Krooninen sairaus

tiivistelmä

kilpirauhassyöpä-1 (TC-1), joka on natiivisti huonokuntoinen proteiini, ilmentyy laajalti selkärankaisia ​​ja yli-ilmennetään monenlaisissa kasvaimissa. Kuitenkin sen tarkka asema ja sääntelyn mekanismi ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ovat vielä epäselviä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että TC-1 ilmentyy voimakkaasti NSCLC, ja että sen poikkeava ekspressio liittyy vahvasti NSCLC-solujen lisääntymisen. Eksogeeninen TC-1 yliekspressio edistää solujen lisääntymistä, kiihdyttää solun G1-to-S-vaiheen siirtymän, ja vähentää apoptoosia NSCLC. Knockdown TC-1 on kuitenkin estää NSCLC soluproliferaatiota, sykli siirtyminen, ja apoptoosin vastus. Lisäksi olemme osoittaneet, että PD173074, joka toimii estäjänä TC-1 in NSCLC, vähentää ilmentymistä TC-1 ja estää TC-1 yli-ilmentymisen välittämän solujen lisääntymistä

in vitro

ja

vuonna vivo

. Kuitenkin esto toiminta PD173074 on NSCLC soluproliferaatioon putosi solujen TC-1 knockdown. Nämä tulokset viittaavat siihen, että PD173074 on merkittävä rooli TC-1 yli-ilmentymisen välittämän NSCLC-solujen lisääntymisen ja voi olla mahdollinen intervention kohde ehkäisyyn soluproliferaation NSCLC.

Citation: Lei J, Li W, Yang Y Lu Q, Zhang N, Bai G, et ai. (2014) TC-1-ilmentymän Edistää soluproliferaation Ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, joka voidaan estää PD173074. PLoS ONE 9 (6): e100075. doi: 10,1371 /journal.pone.0100075

Editor: Philip C. Trackman, Boston University Goldman School of Dental Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 tammikuu 2014; Hyväksytty: 21 toukokuu 2014; Julkaistu: 18 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Lei et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi johtavista sairastavuuden syyt maailmanlaajuinen. Vuonna 2013 noin 228190 uutta tapausta ennustetaan esiintyvän Yhdysvalloissa osuus 13,74% kaikista uusista syöpätapauksista. Vielä pahaenteisesti, vaikka käyttö multimodaalisuuden hoito, kuten kirurginen hoito, kemoterapiaa, ja sädehoitoa, keuhkosyöpä edelleen johtava syy syövän kuolleisuus sekä miehillä että naisilla; Itse asiassa, noin 159480 potilasta kuolee keuhkosyöpään liittyvistä sairauksista Yhdysvalloissa [1]. Siksi Uusien hoitomuotojen jotka syntyvät parannettu ymmärrystä molekyyli sääntelyviranomaisten kasvaimen kasvua tarvitaan pikaisesti. Viime vuosina monet biomarkkerit, jotka ovat mukana etenemisen keuhkosyöpä on tutkittu, mutta vain harvat tutkimukset ovat arvioineet toiminnot TC-1 keuhkosyöpä kehittämiseen.

TC-1 kloonattiin alun perin vähentävän hybridisaation papillaarinen kilpirauhassyövän ja sitä ympäröivä normaali kilpirauhaskudokseen [2]. Se ilmaistaan ​​kaikkialle monilla selkärankaisia ​​korkein suojelu poikki lajien keskittyi avoimen lukukehyksen (ORF). Laajalle levinneeseen ilmaisun ja sekvenssikonservoinnista viittaavat siihen, että TC-1 voi olla tärkeä rooli solubiologian [3]. Se koodaa proteiinia, jossa on 106 aminohappoa ilman toiminnallisia domeeni, joka osoittaa, että TC-1-proteiini on jäsenenä natiivisti häiriintyneestä proteiinin ryhmä, joka on osoitettu suorittamaan keskeinen toimintoja solusyklin kontrolli, lisääntymistä, metastaasia, ja signaalitransduktion [3], [4]. Yhä useammat tutkimukset ovat osoittaneet, että TC-1 ilmentyy voimakkaasti useissa karsinoomat ja sen poikkeava ilmentyminen oli mukana leviämisen normaalien ja syöpäsolujen [5] – [9]. Margaret Sunde et ai. vahvistivat, että TC-1 on uusi tuumorigeenistä proteiinia liittyy kilpirauhassyöpä ja totesi, että yli-ilmentyminen TC-1 normaaleissa kilpirauhassoluja kasvattivat leviämisen nopeus, parantaneet ankkurista riippumaton kasvu pehmeässä agarissa, ja laski niiden apoptoosin korko [3] . TC-1, joka sijaitsee rintasyövän herkkä genomin alueella (8p

11-12), havaittiin olevan merkittävästi yliaktiivista ihmisen rintasyövän solulinjoissa ja kudoksissa, mikä syytetään tämän proteiinin kehityksessä rintasyövän [8]. Mahasyövän, TC-1 havaittiin olevan yksi yliaktiivista geenien molemmissa solulinjoissa ja syövän kudosta, ja sen ekspressio korreloi voimakkaasti lähes kaikki kliinis muuttujat aggressiivista biologista käyttäytymistä syöpiä, mukaan lukien koko, pitkälle, ja huono selviytyminen [10], [11]. Ilmaisulla tason ja biologisen toiminnan TC-1 NSCLC ei ole tähän mennessä selvitetty.

Äskettäin Olivier E. Pardo et ai. raportoitu, että selektiiviset fibroblastikasvutekijäreseptori (FGFR) estäjä PD173074 estää proliferaatiota ja klonogeenisten kasvua kahden pienisoluisen keuhkosyövän solulinjat (H69 ja H510), annoksesta riippuvalla tavalla ja estää FGF-2-indusoidun chemoresistance. Yllättäen H510 ksenografteissa, kasvaimen kasvu oli heikentynyt kanssa PD173074 hoito, johtaen kasvuun mediaanielossaolosta verrattuna ohjaus valekäsiteltiin eläimiä, samoin kuin vaikutus havaittiin yhden aineen sisplatiinin antamisen; in H69 ksenografteissa, PD173074 indusoi täydellisen vasteen, joka kesti vähintään 6 kuukautta 50% hiiristä. Lisäksi vaikutus sisplatiinin merkittävästi voimistaa sen annetaan samanaikaisesti PD173074. Nämä vaikutukset selittyvät havainto, että PD173074 hoito laski kasvaimensisäisenä proliferaatio ja lisääntynyt solujen apoptoosin, joilla on korkea ulkonäkö apoptoottisen solukuoleman markkeri kaspaasi-3 [12]. Nämä rohkaisevat havainnot edistää jatkotutkimusta vaikutuksesta PD173074 on NSCLC soluissa.

roolin tutkimiseksi TC-1 soluproliferaatioon ja arvioida vaikutusta PD173074 TC-1-välitteisen soluproliferaation, tässä tutkimuksessa, tutkimme suhdetta TC-1 ilmentymisen ja solujen lisääntymistä in NSCLC immunohistokemiallisesti, ja vaikutus PD173074 TC-1-välitteisen soluproliferaation sarjaa käyttäen

in vitro

ja

vuonna vivo

menettämisestä toiminnon ja saada-of-function tutkimuksia.

Materiaalit ja menetelmät

2,1 Ethics lausunto

ihmisen tutkimuksen hyväksyi Tangdu Hospital institutionaaliset eettisen komitean ja tutkimus tutkimus tehtiin määräysten mukaisesti Helsingin julistuksen 2008. Kaikki osallistujat edellyttäen kirjallinen lupa ennen tutkimukseen osallistuneiden.

Kaikki eläinkokeet tehtiin kanssa protokolla hyväksymä Tangdu sairaalan Animal Care ja käyttö komitea.

2.2 immunohistokemia ja arviointi

Heti kirurgisen poiston jälkeen näytteet 122 potilasta NSCLC leikeltiin jota patologit ja snap-jäädytettiin nestemäisessä typpi. Syöpä kerättiin päässä kyhmyt, ja normaali näytteet saatiin ala 5 cm: n etäisyydellä kyhmyt. Kukin yksilöiden kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja upotettu parafiiniin. Kudokset leikattiin, jolloin saatiin 4-um: n paksuisia leikkeitä, ja osat poistettiin vaha joukon ksyleeniä ja rehydratoitiin luokiteltujen sarjojen läpi alkoholia. Mikroaaltouuni antigeeni haku suoritettiin 750 W 10 minuutin ajan sitraattipuskurissa (pH 6,0) parantaa immunoreaktiivisuus. Endogeeninen peroksidaasi aktiivisuus kohdat blokattiin 3% vetyperoksidaasin 30 minuuttia, ja leikkeitä inkuboitiin sitten 5% normaalin vuohen seerumilla PBS: ssä 30 minuutin ajan 25 ° C: ssa estämään epäspesifisen vasta-aineen reaktiota. Leikkeitä pestiin kolme kertaa PBS: llä 10 min ajan, inkuboitiin primaaristen vasta-aineiden (TC-1, 1:100, Gene Tex, USA; Ki-67, 1:300, Neomarkers Lab Vision Corp, CA, USA) yön yli 4 ° C, ja sen jälkeen värjättiin Envision ™ Detection Kit (Dako, Tanska) seuraten valmistajan ohjeita. Sitten leikkeitä käsiteltiin 0,003% 3, 30-diaminobentsii- ja vastavärjättiin hematoksyliinillä.

arviointi TC-1 ilmentymisen toteutettiin kaksi patologit ilman pääsy kliinisten tietojen ja perustui sekä asteesta TC-1 merkintöjä ja intensiteetti TC-1 värjäystä. Aste TC-1 merkintää mitattiin mukaan positiivisten solujen prosenttiosuuden: 0 = 0-5%, 1 = 6-25%, 2 = 26-50%, 3 = 51-75%, ja 4 = 76- 100%. Intensiteetti TC-1 värjäys arvioitiin visuaalisesti ja ositettu neljään ryhmään: 0 = negatiivinen; 1 = heikko; 2 = kohtalainen; ja 3 = voimakas. TC-1 pisteet määritettiin aste TC-1 merkintää kerrottuna intensiteetti TC-1 värjäys: 0 = 0, 1+ = 1-4, 2 + = 5-8, 3 + = 9-12. Ne kasvaimet tuloksella 0 katsottiin TC-1-negatiivinen, kun taas toiset (1+: sta 3+) pidettiin positiivisina. Prosenttiosuudet Ki-67-reaktiivisia kasvainsoluja arvioitiin suuritehoisen kentän (400 x) laskemalla yli 1000 kasvainsolujen satunnaisesti valitut edustavat osat kasvain [13].

2.3 Cell Culture

NSCLC A549, SPC-A-1, 95D, ja NCI-H520-solujen ja limakalvolle bronchiorum epiteelin 16HBE-solut saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) ja pidettiin laboratoriossamme . Soluja kasvatettiin RPMI 1640: ssä (Gibco, Grand Island, NY, USA) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (Gibco, Grand Island, NY, USA) ja 100 yksikköä /ml streptomysiiniä /penisilliiniä ja viljeltiin 37 ° C: ssa kosteassa ilmakehässä 5% CO

2. Sillä PD173074 kokeissa, A549 ja A549- Plenti-shRNA1 soluja kasvatettiin seerumittomassa ja epidermaalinen kasvutekijä (EGF) vapaata väliainetta (SITA: RPMI 1640, johon oli lisätty 5 ug /ml insuliinia, 10 ug /ml transferriiniä, 30 nmol /L natriumseleniitti, ja 0,25% naudan seerumin albumiinia), jota oli täydennetty PD173074 (liuotettu DMSO: hon, Cayman, USA), jonka lopullinen pitoisuus on 1 μΜ. Kasvualustaan ​​torjunta- soluja täydennettiin vastaavalla tilavuudella DMSO ilman estäjää.

2.4 knockdovvn TC-1 RNA-interferenssi

neljä RNAi ehdokas kohdesekvenssien ihmisen TC-1 (taulukko 1) suunniteltiin ja kloonattiin pGCSIL-GFP-vektorilla, Shanghai GeneChem Co., Ltd. (Kiina). TC-1 shRNA1 (taulukko 1) oli paras pudotus tehokkuutta 293T-soluissa, jotka oli kotransfektoitu TC-1 ja shRNA ekspressiorakenteita, kuten kävi ilmi, Western blot ja immunofluoresenssi- määritykset, ja näin ollen valittu pudotus endogeenisen TC-1 NSCLC solut. Ei-hiljentäminen-shRNA (NSRNA) käytettiin negatiivisena kontrollina. Oligonukleotidit, jotka koodaavat TC-1 shRNA1 tai NSRNA sekvenssin ja silmukan sekvenssi erottaa komplementaaristen domeenien syntetisoitiin ja insertoitiin pGCSIL-GFP Shanghai GeneChem Co., Ltd. (Kiina). Rekmbinanttivirus pakattiin käyttäen Lentivector Expression Systems (Shanghai GeneChem Co., Ltd., Kiina). A549-soluja infektoitiin parannettu infektio liuoksella ja viljeltiin RPMI-1640-väliaine. Yksi viikko infektion jälkeen, GFP-positiiviset solut lajiteltiin käyttäen virtaussytometrillä (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). Lajitellut GFP

+ soluja (puhtaus 97%) käytettiin sitten seuraavassa kokeita.

2,5 Lentivirus rakentaminen ja solujen transduktio

HA-TC1 rakentaa että Plenti-DEST-vektoriin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) aikaisemmin kuvatulla tavalla [14]. Lyhyesti, merkintä klooni, joka sisältää täyspitkän TC-1 oli ensimmäinen luotu tiimimme käyttämällä pENTR suuntaava TOPO kloonaus (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Tultua klooni luotu, LR rekombinaatio reaktio suoritettiin siirtää geeni Plenti-DEST vektorin luomiseksi ilmaisua klooni. Konstrukti sekvensoitiin sen varmistamiseksi, että sekvenssit ja suunta olivat oikeita. Lentivirus tuotettiin kotransfektoimalla 293T-solut kanssa Plenti ekspressiokonstruktin käyttäen optimoitua pakkaus sekoitus (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). NCI-H520-solut transdusoitiin lentivirus ja Plenti-LacZ-virus käytettiin kontrollina. Valinta aloitettiin 48 tuntia infektion jälkeen RPMI-1640-väliaineessa, jossa oli 10 ug /ml blastisidiinia ilman insuliinia tai EGF. Päästyään yhtymäkohta, valitut solut siirrostettiin ja sarjoittain viljeltiin.

2,6 Real Time-Polymerase Chain Reaction

uutettiin kokonais-RNA käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) , ja cDNA syntetisoitiin käyttämällä PrimeScript RT Master Mix (Takara, Japani). Kvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttäen jatkuvaa fluoresenssin havaitsemiseksi -lämpösyklilaitteella ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (ABI, CA, USA) SYBR Esisekoite Ex Taq II (Takara, Japani). Mittaukset suoritettiin kolmena rinnakkaisena käyttämällä GAPDH kuin endogeeninen kontrolli. qRT-PCR suoritettiin käyttäen alukkeita TC-1 (5-AGCCACCAAGCCATC ATCAT-3, 5-TGTGTCGAAGTGGTAGCCATG-3) ja GAPDH (5-AGGTCCACC ACTGACACGTT-3, 5-GCCTCAAGATCATCAGCA AT-3).

2,7 Western-blottaus

Western-blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [10]. Solut kerättiin ja pestiin PBS: llä viljelyn jälkeen 48 h MG-132 (liuotettu DMSO: hon, Cayman, America), jonka pitoisuus on 500 nM. Tasa-proteiinin määriä näytteitä erotettiin 10% SDS-PAGE. Jälkeen blotting nitroselluloosakalvolle (Amersham Biosciences, Piscataway, NY, USA), kalvo inkuboitiin estopuskurissa [Tris-puskuroitu suolaliuos (TBS), joka sisälsi 0,1% Tween 20 ja 5% rasvatonta maitoa] 1 h 25 ° C ja sitten primaarisen vasta-aineen (TC-1, 1:300, Gene Tex, America, p-aktiini, 1:500, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 4 ° C: ssa yön yli. Sitten kalvo huuhdeltiin kolme kertaa TBS-T: n ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-leimatut sekundääriset vasta-aineet 2 tunnin ajan 25 ° C: ssa. Immunoreaktiivinen bändit paljastui käytetään parannettua kemiluminesenssin järjestelmä (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), ja valokuvat bändit analysoitiin FluorChemTMIS-8900 (Alpha Innotech Co., San Leandro, CA, USA).

2,8 MTT-määritys

solut (1 x 10

3 solua /kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevyille. Sarjalla ajankohtina, 20 ui MTT lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja soluja inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa 4 h. Sitten 150 ui dimetyylisulfoksidia (DMSO, Sigma, USA), lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä ravisteltiin 10 min, ja optinen tiheys (OD) arvo mitattiin 490 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa (Bio-Rad Model 680, USA). Solun kasvukäyrät vedettiin. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa, ja keskiarvot hyväksyttiin.

2,9 Plate pesäkemuodostusta

Solut (4 x 10

2 solua /kuoppa) ympättiin kuudella kuoppaiset levyt ja hajallaan tasaisesti hieman ravistamalla levyt. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2, kunnes näkyvissä pesäkkeitä ilmaantui. Pesäkkeet kiinnitettiin 95% etanolilla ja värjättiin kristallivioletilla värjäysliuosta. Pesäkkeet, joissa on enemmän kuin 40 solusta, laskettiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia, ja pesäkkeen muodostumista laskettiin seuraavan kaavan mukaan: Plate pesäkkeiden muodostumisen tehokkuutta = (pesäkkeiden määrä /solujen lukumäärä inculcated) x 100%. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa, ja keskiarvot hyväksyttiin.

2,10 virtaussytometria analyysi Cell Cycle

Solut kerättiin trypsinaatiolla ja kerätään sentrifugiputkissa (2 × 10

6 solua /putki). Sitten 1 ml PBS: ää ja 2 ml: aan dehydratoitua alkoholia lisättiin kuhunkin putkeen (4 ° C yön yli) solujen kiinnittämiseksi. Sen jälkeen RNaasi ja PI hoitoa, solujen prosenttiosuus S faasi mitattiin käyttäen BD FACSAria virtaussytometrillä (Franklin Lakes, NJ, USA). Aineisto analysoitiin käyttämällä ModFit LT ohjelmisto (Verity Software House, USA).

2,11 virtaussytometria analyysi solukuoleman

Solut kerättiin trypsinaatiolla ja kerätään sentrifugiputkissa (1 × 10

6 solua /putki). Kahden pesun jälkeen jääkylmällä PBS: llä, soluja inkuboitiin 15 min ajan huoneenlämpötilassa pimeässä liuokseen, joka sisälsi PE-A ja PerCP-Cy5.5 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA) ja fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelija (FACS) käyttäen FACS väline varustettu kaksinkertainen erotteleva moduuli (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). Aineisto analysoitiin käyttämällä CellQuest ohjelmistoa (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). Kymmenentuhatta 20000 solut analysoitiin näytettä kohti.

2,12

In vivo

tuumorigeenisyystesti Pitoisuus

tuumorigeenisyyteen määritystä, 4- 6 viikon ikäisten BALB /c Kateenkorvattomien nude-hiirten (Experimental Animal Center, Forth Military Medical University, Xi’an, Kiina) annettiin ihonalaisesti 5 x 10

6 A549- Plenti-shRNA1, A549- Plenti-NSRNA, NCI-H520-Plenti-TC-1 tai NCI-H520-Plenti-LacZ-soluja. Mitat kasvaimet mitattiin joka viides päivä ajan 30 päivän käyttäen lineaarista paksuus. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen seuraavaa yhtälöä: V (mm

3) = a x b

2/2, jossa ”a” on suurin ulottuvuus, ja ”b” on kohtisuorassa halkaisija. Jokainen ryhmä mukana viisi hiirtä. Eläimet tapettiin 30 päivän kuluttua, ja kasvaimet mitattiin ja poistettiin jatkotutkimuksiin.

2,13

In vivo

PD173074 Treatment Pitoisuus

Yhteensä 5 x 10

6 A549- Plenti-shRNA1 tai A549-solut (01:01 solususpensiota, Matrigel) implantoitiin kylkeen 4- 6 viikon ikäisten BALB /c, joilta puuttuu kateenkorva nude-hiirissä. Kun kasvaimet tuli mitattavissa, 50 mg /kg PD173074 /hiirillä tai vastaava määrä puskuria yksin annettiin päivittäin yhteensä 28 päivää. Lisäksi hiiret saivat tai eivät saaneet kaksi annosta 5 mg /kg sisplatiinia i.v. päivinä 1 ja 15. Tuumorin tilavuus seurattiin käyttäen lineaarista paksuus. Eläimet lopetettiin kun kasvaintaakkaa saavutti 15 mm missä tahansa mitta, ja selviytyminen kirjattiin käyttäen Kaplan-Meier juoni.

2,14 Tilastollinen analyysi

Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± standardi error (SE). SPSS 13.0 ohjelmistopaketti (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) käytettiin tilastollisiin analyyseihin. Mann-Whitneyn U-testiä sovellettiin nonparametric datan, ja Student

t

testi käyttäen vertailujen keinot kahden ryhmän välillä mittaustietojen. Varianssianalyysi (ANOVA) sovellettiin vertailuja keinoja useita ryhmiä mittaustietojen ja Student-Newman-Keuls (SNK) testiä käytettiin edelleen vertailuja kussakin ryhmässä. Log-rank (Mantel-Cox) testiä käytettiin analysoimaan selviytymisen käyrä. AP arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

3.1 TC-1 ilmentyy korkealla tasolla ja Associated voimakkaasti Cell Proliferation Human Primary NSCLC

arvioidaan ekspressio TC-1 ihmisen primaarisissa NSCLC, immunohistokemia suoritettiin käyttäen 122 näytteitä NSCLC, mukaan lukien 68 okasolusyöpä ja 54 adenokarsinooma näytteet, jotka on saatu 83 urosta ja 39 naarasta (taulukko 2). TC-1 ilmentyminen oli ilmeistä 49 (72.06%) ja okasolusyöpä näytteitä ja 41 (75,93%) ja adenokarsinooma näytteitä. Ilmaisua TC-1 oli enimmäkseen sijaitsi sytoplasmassa, mutta tumavärjäystä oli osittain myös läsnä. Normaalissa keuhkokudoksessa, ei-neoplastisia keuhkoputkien ja keuhkorakkuloiden epiteelin solut olivat jatkuvasti ei-reaktiivinen tai vähän reaktiivisia TC-1 (Fig. 1). Lisäksi, TC-1 ilmentymisen esitetty pieniä eroja sukupuoli, ikä, ja histologinen alatyyppi (P 0,05, taulukko 2).

Intensive immunohistokemiallisella värjäyksellä TC-1 in lung adenokarsinoomat (A) ja okasolusyöpää (B). Ei-reaktiivisuus TC-1 normaaleissa alveolaarisissa epiteelisoluissa (C). (Suurennus x 200).

Korrelaatio TC-1 ilmentymisen ja soluproliferaatiota NSCLC analysoitiin havaitsemalla ilmentymisen Ki-67. Jotka esitetään taulukossa 2, oli tilastollisesti merkitsevää eroa korkean leviämisen ryhmä (Ki-67 merkintöjä indeksi 10%) ja matalan leviämisen ryhmä (Ki-67 merkintöjä indeksi ≤10%) sekä keuhkojen levyepiteelikarsinooma karsinooma ja adenokarsinooma näytteet (P 0,05), mikä viittaa siihen, että TC-1 ilmentyminen korreloi voimakkaasti solujen leviämisen NSCLC.

3,2 Generation stabiilien kloonien NSCLC yli-ilmentäviä soluja tai downregulating TC-1

vaikutuksen tutkimiseksi TC-1 poikkeava ilme NSCLC-solujen, qReal-Time PCR ja western blotting suoritettiin käyttäen ihmisen NSCLC solulinjoista A549, SPC-A-1, 95D, ja NCI-H520, ja 16HBE solulinjaa käytettiin kontrolliryhmän. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, ilmentymisen taso TC-1 A549, SPC-A-1 ja 95D-soluissa oli suurempi kuin saatu 16HBE soluissa, ja ilmentymistaso TC-1 NCI-H520-soluja oli pienempi kuin havaittiin 16HBE soluja. Näiden tulosten perusteella, A549 ja NCI-H520 todettiin edustavan soluja, jotka osoittavat korkeimman ja alemman ilmentymistaso TC-1 ja valittiin jatkotutkimuksiin. Sitten Plenti-shRNA1 transfektoitiin A549-soluihin, ja Plenti-TC-1 transfektoitiin NCI-H520-soluissa. Stabiileja klooneja eristettiin klooni seulonnan fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelua tai blastisidiinia, vastaavasti. QReal-Time PCR ja Western blotting tulokset osoittivat, että TC-1 ilmentyminen oli merkittävästi vähentynyt tai lisääntynyt käsitellyistä soluista kontrolliin verrattuna, kun taas negatiivinen kontrolli eivät osoittaneet mitään muutosta tason TC-1 ilmentymisen (kuviot. 2B ja 2C).

qRT-PCR: llä ja western-blottauksella osoitti, että A549, SPC-A-1 ja 95D-solut ilmentävät korkeita tasoja TC-1-mRNA: n ja proteiinin, ja että NCI-H520-solut ilmentävät pieniä määriä TC -1 mRNA ja proteiini (A). QRT-PCR: llä ja western-blottauksella esitetyt tulokset B ja C, vastaavasti, näyttää, että TC-1-mRNA: n ja proteiinin merkittävästi vaimentua A549-Plenti-shRNA1 solujen ja merkittävästi voimistunut NCI-H520-Plenti-TC-1-soluja verrattuna säätimet. Sarakkeet edustavat keskiarvoa suhteessa mRNA: n määrä vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta. Palkit esittävät SE. * Tarkoittaa tilastollisesti merkittäviä muutoksia (P 0,05) keskuudessa viiteen ryhmään (A) tai kolmeen ryhmään (B, C).

3,3 TC-1 edistää solujen lisääntyminen ja Cell Cycle Transition ja estää solukuoleman in NSCLC

in vitro

tutkimiseksi toiminta TC-1 ilmentymisen NSCLC solujen lisääntymisen, keskeytys- toiminto ja saada-funktion tutkimukset tehtiin. Erityisesti, että MTT-määrityksellä, transfektio Plenti-TC1 transfektion parannettu leviämisen NCI-H520-soluissa verrattuna kontrollisoluihin. Vaihtoehtoisesti TC1 pudotus käyttäen TC1-shRNA1 osoitti merkittäviä downregulation proliferaation A549-Plenti-shRNA1 soluissa verrattuna NSRNA-transfektoiduissa soluissa (kuvio. 3A). Lisäksi pesäke numerot Plenti-TC-1 ja Plenti-NS RNA ryhmät olivat korkeampia kuin ne, jotka saatiin, että Plenti-LacZ ja Plenti-shRNA1 ryhmiä, vastaavasti (Fig. 3B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että TC-1 edistää solujen lisääntymistä NSCLC

in vitro

.

(A) MTT-määritys. Optinen tiheys-arvo havaittiin useita ajankohtina arvioida solujen lisääntymistä. (B) Plate pesäkemuodostusta. Pesäkkeet värjättiin kristallivioletilla värjäysliuoksena ja laskettiin, ja klooni muodostumisnopeus laskettiin sitten. (C) Cell cycle määrityksessä. Prosenttiosuus soluja S-vaiheessa mitattiin käyttäen virtaussytometriä, ja tiedot analysoitiin käyttäen ModFit LT-ohjelmisto. (D) Cell apoptoosimäärityksessä. Soluja inkuboitiin pimeässä liuokseen, joka sisälsi PE-A ja PerCP-Cy5.5. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen (oikeanpuoleiseen alanurkkaan) analysoitiin käyttäen FACS varustettu dubletti erotteleva moduuli, ja tiedot analysoitiin käyttäen CellQuest-ohjelmaa. Pylväät edustavat keskiarvoa pesäkemuodostuksen rate (B), S-vaihe cell rate (C), ja apoptoosin solujen määrä (D) vähintään kolmen erillisen kokeen. Palkit esittävät SE. * Tarkoittaa tilastollisesti merkittäviä muutoksia (P 0,05) joukossa kolme ryhmää.

solusyklin vaihe jakelu mitattiin virtaussytometrialla. Tulokset osoittivat, että solujen prosenttiosuus S faasi huomattavasti hoidon jälkeen Plenti-TC1 verrattuna, joka saatiin sen jälkeen, kun hoidon Plenti-LacZ. Sitä vastoin solujen prosenttiosuus S vaiheessa väheni merkittävästi käsittelyn jälkeen pLenti- shRNA1 verrattuna, joka saadaan Plenti-NSRNA (Fig. 3C). Nämä tulokset osoittavat, että TC-1 edistää G1-to-S-vaiheen siirtymä.

Lisäksi vaikutus TC-1 NSCLC-solujen apoptoosin analysoitiin virtaussytometrialla. Kuten on esitetty kuviossa. 3D-solut transfektoitiin Plenti-TC-1 näytetään alempi apoptoottista hinnat verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu Plenti-LacZ, ja solut, jotka on transfektoitu Plenti-shRNA1 näkyy korkeampia apoptoottista hinnat verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu Plenti-NSRNA, viittaa siihen, että TC -1 estää solujen apoptoosin NSCLC.

3.4 TC-1 Edistää NSCLC Cell Proliferation

in vivo

arvioimiseksi toiminnan TC-1 ilmentymisen NSCLC solujen lisääntymisen

in vivo

, joka on

in vivo

kasvainten muodostumiseen määritys suoritettiin. Mitat kasvaimet mitattiin joka viides päivä varten 30 päivän ajan (kuviot. 4B ja 4D). Lopussa kokeen, hiiret tapettiin, ja tuumorit poistettiin ja valokuvattiin (kuviot. 4A ja 4C). Kuten on esitetty kuviossa. 4, meidän tuumorigeenisuus määrityksen tulokset osoittavat, että säätelyä ilmentymistason TC-1 edistää solujen lisääntymistä

in vivo

, kun taas knockdovvn ilmentymistason TC-1 inhiboi soluproliferaatiota

in vivo

.

ihonalainen kasvain malli (n = 5). Solut injektoitiin ihonalaisesti kylkeen kateenkorvattomiin nude-hiiriin, ja tuumorin tilavuus kirjattiin viiden vuorokauden välein (C, D). Hiiret lopetettiin 30 päivää injektion jälkeen, kasvaimet poistettiin, ja otettiin valokuvia (A, B).

Osa kunkin ihonalaisen kyhmyn leikattiin ja alistettiin immunohistokemia Ki-67. Tuloksemme osoittivat, että oli merkittävä ero määrän Ki-67-reaktiivisen kasvainsolujen ihonalainen kyhmyt kahden ryhmän välillä (Ki-67-indeksit ihonalainen kyhmyt olivat seuraavat: A549- Plenti-NSRNA, 68,98 ± 2,56%, A549- Plenti-shRNA1, 28,63 ± 2,38%; P 0,05; NCI-H520- Plenti-TC-1, 86,26 ± 3,16%, NCI-H520- Plenti-LacZ, 51.34 ± 1,78%; P 0,05) . Nämä havainnot osoittavat, että TC-1 tehostaa merkittävästi leviämisen kapasiteettia NSCLC-solujen

in vivo

.

3.5 PD173074 Vähentää Expression of TC-1 annoksesta riippuen Manner tietyn Range

Sen testaamiseksi, lisäämällä PD173074 vaikuttaa ilmentymisen TC-1 NSCLC, A549 ja A549-Plenti-shRNA1 solujen SITA käsiteltiin PD173074. Tulokset RT-PCR: ää ja western-blottauksella osoitti, että ilmentymistaso TC-1 laski kasvu pitoisuus PD173074 ja tasoja, kun pitoisuus PD173074 saavuttaa 1 μΜ (Fig. 5). Pitoisuus 1 μΜ näin ollen, valittiin lisätutkimusta varten.

qRT-PCR: llä ja western-blottauksella tulokset osoittivat, että ilmentymistaso TC-1 laski kasvu pitoisuus PD173074 ja tasoja, kun pitoisuus of PD173074 saavuttaa 1 μΜ A549 (A) ja A549-Plenti-shRNA1 (B) soluista. Sarakkeet edustavat keskiarvoa suhteessa mRNA: n määrä vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta. Palkit esittävät SE. * Tarkoittaa tilastollisesti merkittäviä muutoksia (P 0,05) joukossa viisi ryhmää.

3,6 PD173074 estoja soluproliferaation, Cycle Transition, ja apoptoosiresistenssiin Riippuu TC-1 Expression Level

in vitro

vaikutuksen tutkimiseksi PD173074 TC-1-välitteisen soluproliferaation NSCLC, MTT-määritys, levy pesäkemuodostusta, solusyklin analyysi ja solujen apoptoosin analyysi tehtiin. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, PD173074 hoito on selvä vaikutus solujen kasvuun käyrät transfektoidut solut, kuten on kuvattu erotus A549 + PD173074 ryhmä ja A549-ryhmän, mutta on vähän vaikutusta solun kasvukäyrät transfektoituja soluja, kuten on osoitettu jonka erotus A549-Plenti-shRNA1 + PD173074 ryhmän ja A549-Plenti-shRNA1 ryhmä. Samanlainen tulos havaittiin levyn pesäkemuodostusta: oli merkitsevä ero pesäkkeiden muodostumiseen korko välillä A549 + PD173074 ryhmä ja A549 ryhmä, mutta vain pieniä eroja pesäkkeen muodostumisnopeus havaittiin välillä A549-pLenti- shRNA1 + PD173074 ryhmän ja A549-Plenti-shRNA1 ryhmä (Fig. 6B). Kuten on esitetty kuviossa. 6C, prosenttiosuudet solujen S-vaiheen populaatiot PD173074-käsiteltyjen A549-solut, A549-solut, PD173074-käsiteltyjen A549-Plenti-shRNA1 soluja, ja A549-Plenti-shRNA1 solut olivat 29,47 ± 0,62%, 49,5 ± 1,89% , 28,02 ± 0,97%, ja 29,5 ± 1,02%, vastaavasti. On selvää, oli merkittävä ero A549 + PD173074 ryhmä ja A549 ryhmä, mutta vain vähän eroa A549-Plenti-shRNA1 + PD173074 ryhmän ja A549-Plenti-shRNA1 ryhmä. Kuten on esitetty kuviossa. 6D, apoptoottisen hinnat ja PD173074-käsiteltyjen A549-solut olivat merkittävästi korkeampia kuin A549-solut; kuitenkin, ei ollut merkittävä ero apoptoottisen nopeuden välillä PD173074-käsiteltyjen A549-Plenti-shRNA1 solut ja A549-Plenti-shRNA1 soluja. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että PD173074 estää TC-1-välitteisen soluproliferaation, solusyklin siirtyminen, ja solujen apoptoosin vastusta TC-1 on voimakkaasti tai kohtalaisesti ilmaistuna, mutta ei silloin, kun se on alhaiseen ilmaistaan.

(A ) MTT-määritys. Optinen tiheys-arvo havaittiin useita ajankohtina arvioida solujen lisääntymistä. (B) Plate pesäkemuodostusta. Pesäkkeet värjättiin kristallivioletilla värjäysliuoksena ja laskettiin, ja klooni muodostumisnopeus laskettiin sitten. (C) Cell cycle määrityksessä. Prosenttiosuus soluja S-vaiheessa mitattiin käyttäen virtaussytometriä, ja tiedot analysoitiin käyttäen ModFit LT-ohjelmisto. (D) Cell apoptoosimäärityksessä. Soluja inkuboitiin pimeässä liuokseen, joka sisälsi PE-A ja PerCP-Cy5.5. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen (oikeanpuoleiseen alanurkkaan) analysoitiin käyttäen FACS varustettu dubletti erotteleva moduuli, ja tiedot analysoitiin käyttäen CellQuest-ohjelmaa. Pylväät edustavat keskiarvoa pesäkemuodostuksen rate (B), S-vaihe cell rate (C), ja apoptoosin solujen määrä (D) vähintään kolmen erillisen kokeen. Palkit esittävät SE. * Tarkoittaa tilastollisesti merkittäviä muutoksia (P 0,05) välillä A549 ryhmän ja A549 + PD173074 ryhmä.

3,7 PD173074 estoja soluproliferaation, Cycle Transition, ja apoptoosiresistenssiin Riippuvat TC-1 Expression