /Akt ei vaikuttanut kovin paljon androgeenien kaikissa kolmessa LNCaP alilinjat. Androgeenien vähentynyt suhde p-Src /Src 104-R1 ja 104-R2-soluissa, mutta ei 104-S-soluissa. Androgeenien lisääntynyt hieman suhde p-EGFR /EGFR 104-S-soluissa. Androgeenien vähentynyt suhde p-EGFR /EGFR Tyr1148, Tyr1069 ja Tyr 1045 104-R1 ja Tyr1069 ja Tyr845 104-R2 soluissa. Androgeenien lisääntynyt suhde fosfo-EGFR Tyr1173 /EGFR ja fosfo-EGFR Tyr1045 /EGFR 104-R2 soluissa. Verrattuna 104-S, DU-145 ja PC-3-solut ilmaisivat hyvin alhainen fosfo-Akt /Akt ja fosfo-ERK /ERK-suhde mutta suurempi fosfo-EGFR Tyr1045 /EGFR ja fosfo-EGFR Tyr845 /EGFR-suhde. PC-3-solut myös ilmaista suhteellisen pieni fosfo-EGFR /EGFR of Tyr1173, Tyr1148, Tyr1086, Tyr 1069 mutta hyvin korkea suhde fosfo-Src /Src verrattuna 104-S-soluissa.

LNCaP 104-S

LNCaP 104-R1

LNCaP104-R2

DU-145

PC-3

R1881 (nM)

0

0.1

10

0

0.1

10

0

0.1

10

0

0

AktS47310.70.71.41.51.21.11.21.30.00.1T30810.80.70.91.10.90.60.71.00.00.0SrcY52710.91.13.52.32.32.02.01.31.05.0EGFRY117311.41.92.72.53.014.025.025.01.30.6Y114811.71.96.04.04.516.016.014.01.10.5Y108611.01.01.01.01.03.03.02.00.90.5Y106911.41.38.35.05.019.014.010.00.70.5Y104513.52.99.79.07.326.030.033.04.62.0Y84511.51.44.74.04.517.013.09.02.31.8ERK1/2T202/Y20410.70.50.50.50.60.30.10.10.40.0Table 1. suhde fosfo-Akt /Akt, fosfori-Src /Src, fosfori-EGFR /EGFR, ja fosfori-ERK /ERK varten LNCaP 104-S, 104-R1, 104-R2, PC-3, ja DU-145 soluja.

kvantifiointi proteiinin kuviossa 4 ja kuviossa 5 on käytetty laskettaessa suhteen. Taulukon 2 osoittavat suhde fosfo-proteiinin yli kokonaisproteiinipitoisuus runsautta. CSV Lataa CSV

Pattern proteiinin ilmentymisen profiilin kolmessa LNCaP alilinjat, DU-145, ja PC-3

Profile proteiinin muutoksista alle hoitoon 0, 0,1, ja 10 nM R1881 104-S, 104-R1, ja 104-R2 solujen yhteenveto lämpöä kartta kuviossa 6. on mielenkiintoista huomata, että kuvio-proteiinin ekspression 104-S-soluissa, joita käsiteltiin 10 nM R1881 oli samanlainen kuin 104-R1 ja 104-R2 soluja käsiteltiin androgeenireseptorin (0,1 ja 10 nM R1881). Kuvio proteiinin ekspression 104-S-soluja ilman androgen hoito oli hyvin erilainen kuin kaikki muut näytteet testataan (kuvio 6).

Proteiinin ekspressiota profiilia LNCaP 104-S, 104-R1, ja 104-R2 soluja käsiteltiin 0, 0,1 tai 10 nM R1881 96 tuntia sekä DU-145 ja PC-3-solujen puuttuessa androgen analysoitiin kuviossa 3 ja kuviossa 4 yhdistettiin ja tuotettu kahteen lämpö kartta kaavioita käyttäen Cluster 3.0 TreeView (https://genome-www.standford.edu). Punainen ja vihreä väri edustaa lisätä ja vähentää proteiinin runsauden, vastaavasti. Kirkkaampia väri osoittaa suurempaa muutosta proteiinin runsautta.

herkkyys LNCaP alilinjat, DU-145, ja PC-3-solut kemoterapiaa huumeita

vieressä määräytyy kasvureaktio LNCaP 104-S, 104-R1, 104- R2, DU-145, ja PC-3-solujen neljä yleisesti käytetty kemoterapiaa huumeita eturauhasen syöpiä. IC

50 Paklitakselin kaikkien kolmen LNCaP alalinjoja oli samanlainen (kuvio 7 ja kuvio 8). Herkkyys 104-R1 ja 104-R2 solujen etoposidi, mitoksantroni, ja vinblastiinin, oli samanlainen. 104-R1 ja 104-R2-solut olivat resistenttejä hoitoon etoposidi, mitoksantroni, ja vinblastiinin verrattuna 104-S-soluissa (taulukko 2). DU-145 ja PC-3-solut olivat resistenttejä kaikki neljä kemoterapiaa huumeiden verrattuna 104-S-soluissa.

LNCaP 104-S, 104-R1, 104-R2, PC-3, ja DU-145-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla etoposidi (A) tai paklitakselia (B) 72 tuntia. Suhteellinen solujen lukumäärä LNCaP-solujen määritettiin 33258-pohjainen 96-kuoppaisilla lisääntymisen määrityksessä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Solujen lukumäärät normalisoitiin valvoa (dimetyylisulfoksidi) kunkin solulinjan. Triple tähdellä (***) edustavat tilastollisesti merkitsevää eroa

p

0,001 välillä käsitellyn ryhmän ja kontrolli (ei käsittelyä) ryhmässä.

LNCaP 104-S, 104- R1, 104-R2, PC-3, ja DU-145-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla mitoksantronin (A) tai vinblastiinin (B) 72 tuntia. Suhteellinen solujen lukumäärä LNCaP-solujen määritettiin 33258-pohjainen 96-kuoppaisilla lisääntymisen määrityksessä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Solujen lukumäärät normalisoitiin valvoa (dimetyylisulfoksidi) kunkin solulinjan. Triple tähdellä (***) edustavat tilastollisesti merkitsevää eroa

p

0,001 välillä käsitellyn ryhmän ja kontrolliryhmän.

LNCaP 104-S

LNCaP 104-R1

LNCaP 104-R2

PC-3

DU-145

etoposide12.352.002.492.76paclitaxel11.181.072.923.43mitoxantrone13.523.383.382.28vinblastine11.321.453.231.83AG147811.841.410.501.69Gefitinib11.090.991.791.32LY29400211.491.332.953.73Saracatinib11.110.901.870.77BCl-2 inhibitor11.151.030.571.12Table 2. suhde IC

50 LNCaP 104-R1, 104-R2, PC-3, ja DU-145-soluissa verrattuna 104-S-soluissa.

IC

50 maasta Kuviot 7-10 käytettiin laskemiseen suhteen. IC

50 104-S soluissa kaikkien eri estäjien asetettiin 1 vertailua. CSV Lataa CSV

herkkyys LNCaP alilinjat, DU-145, ja PC-3 solujen estäjät ja Bcl-2-estäjä

Verrattuna LNCaP 104-S-solut, 104-R1 ja 104-R2-solujen olivat resistenttejä hoitoon PI3K-inhibiittori LY294002 ja EGFR-inhibiittorin AG1478 (kuvio 9, kuvio 10, taulukko 2). Herkkyys 104-R1 ja 104-R2 solujen EGFR-inhibiittoria Gefitinibi ja Bcl-2-estäjän ABT 737 on samanlainen kuin 104-S-soluissa. 104-R2 solut olivat hieman herkempiä hoito Src-estäjällä Saracatinib. Verrattuna 104-S-soluissa, PC-3 ja Du-145-solut olivat resistenttejä useimmille huumeiden testataan. Kuitenkin PC-3-solut olivat herkempiä hoitoon AG1478 tai ABT 737, kun DU-145-soluja herkempiä Saracatinib.

LNCaP 104-S, 104-R1, 104-R2, PC-3, ja DU-145-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla AG1478 (A) tai Gefitinibin (B) 72 tuntia. Suhteellinen solujen lukumäärä LNCaP-solujen määritettiin 33258-pohjainen 96-kuoppaisilla lisääntymisen määrityksessä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Solujen lukumäärät normalisoitiin valvoa (dimetyylisulfoksidi) kunkin solulinjan. Triple tähdellä (***) edustavat tilastollisesti merkitsevää eroa

p

0,001 välillä käsitellyn ryhmän ja kontrolliryhmän.

LNCaP 104-S, 104-R1, 104-R2, PC-3, ja DU-145-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla LY294002 (A), Saracatinib (B), tai ABT 737 (C) 72 tunnin ajan. Suhteellinen solujen lukumäärä LNCaP-solujen määritettiin 33258-pohjainen 96-kuoppaisilla lisääntymisen määrityksessä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Solujen lukumäärät normalisoitiin valvoa (dimetyylisulfoksidi) kunkin solulinjan.