Krooninen sairaus

tiivistelmä

Androgeenireseptorin (AR) variantteja liittyy vastustuskykyä androgeenihoito sekä ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ja kliinisistä näytteistä. Nämä havainnot tukevat hypoteesia, että AR isoformi kerääntyminen on seurausta valikoivaa terapeuttista paineita täyspitkä AR. PTEN puutteellinen eturauhassyöpämallin etenee hyvin määritelty kinetiikka mukaan lukien eteneminen kastraatio kestävä eturauhassyövän (CRPC). Vaikka kirurgisen kastraation ja enzalutamide hoidot saatiin alustava hoitovaste,

PTEN

– /-

epithelia edelleen lisääntyä myötääminen paikallisesti invasiivisia primaarikasvaimen patologia. Että useimmat epiteelin edelleen AR positiivinen, mutta ligandin riippumaton, viittaa läsnäolo onkogeenisten AR variantteja. Ongelman hypoteesin, olemme käyttäneet paneelin äskettäin kuvattua

PTEN

– /-

kasvainsolulinjoissa johdettu niin hormoni ehjä (E4, E8) ja kuohittu PTEN mutantteja (CE1, CE2) seurasi RACE PCR tunnistaa ja kuvata kolme uutta katkaistu, aminopään sisältävä AR variantteja (MAR-Va, b, c). Vaihtoehdot näkyvät paitsi säilynyt koko etenemisen mutta korreloivat lähes täydellinen menetys täyspitkän AR (AR-FL) at kastraatiotasojen androgeenitason. Yli-ilmentyminen varianttien johtaa tehostetun transkriptionaalista aktiivisuutta AR taas kaataa tutkimusten vähennetään transkription ulostulo. Yhdessä tunnistaminen katkaistun AR varianttien ehdollisen PTEN poisto malli tukee rooli ylläpitämiseksi CRPC fenotyyppi ja antaa lisää terapeuttisia sovelluksia ovat prekliinisen mallin.

Citation: Liang M, Adisetiyo H, Liu X, Liu R, Gill P, Roy-Burman P, et ai. (2015) tunnistaminen androgeenireseptorin Splice variantteja PTEN Puutteellinen Hiiren Eturauhassyöpä Model. PLoS ONE 10 (7): e0131232. doi: 10,1371 /journal.pone.0131232

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 01 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 29 toukokuu 2015; Julkaistu: 21 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Liang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Tietopaketti.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat NIH avustuksen RO1CA059705 PR, PCF Young Investigator Award ja Icahn School of Medicine Cancer Research Funds myönnetään DJM.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä solut on oletettu edetä kastraatio vastuksen läpi lukuisia androgeenireseptorin (AR) muutokset kuten vahvistus, geeni uudelleenjärjestelyt tai mutaatioita, muuttunut ilmentyminen transkription yhteistyötä sääntelyviranomaisten ja

de novo

steroidogeneesiin [1-6]. Viime aikoina tutkimukset ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ja kudoksissa ovat tunnistaneet läsnä AR silmukointivarianteista (AR-Vs), joka voi olla säädelty vastauksena kastraatio ja resistenssiä androgeenireseptorin täsmähoitoihin [7-9] [10 ] [11]. Androgeenireseptorin kuuluu steroidireseptoriperheen transkriptiotekijän perheen ja koostuu N-terminaalinen transkription aktivaatiodomeeni (NTD, exon1), DNA: ta sitovan domeenin (DBD, eksoni 2 ja 3), joka on sarana-alue (eksoni 4), ja C-pään ligandia sitovan domeenin (LBD, eksoni 4-8) [12,13]. Tähän mennessä jopa 15 erilaista AR-vs puuttuu eri osissa LBD on raportoitu ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa CWR-R1, 22rv1, VCAP ja LuCaP ksenografteissa [14-21]. Tästä huolimatta AR isoformit pysyvät huomattavasti tutkittu ilmiö prekliinisissä hiirimalleissa eturauhassyöpäkudoksille rajoittuvat kahteen AR-vs ilmoittama käyttämällä Myc-Cap solulinjassa [15]. Tähän mennessä ei AR variantteja on raportoitu ensisijainen elin prekliiniset hiirimallissa eturauhassyöpää.

PTEN

null hiirimallissa eturauhasen syöpä on huonosti reagoivien androgeeniablaatio hoito, mukaan lukien kirurgisen kastraation ja androgeenireseptorin täsmähoitoihin [22] [23] [24]. Vaikka kohonnut PI3K /Akt signalointi on osoitettu antavan merkittäviä selviytymisen vihjeiden mukaisesti kastroitu olosuhteissa, useimmat epiteeli pysyy androgeenireseptoria positiivinen. Tämä havainto herättää mahdollisuuden, että ligandin riippumattomat muodot androgeenireseptorin voi olla helpottaa selviytymistä ja jatkoi etenemistä. Olemme ottaneet monitahoista lähestymistapaa, joka kohdistuu tämän hypoteesin mukaan lukien karakterisointi ja soveltaminen useita uusia, PTEN puutteellinen, hiiren eturauhassyövän solulinjoissa [25] [26] ja vastaavat primaarikasvaimen malli.

Olemme tunnistaneet kolme uutta variantteja androgeenireseptorin (kutsutaan MAR-Va, b, c). Nämä AR varianttia sisältävät AR-NTD vain yksi, joka sisältää osittaisen sekvenssin päällekkäisyyttä AR-LBD. Suhteellinen ilmentyminen Näiden varianttien paitsi lisää vastauksena kastraatio vaan vastauksena AR täsmähoitoihin lukien casodex ja enzalutamide. Yllättävää kyllä, kun progressio pitkällä aikavälillä kastraatiotasojen androgeenitason havaitsimme huomattava vähennys täyspitkä AR mutta ylläpito tunnistettujen isoformeja. Funktionaaliset tutkimukset osoittivat, että yli-ilmentyminen tai kaataa AR-Va ja AR-Vc voitaisiin säädellä AR transkription lähdön.

Yhdessä meidän tiedot tukevat läsnäolo uuden AR variantteja, jotka voivat toimia tärkeänä avustajat aikana etenemiseen CRPC. Variant tunnistaminen myös merkittävästi parantaa hyödyllisyyttä PTEN null eturauhassyöpämallin olipa ymmärtää funktion AR ja järjestelmänä arvioitaessa hoitoja kohdistamista resistenttien androgeenireseptorin.

Tulokset

tunnistaminen romaani AR varianttien johdetut solulinjat PTEN null eturauhassyöpämallin

Koska osa tutkimuksista androgeenireseptorin (AR) funktio ja mekanismit CRPC etenemisen, olemme hiljattain tunnettu neljä uutta hiiren eturauhassyöpä johdetut solulinjat joko hormonin ehjä (E4, E8) tai kastroitava (CE1, CE2)

PTEN

null mutanttihiirissä. Solulinjoja luonnehtia olevan

PTEN

– /-

, jolla PI3K /Akt signalointi ja ominaisuudet primaarikasvaimen malli [25] [26]. Määrittämään läsnäolon androgeenireseptorin (AR) variantit, haimme 3 ’RACE on cDNA syntyvät E8 ja CE1 ratoihin eteenpäin alukkeita ankkuroitu exon1 hiiren AR (S1 taulukko). Tällä puolueeton lähestymistapa, amplifioimme AR-mRNA: poly (A) hännät myös AR-Vs potentiaalisten uusia 3 ’sekvenssit. Seuraavaa sisäkkäistä PCR, havaitsimme useita ainutlaatuisia sekvenssin tuotteet (kuvio 1a, S1 kuvio). Kuten odotettiinkin, pisin (~ 2 kb) bändi oli täyspitkä AR (AR-FL), joka sisältää sekvenssit ylävirtaan poly (A) alue, joka sovitettu 3’UTR hiiren AR (MAR) mRNA. Kloonaus ja sekvenssin analyysit ~ 850 emäsparin PCR-tuotteet osoitti että on olemassa useita ainutlaatuisia hiiren AR-vs (MAR-Vs) in E8 ja CE1 soluja. Keskityimme kolme ainutlaatuista selostukset. Ensin lyhyt AR isoformi löytyy E8 linja, säilyttäen eksonit 1-4 päässä Mar mRNA, jota seuraa ainutlaatuinen 175 emäsparin sekvenssin havaittiin tasata AR intronialueesta vieressä eksonia 4 jota kutsutaan eksonin 4a (m4a) tai variantti AR-Va (kuvio 1 a ja 1 b). Molekyylirakenteen AR-Va on analoginen 5′-säilyttäen eksonit 1-4, mutta eri koostumuksissa 3’-sekvenssit aiemmin on kuvattu hiiren MAR-V4 [15] ja ihmisen ARV

567es [27]. Seuraavaksi kaksi uutta AR-Vs mahdollisesti ainutlaatuinen vaihtoehto silmukointipaikoista havaittiin CE1 soluissa. Kun seurata niiden sekvenssit hiiren genomiin, huomasimme, että 442-emäsparin ja 495 emäsparin sekvenssit sovitettu introni 1 ja saumattu eksoni 1, jota tarkoitetut M1B ja M1C variantteja. Vältetään mahdolliset sekaannukset nimikkeistön ARV raportoitu ihmisen eturauhassyövän malleja, nimesimme nämä kolme uutta AR variantteja kuten hiiren AR-Va, b, c (MAR-Va, b, c), joista Mar-Va ensimmäiseksi tunnistettiin in E8, jossa on MAR-Vb ja MAR-Vc CE1 (S1 Kuva). Käyttämällä edellä solulinjojen määritimme suhteelliset ekspressiotasot kunkin variantin. Mielenkiintoista, Mar-Va ilmentyminen oli korkein E4 ja E8 linjat taas Mar-Vb ja MAR-Vc osoitti korkeampi ilmaisun CE1 ja CE2 linjat. Kaikki variantit olivat huomattavasti pienemmät ilmaisun kuin AR-FL (S2 Kuva).

a) tunnistetiedot mar variantteja (a, b, c) solulinjat visualisoidaan käyttämällä tavanomaista PCR. b) Reaaliaikainen PCR arviointi AR varianttien monistettiin E8 solujen cDNA visualisoidaan geelielektroforeesilla. c, vasen) havaitseminen AR isoformeja ihmisen ja hiiren eturauhassyövän solulinjoissa ja c, oikealla) densitometrian analyysi variantin ja AR-FL proteiinin ilmentymisen normalisoida p-aktiini (*, p 0,05). d) Kaaviokuva rakenne mar variantteja (a, b, c) ja AR täyspitkä (AR-FL). Yksiväriset laatikot edustavat yhteistä eksonit AR-FL ja kuoriutui kasetit osoittavat arvoituksellinen eksonit. Bold suorat viivat viittaavat puhtaaksi sekvenssit niiden mRNA: iden. Ennustettu aminohapposekvenssi käännetty m4a ja M1C on listattu (alempi kaaviot).

Käyttäen Ape plasmidia muokkausohjelmaan pystyimme päättelemään moolimassat Mar-Va ~ 80 kD ja markkinoi Vb, Vc on ~ 54 ja 56 kDa, joka vastaa meidän tunnistaa selostukset (kuvio 1 d, S2 taulukko, S3 taulukko). Sen varmistamiseksi, AR-vs voitiin havaita proteiinin tason käytimme vasta-aineen kohdistaminen Animo päätepisteestä AR (Santa Cruz, N-20) ja tutkittiin lysaatit E8, CE1 ja kastroitu androgeenireseptorin johdannaiset (E8-CSS, CE1 -CSS). Arvioinut rinnalla ihmisen linjat, LNCaP ja PC3, havaitsimme AR-FL (~ 110 kDa) ja kolme suurta bändejä kotipaikka ~ 75 kD, 85 kDa ja alempi lajien ~ 50 kD ja ~ 56 kD (kuvio 1 c, S2 taulukko).

androgeeniablaatio kasvattaa suhteellista ilmentymistä AR varianttien

tukemiseksi edelleen rooli AR varianttien aikana CRPC pidimme vaikutus antiandrogeeninen hoito. Voit tehdä tämän, me haastoi E8 ja CE2 solujen linjat joko castrate androgeenien viljelyolosuhteet (hiilellä erotettua seerumia, CSS) tai Casodex (10 uM) 3 päivän ajan. Silmiinpistävän, CSS viljelyolosuhteet havaitsimme kasvoi transkriptin ilmentyminen kaikissa kolmessa eri vaihtoehdoille eniten kertainen lisäys havaittiin Mar-Va in E8 soluissa (MAR-Va, 3,5-kertaiseksi, Mar-Vb, 2,5-kertaiseksi, Mar-Vc 2,2 kertaiseksi, p 0,05), kun normalisoitu täyspitkää AR (kuvio 2a). Käyttämällä casodex, myös havaittu tilastollisesti merkittävän parannuksen kaikista AR vaihtoehdot käyttävät E8 ja CE2 linjat (Kuva 2b).

a) kulttuuri hiiren eturauhassyövän (E8) solulinjojen anti androgen hoitoon kuten hiiltä riisuttu seerumia (CSS) (3 päivää) tai b) casodex (10 uM, 3 päivää) johtaa merkittävästi lisääntynyt ilmentyminen AR-isomuotojen normalisoituna AR täyspitkä. c) kirurginen kastraatio PTEN mutanttien (

C

+

; PTEN

L /L

, n = 7) johtaa merkittävään kasvuun suhteellinen ekspressio AR isoformien, kuten havaitaan western blottauksella. d) AR variantti transkriptin ilmentyminen

Wt

, hormoni ehjä ja kastroitu mutanttihiirillä normalisoida AR-FL tasot (*, p 0,05; **, p 0,01).

sitten tutki AR isoformit olemassa

in vivo

käyttäen hormoni ehjä PTEN-null kasvaimet (

C

+

; PTEN

L /L

; n = 6) ja onko progressio kastraatiotasojen androgeenitason voisi muuttaa niiden ilmaisua. Käyttämällä resekoitu lohkoa eturauhasen (vatsa-, selkä- sivusuunnassa, etummainen) arvioimme ilmentymistä AR hormonin ehjä mutanttien 2, 13 ja 23 kuukauden havaittu läsnäolo AR-FL (~ 110 kD) ja kolme muunnelmaa pienennetty noin 45-50, 64 ja 75 kD (kuvio 2c). Niistä 6 mutantit analysoitiin, havaitsimme vain yksi 13 kuukautta kohortti alentunut AR-FL lauseke (*, tähti). Silmiinpistävän, PTEN mutantteja, jotka oli kirurgisesti kastroitu (

C

+

; PTEN

L /L

; n = 7) havaitsimme 6/7 on merkittäviä menetyksiä AR-FL mutta säilytti ilmaus AR isoformeja (kuvio 2c, oikealla). Quantitative RNA (q-PCR) mittaus Mar-Va, b ja c vahvisti korkeus isomuotojen hormonin ehjä ja CRPC PTEN puutteellinen syöpien suhteen

Wt

prostates ja normalisoidaan AR-FL (kuvio 2d ) (**, p 0,01). Edelleen yhdistää läsnäolon katkaistun AR-Vs kastraatio kestävä eteneminen, käsittelimme PTEN hormonin ehjä mutantteja (

C

+

; PTEN

L /L

, n = 6), jossa enzalutamide (10 mg /kg,

kautta

hiiren chow

ad libitum

) ja 10 viikkoa, mitä seurasi immunohistokemiallisesti käyttämällä vasta-aineita vastaan, joko AR aminopäästä (AR, N-20) tai AR C-terminaalissa (AR, C-19). Yhdenmukainen biokemian, havaitsimme hyvin alhainen havaitseminen täyspitkä AR mutta vankka värjäystä varten amino, joka sisältää variantteja (S3 kuvassa). Nämä havainnot osoittavat, että progressio kastraatiotasojen androgeenitason voivat valita vastaan ​​täyspitkä AR muttei AR muunnoksia.

transkriptionaalista aktiivisuutta täyspitkä androgeenireseptorin voimistaa AR variantteja

in vivo

analyysi viittaa siihen, että suhteellinen ilmentyminen AR isomuotojen voi jatkua aikana CRPC ja sai meidät tutkimaan vaikutuksia suhteellisesta kasvusta ilmentyminen Mar-Vs PTEN puutteellinen eturauhassyöpää. Voit tehdä tämän, meillä toteutettiin useita transkription määrityksiä käyttäen PSA-lusiferaasireportteriplasmidin [28]. Ensinnäkin kunkin muunnoksen ja AR-FL oli sub kloonattiin ekspressiorakenteiksi seuraa ilmaisu validointi käyttämällä western blotting ja AR (N-20) vasta-aine (kuvio 3a).

a) Western blotting käyttämällä AR ( N-20) vasta-aine, vahvistaa kloonatun AR varianttien COS-1-soluissa. b) yli-ilmentyminen AR variantit E8 soluissa käsitelty kontrolli, DHT (0,03, 0,3 nM) tai DHT + Casodex (BIC, 1 uM). (Ohjaus

vs

. Mar-Va = vertailut 1-4; ohjaus

vs

. Mar-Vc = vertailut 5-6) (*, p 0,05, **, p 0,01 ). c) Co-immuunisaostuksissa COS-1-solut transfektoitu AR-FL ja joko AR-Va-myc (keskellä) tai AR-Vc-myc (oikealla).

Löysimme ohjaus E8 solujen reagoivan DHT annoksesta riippuvaisella tavalla (0,03-0,3 nM) (kuvio 3b), kun taas CE1 solut eivät reagoi DHT ellei eksogeenisen rotan AR-FL otettiin kautta transfektion (S4 kuvassa). Me seuraavaksi yliekspressoidaan Marva, b tai c osaksi E8 ja CE1 solujen ja havaittiin, että Mar-Va isoformi huomattavasti transkriptionaalisen reportterin aktiivisuus verrattuna ohjata plasmidin transfektioita (pylväsdiagrammi vertailut 1-4, *, p 0,05, ** , p 0,01). Mielenkiintoista, Mar-Vc transfektio täydennetty reportteri tasolle vasta läsnä androgeenien (vertailujen 5-6, *, p 0,05), kun taas Mar-Vb oli tilastollisesti merkityksetön vaikutus (p 0,05) (kuvio 3b).

ymmärtää mahdollisen mekanismin, jolla Mar-Vs aktivoida toiminnon AR-FL, suoritimme yhteistyössä immuunisaostuksissa analysoimalla variantin AR-FL vuorovaikutus. Plasmidit, jotka koodaavat myc-merkitty Mar-Va ja MAR-Vc tuotettiin tässä määrityksessä perustuu havaintoon, että nämä kaksi ARV toimia samanaikaisesti aktivoida AR-FL yhdessä useamman testatuista solulinjoista. AR negatiivinen, COS-1-soluja transfektoitiin rotan AR yksinään (+ tyhjä vektori) tai yhdessä Mar-Va-myc (Va-myc) tai MAR-Vc-myc (Vc-myc) ekspressiorakenteiksi seurasi immuunisaostuksissa Mar -Va /Vc-proteiineja käyttäen myc-epitoopin. Western blot analyysit olivat suoritettiin sitten käyttäen vasta-ainetta, joka on spesifinen C-päähän AR, joka tunnistaa vain AR-FL. Löysimme 110 kDa AR-FL bändi olla läsnä Va-myc immunopresipitaateista osoittaa, että Mar-Va voi muodostaa kompleksin AR-FL. Kuitenkin, koska merkittävä AR-FL vyöhyke ei havaittu VC-myc immunosaostumissa, me päätellä, että stabiili kompleksinmuodostajia oli vähemmän tehokas tai ei muodostettu AR-FL ja AR-Vc-havainto, joka on yhdenmukainen vähensi merkittävästi AR-Vb ja AR-Vc välitteistä co-aktivoitumisen PSA reportteri (Kuva 3c). Nämä tiedot viittaavat siihen, että lisääntynyt ilmentyminen Mar-Vs voidaan parantaa vakautta AR-FL mikä parantaa androgeeniriippuvaisessa reportterimääritys lähtö. Nämä havainnot ovat myös samanlaisia ​​kuin saatiin ihmisen AR-V5, 6, 7es [27].

Sitten katsotaan vaikutuksia variantti estoa PSA transkription toimittaja ulostulo. Siksi meidän suunniteltu Dicer alustan siRNA (DsiRNAs), joka on kohdistettu erityisesti Mar-Va tai c, mutta ei täyspitkä AR. Kautta transfektion näistä siRNA: iden osaksi E8 tai CE1 soluja yhdessä lusiferaasireportteri- plasmideja, havaittiin, että pudotus joko Mar-Va ja Vc vähentää AR transkriptionaalista aktiivisuutta molemmissa solulinjoissa (kuvio 4a). Variant siRNA olivat yhtä voimakkaita in E8 soluissa, kun taas CE1 soluissa, knockdovvn Mar-Vc saatiin vahvin vaikutus (tuloksia ei ole esitetty). Tehokkuus variantti kaataa esimerkkinä on q-PCR mittaus Mar-Vc tasot ohjaus ja MAR-VC-siRNA käsiteltyjen E8 soluja (kuvio 4b).

a) E8 transfektoitiin siRNA: illa kohdistaminen joko Mar-Va tai c ja arvioitiin PSA-luc-reportterin aktiivisuus 48 tunnin kuluttua (kontrolli siRNA

vs

. Mar-Va siRNA = vertailuja 1-3; kontrolloida siRNA

vs

. Mar-Vc siRNA = vertailut 4-7). b) validointi siRNA knockdovvn Mar-Vc mitattuna q-PCR (*, p 0,05, **, p 0,01).

Nämä tulokset osoittavat, että Mar-Vs myötävaikuttaa AR transkriptionaalista aktiivisuutta sekä E8 ja CE1 soluja ja että niiden estäminen vastustaa AR aktiivisuutta. Tutkia edelleen, miten aktiivisuutta AR-signalointi voidaan muuttaa aikana CRPC, mittasimme ekspressiotasot AR kohdegeenin,

Fkbp5

[29], jossa käytetään kahta eri

in vivo

manipulointia. Ensin kastroitu

C

+

; PTEN

L /L

mutanttien 6 viikkoa ja analysoitiin hiirten 30 viikkoa ja toinen Poistimme epiteelin AR PTEN puutteellinen prostates (

C

+

; PTEN

L /L

; Ar

L

/Y

) -a mallia olemme aiemmin tunnettu (S5 kuvio) [30]. Samanlainen kuin meidän enzalutamide käsiteltiin mutantteja (S3 kuvassa), havaitsimme vähentää /tappio ilmentymisen distaalisen AR kohdistaminen vasta-ainetta (AR-C19) ja pidettiin ilmentyminen aminopään kohdistaminen vasta-ainetta (AR-N20). Verrattuna hormoni ehjä (AR +) alueilla (S5b kuvio, ylhäällä vasemmalla paneeli, AR + nuolet), FKBP5 ilmentyminen merkitsevästi vähentynyt kastraatiotasolle näytteissä. Koska geneettinen validointi ja ohjaus FKBP5 androgeeniriippuvaisessa modulaatio, arvioimme AR ja FKBP5 ilmaisun PTEN-null; AR-null alueilla

C

+

; PTEN

L /L

; AR

L

/Y

mutanttien tarkkailemalla täydellinen menetys epiteelin AR (AR- alue) ja lähellä menetys FKBP5 proteiinin ilmentymisen (S5b kuvio, ylhäällä vasemmalla, AR- nuolet). Edelleen, käyttämällä CRPC linjat johdettu PTEN null hiirimallissa [30], me validoitu androgeenireseptorin aktivointi

Fkbp5

lisättäessä eksogeenisen androgeenin (S5c kuvio). Nämä tiedot osoittavat, että kirurgisissa tai geneettinen induktio CRPC PTEN-null tumorgenesis, AR-FKBP5 signalointi akseli on alentunut.

Keskustelu

yli-ilmentyminen androgeenireseptoreita (AR) esiintyy merkittävästi määrä myöhäisessä vaiheessa eturauhasen syöpiä mukaan lukien etenee kastraatio vastarintaa. Tunnistaminen AR variantit ihmisen CRPC solulinjoissa ja kliinisissä näytteissä viittaa siihen, että AR variantit voivat helpottaa jatkuvaa AR onkogeenisiä toiminto läsnäolosta huolimatta AR täsmähoitoihin [31]. Tämä voi johtua siitä, että suurin osa AR-Vs tähän mennessä tunnistetut ennustetaan koodaavat proteiineja, joilla ei ole LBD mutta säilyttää N-terminaalista transaktivaatiodomeenin toimii näin ollen konstitutiivisesti aktiivinen transkriptiotekijät. Tämä osoittaa, että AR LBD on tarpeeton AR transkriptionaalisen aktiivisuuden ja jatkoi panos syövän etenemistä [27] [32] [33]. Tämän seurauksena ymmärtämään prosessia, jolla AR variantteja syntyy ja niiden panos syntymistä CRPC on tullut alueen intensiivisen tutkimuksen.

homologiset järjestelmät eturauhassyövän (hormoni riippuvuus, kastraatio vastus ja solulinjat) joka saadaan käyttämällä PTEN null malli, muodostavat erinomaisen perustan arvioida taudin taudin alkamisen ja etenemisen [22]. Tutkimuksemme, ensimmäistä kertaa, kuvailee luonnollinen esiintyminen näiden AR NTD variantit PTEN puutteellisia hiiren syöpäsolujen ja ensisijainen elin sivustolla. Mikä tärkeintä, me osoitamme, että tunnistettu AR-vs eivät ole staattisia vaan muuteta ilmaisun aikana CRPC etenemisen. Kolme hiiri AR variantteja tunnistettu tässä tutkimuksessa koostuvat uusia molekyylirakenteet. Mar-Va, joka säilyttää vierekkäin eksonit 1-4 seurasi lukea läpi osaksi intronin 4 ja on karkeasti analoginen raportoitu Mar-V4 [15] ja AR

V567es [27] lukuun ottamatta ainutlaatuisen aminohapon jota koodaa 3′-päässä. Mar-Vb ja MAR-Vc koostuvat kahdesta eri alueilla sijaitsevat intronin 1 saumattu jälkeen eksoni 1, mikä päätelty AR-vs proteiinisekvenssin sisältää vain NTD. Ns AR-V8 tunnistettu 22rv1 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen esiintyy lähinnä ihmisen vastine sisältävä AR-NTD seuraa pitkähkö 33-aa tail koodaa eksoni 3 ”sijaitsee intronin 3 [19]. Samankaltaisuus tunnistettu hiiren variantteja ja aiemmin tunnistettu ihmisen solulinjoissa, viittaa siihen, että solujen stressiä hormoniablaatioterapia voi toimia yhteisten tavalla valikoinnin aikana varianttien AR variantin populaatiot

Viimeaikaiset kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, Har-V7 olevan koholla CRPC, etäpesäkkeitä, yhdessä biokemiallisten uusiutuminen ja huono kliiniseen tulokseen [11] [17] [18] [34]. Yksi merkittävistä havainnoista Tutkimuksemme on kyky kastraatio tai AR täsmähoitoihin valita hiiren AR isoformeja. Nämä tiedot paitsi osoittavat ylimääräisen mekanismi, jonka

PTEN

puutteellinen syöpäsolujen voi edetä CRPC mutta myös vaikuttaa tuntuvasti hoitojen tarkoituksena on suoraan kohdistaa ligandia sitovan domeenin androgeenireseptorin. Mielenkiintoista, kun havaitsimme parannettu suhteellinen ilmentyminen mARVs johdetuissa solulinjoilla viljelmässä, ilmentyminen AR-FL säilyi joka on erilainen kuin mitä havaittiin hiiren ensisijainen kasvaimia. Tämä voi johtua monoklonaalisen luonteesta solun johtaminen

verrattuna

keskenään hyvin erilaisia ​​perusnäytteiden. Se voi myös liittyä yleinen ylläpito solulinjojen hormoni ehjä olosuhteissa

verrattuna

pitkän kastraatiotasolle olosuhteita käytetään ylläpitämään primaarikasvaimia. Silmiinpistävä havainto, että AR-FL laskivat progressio kastraatiotasojen androgeenitason tai kroonisen enzalutamide altistumisen esitetä pakottavia tukea että AR-FL valitaan vastaan ​​ja että ARV voivat helpottaa edelleen Jälleenkytkentätoiminto. Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että

PTEN

null mutantit ovat huonosti reagoivat sekä kastraatio ja enzalutamide hoito [23] [35] [24]. Tuloksemme osoittivat suhteellinen kasvu AR-NTD variantit, sekä

in vitro

ja

in vivo

, joka on sopusoinnussa puute vastaus AR täsmähoitoihin tässä mallissa.

Havaitsimme valmiuksia Mar-Va, mutta vähennetään Mar-Vb ja Mar-Vc, parantaa aktiivisuutta AR transkription reportteri määrityksiä. Tämä voi johtua siitä, että MAR-Vb ja Vc puuttuu DNA: ta sitova motiivi. Tuloksemme kuitenkaan voi sulkea pois mahdollisuutta varianttien kuten Mar-Vb ja Vc on onkogeenisen toimintoa vaihtoehtoisia mekanismeja. Mielenkiintoinen, uusi AR variantti samanlainen rakenne tunnistettiin useissa ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa [19]. Ns AR8 puuttuu myös DNA: ta sitova domeeni ja siten kuten Mar-Vb ja MAR-Vc tunnistettu tässä, tuskin toimia transkriptiotekijä omasta. Pikemminkin, AR8 on osoitettu liittyvän Src ja EGF-reseptorin ja siten edistämään parannettu fosforylaatiota AR [19]. On mielenkiintoista tulevia tutkimuksia puuttua onko Mar-Vb ja Vc pystyvät samankaltaisia ​​solukalvon yhdistysten ja mahdollisen panoksen CRPC.

AR-V kaataa tutkimuksia, mikä johti vähentyneeseen AR transkriptioaktiivisuutta , paljastaa potentiaalisia terapeuttisia sovelluksia variantin kohdistaminen aikana etenemiseen CRPC. Läsnäolo katkaistu varianttien PTEN puutteellinen hiiri on sopusoinnussa myös kliininen havainto säilyy AR ilmaisun läsnäolosta huolimatta voimakas AR kohdistettuja hoitomuotoja, enzalutamide. Koska Mar-Va, b, ja c osoitti ero vastauksia ilmentymisen muutoksia kastraatio tai casodex meidän tutkimuksissa tarkka osuus (t) yksittäisten varianttien, ja niiden mahdolliset yhteistoiminnalla kohti CRPC vielä selvittämättä ja riippuu todennäköisesti solujen yhteydessä [8]. Tulevaisuuden eteneminen tutkimukset voivat harkita Mar-V solujen lokalisoinnit, vuorovaikutusta muiden kasvaimia synnyttävän väyliä ja vaikutus

in vivo

etenemiseen.

Havainnot esitetään tässä antaa näyttöä siitä, onko uusien varianttien havaittavissa ensisijainen elinjärjestelmään geenimuunneltujen PTEN nollahiiriä korostettu tehostetun variantti ilmaisun aikana progressio kastraatiotasojen androgeenitason. Tulevaisuuden terapeuttiset tutkimukset voivat harkita, onko varhainen kohdentaminen tunnistetuista AR isoformeja voi estää tai hidastaa etenemistä CRPC. Tämä mar-Va ja Vc esto vähensivät AR transkription toiminto antaa perustelut testaus farmakologisten kohdentamista AR variantteja. Koska tuloksemme, on houkuttelevaa spekuloida, että käyttöönotto AR-FL takaisin tiettyjä PTEN puutteellinen CRPC sisältävien solujen AR Vs voi palauttaa tällaisia ​​soluja androgeenien puute hoitoa.

Methods

Soluviljely ja hiiri eturauhasessa

E4, E8, CE1 CE2 [25] [26] ja CaP8, P8 [36] solulinja perustettiin ehdollisesta

PTEN

-null hiirimallissa. LNCaP ja PC-3-solut hankittiin ATCC. C4-2B ja COS-1 solut olivat lahja tri Baruch Frenkel (University of Southern California, LA, CA) ja tri Allen Epstein (University of Southern California, LA, CA), tässä järjestyksessä. Johdannaiset vanhempien solulinjoja kulttuurin kautta 10% CSS (hiilellä erotettua Serum, Cellgro) enintään 18 päivää. E8 ja CE2 soluja käsiteltiin myös normaalissa säilyttää median kanssa lisäämällä 10 uM antiandrogeeni, bikalutamidin (Sigma-Aldrich) 6 päivää. Eturauhaskudokset kerättiin hiirillä ADCA tai CRPC kasvaimet sekä villityypin niitä eri ikäryhmissä. Leikellään eturauhanen käsiteltiin nopea jäädyttäminen nestetypessä ja varastoidaan -80 ° C: ssa lisäanalyysiä varten.

kloonaus ja konstruktit

Yhteensä solu-RNA: t eristettiin E8 ja CE1 by RNAqueous-4PCR Kit (Life Technologies), jota käytetään lähteenä. Havaitseminen Hiiren AR silmukoitumisvariantit niistä saavutettiin GeneRacer Kit SuperScript III RT ja TOPO TA Cloning Kit Sequencing (life technologies) kohti valmistajan protokollia. Lyhyesti, uutetaan RNA: t olivat ensimmäinen käänteiskopioidusta käyttäen GeneRacer oligo (dT) aluketta ja SuperScript III RT moduuli sarjasta. RACE-valmis cDNA alistettiin 3 ’nopea monistus cDNA lopussa PCR: n (3’ RACE-PCR) käyttämällä eteenpäin geenispesifistä aluketta (GSP) ja kääntää GeneRacer 3 ’aluketta GeneRacer Module. Toinen kierros sisäkkäisiä PCR suoritettiin edelleen vahvistettavaksi käyttämällä eteenpäin GSP sisäkkäistä aluketta ja reverse GeneRacer 3 ’sisäkkäisiä pohjamaali annetaan kit. SuperTaq Plus-polymeraasia (Life Technologies) käytettiin sekä 3’RACE ja sisäkkäistä PCR: ää. Eteenpäin GSP ja sisäkkäisiä alukkeita ankkuroitunut exon1 (S1 taulukko) ennustetun variantteja (S2 taulukko) käyttämällä variantti tiettyjä RACE alukkeita (S3 taulukko). 3 ’RACE ja sisäkkäistä PCR-tuotteet tutkittiin sitten standardin TA sub kloonaus ja sekvensointi käyttäen TOPO TA Cloning Module. Ape plasmidia Editor käytettiin tässä tutkimuksessa analysoidaan sekvensointi tuloksia, ennustaa proteiinisekvenssien ja tuottaa tekstiä karttoja mARVs (S3 taulukko).

plasmidikonstrukteja käytetty tässä tutkimuksessa olivat: Rat AR täyspitkä (Dr. Robert Matusik, Vanderbilt University, Nashville, TN), ihmisen AR täyspitkä (Dr. Jeremy Jones, City of Hope, Duarte, CA), ja PSA-lusiferaasireportteri ja pcDNA3.1-myc (Dr. Parkash Gill, University of Southern California, LA, CA). pCR4-TOPO ostettiin TOPO TA Cloning Kit Sequencing (life technologies).

CDS (koodaussekvenssit) varten Marva, Vb ja Vc monistettiin PCR: llä cDNA: E8 ja CE1 käyttäen alukesarjoilla liitti koko avoimen lukukehyksen (ORF), ja osa kloonattiin pcDNA3.1 myc-HisC. Tuottaa ARVA-myc ja ARVc-myc konstruktioita, reverse-alukkeet suunniteltu uudelleen ankkuroidaan ylävirtaan oman lopetuskodonia ja in-kehystetty ORF ekspressiovektorin. Hifi AccuStart Taq DNA Polymerase (Quanta Biosciences) ja Hotstar Taq-DNA-polymeraasia (Qiagen) sovellettiin PCR-kloonaukseen. Sekvenssit pohjamaali käyttää kloonaamaan Va, Vb, Vc, Va-myc ja VC-myc olisi tarjottu S4 taulukossa.

PCR ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

Solun totaali-RNA: t uutetaan kaikki vanhempien ja muiden johdannaisten solulinjojen ja sitten käänteistranskriboitiin käyttämällä oligo (dT) aluketta ja SuperScript III First-Strand Synthesis (Life Technologies). RNA-näytteet, joita käytetään erilaisissa määrityksissä oli eristetty soluista, joilla on eri erissä. Tavanomaiset PCR suoritettiin cDNA käyttämällä samaa eteenpäin aluke ankkuroitunut exon1 pariksi reverse-alukkeen spesifinen Mar-Va, b, c ja AR-FL, vastaavasti (S5 taulukko). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä ja data-analyysi on kuvattu aikaisemmin. Reaaliaikaista alukesarjoista suunniteltu nimenomaan ja ainoastaan ​​täydentää kunkin ARV ja AR-FL lueteltiin S6 taulukossa.

Transfektio ja lusiferaasireportterista määritys

1-2 päivää ennen transfektiota solut sijoitettiin väliaineessa, joka sisälsi hiilellä erotettua seerumia (CSS). Kaikki transfektiot, altaat solut transfektoitiin käyttämällä Lipofectamine Plus (Invitrogen) ja tyhjän vektorin kontrolli plasmidin, täyspitkän AR-plasmidin, tai AR silmukointivariantti plasmideja yhdessä androgeenien reagoiva konstruktit MMTV-tulikärpäsen lusiferaasi tai PSA-tulikärpäsen lusiferaasi [28 ] ja androgeenin erottelua Renillaa lusiferaasia ohjaus PRL-SV40 (Promega). Tyhjä vektorisäätö plasmidia käytettiin tasaantua kokonais-DNA kaikissa transfektioissa. Seuraavana päivänä solut maljattiin neljänä lääkkeiden kanssa 96-kuoppaisilla levyillä. 24h myöhemmin Lusiferaasiaktiivisuudet määrällisesti (Dual lusiferaasianalyysissä kit, Promega) on (TECAN) ja tulikärpäsen signaali normalisoidaan Renilla signaali ohjaamaan solujen määrä.

Co-Immunosaostusmääritys

COS-solut transfektoitiin Marva-myc tai mARVc-myc yhdessä Rat AR-FL käyttäen Lipofectamine 2000 (Life Technologies) kohti valmistajan protokollaa. Noin 48 tuntia.