Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ihmisen genomi sisältää kuusi geeniä koodaavat proteiineja validoitu

in vitro

erityisiä aktivaattoreita pienen GTPaasit ”Ras-sukuinen proteiini Ral-A” ja ”Ras-sukuinen proteiini Ral-B”, kutsutaan yleisesti Ral-guaniininukleotidiä vaihto tekijät (RalGEF). Ral proteiinit vaikuttavat merkittävästi Ras onkogeeniset signalointi, ja

RAS

onkogeenit ovat tärkeitä ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Siksi tässä työssä, RalGEF panos kasvaimia ja ei-onkogeenisiä piirteitä ihmisen NSCLC solulinjoista, kuten kiinnittymisestä riippuvaisen ja riippumatonta kasvua, solujen eloonjäämistä ja proliferaatiota, tutkittiin. Kaikista ihmisen RalGEF, vaimentaminen

RGL1

ja

RALGPS1

ei ollut havaittavaa vaikutusta. Kuitenkin hiljentäminen joko

RGL2

,

RGL3

,

RALGDS

tai suuremmassa määrin,

RALGPS2

esti solupopulaation kasvua kiinnittymisestä riippuvaisille ja riippumaton olosuhteissa (90 ja 80%, vastaavasti).

RALGPS2

hiljentäminen aiheutti myös lisääntyneet apoptoottisten solujen, jopa 45% solupopulaation transformoiduissa keuhkoputken BZR soluja. Vuonna H1299 ja A549, kaksi NSCLC solulinjat,

RALGPS2

hiljentäminen aiheutti pidätykseen solujen G0 /G1-vaiheeseen solukierron. Lisäksi se liittyi modulointiin tärkeitä solukierron sääntelyviranomaiset: E3 Ubiquitin Protein Ligaasihybridisaa- S-vaiheen kinaasi liittyvä proteiini 2 (Skp2) oli vahvasti alassäädetty (sekä mRNA ja proteiini tasoilla), ja sen tavoitteet, solu kierto estäjät P27 ja p21, jotka sääteli. Nämä molekyyli- vaikutuksia ei jäljitellä hiljentäminen

RALA

,

RALB

, tai molemmat. Kuitenkin

RALB

hiljentäminen aiheutti vaatimaton eston solusyklin etenemisen, mikä H1299 soluissa liittyi sykliini D1 sääntelyä. Lopuksi

RALGPS2

on osallisena valvonnassa solusyklin etenemisen ja selviytyminen

in vitro

kasvun NSCLC solulinjoissa. Tämä toiminto on pitkälti riippumaton Ral GTPaaseja ja liittyvät modulointiin Skp2, P27 ja p21 solukierron sääntelyviranomaisten.

Citation: O. Santos A, Parrini MC, Camonis J (2016) RalGPS2 on välttämätöntä Survival ja Cell Cycle eteneminen Lung Cancer Cells riippumatta sen Perustettu alustat Ral GTPaaseja. PLoS ONE 11 (5): e0154840. doi: 10,1371 /journal.pone.0154840

Toimittaja: David J. Reiner, Texas A M University Health Science Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 13 tammikuu 2016; Hyväksytty: 20 huhtikuu 2016; Julkaistu: 05 toukokuu 2016

Copyright: © 2016 O. Santos et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: AOS palkka tukivat avustusta ”Fondation de France” (Ref Engt 2008005019, https://www.fondationdefrance.org/) ja fellowship ”Institut National de la Sante et de la Recherche médicale” (INSERM, https://www.inserm.fr/), Ranska, nimellä ”soutien pour la muodostumista à la Recherche translationnelle en cancérologie” (yleissopimus nro 201103) . työtä tukivat avustuksia ”Fondation de France” (JC: Ref Engt 2008005019), ”Association pour la Recherche sur le Cancer” (JC: SFI20111203931; MCP: SFI20121205710, https://www.fondation-arc.org /), ”Ligue National contre le Cancer” (JC: RS12 /75-62, MCP: RS14 /75-54, https://www.ligue-cancer.net/) ja Association Christelle BOUILLOT (http: //bouillot-christelle.fr/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ras-proteiinit ovat pieniä GTPaaseja usein mutatoitunut ihmisen syövässä. Niillä on monia loppupään efektoreja, mukaan lukien pienet GTPaasit ”Ras-sukuinen proteiini Ral-A” (RALA) ja ”Ras-sukuinen proteiini Ral-B” (RalB), jotka aktivoidaan guaniininukleotidiä Exchange tekijät (RalGEF). RalGEF-Ral reitin saavuttanut erityistä huomiota sen jälkeen havainto, että ilmaus mutantti muoto GTPaasi HRAS että erityisesti ja yksinomaan aktivoi tämä signalointireitille riittää Ras aiheuttama muutos ihmisen soluja [1]. On kuusi Ral erityisiä guaniininukleotidiä vaihto tekijöitä. Neljä niistä, RAL guaniininukleotidiä dissosiaation stimulaattori (RalGDS), RAL guaniininukleotidiä dissosiaation stimulators kaltainen 1, -kuten 2 ja -kuten 3 (RalGDS kaltainen 1, -kuten 2 ja -kuten 3 tai vaihtoehtoisesti RGL1, RGL2 ja RGL3), satama Ras sitovia alueita ja voi siten suoraan signaalin alavirtaan Ras proto-onkogeenien kohti Ral GTPaaseja. Lisäksi Ral guaniininukleotidiä vaihto tekijä PH domain ja SH3 domain sitova motiivi 1 (RalGPS1) ja Ral guaniininukleotidiä vaihto tekijä PH domain ja SH3 domain sitova motiivi 2 (RalGPS2) ovat kaksi Ras riippumattomia RalGEF [2] . Ras-riippuvainen RalGEF (katsaus [3]), on enemmän tutkittu kuin Ras-riippumaton RalGEF, joka tunnetaan toiminnot rajoittuvat sytokineesiin HeLa-solujen [4], ja rotan feokromosytooma erilaistumisen mukaisesti hermokasvutekijän ärsyke [5]. Lisäksi vaikka paljon työtä on RALA ja RalB GTPaaseja osuus ihmisen syöpään [6], vasta äskettäin niiden roolia keuhkosyöpään, usein kätkeminen Ras kasvaimia synnyttävän mutaatioita on raportoitu [7,8]. Kuitenkin RalGEF merkitys ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on edelleen tuntematon.

Tässä työssä osuus kuudesta RalGEF geenit ihmisen NSCLC solujen selviytymistä, proliferaatiota ja muuttaa ominaisuuksia tutkittiin. Tärkein strategia oli järjestelmällisesti vaientaa jokainen RalGEF NSCLC solulinjoissa joissa eri Ras mutaatiota (taulukko 1) sekä tutkia toiminnallinen osuus kunkin RalGEF geenin. Näin pystyimme paljastaa odottamattomat tehtävät tietyn RalGEF The RalGPS2 proteiini solujen eloonjäämistä ja G1-S-solukierron faasimuutoksen.

Materiaalit ja menetelmät

Cell linjat ja kulttuuri

HeLa- ja ihmisen NSCLC solulinjoissa H23, H1299, A549, ja H838, olivat American Type Culture Collection (ATCC, luettelonumerot CCL-2, CRL-5800, CRL-5803, CCL -185, CRL-5844, vastaavasti) ja kasvatettiin mukaan toimittajan suositusten. Ihmisen HeLa-solulinja, viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) (GIBCO, ref. 41966-029 Invitrogen), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää, ja 2 mM L-glutamiinia. NSCLC solulinjoja viljeltiin RPMI-Glutamax (GIBCO, ref. 61870-010, Invitrogen), johon oli lisätty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS, MP Biomedicals, ref. 092910154), 4,5 g /l glukoosia (ref. G8769 , Sigma) ja 1 mM natriumpyruvaattia (ref.15070-063, Invitrogen). Kaikki soluja pidettiin eksponentiaalisen kasvun olosuhteissa 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, (90%), joka sisälsi 5% CO

2. Rutiininomaisesti ei antibiootteja lisättiin elatusaineeseen ja viljelmät vahvistettiin olevan vapaita mykoplasmakontaminaation jonka polymeraasiketjureaktion (PCR) (VenorGeM Classic, ref. 11-1100).

Ihmisen alkion munuaissoluja, jotka ekspressoivat stabiilisti varhainen alue SV40, katalyyttinen alayksikkö telomeraasi hTERT HEK-HT (HekHT) ja HEK-HT-Ras

G12V (HekRasV12) solut ystävällisesti toimittanut Christopher laskuri [9,10] ja viljeltiin DMEM 10 % lämmöllä inaktivoitua FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia ja antibiootteja valinta (hygromysiini 100 ug /ml, neomysiinille 400 ug /ml, ja kun kyseessä on HekRasV12 myös puromysiinin 0,5 ug /ml).

BEAS 2B ja BZR ostettiin ATCC: ltä (luettelo numero CRL-9609 ja CRL-9483, vastaavasti) ja viljeltiin LHC-9 väliaineessa (GIBCO, ref. 12680-013, Invitrogen), päällystettyjen levyjen (ilman lisättyä BSA) . Päällystysliuos koostui 0,01 mg /ml fibronektiinin (SIGMA, ref. F0895, Sigma-Aldrich) ja 0,03 mg /ml kollageeni tyyppi I (ref. 207050357, Institut de Biotech., Ranska) LHC Basal väliaineessa, jossa oli 0,01 mg /ml BSA: ta (Sigma). Jakamiseksi soluihin, tai pinnoitus kokeissa solut irrotettiin käyttäen Accutasella Solution (SIGMA, ref. A6964, Sigma-Aldrich), sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen tuoreeseen väliaineeseen.

siRNA-oligonukleotidien ja solujen transfektio

siRNA käytti enimmäkseen ostettiin Eurogentec SA (Belgia) muodossa suola hehkutettu duplexes, joko kuivana tai liuoksena. Ohjaus siRNA sekvenssi (ON-TARGETplus Non-kohdistaminen siRNA # 1, nimetty Sint vuonna lyhennetty muoto) oli aina ostettiin Dharmacon, (Thermo Fisher Scientific, USA). Target prosesseja kuvataan taulukossa 2. -siRNA varastossa pitoisuudet olivat oli aina varmistettiin mittaamalla liuoksen absorbanssi 260 nm: ssä käyttäen ekstinktiokerrointa laskettuna Dharmacon verkkosivuilla kunkin siRNA hybridi (https://www.thermoscientificbio.com/custom- modifioitua-siRNA /), laimennettu siRNA-puskuriin (300 mM KCI, 30 mM HEPES, pH 7,5, 1,0 mM MgCl

2-from 5x puskuriliuosta ostettu Dharmacon, USA) ja annosteltiin minimoimiseksi toistuva jäädytys /sulatus syklien. Joissakin kokeissa altaat siRNA: iden käytettiin, joka koostui seoksissa ekvimolaariset määrät 3 oligonukleotideja.

siRNA lisättiin oligonukleotidit soluihin muodossa, 5X lipoplexes valmistettiin OPTIMEM (Invitrogen), jossa on kaupallinen transfektioreagenssi (Lipofectamine RNAiMAX, ref. 13778030, Invitrogen), saavuttaa lopullinen konsentraatio optimoida kutakin solulinjaa (yleensä 10 nM tai 12 nM). Suhde transfektioreagenssia ja siRNA oli joko 1 ui: 10 pmol tai 1 ul: 12 pmol, kaikkien muiden näkökohtien mukaisesti valmistettu valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokeellinen tekijöitä optimoitiin kullekin solulinjan jotta on vähintään transfektion myrkyllisyys (ero käsittelemättömät ja Sint-käsiteltyjä soluja) ja suurin positiivinen kontrolli vaikutus (siPLK1).

Resatsuriini vähentäminen määritys

Cells levytettiin illalla ennen transfektiota 96 kuoppalevyillä, on optimoitu tiheys kunkin solulinjan että taattu-yhtymäkohta lopullisessa ajankohtana. Hoitamaton, Sint ja siPLK1 tarkastukset olivat läsnä kunkin levyn. Optimaaliset olosuhteet olivat sellaiset, joissa on keskimäärin suhteellisen resatsuriinia vähentäminen käsiteltyjen solujen SINT (Non-kohdistus kontrollisekvenssin) oli yli 75%, ja käsiteltyjen solujen siPLK1 oli 10% tai vähemmän. Transfektiota varten, alusta korvattiin 64 ul: aan tuoretta täydellistä alustaa ilman antibiootteja ja siRNA: Lipofectamine RNAiMax lipoplexes lisättiin 16 ui, kuoppiin neljänä kappaleena. Tuoretta väliainetta lisättiin kuoppiin 24 tai 48 h transfektion jälkeen. Lopullisessa aikapisteessä (72 h Hela, 96 h A549, H1299, HekHT ja HekRasV12, ja 120h varten H23-soluja) väliaine korvattiin 200 ui RPMI ilman fenolipunaista, joka sisältää resatsuriinia (SIGMA

®, Sigma-Aldrich Chemie GmbH) 10 ug /ml ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 h-4 h. Fluoresenssi luettiin levylukijalla aallosta pituudet 540 nm (viritys) ja 620 nm (emissio), ja tulokset ilmaistiin prosentteina fluoresenssisignaalin käsittelemättömien solujen jälkeen taustan vähentäminen.

Western blotit

Solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille yön yli ja ennen transfektiota väliaine korvattiin 2 ml: lla tuoretta täydellistä kasvualustaa (ilman antibiootteja). Solut käsiteltiin 0,5 ml: lla 5x siRNA lipoplexes kuten kuvattu edellisessä jaksossa. 48 h 96 h transfektion jälkeen solut pestiin fosfaattipuskurilla suolaliuoksella ilman kalsiumia ja lyysattiin Triton lyysipuskuria (1% Triton X-100, 5 mM MgCl

2, 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7,4) täydennettynä proteaasi-inhibiittorit cocktail tabletti (vrt. 11873580001 Roche) yleisten menetelmien mukaan, tai suoraan lysoitiin 2X Laemmli-puskuria (Tris-HCl 62,5 mM, glyseroli 15%, SDS 4%, bromifenolisinistä 0,01%, DTT 200 mM, pH 6,8) täydennettynä jossa fosfataasiestäjät ja keitetty. Liukoisen proteiinin näytteet Triton lysaatit kvantitoitiin käyttäen BCA proteiinia määritystä (Pierce, viite. 23225, Thermo Scientific), sitten laimennettiin hajotuspuskurissa samaa keskittymää keskuudessa putket, Laemmli-puskuria lisätään 1X keskittyminen, ja keitetty. Laemmli-puskuriin lysaatit kvantitoitiin käyttäen turbidometrisillä Protein kvantifiointi Assay (vrt. 740967,250, Machery-Nagel) ja laimennettiin yhtä suurissa pitoisuuksissa. Näytteet ladattiin betonielementit (4-15% tai ”kaikki kD” kaltevuus polyakryyliamidigeeleillä, Bio-Rad) tai päälle juuri valettu 10 tai 12% polyakryyliamidigeeleillä. Elektroforeesin jälkeen, proteiinit siirrettiin 0,2 uM nitroselluloosa siirto kalvo (Whatman). Seuraavat ensisijainen vasta-aineet ja laimennoksia käytettiin: hiiren anti-adaptiiniproteiinin α (vrt. 610502, BD Biosciences, 1: 1000), hiiren anti-RALA (vrt. 610222, BD Biosciences, 1: 1000), hiiren anti-Actin (ref . A5441, Sigma-Aldrich, 1: 10000), kanin anti-RalB (vrt. 3523, Cell Signaling, 1: 500), hiiren anti lohkaista PARP (vrt. 552597, BD Pharmingen, 1: 1000), kanin anti-sykliini D1 (vrt. 2922, Cell Signalling, 1: 1000), hiiren anti-sykliini D3 (vrt. 2936, Cell Signalling, 1: 2000), hiiren anti-p21 (vrt. 2946, Cell Signalling, 1: 1000), kani anti-p27 (vrt. sc-527, Santa Cruz, 1: 1000), kanin anti-Skp2 (vrt. sc-7164, Santa Cruz, 1: 1000). Asianmukaiset konjugoituja sekundäärisiä vasta-aineita käytettiin joko visualisointiin blotteja tehostetulla kemiluminesenssidetektiolla (Länsi Lightning

® Plus-ECL, PerkinElmer) tai LICOR Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences).

Quantitative real- aika käänteistranskriptiotuotteiden PCR

Solut illalla ennen transfektiota ja transfektoitiin kuten on kuvattu Western blot-analyysi. Ilmoitettuina ajankohtina, supernatantti poistettiin ja solut hajotettiin 350 pl RTL puskurista RNeasy

® mini kit (QIAGEN GmbH, Hildon, Saksa), jossa ex tempore lisätään beeta-merkaptoetanolia, ja pidettiin -80 ° C: ssa. Kokonais-RNA eristettiin RNeasy

® mini kit, mukaan valmistajan ohjeiden, mukaan lukien genominen DNA poistaminen. Absorbanssi 260 nm: ssä, ja 260 /230-260 /280 nm suhde, käytettiin määrällisesti ja laadun määrittämiseksi eristetyn RNA: ta. 1 ug RNA: ta käänteiskopioitiin käyttäen iScript

™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories) mukaan valmistajan protokollaa. Kvantitatiivinen Käänteiskopiointia reaaliaikainen PCR (qPCR) suoritettiin käyttäen joko spesifisiä alukkeita (ostettu Sigma Proligo, taulukko 3) ja SYBR Green PCR Master Mix (ref. 4367659, Applied Biosystems) tai Taqman-koetin asetetaan (Applied Biosystems, taulukko 4) ja Taqman PCR Master Mix (Applied Biosystems). Reaktiot suoritettiin 25 ul: ssa (SYBR vihreä) tai 20 ui (Taqman) ja lopullinen tilavuus käyttäen Chromo4 lämpösyklilaitteeseen (Bio-Rad Laboratories). Hehkutus-laajennus lämpötila oli 60 ° C ja alukkeet olivat 300 nM. Vuonna SYBR Green määrityksissä sulamiskäyrää protokolla aloitettiin heti vahvistus vahvistaa reaktion spesifisyys. Prosenttiosuus kunkin mRNA laskettiin Pfaffl menetelmällä [11] käyttämällä

Beta-2-mikroglobuliinin

viitteenä geenin. Primer tehokkuus oli kokeellisesti määritettiin kalibraatiokäyristä mukana ainakin kolmessa ensimmäisessä reaktioita, ja keskimääräinen hyötysuhde arvoa käytettiin muina aikoina.

trypaanisiniekskluusiolla määritys

solut maljattiin 6-kuoppalevyille ja transfektoitiin siRNA: t, kuten on kuvattu edellä. Kussakin 24 h välein, sekä supernatantit ja solut irrotettiin trypsiinillä ja kerätään kartiomainen putkiin, sentrifugoitiin, sitten solut suspendoitiin uudelleen noin 0,7 ml: aan tuoretta alustaa. Elinkelpoisia ja elinkelvottomia soluja automaattisesti laskettiin käyttäen Vi-cell counter (Backman), joka määrittää solujen elinkelpoisuus trypaanisinieksluusiolla.

Anchorage riippumaton kasvu

H1299-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja transfektoitiin siRNA kuten edellä on kuvattu. Seuraavana päivänä (noin 20 tuntia myöhemmin), ei-kiinni 6-kuoppaisille levyille (käsittelemätön muovi pinnoitetaan edelleen 0,01% Pluronic, Sigma-Aldrich), päällystettiin 2 ml: lla 0,75% alhaisen sulamispisteen agaroosia (Sigma-Aldrich), joka on valmistettu sekoittamalla yhtä suuret tilavuudet 1,5% agaroosia vettä ja 2X täydellistä alustaa ilman fenolipunaista, ja jätettiin kiinteytyä huoneen lämpötilassa. Ennen käyttöä, extra alhaissulamislämpötila agaroosia 0,75%, valmistettiin ja pidettiin vesihauteessa 37 ° C: ssa. Solut kerättiin Accutasella, lasketaan, laimennetaan sama konsentraatio (25000 /ml) ja jaetaan 5 ml polypropyleeniputkissa (0,8 ml putkea kohti). Määräosa saman solususpensiota jaettiin samanaikaisesti toistamaan kuoppiin valkoisen 96-kuoppaisille levyille vahvistaa syöttää CellTiter Glo-määrityksellä (vrt. G7571, Promega). 3,2 ml 0,75% agaroosia perusteellisesti mutta varovasti sekoittaa solujen ja 1 ml /kaivo heti maljattiin kolmena kappaleena. Jähmettymisen jälkeen agaroosia, ylimääräistä väliainetta (ilman fenolipunaista) lisättiin kuoppiin, levyt siirrettiin soluinkubaattorissa ja nestemäisen väliaineen päällä huolellisesti vaihdettava 2-3 päivää.

jälkeen 14 päivää, oli väliaineen poistettu, ja 0,3 ml 0,05%: MTT-liuosta PBS: ssä lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä inkuboitiin 30 min 1 h 37 ° C: ssa ja sitten skannattu korkealla resoluutiolla (Epson Perfection V700 Photo) ja pesäkkeiden ohjelmiston avulla ImageJ.

Cell cycle jakelu ja aktiivinen kaspaasi-3 arviointi virtaus cytometry

Solut maljattiin 12-kuoppalevyille ja transfektoitiin siRNA: t, kuten on kuvattu edellä. 72 h transfektion jälkeen supernatantit kerättiin 15 ml: n putkissa ja jäihin. Solut kerättiin Accutasella ja lisättiin kuhunkin vastaavaan supernatanttiin putkeen. Putkia sentrifugoitiin 4 ° C: ssa, ja solupelletit suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 0,05% BSA: ta. Solut kiinnitettiin ja permeabilisoitiin lisäämällä ennalta jäähdytetty -20 ° C: ssa 70% etanolia tipoittain soluihin, sitten pidettiin jäillä ainakin 30 min. Solut pestiin PBS: llä, sitten PBS: llä, joka sisälsi 0,05% BSA: ta, ja suspendoitiin uudelleen 0,25-0,4 ml PBS: ää, joka sisälsi 0,05% BSA: ta ja propidiumjodidilla (50 ug /ml). RNaasi (5 ui varastoliuosta 10 mg /ml) ja 6 ui anti-aktiivinen kaspaasi-3-vasta-aine (Ref 559341, BD Biosciences) lisättiin 0,2 ml propidiumjodidia-värjäytyneiden solujen 5 ml FACS-putket, inkuboitiin valolta suojattuna huoneenlämmössä vähintään noin 15 min ja analysoitiin virtaussytometrialla (BD ™ LSRII, BD Biosciences), tai pidettiin 4 ° C: ssa ja hankki jälkimmäinen samana päivänä. Tiedot analyysit tehtiin, kun kyseessä on aktiivinen kaspaasi-3 FlowJo Software (FloJo, LLC) tai, jos kyseessä on solusyklin jakelu, jossa ModFit LT ™ (Verity Software House).

Ral-GTP Pull alas

Solut maljattiin 15 cm: n maljoilla, ja kerättiin samalla solukerros oli alle 70-80% konfluentteja. Yksi levy joka kerta, kylmähuoneessa, jäällä, solut pestiin kerran jääkylmällä PBS: llä. Solut hajotettiin lyysipuskuria (1 ml, Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NP40 1%, glyseroli 15%, NaCl 200 mM, MgCI 2: ta 5 mM, johon oli lisätty proteaasi-inhibiittorit) ja lysaatit kirkastetaan sentrifugoimalla (2 min 10000 rpm, kylmässä huoneessa). Supernatantit jaettiin osiin 3 putkiin (proteiinien määrällisesti, tulo Western blotit ja avattavan kokeilut), sitten välittömästi jäädytettiin nestemäisessä typessä.

glutationin magneettiset helmet (Pierce # 88822) pestiin 3 kertaa 3 kertainen niiden tilavuus pesu- puskuria A (Tris.HCl 125 mM, pH 8, NaCl 150 mM, täydennettynä ennen käyttöä proteaasinestäjät), inkuboitiin 30 min 1 h samaan puskuriin pyörivän kiekon päällä 4 ° C: lysaateilla alkaen

E

.

coli

soluja, jotka ilmentävät GST-fuusioitu Ral Binding Domain alkaen Sec5 (GST-Sec5-RBD, RBD on N-pään 1-99 aa of Sec5) [12,13], ja jälleen pestiin 3 kertaa Pesu puskuri A. Sitten helmet resuspendoitiin Hajotuspuskuriliuoksessa ja jaettu eri mikroputkea (40 ui helmiä vuode per mikroputkeen).

Jokainen lysaatti sulatettiin ja haluttua proteiinia määrä inkuboitiin 45 min 1 h GST -Sec5-RBD-helmiä pyörivä pyörä 4 ° C: ssa. Sitten helmet pestiin nopeasti kaksi kertaa 0,5 ml: lla pesupuskuria B (Tris-HCl 25 mM, NaCl 40 mM, MgCI 2 30 mM, pH 7,5). Sitten 15 ui 2X Laemmlin näytepuskuria lisättiin helmiä, jotka sitten keitetään 2 min, ja jäädytettiin välittömästi tai ladattiin geeliin.

Tulokset ja keskustelu

RGL2, RGL3, RalGDS ja RalGPS2 ovat tarvitaan in vitro kiinnittymisestä riippuvaisen ja kiinnittymisestä riippumatonta solu- väestönkasvun

Aloitimme arvioimalla välttämättömyys kunkin kuuden RalGEF varten

in vitro

lisääntymistä ja /tai eloonjäämistä ihmisen neljän NSCLC solulinjat kätkeminen eri Ras mutaatioita (A549, H23, H1299, H838), verrattuna muihin solulinjoihin jossa Ral ja RalGEF proteiineja on tutkittu aiemmin: HeLa (kohdunkaula syöpä), HEK-HT-HRAS

G12V (transformoitua solulinjaa, tästedes nimeltään HekRasV12) ja sen isogeenisistä pari HEK-HT (kuolemattomaksi solulinja, tässä myös nimeltään HekHT) [10]. Tiedot kudosten histologia ja Ras mutaatiostatus solulinjojen käytetään tässä työssä on esitetty taulukossa 1.

Tehokkuusetuja siRNA oligonukleotidien vasten RalGEF (kaksi-kolme siRNA per geeni) vahvistettiin qPCR (S1 Fig ): kohde-mRNA: n ilmentymisen oli alle 30% endogeenisen tason kaikkien siRNA sekvenssit, 72 h transfektion jälkeen, vahvisti ainakin kaksi riippumatonta solulinjoissa.

metabolinen resatsuriinia vähennys määritystä käytettiin mittaamaan solun väestönkasvu. Kunkin solulinjan transfektio edellytykset ja kesto soluviljelyn aikana valittiin varmistaen: 1-, että solut eivät ole konfluentteja määrityksen aikana; 2- että kasvua estävä vaikutus ei-suunnattu siRNA (sint, negatiivinen kontrolli) oli minimaalinen ( 15-20%) kuin soluilla ei toimitettu transfektiosta (käsittelemättömiin soluihin); ja 3- että kasvua estävä vaikutus siRNA vastaan ​​positiivisena kontrollina, (valitsimme polo kaltainen kinaasi 1) oli maksimaalinen (≥ 90%). Tätä määritystä käyttämällä havaitsimme, että

RGL1

ja

RalGPS1

mRNA hiljentäminen ei ollut mitään havaittavaa vaikutusta solujen populaation kasvuun (kuvio 1A ja 1 E, vastaavasti), mikä viittaa siihen, että ne ovat tarpeeton solupopulaation kasvua vaikuttaen merkittävästi eikä eloonjäämiseen eikä lisääntymistä näissä soluissa. Kuitenkin pysyvyys näiden kahden proteiinien takia proteiinipitoista vakautta ei voida sulkea pois, koska emme voineet seurata proteiinin hajoaminen ajan myötä ei ole saatavilla spesifisten vasta-aineiden. Ehtyminen RGL2, RGL3 tai RalGDS aiheuttama osittainen kasvun estäminen (vaihtelee 12-70% verrattuna sint, kuvion 1B, 1C ja 1D). Mielenkiintoista, hiljentäminen Ras-riippumaton RalGEF geenin

RALGPS2

indusoi erittäin vahva inhibitio solupopulaation kasvua kaikissa NSCLC testatuissa solulinjoissa (jopa 90%, kuvio 1F). Lisäksi tämä vaikutus ei ollut erityisiä NSCLC solulinjojen, koska se havaittiin myös solulinjoissa alkuperää munuaisessa (HekHT /HekRrasV12) ja kohdunkaulan (HeLa-solut), ja joka ei-transformoitu solulinja (HekHT). Riippumattomuus läsnäolo aktivoitua Ras-geeni olisi voitu odottaa varten Ras-riippumaton RalGEF.

(A-F) Cell väestönkasvu kiinnittyminen mitattiin käyttäen resatsuriinia vähentäminen määritys ja ilmaistaan ​​prosenttiosuutena käsittelemättömät (ei-transfektoituja soluja) (keskiarvo ± SEM,). Se arvioitiin 72-120 h kuluttua solujen transfektion, riippuen optimoitu edellytys kunkin solulinjan. Kukin paneeli kuvaa vaikutusta hiljentäminen yhden RalGEF kaksi tai kolme riippumatonta siRNA oligonukleotideja: (A)

RGL1

; (B)

RGL2

; (C)

RGL3

; (D)

RALGDS

; (E)

RALGPS1

; (F)

RALGPS2

. Vaikutus kunkin siRNA oli tilastollisesti verrattiin vaikutus saadaan Sint kaksisuuntaisella ANOVA ja Bonferroni posttests (*

p

≤ 0,05, **

p

≤ 0,01, ***

p

≤ 0,001;

n

= 2-4 keskiarvoja itsenäisestä kokeesta, jokainen tehdään neljänä kaivoihin). (G) ankkurointi-riippumaton kasvu H1299-solujen arvioitiin yli 14 päivää, ja se ilmaistaan ​​keskimääräinen suhteellinen pesäkkeiden määrä suhteessa Sint-käsitellyt solut. Tiedot kerättiin itsenäisestä kokeesta, jossa siPLK1 (positiivinen kontrolli) peräisin yhtään tai hyvin vähän pesäkkeitä. (H) antava kuvia H1299 siirtomaiden agaroosia 14 päivän kasvatuksen jälkeen sint, siPLK1, siRalGPS2 # 231, ja siRalGPS2 allas, kuten on osoitettu. Tilastollinen vertailu suoritettiin yksisuuntainen ANOVA Dunnettin posttest. (*

p

≤ 0,05, **

p

≤ 0,01, ***

p

≤ 0,001;

n

= 2 (siRGL1 ja siRALGPS1 ), 3 (siRalGPS1 ja siRalGPS2) tai 4 (siRGL2, siRGL3 ja siRalGDS) itsenäisestä kokeesta, kussakin suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Päinvastoin kuin kuolemattomien solujen, transformoidut solut näyttää kyky selviytyä ja lisääntyä ankkurointi riippumaton kasvuolosuhteet. vaikutus RalGEF ehtyminen ankkurista riippumaton kasvu testattiin teki useita pesäkkeitä H1299 solujen agaroosi- hyytelömäinen väliaineessa. Vaikka

RGL1

ja

RALGPS1

hiljentäminen oli mitään havaittavaa vaikutusta,

RGL2

,

RGL3

,

RALGDS

ja

RALGPS2

ohimenevä hiljentäminen olennaisesti estyy kiinnittymisestä riippumatonta kasvua H1299 solujen rinnalle havainnot tehdyt noudattamista olosuhteissa (kuvio 1 G). Mielenkiintoista, estävä vaikutus

RGL3

ja

RALGDS

hiljentäminen Anchorage riippumaton kasvu oli voimakkaampaa (noin 75%: n esto) kuin vaikutus havaittiin kiinnittynyt soluja (noin 45% ja 35% kasvun estäminen). Koska

RALGPS2

hiljentäminen näkyy vahvin fenotyyppiä, kaikki edelleen keskittyi RalGPS2.

RalGPS2 vaaditaan in vitro solujen selviytymistä

Kun ehtyminen RalGPS2 suuren prosenttiosuuden solupopulaatio näkyvissä fenotyyppinen merkkejä solukuoleman: solut pyöristystä ylöspäin, irrotus ja kupliminen (S2 Kuva). Lisäksi trypaanisinieksluusiolla määrityksessä osoitti, että voimakas kasvun estäminen päivinä 3 ja 4 jälkeen transfektion H1299-solujen (kuvio 2A) oli ainakin osittain johtuen 10: sta 20% vähennys solujen elinkelpoisuuden (kuvio 2B). Näin ollen, RalGPS2 tarvitaan solujen eloonjäämistä. Lisäksi solut todennäköisesti kuolee apoptoosin kautta, kuten on esitetty 10-15%: n lisäys solujen määrän kanssa aktivoitua kaspaasi-3 analysoitiin virtaussytometrialla in H1299-soluissa (kuvio 2C), ja havaitseminen pilkkoa Poly [ADP-riboosi ] polymeraasit (PARP) Western blot A549-solujen (S3 kuvassa). RalGPS2 ehtyminen-vaikutus apoptoosiin tutkittiin edelleen on HRAS

G12V onkogeeni yhteydessä hiljentämällä ilmaisunsa isogeenisissä pari keuhkoputkien solulinjojen BEAS-2B (ikuisti) ja BZR (BEAS-2B ilmentävien HRAS

G12V) . Mielenkiintoista, kaspaasi-3-aktivaation upon RalGPS2 ehtyminen BZR soluissa oli noin 2 kertaa useammin kuin isogeenisissä kuolemattomaksi ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen BEAS-2B (kuvio 2D). Tämä tulos on viittaavia HRAS

GV12 onkogeeni aiheuttama herkistyminen solujen RalGPS2 eloonjäämisestä vaikka maailmanlaajuinen vaikutus solujen populaation, kuten arvioitiin Resatsuriini väheneminen määrityksessä, oli samanlainen (S4 kuvassa), kuten muissakin isogeenisistä parin ( HekHT ja HekRasV12, kuvio 1).

(A) määrä elinkelpoisia H1299 solujen ja (B) osuus elinkelpoisuuden induktion jälkeen RalGPS2-ehtyminen saatiin päivittäin neljän päivän ajan trypaanisinieksluusiolla määritys ja tilastollisesti verrattiin Kaksisuuntainen ANOVA ja Bonferroni posttests (*

p

≤ 0,05, ***

p

≤ 0,001;

n

= 2 itsenäisestä kokeesta, kukin kolmena kappaleena ). (C) osuus solujen kätkeminen aktiivinen kaspaasi-3 arvioitiin 72 tuntia transfektion kanssa siRalGPS2, virtaussytometrialla analyysissä H1299 soluissa ja (D) isogeenisissä parin kuolemattomaksi BEAS-2B ja HRAS

G12V transformoiduista BZR soluja. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin vastaavasti yksisuuntainen ANOVA Dunnettin posttest, **

p

≤ 0,01 ja ***

p

≤ 0,001,

n

= 4 tai 5 itsenäisestä kokeesta (C); ja kaksisuuntainen ANOVA Bonferronin posttest,

### p ≤ 0,001,

n

= 2 tai 3 itsenäistä koetta (D).

RALGPS2-vaientaminen vaikutuksia go pidemmälle RALA ja RalB

Seuraavaksi kysyimme, missä määrin Ral proteiinit ovat osallisina loppupään RalGPS2 solujen populaation kasvua ja selviytymistä.

RALA

hiljentäminen ei ollut vaikutusta solujen populaation kasvuun (paitsi osittaisen 20% kasvun estyminen vain yhdessä solulinjassa, H1299, kuudesta testattu), kun taas kun RalB ehtyminen oli osittainen kasvun esto viidessä kuudesta testatuista solulinjoista (24-38% keskimääräinen ero Sint, kuvio 3A), joskin vähäisempinä mitä havaittiin hiljentämällä

RALGPS2

samoissa soluissa (61-96% keskimääräistä eroa sint keuhkosyövän solulinjat, 41-62% keskimääräinen ero Sint ei-keuhkosyövän solulinjat, kuvio 1F). Lisäksi toisin kuin vakiintunut asema RalB solujen eloonjääminen [14], emme tarkkailla apoptoosin upon RalB ehtyminen ei A549 eikä H1299 keuhko- solulinjoissa, analysoituna kaspaasi-3 aktivaation (kuvio 3B) ja lohkaistaan ​​PARP (kuvio 3C). Nämä tulokset osoittivat, että väestön kasvun estäminen indusoi

RALB

hiljentäminen ei johtunut solukuolemaa, ainakin näissä kahdessa NSCLC solulinjoista, ja toi esiin mahdollisuuden, että

RALB

hiljentäminen saattavat vaikuttaa solujen syklin etenemisen, jota käsitellään seuraavassa jaksossa.

(A) solujen väestönkasvu arvioitiin solulinjat ilmoitettu kuvaajan resatsuriini väheneminen 72-120 h transfektion jälkeen ja ilmaistiin prosentteina resatsuriinia vähennys suhteellisen käsittelemättömiin soluihin. Vaikutus kunkin siRNA oli tilastollisesti verrattiin vaikutus saadaan Sint (negatiivinen kontrolli) by Kaksisuuntainen ANOVA ja Bonferroni posttests (*

p

≤ 0,05, **

p

≤ 0,01, ***

p

≤ 0,001;

n

= 2 tai 3 riippumattomasta kokeesta kukin keskiarvo, jotka saatiin neljästä kaivot). (B) Kaspaasi-3 aktivaation arvioitiin virtaussytometrialla analyysi 72 h transfektion jälkeen, ja se ilmaistaan ​​prosentteina solupopulaation positiivisia staning. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin yksisuuntaisella ANOVA Dunnettin posttest, mutta ei ole merkitystä saatiin (

n

= 3 itsenäistä koetta). (C) Länsi blotit osoitetun solulinjojen ja ajankohtina näyttää RALA ja RalB proteiini downregulation, halkaistut Poly [ADP-riboosi] polymeraaseja (CI. PARP) immunodetektioon ja Actin tai adaptiiniproteiinin latauskontrollina.

Viimeaikaiset Theodorescu laboratoriosta työ osoitti, että keuhkosyövän solulinjat vaikutus hiljentäminen

RALA

ja /tai

RALB

on solulinja riippuvainen, ja todennäköisesti riippuu tyypistä Ras mutaation läsnä [7] . Tämän kanssa johdonmukaisesti solutyypissä vaihtelevuus, voisimme tarkkailla maltillista lohkaistaan ​​PARP Western blot HeLa- ja keuhkosyövän H23 solulinjoissa, mutta ei A549 ja H1299 solulinjoissa (kuvio 3C), mikä viittaa siihen, että solukuolema voisi todellakin edistää