PLoS ONE: p21-Activated kinaasien 1, 2 ja 4 Kohdun limakalvon Syöpä: Vaikutukset Kliiniset tulokset ja Cell Proliferation
tiivistelmä
p21-aktivoitua kinaasien (Paksin) ovat seriini /treoniiniproteiinikinaasit osallisena biologisten tapahtumien liittyy pahanlaatuinen kasvain etenemiseen. Tässä tutkimuksessa ilmaus PAK1, p-PAK2 Ser
20, PAK4, pPak4 Ser
474 21 normaalilla endometriumin 16 hyperplastisessa kohdun limakalvon ilman atypia, 17 epätyypillinen monimutkainen liikakasvun ja 67 kohdun limakalvon syöpiä arvioitiin immunohistokemiallisesti ja korreloivat kanssa kliinis parametreja. Olemme myös pääsee proliferatiivinen rooli ja loppupään tavoitteet PAK1 endometriumin syöpä. PAK1 ilmentyi sytoplasmassa taas PAK4 ja p-PAK4 ilmaistiin sekä sytoplasmassa ja tumassa kohdun limakalvon kudoksissa. Normaalissa kohdun limakalvo, huomattavasti korkeampi PAK1 (
P
= 0,028) ja sytoplasminen p-PAK2 (
P
= 0,048) ekspressiota havaittiin proliferatiivinen endometrium kuin sekretorisen kohdun limakalvoon. PAK1, soluliman ja ydin- PAK4 ja ydinvoiman p-PAK4 oli merkittävästi yli-ilmentyy kohdun limakalvon syöpään verrattuna atrofisen kohdun limakalvo (kaikki
P
0,05). Lisäksi tyypin I endomet- karsinoomat osoittivat merkittävästi korkeampia PAK1 ilmaisu kuin tyypin II ei-endomet- karsinoomien (
P
0,001). Toisaalta, PAK1, PAK4 ja p-PAK4 ilmaisu korreloi negatiivisesti histologinen arvosana (kaikki
P
0,05), kun taas p-PAK2 ja sytoplasmista PAK4 ilmaisun korreloi käänteisesti myometrisia invaasio (kaikki
P
0,05). Lisäksi potilailla, joilla on kohdun limakalvon syöpiä pienemmillä sytoplasmisen PAK4 ilme näytti huonompi selviytyminen (
P
= 0,026). Monimuuttuja-analyysi osoitti soluliman PAK4 on itsenäinen ennustetekijä. Toiminnallisesti knockdovvn PAK1, mutta ei PAK4, endometriumin syövän solulinjassa vähentänyt solujen lisääntymistä sekä pienentää sykliini D1, estrogeenireseptorin (ERa) ja progestiinia reseptori (PR) lauseke. Merkittävä korrelaatio PAK1 ja PR havaittiin ilmentyvän myös kliinisistä näytteistä. Tulosten perusteella näyttää, että PAK1 ja sytoplasminen p-PAK2 saattaa edistää soluproliferaatiota normaalissa endometrium aikana menstral aikana. PAK1, soluliman ja ydin- PAK4 ja ydinvoiman p-PAK4 osallistuvat synnyssä kohdun limakalvon syövän erityisesti vaihdevuodet ohittaneilla naisilla. PAK1 edistää kohdun limakalvon syöpä soluproliferaatiota, erityisesti tyypin I endomet- syöpä. Sytoplasmisen PAK4 voi olla potentiaalinen ennustetekijöiden markkeri endometriumsyöpään.
Citation: Siu MKY, Kong DSH, Ngai SYP, Chan HY, Jiang L, Wong ESY, et al. (2015) p21-Activated kinaasien 1, 2 ja 4 Kohdun limakalvon Syöpä: Vaikutukset Kliiniset tulokset ja Cell Proliferation. PLoS ONE 10 (7): e0133467. doi: 10,1371 /journal.pone.0133467
Editor: Steen Henning Hansen, lastensairaala Boston, Yhdysvallat |
vastaanotettu: 03 toukokuu 2014; Hyväksytty: 27 Kesäkuu 2015; Julkaistu: 28 heinäkuu 2015
Copyright: © 2015 Siu ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään
Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.
Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Hongkongin Anti-Cancer Society Grant, University of Hong Kong Pieni projektivarat ja konferenssin ja tutkimusneuvosto Grant.
Kilpailevat edut: Annie NY Cheung on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One Pääkirjoitus politiikan ja kriteerit.
Johdanto
Kohdun limakalvon syöpä on yleisin gynekologinen maligniteetti maailmanlaajuisesti [1] ja sen esiintyvyys Aasiassa on kasvussa. Se voidaan jakaa kahteen suureen kliinis tyyppejä. Estrogeeniriippuvaisen tyypin I endomet- syöpä, käsittää noin 80% kohdun limakalvon syöpiä, liittyy tavallisesti kohdun limakalvon liikakasvu [2, 3]. Tyyppi II ei-endometroid karsinooma, joka on estrogeeni-riippumaton ja sisältää serous karsinooma ja selkeä cell carcinoma, esiintyy yleensä atrofinen endometrium [2, 3]. Tyypin I endomet- karsinooma on suotuisa ennuste kun taas tyypin II kohtukarsinooma on aggressiivisempi [2, 3].
p21-aktivoidun seriini /treoniini kinaasien (Paksin) ovat efektoreita pienille Rho GTPaasit Rac1 ja Cdc42 että pelata tärkeä roolit erilaisissa solun toimintoja, kuten solun morphogenesis, liikkuvuuteen, selviytyminen ankkurista riippumaton kasvu ja angiogeneesi, jotka kaikki ovat edellytys vaiheita kasvaimen muodostumisen ja kasvaimen invaasio [4, 5]. Perustuu eri domeenirakenteet ja biokemialliset ominaisuudet, kuusi jäsentä Pak perheen luokitellaan ryhmä I (Paks1-3) ja ryhmän II (Paks 4-6), joilla on erilaisia ekspressiokuviota, alustan prioriteetti ja toiminnalliset erityispiirteet eri kudoksissa [ ,,,0],5-7].
Olemme hiljattain tunnistettu PAK1 ja PAK4 kuin ennustetekijöitä markkereita ja mahdollisia terapeuttisia kohteita munasarjasyöpä [8, 9]. Lisääntynyt fosforyloidun (p) -Pak2
Ser20 ilmentyminen munasarjasyövän havaittiin myös [9]. PAK1 ja PAK4 edistää munasarjasyövän solujen vaeltamiseen ja invaasion kautta p38 /VEGF-reitin ja c-Src /MEK-1 /MMP2 reitin vastaavasti [8, 9]. PAK4 aiheuttaa myös munasarjasyövän solujen lisääntymistä kautta PAK4 /c-Src /EGFR /sykliini D1 /CDC25A reitin [8]. Olemme myös paljasti yliekspressio PAK1 vuonna choriocarcinoma ja rypäleraskaus myyrät jotka etenivät aggressiivinen tauti [10]. PAK1 säätelevät choriocarcinoma solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion kyky yhdessä muuttunut taso p16, VEGF ja MT1-MMP [10].
Up-säätely PAK1 ja PAK4 on havaittu myös muissa ihmisen syövissä [4 , 5, 11], kuten rinta- ja paksusuolen syöpiä. Tuoreessa tutkimuksessa on raportoitu, että PAK1 on alas-säätelee progesteronin aikana eritysvaiheessa normaalissa endometrium [12]. Kuitenkin ero ilmentyminen Paksin in kohtukarsinooma on rajallinen. Tässä ilmaisu ja lokalisointi PAK1, fosforyloidun (p) -Pak2
Ser20, PAK4 ja p-PAK4
Ser474 (aktivoitua lomake) normaalissa, hyperplastisiin ja syöpä- kohdun limakalvo arvioitiin ja korreloi kliinispatologiset parametreja. Proliferatiivinen rooli ja alavirtaan tavoitteet PAK1 endometriumin syövän tutkittiin tarkemmin.
Materiaalit ja menetelmät
Kliiniset näytteet
Kuusikymmentä seitsemän formaliinilla, parafiiniin upotettuja näytteitä kohdun limakalvon syöpien mukaan lukien 56 endomet- karsinoomat, 7 serous karsinoomat ja 4 selkeitä solukarsinoomat haettiin Patologian osasto, University of Hong Kong, Queen Mary sairaalassa immunohistokemiaa. Kliiniset ja patologiset muuttujat, kuten estrogeenireseptori alfa (ERa) ja progesteroni reseptorin (PR) status [13] arvioitiin immunohistokemiallisesti noudettiin. Kaksikymmentäyksi näytteet normaalin kohdun limakalvon (mukaan lukien 10 atrofinen, 5 eritys- ja 6 proliferatiivinen kohdun limakalvon), 16 näytettä hyperplastisten kohdun limakalvon ilman atypia (mukaan lukien 7 yksinkertainen liikakasvu ja 9 monimutkaisia liikakasvu) ja 17 näytettä epätyypilliset monimutkaisten liikakasvun myös noutaa. Niistä 17 epätyypillinen monimutkainen liikakasvu, 8 tapausta olivat puhtaita epätyypillinen hyperplasia taas 9 tapausta myöhemmin kehitetty kohdun limakalvon syöpiä (epätyypillinen hyperplasia kohdun limakalvon syövät). Keski-ikä näistä potilaista oli 57,2 vuotta (vaihteluväli 20-82 vuotta). Keskimääräinen seuranta-aika oli 42,75 kuukautta (vaihteluväli 1-108 kuukautta). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilla potilailla. Tutkimus hyväksyi Institutional eettinen Review Board of University of Hong Kong /Hospital Authority Hong Kong West Cluster (HKU /HA HKW IRB). Hema- eosiinileikkeissä tutkittiin patologit tarkistaa diagnoosi ja varmistaa, että jokainen näyte koostuu yli 75% kasvainsoluja.
Solulinjat
Ihmisen normaali kohdun limakalvon solulinja (NEM) , pidennetty primaariviljelmää normaalien kohdun limakalvon soluja ~ 40-vuotiaan premenopausaalista nainen säännöllisesti 28 päivän kiimakiertojen oli ystävällisesti antanut professori Doris Benbrook (University of Oklahoma Health Sciences keskus) [14]. Kolme ihmisen kohdun limakalvon syöpä solulinjoja, HEC-1B, HEC-1A ja RL95-2 olivat ATCC: ltä (Manassas, VA). Kaikki kulttuuri viljeltiin kuten aiemmin kuvattu [15].
ohimenevä knockdovvn PAK1 ja PAK4 vuonna RL95-2
transfektoitiin 100 nM kutakin si
genomin
Smart -Pool varten PAK1, PAK4 ja si
Ohjaus
nontargeting siRNA allas (Dharmacon, Lafayette, CO), käyttäen SilentFect (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti 48 tuntia ennen RNA: n ja proteiinin uuttamalla, solujen laskenta ja solujen pinnoitus [10].
immunohistokemia
Lyhyesti, formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut leikkeet värjättiin vasta-aineita PAK1, p-pAK2
Ser20, PAK4 ja p- PAK4 Ser
474 (jotka on lueteltu S1 taulukossa) käyttäen EnVision + Dual Link System (K4061, Dako, Carpinteria, CA) [8-10]. Mikroaaltouuni antigeeni talteenotto suoritettiin käyttäen sitraatti- puskuria (pH 6,0). Jättäminen tai korvaaminen primaarisen vasta-aineen kanssa, esi-IgG seerumia käytettiin negatiivisena kontrollina. Voimakkuutta ja prosenttiosuus värjättiin epiteelisolujen arvioitiin. Immunoreaktiivisuus arvioitiin semikvantitatiivisesti jonka intensiteetti ja prosenttiosuus epiteelin värjätään. Värjäys intensiteetti pisteytettiin 0 (negatiivinen), 1 (heikko), 2 (lievä), 3 (kohtalainen) ja 4 (voimakas). Niiden positiivisten solujen arvioitiin 0 (alle 5%), 1 (5% -25%), 2 (26% -50%), 3 (51% -75%) ja 4 ( 75%) . Komposiitti ”Histoscore” annettiin kertomalla värjäyksen voimakkuus (0-4), jonka prosenttiosuus värjätään solujen (0-4), jossa maksimipisteet 16 [16].
Reaaliaikainen PCR
Kokonais-RNA uutettiin syöpäsolulinjasta käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen). 2,5 ug kokonais-RNA käänteistranskriboitiin, jonka SuperScript-käänteistranskriptaasia (Invitrogen, San Diego, CA). Reaaliaikainen PCR suoritettiin ABI Prism 7700 järjestyksessä tunnistusjärjestelmä (Applied Biosystems, Foster City, CA) [17, 18]. Alukesekvenssit PAK1, PAK4, CDC25A, sykliini D1, ERa, PR (tavoite sekä PRA ja PRB isoformit) ja GAPDH (sisäisenä kontrollina) esitetään S2 taulukossa. PCR-puhtaus varmistettiin geelielektroforeesilla.
immunoblottauksella
Solut kerättiin lyysipuskurilla (0,125 M Tris, pH 6,8 22 ° C: ssa, joka sisälsi 1% NP-40 (v /v), 2 mM EDTA, 2 mM N-etyylimaleimidiä, 2 mM PMSF, 1 mM natriumortovanadaattia ja 0,1 uM natrium- okadate], ja kirkastettiin sentrifugoimalla 4 ° C: ssa. Proteiinipitoisuus määritettiin DC (pesuaineen kanssa) proteiinin määritys (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). 20 ug proteiinia erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvo, ja hybridisoitiin vastaavien vasta-aineiden (jotka on lueteltu S1 taulukossa) [17, 18].
Solujen proliferaatio oli solujen lukumäärällä määritettynä menetelmällä
3 x 10
4-solut ympättiin 6-kuoppaisille viljelylevyille. solujen lukumäärä laskettiin käyttämällä trypaanisinivärin syrjäytymisen hematosytometrillä päivänä 4 [18].
tilastollinen analyysi
tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS 15.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL). Mann-Whitneyn testiä käytettiin vertailun kahden ryhmän välillä. Kruskal-Wallis rank-testiä sovellettiin vertailun joukossa useita ryhmiä. Survival-analyysi suoritettiin Kaplan-Meier-analyysi ja log-rank-testi.
P
arvojen 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.
tulos
ilmentäminen PAK1 ja sytoplasman p-PAK2 Ser
20 oli suurempi proliferatiivinen kohdun limakalvoon. PAK1, soluliman ja ydin- PAK4 ja ydinvoiman p-PAK4 Ser
474 oli yli-ilmentynyt endometriumsyöpään verrattuna atrofinen endometrium
immunohistokemiallisesti, PAK1 oli ilmentyvät pääasiassa sytoplasmassa kohdun limakalvon kudoksissa vain polttoväli tumavärjäystä havaittu (kuvio 1A). Normaalissa kohdun limakalvon näytteissä, atrofinen ja sekretorisen kohdun limakalvoon osoitti heikkoa ilme taas proliferatiivinen kohdun limakalvo näkyy voimakas ilmaisu (kuvio 1A i-iii). Hyperplastic endometrium ja kohdun limakalvon syöpien osoittivat kohtalaisesta vahva ilmaisu (kuvio 1A iv-ix). PAK1 ilmentyminen proliferatiivinen endometrium oli merkittävästi suurempi kuin atrofisessa (
P
= 0,001) ja sekretorisen (
P
= 0,004) kohdun limakalvon, epätyypillinen hyperplasia (
P
= 0,042 ) ja kohdun limakalvon syöpiä (
P
= 0,044) (kuvio 1 B). Merkittävästi suurempia PAK1 ilmaisun hyperplastic kohdun limakalvon ja kohdun limakalvon syöpiä kuin atrofinen endometrium (molemmat
P
0,05) havaittiin (kuvio 1 B). Vaikka korkeampi PAK1 ekspressio havaittiin hyperplastic kohdun limakalvon ja kohdun limakalvon syöpiä kuin sekretorisen kohdun limakalvon, merkitsevä ero oli ainoastaan päässeet yksinkertainen /monimutkainen liikakasvu ja sekretorisen kohdun limakalvoa (kuvio 1 B). Vastaavia PAK1 ekspressiota havaittiin hyperplastic kohdun limakalvon ja kohdun limakalvon syöpien.
p-pAK2 havaittiin sekä sytoplasmassa ja tumassa kohdun limakalvon kudoksissa (kuvio 2A). Joukossa kaikki luokat, proliferatiivinen endometrium voimakkaimmin soluliman ja ydin- p-PAK2 ilmaisu (kuvio 2A). Atrofinen ja sekretorisen kohdun limakalvoon sekä kohdun limakalvon syöpiä osoitti heikkoa soluliman ja ydin- p-PAK2 ilme taas hyperplastic endometrium esti kohtalaisesti soluliman ja ydin- p-PAK2 ilmaisu (kuvio 2A). Sytoplasmisen p-PAK2 ilmentymisen proliferatiivisen endometrium oli huomattavasti korkeampi kuin kaikkien muiden luokkien (kaikki
P
0,05) paitsi monimutkainen liikakasvun taas ydin- p-PAK2 vain osoittivat merkittävästi korkeampia ilmentymistä proliferatiivinen kohdun limakalvon kuin atrofinen (
P
= 0,046) ja sekretorisen (
P
= 0,028) kohdun limakalvon ja kohdun limakalvon syöpiä (
P
= 0,007) (kuvio 2B). Vaikka korkeammat soluliman ja ydinvoiman p-PAK2 ekspressio havaittiin hyperplastic endometrium kuin atrofinen endometrium, vain monimutkainen liikakasvun (
P
= 0,007) ja puhdas epätyypillinen hyperplasia (
P
= 0,013) osoitti merkittävää korkeampi sytoplasminen p-pAK2 ilmentymistä (kuvio 2B). Lisäksi oli merkittävää pienentää soluliman ja ydin- p-PAK2 ilmentymisen kohdun limakalvon syöpiä kuin monimutkaisissa liikakasvun (
P
= 0,009 ja
P
= 0,006, vastaavasti) ja puhdas epätyypillinen hyperplasia (
P
= 0,038 ja
P
= 0,042, vastaavasti) (kuvio 2B).
PAK4 on ilmaistu sekä sytoplasmassa ja tumassa kohdun limakalvon kudoksissa (kuvio 3) . Soluliman ja ydinvoiman PAK4 osoittivat heikkoa ilmentymistä atrofinen endometrium ja kohtuullisesta voimakkaaseen ilmentymistä eritys- proliferatiivinen, hyperplastic kohdun limakalvo ja kohdun limakalvon syöpiä (kuvio 3). Sytoplasmisen PAK4 ilmentyminen atrofinen endometrium oli merkittävästi pienempi kuin muissa luokissa (kaikki
P
0,05) (kuvio 3B, yläpaneeli). Merkittävästi suurempia sytoplasminen PAK4 ilmentyminen havaittiin myös sekretorisen kohdun limakalvon kuin monimutkainen liikakasvun (
P
= 0,047) ja kohdun limakalvon syöpiä (
P
= 0,036) (kuvio 3B, yläpaneeli). Nuclear PAK4 atrofisessa endometrium näytetään myös pienempi ilmaus kuin muissa luokissa. Kuitenkin merkittävä ero ydinvoiman PAK4 ilmaisun vain havaittu kohdun limakalvon syöpiä ja atrofisen kohdun limakalvo (
P
= 0,026) (kuvio 3B, alempi paneeli). Ei ole mitään merkittävää eroa soluliman ja ydinvoiman PAK4 ilmaisun muiden luokkien välillä.
p-PAK4 havaittiin myös sekä sytoplasmassa ja tumassa kohdun limakalvon kudoksissa (kuvio 4A). Sytoplasmisen p-PAK4 osoittivat heikkoa tai kohtalaista ilmaisun kaikkien luokkien (kuvio 4A) ja merkittävä ero havaittiin vain välillä proliferatiivisia kohdun limakalvon ja yksinkertainen liikakasvun (
P
= 0,041) (kuvio 4B, yläpaneeli). Heikko tai kohtalainen ydinaseiden p-PAK4 ilmentymistä havaittiin atrofinen endometrium taas muissa luokissa näkyy voimakas ilmentyminen (kuvio 4A). Havaittu merkittävää eroa välillä atrofisen kohdun limakalvo ja muihin ryhmiin (kaikki
P
0,05) (kuvio 4B, alempi paneeli). Koska tässä tutkimuksessa mukana 6 proliferatiivinen kohdun limakalvon tapauksissa vain, virhe baari ydin- pPak2 ja PAK4 proliferatiivisessa kohdun limakalvo on suhteellisen suuri.
Up-säätely PAK1 ja PAK4 mRNA- ja proteiinin ilmentyminen todettiin myös syöpäsolun linjat (HEC-1B, HEC-1A ja RL95-2) verrattuna normaaliin kohdun limakalvon solujen qPCR (kuvio 5A) ja Western blot-analyysi (kuvio 5B), tässä järjestyksessä.
PAK1, PAK4 ja p-PAK4 ilmaisu korreloi kliinis parametreja. PAK1 ilmentyminen korreloi PR
PAK1 ilmentyminen havaittiin korreloivan merkittävästi histologinen tyyppi, histologinen arvosana (arvosana 1/2 vs. 3) ja potilaiden ikä diagnoosin (kaikki
P
0,05), mutta ei muiden kliinisten parametrien (S3 taulukko). Potilaat, joilla on tyypin I endomet- karsinooma (kuvio 1 C), luokka 1 ja 2 sekä ikä ≤ 57 näytetään korkeampi PAK1 ilmaisun kuin ne, joilla on tyypin II vakavien ja selkeä cell carcinoma, asteen 3 ja ikä 57. Merkittävästi suurempia soluliman ja ydinvoiman p-PAK2 sekä sytoplasman PAK4 ilmentymistä havaittiin pinnallinen myometrisia invasion kuin syvä myometrisia invaasiota (kaikki
P
0,05) (S3 taulukko). Oli merkittävä korrelaatio välillä oli PAK4 ja p-PAK4 lauseke (sekä soluliman ja ydin) ja histologinen luokka (kaikki
P
0,05) (S3 taulukko). Laadukkaampaa kasvaimia osoitti pienempi ilmaus PAK4 ja p-PAK4. Sytoplasmisen PAK4 osoittivat merkitsevästi pienempi ilmentymistä potilailla, joilla myöhäisessä vaiheessa tauti ja syöpiä kohdunkaula (kaikki
P
0,05) (S3 taulukko). Mitään merkittävää korrelaatiota ilmentymisen p-PAK2, PAK4 ja p-PAK4 muiden kliinisten parametrien todettiin.
Kaplan-Meier-selviytymisen analyysit paljastivat, että pienempi ilmentyminen sytoplasman PAK4 (
P
= 0,026), mutta ei PAK1, ydin- ja sytoplasman p-pAK2, ydinvoima PAK4, ydin- ja sytoplasman p-PAK4, johti huonompi selviytymisen kohdun limakalvon syöpäpotilailla (kuviot 1D, 2C, 3C ja 4C). Monimuuttuja-analyysi paljasti, että soluliman PAK4 on itsenäinen ennustetekijä (
P
= 0,037).
knockdovvn PAK1 endometriumin syöpäsoluissa vähensi solujen lisääntymisen ja alassäädetty sykliini D1, ERa ja PR
määrittämiseksi proliferatiivinen roolia PAK1 ja PAK4 endometriumin syöpäsoluissa, ohimenevä knockdovvn PAK1 ja PAK4 in RL95-2 suoritettiin siRNA lähestymistapaa. Vahvistuksen jälkeen erityisiä knockdovvn PAK1 ja PAK4-mRNA: n (kuvio 6A) ja proteiini (kuvio 6B), vaikutus soluproliferaatioon määritettiin solumäärän menetelmällä. PAK1 köyhdytettyä RL95-2 osoitti vähentää merkittävästi proliferaationopeus verrokkiin verrattuna soluihin, jotka oli transfektoitu ohjaus siRNA (kuvio 6C). Kuitenkaan mitään merkittävää eroa leviämisen nopeus jälkeen knockdown PAK4 vuonna RL95-2 havaittiin (kuvio 6C). Lisäksi knockdovvn PAK1 vuonna RL95-2 merkittävästi alassäädetty solukierron liittyvä geeni sykliini D1 ja steroidireseptorit, ERa ja PR, mutta ei ole vaikutusta toisen solusyklin liittyvä geeni CDC25A, arvioituna qPCR (kuvio 6D). Sykliini D1 väheni myös merkittävästi vuonna siPak4 RL95-2 (kuvio 6D).
Bars, keskiarvot ± SD kolmesta kokeesta; **,
P
0,005, Mann-Whitney testi.
Keskustelu
Tuloksemme osoittivat huomattavasti korkeampi PAK1 ja sytoplasminen p-PAK2 ilmentymistä normaalissa proliferatiivinen endometrium kuin sekretorisen kohdun limakalvon, mikä viittaa siihen, PAK1 ja p-pAK2 voi liittyä estrogeenin säännelty proliferatiivinen aktiivisuus kohdun limakalvon aikana menstral aikana. Rintasyövässä säätely PAK1 estrogeenin on raportoitu [19]. Havainnot myös yhtyä edellisen raportin alas-säätely PAK1 mukaan progesteronin normaalissa sekretorisen kohdun limakalvoon [12].
proliferatiivinen rooli PAK1 ja PAK2 on dokumentoitu normaaleissa soluissa. Esimerkiksi fibroblastit, PAK1 fosforyloituu CDC2A on todettu muuttaa postmitoottisia leviää, joka on olennainen askel solusyklin etenemisen ja lisääntymistä [20]. Aikaisemmat tutkimus paljasti myös osallistumista PAK1 vuonna trophoblast leviämisen [10]. Normaaleissa nisäepiteelisoluissa, hyperaktiivinen Rac3 on havaittu parantavan solujen lisääntymisen kautta pAK2 [21]. Fosforylaatio pAK2 Ser
20, sen vastaava fosforylaatio sivusto PAK1 Ser
20, on havaittu moduloivan Nck välisen sitoutumisen sytosoliin ja kalvon, siten säätelevät solujen vaeltamiseen [22, 23]. Edellisessä tutkimuksessa, sytoplasmisen p-pAK2 havaittiin cytotrophoblast, jota voidaan pitää trofoblastiset kantasolujen vastuussa proliferaation [10]. Olemme myös havainneet ydin- p-PAK2 endometriumin kudoksissa, vaikkakin rooleja p-PAK2 nucleus vielä edelleen tutkia. Kuten PAK1 ja PAK4 [8, 24], p-PAK2 nucleus voi olla toiminto geenien transkriptio. Jatkossa tutkimus on kiinnostavaa määrittää, jos estrogeeni voi säädellä PAK1 ja p-PAK2 ilmaisua mikä lisää lisääntymisaktiivisuus kohdun limakalvon aikana menstral aikana.
Löysimme huomattavasti korkeampi PAK1, soluliman ja ydin- PAK4 ja ydinvoiman p- PAK4 ilmentyminen kohdun limakalvon syöpiä kuin atrofinen endometrium. Lisääntynyt ilmentyminen PAK1 ja PAK4 havaittiin myös kohdun limakalvon syövän solulinjoissa. Useimmat toiminnot PAK4 ovat riippuvaisia sen kinaasiaktiivisuuden [8]. Edellisessä tutkimuksessa lisäksi solumigraatiota toteutetaan sytoplasmassa, olemme paljastaneet geenien transkription säätelystä Ydinvoimalla PAK4 munasarjasyövän [8]. Esillä olevat havainnot viittaavat siihen, että PAK1, soluliman ja ydin- PAK4 ja ydinvoiman p-PAK4 voi olla tärkeä rooli patogeneesissä endometriumsyövän erityisesti vaihdevuodet ohittaneilla naisilla ja voi olla hyödyllistä havaitsemiseen kohtukarsinooma pieninä koepala kohdun postmenopausaalisilla naisilla.
osoitti myös vähentynyt proliferaatio endometriumin syöpäsoluissa jälkeen PAK1 knockdown yhdessä alentunut sykliini D1 ilme. Me ja muut ovat dokumentoineet proliferatiivista roolia PAK1 muissa ihmisen syövissä, kuten rintasyövän [25], squamous nonsmall keuhkosyöpä [26] ja choriocarcinoma [10]. Yliekspressio sykliini D1, D-tyypin sykliini säätelevä G1-S-vaiheessa solusyklin etenemistä, on raportoitu kohdun limakalvon syöpä [27, 28]. Edellisessä tutkimuksessa todettiin myös, että PAK1 säätelee prolaktiini välittämä sykliini D1 promoottorin aktiivisuutta rintasyövän [29]. Esillä olevat havainnot viittaavat siihen, että PAK1 voi säädellä solujen lisääntymistä kautta muuttaminen solusyklin etenemisen. Koska sykliini D1 voi olla vaihtoehtoinen tavoite hoidon [30] ja pienimolekyylisiä estäjiä Pak perheen kehitetään [7, 31], yhdistetään kohdistettu hoito voidaan saada aikaan kohdentamalla kohdun limakalvon syöpä. Vaikka olemme paljastaneet lisääntymistä edistävä vaikutus PAK4 on munasarjasyöpä [8] ja havaitaan vähensi sykliini D1 ilmentyminen RL95-2 soluissa jälkeen PAK4 Knockdown tässä tutkimuksessa, ei ole merkittävää vaikutusta PAK4 on kohdun limakalvon syöpä soluproliferaatioon voitiin osoittaa, kun PAK4 oli ohimenevästi vaiennetaan in RL95-2 soluissa esillä olevassa tutkimuksessa. On mahdollista, että vaikutus soluproliferaatioon on määritettävä käyttäen vakaa Knockdown soluja enää itämisaika ennen teet solumäärän menetelmällä. Tällaista mahdollisuutta tulisi harkita tulevaisuudessa tutkimuksessa. Roolit PAK4 endometriumin syövän tarpeen valaistaan edelleen.
osoittivat merkitsevästi korkeampi PAK1 ilmaisun tyypin I endomet- syöpä kuin tyypin II ei-endomet- karsinooma. Tyypin I endomet- karsinooma on estrogeeniriippuvainen kasvain [2, 3]. Vaikka edellinen tutkimus on osoittanut mitään vaikutusta PAK1 ilmaisun jälkeen estrogeenihoito Ishikawa soluissa (hyvin erilaistunut kohdun limakalvon Adenokarsinoomasolulinja) [12], löysimme ERa ja ER kohdegeenin PR, aleni jälkeen knockdovvn PAK1 in RL95-2. Lisäksi positiivinen korrelaatio PAK1 ja PR ilmaisun meidän endometriumsyöpään kliiniset näytteet lisätukea niiden yhteys. Vahva yhdistys välillä ERa ja PR ilmaisun ja tyypin I endomet- karsinooma verrattuna tyypin II ei-endomet- karsinooma [32], kertoo tehokkuutta progestiinia hoidon tyypin I endomet- syöpä. Rintasyöpäsoluissa, PAK1 estäjä esti ER transaktivaatiota toimintoja ja vaimentua ER tavoite tuote PR (sekä PRA ja PRB isoformit) proteiinin ilmentymistä [33]. Lisäksi PAK1 välittämää fosforylaatiota ERa at Ser305 on osoitettu tehostavan transaktivaation ERa johtaa säätely ylöspäin ER-geenien, kuten sykliini D1, mikä puolestaan edistää hormoni riippumatonta kasvua rintasyöpä solujen [33-35]. On mahdollista, että PAK1 on yksi ylävirran välittäjiä ERa ja PR ilmaisun tyypin I endomet- syöpä ja PAK1 voi lisätä kasvua kohdun limakalvon syövän soluihin säätelemällä ERa
Löysimme pienempi ilmentyminen sytoplasman PAK4 liittyi huonompi ennuste endometriumin syöpiä. Aikaisemmat tutkimukset myös meidän löytäneet korkeampi PAK4 ilmaisun edistää huonoon ennusteeseen potilailla munasarjasyövän [8] ja suun squamous-cell carcinoma [36]. Tämä suhteellisen yllättävää yhdistys voi liittyä ainutlaatuinen biologinen ympäristö kohdun limakalvon, joka on syklinen proliferatiivista kudosta herkkiä hormoni sääntelyä. Syy tällaiseen havainto on edelleen tutkittu tulevaisuudessa.
Yhteenvetona PAK1 ja sytoplasminen p-PAK2 voi olla rooleja lisääntymisaktiivisuus kohdun limakalvon aikana menstral aikana. PAK1, soluliman ja ydin- PAK4 ja ydinvoiman p-PAK4 osallistuvat patogeneesiin kohdun limakalvon syövän ja voivat olla mahdollisia terapeuttisia kohteita erityisesti vaihdevuodet ohittaneilla naisilla. PAK1 parantaa kohdun limakalvon syöpä solujen lisääntymistä erityisesti tyypin I endomet- syöpä. Sytoplasmisen PAK4 voi olla potentiaalinen ennustetekijöiden markkeri endometriumsyöpään.
tukeminen Information
S1 Taulukko. Lähteet ja työ laimennoksia käytetyt vasta-aineet tässä tutkimuksessa.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0133467.s001
(DOC)
S2 Taulukko. Käytetyt alukkeet real-time PCR.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0133467.s002
(DOC)
S3 Taulukko. Korrelaatio PAK1, ydin- ja sytoplasman p-PAK2, PAK4 ja p-PAK4 kanssa kliinis parametrit endometriumsyöpään.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0133467.s003
(DOC) B
Kiitokset
Tutkimus tukivat Hongkongin Anti-Cancer Society Grant, University of Hong Kong Pieni projektivarat ja konferenssin ja tutkimusneuvosto Grant.