Krooninen sairaus

tiivistelmä

YM155, joka estää anti-apoptoottisen proteiinin surviviini, tiedetään aiheuttavan kasvaimen vastaisen vaikutuksia erilaisten syöpien, mukaan lukien eturauhas- ja keuhkosyöpä. On kuitenkin olemassa muutamia kuvaavia raportteja estävää vaikutusta YM155 ihmisen haimasyöpä että korkeasti ilmaista surviviini. Tässä testasimme vaikutuksia YM155 erilaisilla syöpäsolulinjoja, mukaan lukien haiman syöpäsoluja. Olemme havainneet, että YM155 kykenee anti-proliferatiivinen vaikutus haiman syöpäsoluissa, joka indusoi solukuolemaa kautta suppression XIAP (X-linked apoptoosi-inhibiittori), sekä surviviinin vaikuttamatta anti-apoptoottisten proteiinien Bcl-xL tai Mcl-1. YM155 esti myös kasvaimen kasvua

in vivo

, koon pienentäminen haimasyövän solulinjan MiaPaca-2 ksenografteissa 77,1% päivänä 31. Western blot-analyysit osoittivat lisäksi, että YM155 vaimentua phosphoinoside 3-kinaasi (PI3K) ilmaisun ja vähensivät fosforyloituu (aktivoitu) ekstrasellulaarinen signaali säädelty kinaasi (ERK) ja STAT3 (signaalinmuuntajana ja aktivaattori transkription 3) in PANC-1-soluissa. Kiinnostavaa kyllä, Huomasimme myös, että YM155 vaimentua epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) erilaisissa syöpäsolulinjoissa ja indusoi EGFR fosforylaatiota ja ubikitinaatio EGFR in PANC-1-soluissa. YM155 myös vaatimattomasti edistänyt ubikinaation surviviinin ja XIAP. Siksi YM155 toimii moduloimalla EGFR ja surviviinin ilmaisun myöhemmin vähentää selviytymistä. Ehdotamme, että YM155 on potentiaalia terapeuttisena aineena hoidettaessa haimasyöpä.

Citation: Na Y-S, Yang S-J, Kim S-M, Jung K-A, Moon J-H, Shin J-S, et ai. (2012) YM155 Aiheuttaa EGFR Suppression haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (6): e38625. doi: 10,1371 /journal.pone.0038625

Editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 10 marraskuu 2011; Hyväksytty: 12 toukokuu 2012; Julkaistu: 18 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Na et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia Korea Health 21 R päinvastoin keskeytys EGFR edistää apoptoosin. EGFR-kohdennettu hoito, kuten erlotinibi, on kehitetty hoitoon haimasyöpä.

YM155 on osoittanut antituumorivaikutus haimasyövän solulinjoissa [14]. Lisäksi rintasyöpäsoluissa surviviiniperäiset ilme on raportoitu säänneltävä EGFR kautta PI3K /AKT-reitin, toinen tärkeä väylän haimasyöpä [15]. Siten näyttää mahdolliselta vaikutuksesta YM155 on EGFR ja sen loppupään signalointi haimasyöpäsoluissa koska surviviini säädellään EGFR.

Tässä tutkimuksessa arvioimme syöpää ehkäisevistä vaikutuksista YM155 haimasyövän solulinjoissa ja ksenograftit. Lisäksi olemme tutkineet vaikutus YM155 on EGFR, PI3K, ERK, ja STAT3 ilmaisun onko YM155 vaikuttaa EGFR /PI3K /STST3 reittejä. Tutkimme myös vaikutuksia YM155 ilmentymistä koskevat muiden jäsenten IAP perheen liittyvät anti-apoptoottisten ja pro-apoptoottisten proteiinien haimasyövän solulinjoissa.

Tulokset

haimasyöpä solut herkkiä YM155

tutkimiseksi anti-proliferatiivista kapasiteettia YM155 erilaisissa syöpäsolulinjoissa, mittasimme IC

50-arvot YM155 haiman, mahalaukun ja paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja (taulukko 1 ja taulukko S1) . IC

50-arvot YM155 haiman, mahalaukun ja paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinjat olivat 3,7-30,3, 1,4-+140,8, ja +8,7-+370,0 nM. Siten YM155 on tehokas haiman, mahalaukun ja paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja.

vaikutuksen määrittämiseksi surviviiniproteiinia estäjän YM155 ilmenemistä surviviinin ja XIAP, toinen jäsen IAP perhe, suoritimme Western blotting haiman ja mahalaukun syövän solulinjoissa (Fig. 1A ja kuvio. S1). Suurina pitoisuuksina YM155 merkittävästi vähentynyt ilmentyminen surviviinille PANC-1, MiaPaca-2, BxPC-3, KATOIII, ja MKN45 solulinjat. YM155 oli selvästi voimakkaampi PANC-1-soluissa, joissa se laski ilmentymä surviviinin matalina pitoisuuksina (10 nM). YM155 esti myös ilmentymisen XIAP haiman ja mahalaukun syövän solulinjat, paitsi MKN45 soluja; näissä soluissa, YM155 ollut havaittavaa vaikutusta XIAP tasoilla. Aiempien havaintojen [9], [16], YM155 osoitti vähän vaikutusta ilmaus IAP: t, cIAP1 ja cIAP2, haimasyövän solulinjoissa (kuvio. S2).

, riippuu pitoisuudesta vaikutukset 24 tunnin hoidon YM155 on surviviinin ilmentymiseen ja XIAP in PANC-1, MiaPaca-2, ja BxPC-3-solut määritettiin Western-blottauksella. B, vaikutus YM155 ekspressioon XIAP verrattiin surviviinin pudotus Western-blottauksella. PANC-1-soluja käsiteltiin YM155 24 tuntia tai transfektoitu 40 nM siRNA (siSurvivin, siXIAP, ja salattu siRNA) 48 tuntia. *, Epäspesifinen. C, pitoisuus-riippuvainen vaikutus YM155 ilmentymistä koskevat anti-apoptoottisten (Bcl-xL: n ja Mcl-1) ja pro-apoptoottinen (Bid ja Bad) proteiinit tutkittiin in PANC-1, MiaPaca-2, ja BxPC-3-soluissa .

Voit selvittää YM155 aiheuttama downregulation XIAP ilmaisun johtuu vähentyneestä surviviinin ilmentymiseen, me pudotti surviviinille PANC-1 siRNA (siSurvivin) ja arvioi XIAP ilmaisun Western blottauksella (kuvio . 1 B). Taso XIAP-proteiinin vähentynyt enemmän altistuksen jälkeen 10 nM YM155 kuin soluissa, jotka on transfektoitu siSurvivin, mikä viittaa siihen, että YM155 aiheuttama lasku XIAP tasoilla ei tapahdu kautta downregulation surviviiniin. Surviviini on raportoitu olevan sitoutumiskohtia XIAP [2]. Jotta voidaan tutkia vaikutus YM155 surviviiniperäisiin XIAP vuorovaikutukset, me immunosaostettiin surviviini ja tutkitaan sitten immunosaostumat Western blottauksella vastaisella vasta-aineella XIAP (Fig. S3). Treatment of PANC-1-solujen kanssa 100 nM YM155 6 tuntia ei ollut mitään vaikutusta tasot surviviinin tai XIAP, mutta hieman estävät vuorovaikutusta surviviinin kanssa XIAP, mikä viittaa siihen, että YM155 vaikuttaa kokoonpano surviviiniperäistä XIAP kompleksin jonkin verran .

Tutkimme myös vaikutuksia YM155 ilmentymistä koskevat anti-apoptoottisten ja pro-apoptoottisten proteiinien haimasyövän solulinjoissa (Fig. 1 C). Ei ollut mitään muutosta Bcl-Mcl-1 tasot hoidon jälkeen YM155. YM155 aiheuttama pitoisuudesta riippuvaa vähenemistä Bid, p-Bad, ja Bad tasolle useimmissa haimasyövän solulinjoissa; poikkeuksena oli Bid, joka ei muuttunut BxPC-3-soluissa.

YM155 indusoi downregulation PI3K, p-ERK, ja p-STAT3

Koska YM155 tukahdutetaan XIAP ilmaisua, me tutki YM155 vaikutti ilmentyminen muut signalointi komponenttien haiman syöpäsoluissa. Hoito HER2-yli-ilmentävät MCF7-solujen PI3K-inhibiittori LY294002 tai ERK1 /2-inhibiittori U0126 on raportoitu säätelevät vaimentaen surviviiniin [17]. STAT3 estäjä on myös raportoitu tukahduttaa surviviiniin ilmaisun [18]. Sen näiden raporttien perusteella, tutkimme vaikutuksia YM155 on PI3K, ERK, ja STST3 in PANC-1-solut (Fig. 2), jota oli todettu olevan kaikkein YM155 herkkä haiman testatuista solulinjoista. Hoito näiden solujen kanssa YM155 pitoisuuksina 10 nM ja yli laski PI3K (Fig. 2A), p-ERK (Fig. 2B), ja p-STAT3 (Fig. 2C) tasoilla verrattuna in siSurvivin-käsitellyissä soluissa. PI3K-inhibiittori LY294002 ja MEK1 /2-estäjän AZD6244 käytettiin verrokkeina analysoida tasot PI3K fosforyloitu ERK ja surviviinin. Olemme myös tutkinut, mitä vaikutuksia YM155 ilmenemistä koskevat PI3K perheenjäsenten p110α, p110β, luokka III, p85, ja p-p85 in PANC-1, MiaPaca-2, ja BxPC-3-soluissa, ja totesi, että kaikki vähenivät 100 nM YM155 kaikissa kolmessa solulinjoissa (kuvio. S4). Lisäksi, fosforylaatio Akt, joka on alavirtaan efektori PI3K, vähensi myös YM155 (100 nM) näissä haimasyövän solulinjoissa. Akt tiedetään edistävät solujen eloonjäämistä fosforylaation kautta Bad [19], [20]. Sen vuoksi, vähentää fosforyloidun muodossa Akt aiheuttaa väheneminen p-Bad, kuten on esitetty kuviossa 1C, jolloin solun kuolemaan.

, tasot PI3K ja surviviinin analysoitiin Western-blottauksella jälkeen käsittelemällä YM155 tai 30 uM LY294002 (kontrolli) 24 tunnin ajan, ja 48 tuntia transfektion jälkeen 40 nM siRNA. B, tasot fosforyloidun ERK ja surviviinin ilmentyminen määritettiin Western-blottauksella käsittelyn jälkeen 24 tuntia YM155 tai 500 ng AZD6244, ja 48 tuntia transfektion jälkeen 40 nM siRNA. C, tasot fosforyloitua STAT3 ja surviviinin ilmentyminen analysoitiin Western blottauksella, kun 24-tunnin hoidon YM155 ja 48 tuntia transfektion jälkeen 40 nM siRNA.

YM155 downregulates EGFR

Koska YM155 downregulates PI3K, p-ERK, ja p-STAT3, jotka ovat alavirtaan välittäjiä EGFR signaloinnin [21], [22], [23], analysoitiin onko YM155 vaikuttaa ilmentyminen EGFR (Fig. 3). Kuten odotettua, hoito EGF lisäsi EGFR fosforylaatiota. Mielenkiintoista on kuitenkin, tasot p-EGFR sekä yhteensä EGFR PANC-1-solut merkittävästi vähentynyt altistuksen jälkeen YM155, kun läsnä on EGF: ää (Fig. 3A). Nämä tulokset viittaavat siihen, että YM155 vähentää p-EGFR-tasoja kautta lasku EGFR tasoilla. Setuksimabi, jota käytetään positiivisena kontrollina, laski myös p-EGFR EGF: n läsnäollessa. Toinen analyysi vaikutuksista YM155 on EGFR erilaisissa syöpäsolulinjoissa osoitti YM155 indusoi pitoisuudesta riippuvaa vähenemistä EGFR tasoilla haiman (PANC-1, MiaPaca-2, ja BxPC-3), peräsuolen (HCT116), eturauhasen (PC3) ja keuhkojen (H460) syöpäsolulinjoissa; samanlaisia ​​vaikutuksia on havaittu KATOIII mahasyövän soluissa, mutta ei MKN45 mahalaukun syövän solut (Fig. 3B ja kuvio. S5).

A, PANC-1-soluja stimuloitiin 100 ng /ml EGF: ää 10 minuuttia ennen inkuboimalla kanssa tai ilman YM155 6 tuntia. Setuksimabi (CTX; 100 ng /ml 1 tunnin ajan) käytettiin kontrollina. Tasot fosforyloitua (Y1068) EGFR ja koko EGFR analysoitiin Western blottauksella. B, YM155 vähentynyt ilmentyminen EGFR pitoisuudesta riippuvalla tavalla PANC-1, MiaPaca-2 (rajattu blotit, täyspitkä blotteja on esitetty kuvassa. S5a), ja BxPC-3-soluissa. Suhde EGFR:actin ilmentymisen verrattuna kontrolliryhmään on esitetty kunkin kaistan (Multi-Gauge v2.3 ohjelmisto). C, Surviviinivasteita ja EGFR havaittiin subsellulaarisia fraktioita PANC-1-soluissa Western-blottauksella. Sytoplasminen (cyto) ja ydin (nu) fraktiot eristettiin altistuksen jälkeen YM155 24 tuntia. Aldolaasisekvenssien (sytoplasmisen) ja H3 (ydin) toimi merkkiaineita puhtauden subsellulaarisista jakeet. Yhteensä lysaatit (koko) analysoitiin samanaikaisesti. D, YM155 (10 nM) indusoi ydin- EGFR kertymistä. PANC-1-solut värjättiin anti-EGFR, anti-Alexa Fluor 488, ja DAPI jälkeen YM155 hoidon. Mittaviivat: 10 pm.

tutkinut, mitä vaikutuksia YM155 surviviiniperäisiin ja EGFR lokalisointi tutkimalla solunosafraktio tasoilla (Fig. 3C); YM155 alennettu surviviini tasoilla sekä sytoplasman ja ydinvoiman fraktioita PANC-1-soluissa. EGFR tasot alenivat vuonna solulimafraktio, mutta EGFR kertynyt tumafraktios-. Ydin- EGFR kertymistä aiheuttama 10 nM YM155 vahvistettiin konfokaalimikroskopiaa (Fig. 3d). Koska YM155 (10 nM) ei ollut vaikutusta EGFR tasoa yhteensä lysaatit, tämä ehto saattaa heijastaa tumaansiirtymiseen EGFR. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että YM155 alentaa veren soluliman ja ydin- surviviinin, ja viittaavat siihen, että YM155 edistää EGFR tumaansiirtymiseen.

YM155, joka estää surviviini promoottorin aktiivisuutta, indusoi hajoamista EGFR, XIAP, ja surviviini

Voit selvittää EGFR on tavoite YM155 toiminta, tutkimme vaikutus YM155 on PANC-1 solujen elinkykyä jälkeen siRNA-välitteisen knockdovvn EGFR (Fig. S6A). Western blotting osoitti, että siSurvivin ja siEGFR tehokkaasti tippuu alas surviviinin ja EGFR, vastaavasti, kuten on osoitettu Western blottauksella, ja prosenttiosuudet elävien solujen olivat noin 66% ja 75%, vastaavasti. Lisääminen YM155 vähensi solujen elinkelpoisuuden survivin- tai EGFR-pudotus solujen siinä määrin samanlainen kuin havaittiin ohjaus transfektoiduissa soluissa salattu siRNA. YM155 toimii transkription estäjä surviviinin, vähentää surviviinin promoottorin aktiivisuutta pitoisuudesta riippuvalla tavalla PANC-1-soluissa (kuvio. S6b). Tämän takia esto surviviinispesifisten transkription, YM155 toimia voidaan juuri vaikuta knockdown surviviinispesifisten. Laajemmassa samanlainen vähennykset solujen elinvoimaisuuden YM155 havaittu EGFR-taintumisen ja ohjaus (salattu siRNA) solut voivat johtua väheneminen surviviiniperäisiä tasolla YM155.

onko alentunut taso EGFR jälkeen YM155 hoito johtui tuotannon vähenemiseen tai lisääntynyt hajoaminen, analysoimme transkriptipitoisuuksissa käyttäen reaaliaikaista RT-PCR (Kuva. 4A) ja arvioitu vaikutus YM155 proteiinien hajoaminen käyttäen inhibiittorin sykloheksamidin (Fig. 4B) in PANC- 1-soluissa. Kuten odotettua, joka perustuu sen estävää vaikutusta Surviviiniproteiinin promoottorin, YM155 laski surviviini transkriptin tasolla. Kuitenkin XIAP transkriptio kohoamiseen, vaikutus, joka saattaa olla korvaavia vastaus lasku XIAP proteiinin tasot. Nimittäin suojautua apoptoosin, soluista voisi säädellä lisäävästi XIAP, toinen IAP proteiinia, kun surviviinipeptideille ilmentyminen vähenee, mutta hajoaminen XIAP proteiinin YM155 voi lisätä sen XIAP transkriptio korvaavana mekanismi. EGFR transkriptio kohoamiseen 10 nM YM155 mutta pienenivät 100 nM YM155. Analyysi muutoksia proteiinin tasot ajan ilman proteiinisynteesiä (eli, kun läsnä oli sykloheksimidiä) osoitti, että surviviini, EGFR, ja XIAP hajosivat nopeasti PANC-1-soluja käsiteltiin YM155 kuin verrokeilla (cyclohexamide- vain solut). Vaikutukset 100 nM YM155 on surviviinin ilmentymiseen, EGFR, ja XIAP että PANC-1-soluissa ajan tutkittiin (Kuva. S7). 8 h hoito vähensi merkittävästi surviviiniproteiinista tasolle. Siksi surviviiniperäiset voisi olla laukaista myöhempää apoptoosin. Yhdessä nämä analyysit osoittavat, että YM155 vähentynyt tuotanto surviviinin ja EGFR (suuri annos, 100 nM) ja tehostetun hajoamisen surviviinin, XIAP, ja EGFR.

, hoidon jälkeen PANC-1 solujen YM155 24 tuntia, surviviini, EGFR, ja XIAP-mRNA-tasot määritettiin käyttäen reaaliaikaisen RT-PCR: llä. B, surviviinia, EGFR, ja XIAP tasot PANC-1-soluissa hoidon jälkeen 50 ug /ml sykloheksimidiä (CHX) puuttuessa tai läsnä oli 100 nM YM155 varten ilmoitettu aikoja tutkittiin Western-blottauksella. Suhde surviviinin, EGFR, tai XIAP:actin ilmentyminen verrattuna kontrolliin on esitetty kunkin kaistan. *, Epäspesifinen.

YM155 indusoi EGFR fosforylaatiota, ja ubikitinaatio EGFR

Voit selvittää, onko YM155 vaikutuksia EGFR, XIAP, ja surviviini hajoaminen olivat proteasome-, lysosome- tai kaspaasi -riippuvaista teimme Western blotting in PANC-1 soluissa, sen jälkeen käsittelemällä proteasomin estäjä MG132, lysosomin estäjä klorokiini, tai kaspaasiestäjä Z-VAD-fmk (Kuva. 5A). Lisäksi klorokiinin ja YM155-käsitellyn PANC-1-soluissa pyöristettyjä väheneminen EGFR, XIAP, ja surviviini tasolla, kun taas MG132 ja Z-VAD-fmk, olivat tehottomia, mikä viittaa siihen, että lyhyempi puoliintumisaika näiden proteiinien läsnä ollessa YM155 oli liittyvä tehostetun lysosomaalisen hajoamisen. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin MiaPaca-2-solut (Fig. S8). Me seuraavaksi ratkaistava, onko YM155 aiheuttama, lysosomifuusio riippuvaa hajoamista liittyi ubikitinaa- EGFR, XIAP, ja surviviini (kuvio. 5B). Immuunisaostuskokeissa paljasti selvästi lisääntynyt ubikitinoitu EGFR hoidon jälkeen YM155 (100 nM) 6 tuntia, ja vaatimaton kasvu surviviinin ja XIAP ubikitinaatio. Siksi YM155 indusoi ubikitinaa- EGFR surviviiniperäiset, ja XIAP.

, YM155 aiheuttama lysosomaalisen hajoamisen EGFR, XIAP, ja surviviinille PANC-1-soluissa. PANC-1-soluja käsiteltiin 100 nM YM155 (YM), 10 uM MG-132 (MG), 50 uM klorokiinin (CQ), tai 30 uM Z-VAD-fmk (Z-VAD) kanssa tai ilman YM155 24 tuntia . Ilmaisu suhteet EGFR, XIAP tai surviviini aktiinin kontrolliin verrattuna on esitetty kunkin kaistan. ctrl, valvonta; M + Y, MG-132 + YM155; C + Y, klorokiini + YM155; Z + Y, Z-VAD-fmk + YM155. B, PANC-1-soluja käsiteltiin 100 nM YM155 6 tuntia immunosaostettiin (IP), jossa vasta-aineita EGFR: ää, surviviini tai XIAP, ja analysoitiin Western-blottauksella ja ubikitiini. C, aika-kulku EGFR fosforylaation Y1045 in PANC-1-soluissa hoidon jälkeen YM155 (100 nM) on esitetty.

Y1045-fosforyloitua muotoa EGFR tiedetään olevan vuorovaikutuksessa E3 ubikitiinistä proteiini ligaasi c-CBL, jonka kohteena EGFR lysosomiin myöhempää hajoamista [24]. Koska YM155 indusoi EGFR ubikitinaation, tutkimme fosforylaatio EGFR funktiona ajan hoidon jälkeen YM155 tutkimalla varten pY1045-EGFR-Western-blottauksella (kuvio. 5C). Nämä kokeet osoittivat selvän laskun pY1045-EGFR altistumisen jälkeen YM155 105 minuuttia tai enemmän. Nämä tulokset viittaavat siihen, että YM155 moduloi Y1045-fosforylaation EGFR.

YM155 esillä antituumorivaikutuksia vastaan ​​haimasyöpä

in vivo

arvioimiseksi anti-kasvain vaikutuksia YM155 on haimasyöpä

in vivo

, käytimme MiaPaca-2 haiman solulinja ksenografti kasvain malli, mittaus- kasvaimen tilavuus ja kehon paino (Fig. 6A ja 6B). In MiaPaca-2-ksenografteja, kasvaimen kasvu estyi 77,1% päivänä 31 hoidon jälkeen jatkuvana infuusiona YM155 (p 0,001, YM155 vs. vehikkeli). Kehon paino ei merkitsevää eroa käsittelemättömän ja YM155 hoidetuissa ryhmissä. YM155-käsitelty ryhmä päivänä 31 oli pienempi kasvain painoja kuin ajoneuvon käsiteltyjen eläinten (Fig. 6C). YM155 indusoi downregulation EGFR surviviiniperäiset, ja XIAP ilmaisuja ksenograftikasvaimissa (Fig. 6D). Nämä tulokset osoittavat, että YM155 kohdistaa merkittävän antituumorivaikutuksen vastaan ​​haimasyöpä

in vivo

.

Effects of YM155 kasvaimen kasvuun (A) ja paino (B)

in vivo

arvioitiin MiaPaca-2 ksenografteja (ajoneuvo, n = 6; YM155, n = 8). Kasvaimen tilavuus määritettiin osoitettuina aikoina sen jälkeen, kun hoidon aloittamisesta. YM155 annettiin annoksena 50 mg /kg.

in vivo

kokeellinen aikataulu YM155 ilmoitetaan alareunassa kunkin kaavion. Päivä 0 ilmaisee ajan, jolloin ihonalainen olivat saavuttaneet 100 mm

3 ja hallinnon YM155 aloitettiin. Tilastolliset analyysit vaikutusten YM155 kasvaimen kokoon suoritettiin käyttäen Mann-Whitney-testit (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, YM155 vs. vehikkeli). C, Keskimääräinen kasvaimen kokoa kuvataan kunkin ryhmässä päivänä 31. D, immunohistokemiallinen analyysit ksenograftikasvaimissa päivänä 31 sen jälkeen, kun YM155 käsittely suoritettiin käyttäen vasta-aineita EGFR surviviiniperäiset, ja XIAP ja värjättiin H Daewoong Pharmaceuticals, Korea), ja setuksimabi (Merck Korea). Ensisijainen vasta-aineita seuraavia proteiineja käytettiin Western blot -analyysit: surviviini (Abcam, Cambridge, MA, USA); XIAP (BD Biosciences, San Jose, CA, USA); ubikitiini ja β-aktiini (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); EGFR, fosfo (p) -EGFR (Y1068, Y1045), Bcl-x L, Mcl-1, Bid, p-Bad (S112), Bad, PI3K, ERK, p-ERK (T202 /Y204), STAT3, p- STAT3 (Y705), aldolaasi, ja H3 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA). Immunoreaktiivisia proteiineja ei havaittu käyttämällä lajien sopivia piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita. Jotkut materiaalit on kuvattu Materiaalit ja menetelmät S1.

solunelinkykyisyysmääritys ja siRNA transfektio

Solujen elävyys määritettiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japani), mukaan valmistajan ohjeita. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kahtena kappaleena. Viisikymmentä prosenttia estävät pitoisuudet (IC

50s) määritettiin käyttämällä GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego).