Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mutaatiot

TP53

geeni ovat yleisimpiä muutoksia ihmisen kasvaimissa.

TP53

mutaatiokaavojen on joskus yhdistetty karsinogeeniksi altistumiseen. Maksasolukarsinoomassa erityinen G T transversiosta on kodonissa 249 on klassisesti kuvattu sormenjäljen aflatoksiini B

1 altistumista. Samoin G T transversioita kodoneissa 157 ja 158 ovat liittyneet tupakka altistus ihmisen keuhkosyövässä. Kuitenkin kiistat jäävät noin tulkinnasta

TP53

mutaatiostatuksesta kuvio kasvaimissa sormenjälki genotoxin altistumista. Käyttämällä toiminnallinen määrityksessä Functional Analysis of Erillään alleelit hiivassa (FASAY), esillä olevassa tutkimuksessa kuvaa mutaatiostatuksesta mallia

TP53

normaaleissa ihmisen fibroblasteissa jälkeen

in vitro

altistuminen hyvin tunnettuja karsinogeenejä: bentso

[a]

pyreenin, aflatoksiini B

1 ja asetaldehydiä. Nämä

in vitro

mutaatioprofiileja verrattiin sitten ne ihmisen kasvaimista löydetyistä käyttämällä IARC tietokantaa

TP53

mutaatioita. Tulokset osoittavat, että

TP53

mutaatiokaavojen ihmisen kasvaimista löydetyistä voidaan vain osittain katsoa johtuvan genotoxin altistumista. Monimutkainen vuorovaikutus toiminnalliset vaikutukset mutaatioita p53 fenotyyppiin ja syöpä luonnonhistorian voi vaikuttaa näihin malleihin. Kuitenkin meidän tulokset tukevat vahvasti, että genotoxins altistuminen on merkittävä rooli etiologiassa tarkasteltavan syöpien.

Citation: Paget V, Lechevrel M, André V, Le Goff J, Pottier D, Billet S, et al . (2012) bentso

[a]

pyreenin, AFLATOKSIINIT B

1 ja Asetaldehydi mutaatiokaavojen in

TP53

Gene käyttäminen toiminnallinen määritys osuma Human Cancer etiologia. PLoS ONE 7 (2): e30921. doi: 10,1371 /journal.pone.0030921

Editor: Andy T. Y. Lau, Shantou University Medical College, Kiina

vastaanotettu: 26 elokuu 2011; Hyväksytty: 26 joulukuu 2011; Julkaistu: 03 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Paget et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Agence Française de Sécurité Sanitaire de l’Environnement et du travail (AFSSET; yleissopimus nro EST-2007-48), Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche (Convention nro 16848-2005), The Région Nord-Pas de Calais (Convention nro 08070005) ja Ligue Nationale Contre le Cancer, Comité de l’Orne. Puol de Chimie environnementale et vuorovaikutukset sur le Vivant (UCEIV-EA 4492) toimii yhteistyössä Institut de Recherches en Environnement Industriel (IRENI), joka rahoitetaan Région Nord-Pas de Calais, Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche, ja Euroopan rahastojen (EAKR). V.P. sai jälkeinen PhD apurahan alueelta Nord-Pas de Calais. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Somaattiset mutaatiot ovat keskeinen tapahtuma syövän synnyn ja se on nyt hyvin tunnustettu, että syövän synty liittyy periytyviä geneettiset tekijät sekä epigeneettiset muutokset. Käännekohta aikana syöpä aloittamista on hankkia kohdennettuja somaattisista mutaatioista, joka antaa soluille valikoivan edun klonaalisia leviämistä. Useiden erilaisten geenien mukana tässä prosessissa,

TP53

edelleen useimmin mutatoitunut ihmisen syövissä, mikä vastaa yli 70% kaikista kuvattuja mutaatioita toistaiseksi ihmisen syövissä [1]. Kansainvälinen Agency for Research Cancer (IARC)

TP53

mutaatio tietokanta sisältää 27580 somaattisten

TP53

mutaatioita (https://www-p53.iarc.fr/, R15 release) [2] . Toisin kuin muut tuumorisuppressorigeeneille, valtaosa

TP53

mutaatiot ovat missense- pikemminkin kuin ei tunne tai lukukehysmutaatioita, mikä johtaa eri malleja eri syövissä. Mielenkiintoista, nämä kuviot on joskus yhdistetty altistumiseen etiologisten tekijät, kuten UV-valo ihosyöpätyyppejä [3], tupakka keuhkosyövässä [4], aflatoksiini B

1 maksasyöpä [5] tai aristolokihappo happoa munuaiskarsinoo- [ ,,,0],6], [7]. Kuitenkin tulkinta

TP53

mutaatiostatuksesta kuvio kasvaimissa sormenjäljen genotoxin altistumisen edelleen kiistanalainen [8]. Todellakin, mutaatiot johtuvat altistumisesta genotoxins ja muiden solun tapahtumien aikana syntyneet syövän synnyn vaikuttaa lopulliseen mutaatiostatuksesta profiilin ihmisen kasvaimista löydetyistä, esim. kloonijalostus erityisen mutanttien geneettinen epävakaus syöpäsoluissa tai epigeneettisellä vaikutteet (esim metylaatiostatuksen) [9] – [11].

Koska monet

TP53

mutaatioita löydettiin kasvaimia vaikuttavat voimakkaasti p53 toiminnallisia ominaisuuksia [12], toiminnallinen määritys, Functional Analysis of Erillään alleelit hiivassa (FASAY) näkyy käyttökelpoinen tekniikka erottaa hiljaisia ​​mutaatioita

TP53

ja ne, jotka tekevät proteiinin inaktiivinen [13], [14]. DNA eri lähteistä voidaan seuloa FASAY varten, kun läsnä on

TP53

alleeli koodaa huonosti proteiinia. Olemme aiemmin kuvattu mutaatiokaavojen normaaleissa ihmisen fibroblasteissa jälkeen

in vitro

asetaldehydialtistus ja aflatoksiini B

1 (AFB

1) käyttäen FASAY [15], [16]. Täällä olemme saattaneet näitä tietoja, jotka saatiin tunnettu genotoxin: bentso

[a]

pyreenin (B

[a]

P). Altistuminen B

[a]

P ja AFB

1 tulosta muodostumiseen vieviä additiotuotteiden pääasiassa kohdistaminen guaniini. Aiomme keskustella siitä, miten nämä voivat johtaa toiminnallisesti eri mutaatiokaavojen eri kasvaimissa.

Lisäksi, kokeellisesti syntyvän

TP53

mutaatiokaavojen verrattiin liittyvien kasvainten tallennetaan IARC tietokannassa [ ,,,0],2]. Mutaatioiden malli B

[a]

P verrattiin niihin keuhkosyövässä ja keskustellaan perusteellisesti esillä paperin. Tämän ansiosta voimme keskustella syy on genotoxins altistuminen ihmisen syövän mutaatiokaavojen.

Materiaalit ja menetelmät

Solun viiva ja soluviljelmissä

ihmisen diploidi fibroblasteja AG1521 (Coriell Institute , Camden, NJ) valittiin tähän tutkimukseen. Koska ennestään mutaatiot

TP53

lokuksen näissä soluissa varmistettiin sekvensoimalla genomisesta DNA: sta, jossa on Beckman Automated Sequencer (CEQ 8000). Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 ja 95% ilmaa, Eagle Minimal Essential Medium (MEM), johon oli lisätty 10% inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS). Ennen altistumista genotoxin, väliaine täydennettiin 200 ul (4%) S9 maksan mikrosomaalisia osa phenobarbital- ja naphtoflavone saaneilla rotilla (Biopredic, Rennes, Ranska), NADPH: ta (4 uM) ja G6P (5 mM). Tarvittava määrä B

[a]

P (Sigma, CAS-numero: 50-32-8, 200 uM) laimennettiin edellä väliaineessa ja käytetään käsitellä soluja 2 tuntia 37 ° C: ssa . Altistuksen jälkeen viljelmä Levyt pestiin kolme kertaa PBS: llä ja inkuboitiin tuoreessa väliaineessa. Koska kaksinkertaistaa ajan näiden solujen on noin 3 päivää, itämisaika viikon valittiin mahdollistaa kahden solun syklit ja varmistaa kiinnitys mutaatioiden.

Sytotoksisuus tutkimus

AG1521 fibroblasteja altistettiin B

[a]

P pitoisuuksina 1-200 uM, kun läsnä oli S9, 2 tuntia 37 ° C: ssa 96-kuoppaisille mikro- levyille. Levyt pestiin kolme kertaa PBS: llä ja inkuboitiin 3 päivää 37 ° C: ssa. Sytotoksisuus arvioitiin kanssa XTT-määritys (Sigma) mukaisesti Scudiero protokollan [17].

Post-merkintöjä

Post-merkintöjä menetelmää sovellettiin päässä Reddy ja Randerath [18]. Genomi-DNA uutettiin käyttäen klassista fenoli /kloroformilla menetelmällä käsittelyn jälkeen RNAasi A ja T1 seurasi proteinaasi K: n (Sigma-Aldrich) ja post-merkintöjä määritys suoritettiin sitten kuten aiemmin on kuvattu [19]. Alkaen autoradiogrammien näin saatu, paikkoja vastaavat additiotuotteet leikattiin radioaktiivisuuden mittaamiseen. Tulokset ilmaistaan ​​Suhteellinen additiotuote Levels (RAL) laskettuna seuraa: RAL = (cpm

addukteja /kopiota

BPDE) x 110,7 x 10

-8, jossa cpm

addukteja ja cpm

BPDE vastaavat lukemat minuuttia kohti leikatusta täplät ja positiivinen kontrolli myönnetty vasikan kateenkorvan alttiiksi B

[a]

P-7,8-dihydrodioliksi-9,10-Epoksidititraus (BPDE), ja kuljettaa 110,7 additiotuotteet 10

-8 normaalia nukleotidin mitattuna muualla [20]. Positiivinen kontrolli oli ystävällisesti toimittanut F. Beland, Jefferson, Yhdysvallat.

FASAY

RNA ja Reverse Transcription (RT) -PCR suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [15]. Monistamaan cDNA-alukkeet, jotka sisältävät fosforotioaatti sidoksen 3′-päässä on suunniteltu: P3 [5′-ATT-TGA-TGC-TGT-CCC-CGG-ACG-ATA-TTG-AA (t) C-3 ’] ja P4 [5’-ACC-CTT-TTT-GGA-CTT-CAG-GTG-GCT-GGA-GT (t) G-3 ’]. FASAY tehtiin mukaan Flaman

et al.

[14], muutamin muutoksin aikaisemmin kuvatulla [15]. Plasmidi pSS16 ja hiivakanta YIG397 olivat lähes täynnä lahjoitti JM Flaman (INSERM U614, Rouen, Ranska) ja J. Cachot (LEMA EA3222, Le Havre, Ranska), tässä järjestyksessä.

TP53

– ilmentävät plasmidit pelastettiin eristetty punainen pesäkkeitä, jotka palautettiin kulttuuriin ja hajotetaan

Zymolyase

(MP-Biomedicals). Purelink Nopea Plasmid Miniprep Kit® (Invitrogen) käytettiin pelastaa plasmidit. Ennen sekvensointi,

TP53

cDNA monistettiin uudelleen alukkeilla P5 [5′-TCT-GTC-ACT-TGC-ACG-TAC-TCC-3 ’] ja P6 [5’-AGA-GGA-GCT -GGT-GTT-GTT-GG-3 ’], jonka tarkoituksena on kattaa eksonin 4-9 mukainen kuvattu jakso GenBank (NM_000546). Kaksi alukkeiden valittiin sekvensoida rekombinaatiokohdat kummallakin puolella

TP53

cDNA: 5 ’alueen alukkeita PA [5′-CAG-TCA-GAT CCT-AGC-GTC-GAG-3 ”] ja PB [5’-CTC-CGT-CAT-GTG-CTG-TGA-CT-3 ’]; 3 ’alueella alukkeiden PC [5′-AAG-GAA-ATT-TGC-GTG-TGG-AG-3′] ja PD [5’-CAG-GCC-CTT-CTG-TCT-TGAAC-3 ’].

Sequence työkaluja analyysi

Thierry Soussi tietokanta (https://p53.free.fr/) käytettiin referenssinä

TP53

villityypin sekvenssin ja IARC tietokanta R14 release (https://www-p53.iarc.fr/) käytettiin vertailtaessa erilaisia ​​

TP53

mutaatiokaavojen [2]. BLAST työkalu NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) käytettiin analysointiin sekvenssin samankaltaisuuksia.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi tehtiin käyttämällä SAS-ohjelmiston release 9.2. A chi neliö testi, jossa yhdellä vapausasteen levitettiin arvioimaan välisen vastaavuuden havaitut ja teoreettinen taajuudet mutaatioiden ulos pohjan substituutioita eksonit 4 9. vertailtava toisiinsa vaihdot kuviot liittyvät genotoxins tehtiin käyttämällä Fisherin testiä . Kaikki testit olivat kaksipuolisia kanssa merkitsevyystasolla 0,05.

Tulokset

Sytotoksisuus tutkimuksia AG1521 fibroblasteissa

Solun kasvu 2 tunnin altistuminen AG1521 ihmisen fibroblasteja B

[a]

P eri pitoisuuksina oli kohtalainen sytotoksisuuden B

[a]

P näissä olosuhteissa, IC50 arvioitiin olevan yli 200 uM (kuvio 1). Sitten Valitsimme altistus pitoisuudeltaan 1 uM vastaavaa suurempina pitoisuuksina ilman kasvun estämistä 50 uM vastaa 25%: kasvun esto. Siten soluvauriot minimoitiin ja uudelleen kulttuurin oli helpompi altistumisen jälkeen. Pitoisuusalueen asetaldehydin ja AFB

1 käytettiin aiemmin kuvattu ja käsitelty [15], [16]. Asetaldehydi käytettiin 0,1-7,5 mM ja AFB

1 klo 16-800 nM.

sytotoksisuus B

[a]

P ihmisten fibroblastsAG1521 2 h altistuksen ja 3 päivää elpyminen (4 kaivot pitoisuutta kohti, keskiarvot ja keskihajonnat).

Post merkintöjä B

[a]

P indusoitu DNA addukteja

Kuvio 2A esittää kuviota DNA tilaa vieviä addukteja 2 tunnin kuluttua altistumisesta B

[a]

P 1, 10 ja 50 uM, kun läsnä on eksogeenisiä metabolisoitumisen osa (S9mix). Positiivinen kontrolli saatiin paljaalla vasikan kateenkorvan DNA altistetaan 35 nM BPDE, aktiivisen metaboliitin (kuvio 2B). Merkittävä paikalla muuttolintuja samalla sen ohutkerroskromatografialla levyillä näkyi neljä näytettä. Sen jälkeen B

[a]

P valotuksen, toinen mutta hyvin heikko paikalla havaittiin myös, että 2 korkeimmat pitoisuudet. RAL-DNA B

[a]

P-altistetuissa soluissa jälkeen eksogeenisen metabolization ylitti merkittävästi määritysraja 1,75 x 10

-8. Tämä arvo määritettiin jälkeen sisäisen prosessin validointi (julkaisemattomia tuloksia). Tämä osoittaa, että tehokkuus metaboloivien menettelyä. Kuitenkin tasannevaikutuksen saavutetaan 10gM.

(A) AG1521-solut 2 tunnin kuluttua altistumisesta B

[a]

P. (B) vasikan kateenkorvan DNA altistumisen jälkeen 35 nM B (a) P-7,8-dihydrodioliksi-9,10-Epoksidititraus (BPDE kontrolli). RAL arvot ovat keskiarvo kahden riippumattoman määrityksiä.

Mutaatio hintojamme FASAY

Taulukko 1 esittää kokonaistulokset B

[a]

P. Kukin konsentraatio testattiin kolmena kappaleena. Kuten toistettavuus joukossa triplikaatit oli erittäin korkea, kokonaismäärä pesäkkeiden kutakin pitoisuutta näytetään.

Yksi punainen pesäkkeet, jotka ilmaantuvat käsittelemätön kontrolli soluista, vain muutaman karhun mutaatioita keskiosassa

TP53

eli eksonit 4 9. muut punainen pesäkkeet katsotaan artefakteja kuin ne toteutetaan pilkkoutumattomiin pSS16 plasmidissa tai mutaatioita sijaitsevat rekombinaatiokohdat. Niistä 3 punaista pesäkettä kontrollista soluista, joissa on mutaatio keskiosassa

TP53

, 2 osoitti AGT lisäys eksonissa 7/8 mikä todennäköisesti silmukointioperaation vika sijaan todellinen mutaatiotapahtumaa tapahtuma, kuten aiemmin on kuvattu [15]. On huomionarvoista, että korko tämän liitos vika oli verrannollinen kokeissa kolmeen genotoxins keskusteltu täällä. Vain yksi todellinen mutaatio löydettiin ohjaus soluissa, joiden avulla voidaan laskea spontaani mutaatio on 0,05%. Tämä oli noin 9-18 kertaa alempi kuin mutaationopeudet lasketut altistetuissa soluissa. Tämä yksittäinen spontaani mutaatio, oli G Siirtymä sisällä CpG-sekvenssin kodonissa 267 (CGG TGG). Tällainen mutaatio on klassisesti katsoneet spontaani Deaminoimalla 5-metyylisytosiinin, vaikka emme voi sulkea pois mahdollisuutta virhettä synny DNA-polymeraasin aikana RT-PCR-vaiheessa.

Mutaatio hinnat alttiina solut koostui välillä 0,45-0,92%. Kuten havaitaan post-merkintöjä koskevat tiedot, tasanne saavutetaan 10gM.

tunnistetiedot

TP53

mutaatioita B

[a]

P alttiina AG1521 ihmisen fibroblasteja

taulukossa 2 esitetään 37 todellinen mutaatiot löydettiin B

[a]

P-altistetuista soluista. Viisi mutaatiot olivat yhden tai useamman emäksen insertiot /deleetiot, jotka johtavat lukukehyksen. Loput mutaatiot olivat yhden nukleotidin substituutioita lukien 1 roskaa ja 25 missensemutaatioita. Mutaation kuvio on esitetty kuviossa 3C: G T transversioita olivat yleisimpiä (8/37, 21,6%). Niitä seuraa G A, G A CpG ja A G siirtymiä (7/37, 18,9% jokaista heistä), poistot (4/37, 10,8%), G C transversioita (2/37 , 5,4%), A T transversiot (1/37, 2,7%) ja yksi emäksen insertio (1/37, 2,7%). Tämä mutaatiotutkimukset kuvio keskustellaan verrattuna aikaisemmin saatu AG1521 fibroblastien asetaldehydialtistus (kuvio 3A) ja aflatoksiini B

1 (AFB

1, kuvio 3B) [15], [16].

(A)

In vitro

Asetaldehydi-alttiina ihmisen fibroblasteja AG1521 (FASAY) (n = 35 mutaatiota, tiedot [15]), (B)

In vitro

AFB

1-alttiina ihmisen fibroblasteja AG1521 (FASAY) (n = 37 mutaatiota, tiedot [16]), (C)

In vitro

B

[a]

P-alttiina ihmisen fibroblasteja AG1521 (FASAY) (n = 37 mutaatiota).

lokalisaatio mutaatioista

TP53

eksonit 4-9

Kuvio 4 esittää lokalisoinnin mutaatioiden B

[a]

P (tässä tutkimuksessa), AFB

1 ja asetaldehydi [15], [16]. B

[a]

P kuvio näkyy kaksi hot-spots Kodonit 248 ja 127, kun taas AFB

1 hot-spotit ovat kodoneja 179 ja 220 sekä asetaldehydin ne kodonit 248, 245 ja 283.

Mutaatiotutkimukset kuvio nähty AG1521 fibroblasteissa jälkeen B

[a]

P (oranssi baareja, n = 32 mutaatiota); AFB

1 (vaaleanpunainen baaria, n = 29 mutaatiota); ja asetaldehydiä (siniset palkit, n = 32 mutaatiota) altistumista. Kodonit kirjoitettu kursiivilla ovat merkittäviä hot-spotit ihmisen kasvaimissa IARC tietokantaan.

Jotta voidaan arvioida, jos malli B

[a]

P mutaatiot voisi olla kyse sattumasta, olemme analysoineet tiedot kuin Shen

et al.

[21]. Tätä analyysiä hot-spotit, vain emässubstituutiota esiintyvät eksonien 5-9 otettiin huomioon. Hot-spotit määriteltiin 24 mutaatioita, joiden osuus 50% mutaatioista raportoitu keuhkosyöpä R14 IARC tietokantaan. Alenevassa taajuus, ne ovat kodoneja: 273, 248, 249, 245, 158, 157, 175, 179, 282, 220, 242, 163, 176, 154, 280, 266, 298, 237, 193, 281, 159, 135, 234 ja 244. Jos nämä 24 hot-spotit oletettiin satunnaisesti mutatoitu, niin ne voidaan ennustaa osuma 24/205 (kokonaismäärä kodonien eksonien 5-9), eli taajuudella 11,7 %. Niistä 30 emässubstituutiot eksoneissa 5-9 tutkimuksessamme, 11 (36,7%) vastaavat yhtä edellä kuormittajat tunnistettu keuhkosyövässä, korko merkittävästi suurempi kuin ennustettiin satunnaisia ​​tapahtumia (11,7%; p = 2,10

-5). Sama analyysi suoritettiin käyttäen joko vain hot-spots löytyy keuhkosyöpään tupakoitsijoita, tai toinen määritelmä kuumien kohtien eli mutaatio taajuus ylivoimainen 2% kaikista mutaatioista ehdottaman Olivier

et al.

[ ,,,0],22]. Nämä analyysit olivat erittäin merkittävä riippumatta käytetyt parametrit (tuloksia ei ole esitetty).

Nämä havainnot yhdessä vertailun mutaation sivustojen kanssa keuhkosyöpä hot-spotteja yllä, voimakkaasti vastustavat satunnaista jakautumista mutaatioiden meidän määrityksessä.

keskustelu

käsitellään kahta asiaa: ensinnäkin on kokeellisesti syntyy mutaatio profiilit edustavat niitä esiintyy luonnollisesti tietyn genotoxin? Toiseksi, joka perustuu koosteen kokeellista ja epidemiologiset tiedot liittyviä mutaatioita ihmisen kasvaimista, voidaan kemiallisesti aiheuttama mutaatioita

TP53

tietyissä kohteissa (kodonit) tunnistetaan keskeiseksi tapahtuma karsinogeneesis-?

suhde B

[a]

P mutageenisuus ja

TP53

mutaatioita

Monet genotoksisia aineenvaihduntatuotteiden muodostuminen B

[a]

P. Tärkein tapa, johon kuuluu CYP1A, CYP1B, CYP3A ja epoksidi hydrolaasit johtaa perimmäinen genotoksinen metaboliitti (±) -anti-BPDE joka sitoutuu DNA: han ja lomakkeita pääasiassa DNA addukteja on

N2

aseman guaniini ja vähemmässä määrin

N6

asema adeniinin [23] – [25]. Toinen reittiin kuuluu dihydrodioliksi dehydrogenaasit AKR1A1 ja 1C1-4 joka hapettaa B

[a]

P dihydrodiols on katekolien [26]. Katekolit voi sitten läpikäydä mono-sähköisen oxidizations johtaa

o

-quinones, jotka muodostavat DNA: n addukteja, kuten B

[a]

P-7,8-dione-

N

2

-dG ja B

[a]

P-7,8-dione-

N

6

-dA [27], [28]. Tässä tutkimuksessa aikana altistuminen AG1521 fibroblasteja B

[a]

P metaboloivia entsyymejä eksogeenisesti, standardin käytäntöjä -genotoksisuuskokeet. Jälkeinen merkintöjä analyysi paljasti merkittävän paikka, joka liikkui yhdessä, joka nähdään kontrolli DNA alttiina BPDE. Tämä viittaa vahvasti siihen, että B

[a]

P altistuminen johtaa pääasiassa BPDE-DNA addukteja.

suostumuksella tietoihin kirjallisuudessa, huomasimme, että suurin osa emässubstituutiot aiheuttamien B

[a]

P sijaitsivat G: C emäsparia, joista vain 6 sisällä CpG alueilla. Guaniinit metyloituja CpG-sekvenssit ovat tyypillisiä kohteita DNA addukteja [10], [23]. On todennäköistä, että DNA: n metylaatio on huono matkapuhelinverkossa mallin kaltainen Tässä käytettävä, mutta Shen

et al.

, Käyttäen samoja toimittaja hiivakanta transformoitiin kemiallisesti muunnetut plasmideja, havaittiin, että DNA: n metylaatio eivät vaikuttaneet sukupolven BPDE additiotuotteiden [21].

käyttäminen UvrABC endonukleaasilla yhdessä ligaation välittämää PCR (LMPCR), jakelu BPDE additiotuotteiden on eksonien 5, 7 ja 8

TP53

vuonna HeLa-solut on kartoitettu [29], [30]. Vahva adduktin muodostumista tapahtui guaniinit kodoneissa 154, 156, 157, 158, 159, 245, 248 ja 273, joista suurin osa on kuvattu hot-spots keuhkosyövässä (157, 158, 245, 248, ja 273; IARC tietokanta, versio R14). Todellakin, kodoni 248 oli useimmin kohdistettu B

[a]

P meidän määrityksessä. Toiseksi, käyttämällä metyloidut ja BPDE-altistetaan DNA-fragmentteja, jotka sisältävät eksonin 5

TP53

, additiotuotteet löydettiin kolme muuta kodonia: 152, 175, 181, jotka kaikki löydettiin esillä olevassa tutkimuksessa sekä [10] .

B

[a]

P aiheuttama mutaatiokaavojen on tutkittu laajasti monissa geenejä erilaisissa biologisissa järjestelmissä. Analyysit suoritettiin jyrsijän soluja

in vitro

tai

in vivo

toimittaja geenejä, kuten

HPRT

tai

Lacl

ovat johdonmukaisesti raportoitu hallitsevuus G T transversiot ja vähemmässä määrin, G siirtymiä ja poistot [31] – [34]. Nopeus G T transversioita näyttää olevan pitoisuudesta riippuva [31]. Mielenkiintoista on, käyttäen hiivan määritystä eri kantojen puutteellinen nukleotidin poisto korjaus, on osoitettu, että DNA-polymeraasit η ja ζ vaadittiin yhdistelmässä varten translesion korjaus poikki BPDE addukteja, mikä johtaa G T transversioita [35]. Pol ζ yksin pystyi myös tuottamaan suuria deleetioita tässä määrityksessä.

riippuen Kokeellinen lähestymistapa, poikkeavuudet ole havaittu mutaatiokaavojen in

TP53

aiheuttama

in vitro

ja

in vivo

altistuminen B

[a]

P tai BPDE. Käyttämällä samaa hiivaa määrityksessä meitä, mutta sen jälkeen suora BPDE altistuminen metyloitua plasmidin, jossa on ihmisen

TP53

järjestyksessä, Yoon

et al.

Ovat löytäneet selvästi muita G T transversioita kun taas Shen

et al.

ovat löytäneet lähinnä G siirtymät [11], [21]. Suora sekvensointi

TP53

ihmisen-p53 knock-in (Hupki) hiiren alkion fibroblasteista jälkeen

in vitro

altistuminen B

[a]

P ovat osoittaneet pääasiassa G T transversioita [36], [37]. Samoin G T mutaatioita havaittiin myös pääasiassa ihotuumoreissa jälkeen B

[a]

P altistus [38]. Aikataulun laatiminen

TP53 myynnissä maassa erilaisten kasvainten aiheuttamaa jälkeen

in vivo

altistuminen hiirten B

[a]

P tai kivihiilitervan johti samassa määrin G T , G A ja G C mutaatiot [39]. Kokonaisuutena ilmenee valtaosa tutkimuksista, että riippumatta geenin tutkitaan ja biologisessa järjestelmässä käytetään, G T transversiosta on tunnusomaista B

[a]

P tai BPDE altistumista. Tässä suhteessa olimme yllättyneitä löytää näitä transversioita osuus on vain 22% mutaatioiden tutkimuksessamme, mutta nousten 17% 1 uM 27% 50 uM. Ehdottivat Wei

et al.

[31], se voi olla kyse annoksen. Monet

in vitro

tutkimuksissa on käytetty BPDE on uM alueella [11], [35] kun taas käytimme B

[a]

P samaa luokkaa, mikä ilmeisesti johti vähäisempään altistumiseen jotta BPDE meidän protokollaa. Jotkut

in vitro

tutkimuksissa käytettiin B

[a]

P uM alueella, mutta näissä tutkimuksissa valotushetkellä vaihteli 4-9 päivää sijasta 2 tuntia meidän protokolla [ ,,,0],36], [37]. Tämä viittaa siihen, että G T transversioita voisi olla tunnusmerkki voimakkaan altistumisen B

[a]

P, skenaario, joka vaikuttaa uskottavalta yhteydessä tupakansavulle altistuminen runsaasti tupakoivat, kun taas kohtalainen altistuminen voi johtaa sekä G T, G A, G C ja poistot, kuten monissa tutkimuksissa. Tätä hypoteesia tukee esiintyvyys G T transversioita in keuhkosyövässä suhteessa tupakkaan altistumista. IARC tietokantaan (kuva 5), ​​tämä esiintyvyys vaihtelee 25% tupakoimattomien 32% tupakoitsijoilla ja 55% runsaasti tupakoivat.

Vasemmalta oikealle:

in vitro

B

[a]

P-alttiina ihmisen fibroblasteja AG1521 (FASAY) (n = 37); ihmisen keuhkosyövässä, tupakoimattomien (n = 288); ihmisen keuhkosyövässä, tupakoitsijoita (n = 870); ihmisen keuhkosyöpää, runsaasti tupakoivat (n = 20). Keuhkosyöpä tietoja IARC tietokannasta R14. Harvinaiset mutaatiot jätetty pois näistä kuvioista.

Käänteisesti nopeuteen G T transversion, löysimme korkea G siirtymät (38%), joista puolet on sijoitettu CpG-sekvenssit . Tämä voi johtua osittain siitä, spontaani mutaatioita nähty ohjaus soluissa. Mutta tekninen bias voidaan harkita, koska meidän pöytäkirja ei erottaa kaksi itsenäisesti aiheutuvat mutta samanlainen mutaatio tapahtumia ja yksi seuraava tilanne: (i) useita mRNA-transkriptien samasta mutantti solu, joka myöhemmin itsenäisesti jää plasmideihin tai (ii) kloonilaajenemisen mutanttisolu ennen sadonkorjuuta poolin käsiteltyjen solujen. Taulukossa 2 vain 3 mutaatiot voivat olla mahdollisesti merkitystä tällaisen bias, mikä viittaa siihen, että johtuva artefakti päällekkäisyyttä mutaatioiden saattaa olla harvoin. Lisäksi monistaa mutaatiot ovat useimmiten G siirtymiä CpG sivustoja. Tämä saattaa virheellisesti nostamaan tämän kyseisen mutaation.

vertailu

TP53

Mutaatioiden varten saadun genotoxins, B

[a]

P asetaldehydi ja AFB

1

saadut tulokset soveltamisesta FASAY arvioida mutageenisiä vaikutuksia

in vitro

altistuminen normaalia ihmisen fibroblasteja B

[a]

P asetaldehydi ja AFB

1 verrattiin. Fisherin testiä paljasti, että suhteen mutaation tyypistä, B

[a]

P ja AFB

1 kuviot eivät olleet tilastollisesti erilaisia ​​(p = 0,6735), kun taas eroja kaavoja asetaldehydin ja joko B

[a]

P tai AFB

1 olivat tilastollisesti bevasitsumabia (p arvoja 0,0546 ja 0,0705, vastaavasti). Nämä kolme yhdisteiden tiedetään aiheuttavan erilaisia ​​DNA vahingoista, jotka voivat puolestaan ​​liittyä spesifisiä mutaatioita. Asetaldehydi aiheuttama kuvio on pääasiassa ominaista erittäin suuri osa G siirtymät (66%), enimmäkseen sijaitsevat CpG-sekvenssit, jotka on todennäköinen perusta muodostumista säikeiden- ristisidosyhdisteiden additiotuotteiden CpG-sekvenssit [15]. Sen sijaan korkea G T transversioita joukossa havaittu B

[a]

P- ja AFB

1 aiheuttama mutaatioita, on tunnustettu tunnusmerkki niiden mutageenisuutta,

in vitro

ja

in vivo

[4], [40]. Tämä on pääosin seurausta läsnäolo vieviä additiotuotteiden.

B

[a]

P kuvio ilmenee kaksi ainutlaatuisia ominaisuuksia verrattuna kuin AFB

1 ja asetaldehydi: esiintyminen G C siirtymiä ja korkeampi poistot (11% vs. 5-6%). Kun taas AFB

1 ja asetaldehydiä aiheuttama yhden emäsdeleetiota, B

[a]

P voisi tuottaa poistot jopa 24 nukleotidin. Tämä ominaisuus voi olla seurausta tietyn translesion synteesireitti B

[a]

P addukteja kuten edellä.

Näin alustavan analyysin avulla FASAY meille mahdollisuuden tallentaa ja erottaa eri kokeellisesti syntyvän mutaatio kuviot

TP53

, jota käytettiin sitten verrata nykyisten epidemiologista tietoa karttoja DNA additiotuotteiden ja kasvaimen mutaatiot

TP53

.

esiintyminen kokeellisen

TP53

mutantteja ihmisen kasvaimissa ja toiminnalliset vaikutukset mutaatioiden

yhdistetty jakauma mutatoituja kodoneja saatu altistuksen jälkeen kunkin kolmen genotoxins keskusteltu täällä pystyimme tunnistamaan 6 suuria hot-spots ihmisen kasvaimet, kodonit 248, 273, 175, 245, 282, 249 (kuvio 4).

fenotyyppisinä, joukossa 63-mutanttien, jotka johtuvat nukleotidisubstituution, kaksi yleisimmin hakea ihmisen kasvaimissa oli myös löytyy meidän kokeellisia malleja, eli Arg175His ja Arg248Gln (taulukko 3). Lisäksi neljä substituutioita (Arg175His, Arg248Gln, Arg273Cys ja Gly245Ser) edustavat yhteensä yli 10%: n mutantteja ihmisen kasvaimista löydetyistä. Vain kolme mutantteja löytyi tutkimuksessamme ei ole koskaan kuvattu ihmisen kasvaimissa (Gly117Val, Gly262Leu, Asn288Ile). Tämä viittaa vahvasti siihen, että FASAY toipuu mutantit, joissa on toiminnallinen muutos mahdollistaa valinnan aikana syövän synnyn prosessissa.

Arvioimme toiminnallinen seurausta mutaatioista jälkeinen

in vitro

altistuminen kolme kemikaalien valossa tietojen Dearth

et al.

että tarkistetaan vaikutus 76

TP53

mutanttien havaitaan usein ihmisen kasvaimissa [12]. Neljätoista ulos 76 analysoitu mutantit haettiin meidän tutkittavissa kuvioita (taulukko 3). Kuten odotettua, nämä 14 mutantit olivat vailla aktiivisuutta

RGC

sekvenssit jota käytettiin meidän FASAY protokollaa. Tämä analyysi osoittaa, että suurin osa kokeellisen mutaatioiden satama suurta toiminnallista haittaa, eli täydellinen menetys transkriptionaalisen aktiivisuuden 22 p53 DNA Binding Jaksot (DBS) ja Hallitseva negatiivinen vaikutus (DNE). Toisaalta jotkut mutaatiot, jotka ovat yleisiä ihmisen kasvaimissa ovat todennäköisesti noutaa FASAY, koska ne säilyttävät transkriptionaalista aktiivisuutta [12]. Tämä sisältää esimerkiksi Arg175Leu tai Glu285Lys, joita ei löydy meidän määrityksessä.

Kuitenkin funktionaalinen analyysi mutanttien FASAY ei toki mahdollista erotella eri syöpiä. Todellakin, jos FASAY antaa meille mahdollisuuden hakea mutanttien esiintyy usein ihmisen kasvaimissa, nämä mutantit eivät olleet erityisen yleisiä eikä harvinaisia ​​kasvaimia, jotka liittyvät altistumiseen tietylle genotoxin. Esimerkiksi Arg175His ja Arg248Gln löytyy B

[a]

P ja AFB

1 kuviot ovat useimmin tunnistettu mutantteja ihmisen kasvaimissa, mikä vastaa 4,25% ja 3,21% kaikista mutanttien (taulukko 3), mutta ne muodostavat vain 1,2% keuhkosyövässä tai maksasyöpä mutanttien IARC tietokantaan. Samalla tavalla, Arg273Cys kuvattu asetaldehydi kuvio on useammin koko ihmisen tuumorin spektri (2,44%) kuin että ruokatorven syöpä (1,3%).

Tämä analyysi tuo esiin mahdollisuuden kemikaalien indusoimaan usein ja erittäin heikentynyt

TP53

mutantteja, jotka voivat olla keskeinen tapahtuma osallistuu syövän synnyn. Verrattuna mutageneesillä joissa käytetään reportteri geenejä, tämä toiminnallinen

in vitro

lähestymistapa tarjoaa vahvoja perusteita varten biologinen uskottavuus karsinogeenisuus varten genotoxin. Kuitenkin se esitetään yhteenveto vain aloittava vaihe syövän synnyn ja näin ollen on epätarkka ennustettaessa, mistä erityisesti mutaatio voi olla liikkeellepaneva voima seuraavien vaiheiden aikana syövän tietyllä kudoksessa.