Krooninen sairaus

tiivistelmä

syntyminen kastraatiotason vastustuskykyisten eturauhassyöpä ( CRPC) myötävaikuttaa korkeaan kuolleisuuteen potilaiden diagnosoitu eturauhassyöpä (PCA), joka osittain syynä voi olla olemassaolon ja syntyminen syövän kantasoluja (CSCS). Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että vapautetuilla ilmentyminen MikroRNA (miRNA) edistää aloittamista ja etenemistä PCa. Joukossa useita tunnettuja miRNA, anna-7 perhe näyttää avainasemassa toistumiseen ja etenemistä PCa säätelemällä CSCS; kuitenkin, mekanismi, jonka avulla-7 perheen edistää PCa aggressiivisuus on epäselvä. Enhancer of Zeste homologin 2 (EZH2), oletetun tavoite let-7 perhe, osoitettiin ohjata kantasolujen toiminto. Tässä tutkimuksessa löysimme menetys let-7 perheen vastaavien yli-ilmentyminen EZH2 ihmisen PCa kudosnäytteet, etenkin korkeamman Gleason palkkaluokkaan kasvaimia. Yli-ilmentymisen let-7 transfektoimalla let-7 esiasteiden väheni EZH2 ilmaisun ja tukahdutettu klonogeeniset kyky ja palloja muodostavan kapasiteetin Eturauhassyövän soluja, mikä oli sopusoinnussa esto EZH2 3’UTR lusiferaasiaktiivisuuden. Huomasimme myös, että hoito Eturauhassyövän soluja BR-DIM (muotoiltu DIM: 3,3′-di-indolyylimetaani Bio Response, Boulder, CO, lyhennettynä BR-DIM) sääteli let-7 ja alassäädetty EZH2 ilme, sopusoinnussa esto itseuudistumisen ja klonogeeniset kapasiteettia. Lisäksi BR-DIM interventio meidän käynnissä vaiheen II kliinisessä tutkimuksessa potilailla ennen eturauhasen osoitti ylössäätely let-7 yhdenmukaisia ​​alas-säätely EZH2 ilmaisun PCA kudosnäytteiden jälkeen BR-DIM interventio. Nämä tulokset viittaavat siihen, että menetys let-7 välitteisen lisääntyneen ilmentymisen EZH2 edistää PCa aggressiivisuus, joka voitaisiin heikennetty BR-DIM hoitoon, ja siten BR-DIM on todennäköisesti ole kliinistä vaikutusta.

Johdanto-osan: Kong D, Heath E, Chen W, Cher ML, Powell I Heilbrun L, et al. (2012) menetys Let-7 Up-regulation EZH2 in Eturauhassyöpä Yhdenmukainen hankinta Cancer Stem Cell allekirjoitukset vaimennetaan BR-DIM. PLoS ONE 7 (3): e33729. doi: 10,1371 /journal.pone.0033729

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 15 marraskuu 2011; Hyväksytty: 16 helmikuu 2012; Julkaistu: 19 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Kong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat avustusta National Cancer Institute, National Institutes of Health (5R01CA108535-06 ja 5R01CA083695-08) myönnetty FHS. (https://projectreporter.nih.gov/reporter_searchresults.cfm? new=1 icde=4342569 loc=2 CFID=28929570 CFTOKEN=80568291). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on toiseksi suurin syy syövän kuoleman miehillä Yhdysvalloissa tappoi yli 32050 miestä vuonna 2010 [1]. Viimeisten kymmenen vuoden aikana on tapahtunut merkittäviä parannuksia kirurginen hoitovaihtoehtoja potilaille diagnosoitu paikallisia PCa. Eturauhasen leikkaus on myös hyötynyt teknisistä ja teknologia kuten hermoja säästämättä eturauhasen ja robotti prostatektomia. Adjuvanttihoito määritelty lisähoitoa vähentämiseksi tai poistamiseksi paikallista ja kaukainen sairaus, tarjotaan potilaille [2], erityisesti niille, jotka ovat suuri riski toistumisen (kuten usein määritelty d’Amico kriteerit PSA 20 ng /ml, Gleason 8-10, ja vaihe T2c T4) [3].

Sädehoito ja systeeminen hoito erityisesti androgeenien puute hoitoa (ADT) pidetään kohtuullisena adjuvanttina hoitovaihtoehtoja. Potilaat korkean riskin luokkaan on uusiutumisriski on suurempi kuin 50% niiden käyttöikä, mikä ei ole hyväksyttävää. Kuitenkin yksi koskee tarjoamalla adjuvanttihoito kaikkien potilaiden suuren riskin ryhmä on, että vaikka yli 50%: lla potilaista ei toistuisi, on 38-50%: lla potilaista, jotka eivät [4]. Keventää yli-hoitoa tässä potilasryhmässä, täydentäviä välineitä tarvitaan tunnistamaan todella korkean riskin potilailla. Nykyinen työkaluja tutkitaan sisältää ennustavan nomogrammit [5] ja tutkimuksissa arvioidaan geeniekspressioprofilointi, jotka ovat tunnistaneet muutamia markkereita kasvaimen aggressiivisuus [6], [7], vaikka tällaisia ​​päätelmiä ei ole käännetty potilaan hoidossa.

koska kasvaimen uusiutumisen ja etäpesäkkeiden myötävaikuttaa korkeaan kuolleisuuteen, tutkimukset ovat osoittaneet, että aggressiivisuus Eturauhassyövän voitaisiin tiukasti sidoksissa hankintaan syövän kantasoluja (CSC) tai syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja (CSLCs) ominaisuudet. Kehittyvät todisteet osoittavat, että sääntelemättömään ilmentymiseen monien MikroRNA (miRNA) sisältäen let-7 perheen vaikuttaa syövän etenemiseen ja uusiutumisen [8]. MikroRNA ovat luokan ei-koodaavat RNA: t on noin 20-22 nukleotidiä. Ne säätelevät geeniekspressioiden transkription jälkeen sitomalla sivuston 3’untranslated alueen (3 ’UTR) ja kohde-mRNA. Niiden on osoitettu säädellä solusyklin ja kehittymistä ja etenemistä syövän [9]. Anna-7 havaittiin ensimmäisen ja hyvin tutkittu Caenorhabditis elegans. Ihmisen let-7 Perheeseen kuuluu let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7 g, anna-7i ja miR-98. Let-7 perhe on yleisesti katsottu tuumorisuppressorina sopusoinnussa down-regulation onkogeenien kuten Ras [10], suuren liikkuvuuden ryhmä A2 (HMGA2) [11] ja c-myc [12] sitoutumalla 3’UTR näiden kohde mRNA: iden. Lisäksi vähentynyt let-7 ilmentymistä monissa syövissä, mukaan lukien Eturauhassyövän [13], ja se on yhdistetty huono potilaan ennusteeseen keuhkosyövän [14], pään ja kaulan okasolusyöpä [15], ja munasarjasyöpä [16 ].

Mielenkiintoista, anna-7 perheenjäseniä on osoitettu säännellä kyky uusiutua rintasyövän solujen [17] ja PCa solujen säätelemällä kantasolun liittyvät tekijät, kuten Oct4, Sox2, ja Nanog ilmaisun [18]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat myös dokumentoitu, että let-7 voisi säätelemään Lin28 ja Lin28B, mikä puolestaan ​​estää kertymistä kypsän let-7 [19]. Tämä palaute asetus on kriittinen rooli säätelyssä ”stemness” ohjaamalla itseuudistumisen [20] – [23], joka on solun ominaisuus CSCS tai CSLCs liittyy kasvaimen aggressiivisuus ja toistumisen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että let-7 perhe voisi olla keskeinen rooli etenemistä PCa ylläpitämällä ja säätelemällä molekyyli- piirteitä CSCS tai CSLCs PCA; kuitenkin, miten anna-7 perhe osallistuu PCa aggressiivisuus ei tunneta.

Enhancer of Zeste homologin 2 (EZH2) on yksi tavoitteista on antaa-7 perheen miRNA, ja että ilmaus EZH2 on vahvasti liittyvä molekyyli piirteitä sekä normaalit kantasolujen ja CSCS tai CSLCs. EZH2 on histoni-lysiini N-metyylitransferaasi, alayksikköä Polycomb tukahduttavia monimutkaisten 2 (PRC2). Polycomb ryhmä proteiinien tiedetään olevan osallisena säätelyssä geeni tukahduttamisen kautta kromatiinin muutoksia, mikä on välttämätöntä ylläpidosta alkion ja aikuisen kantasoluja [24], [25]. PRC2 sisältää EZH2, Suz12, TE, ja RBAP alayksiköt ja tämän monimutkaisen tiedetään toimivan alkion ja aikuisen kantasoluja tukahduttamiseksi kehitykseen geenejä, jotka ensisijaisesti aktivoida erilaistumisen [26]. Lisäksi lisätutkimukset ovat osoittaneet, että PRC2 tavoite geenit ovat yhdessä käytössä kantasolu sääntelyviranomaisten kuten Oct4, Sox2, ja Nanog [27]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat myös ehdottaneet, että Polycomb ryhmä proteiinit ovat paitsi välttämättömiä alkion kehityksen mutta myös soittaa kriittinen rooli kasvaimen taudin alkamisen ja etenemisen [25]. Yli-ilmentyminen EZH2 on vahvasti sidoksissa syövän etenemisen osittain siksi PRC2 estää E-kadheriinin ilmentymisen, joka edistää epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) syöpäsoluissa [28], ilmiö, joka muistuttaa CSCS tai CSLCs. Suz12 on havaittu välittävän E-kadheriinin inhibitio snail1 [29]. Vielä tärkeämpää on, EZH2 suoraan säätelee DNA: n metylaatio toimimalla rekrytointi alustan DNA metyylitransferaasi [30]. Edellisessä tutkimuksessa havaittiin, että tasot EZH2 ja Suz12 mRNA nostettiin PC3 PDGF-D-soluja (EMT-fenotyypin solut) verrattuna PC3 Neo soluihin [18]. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että PRC2 voi edistää EMT ominaisuuksia PC3 PDGF-D-solut, jotka ovat sopusoinnussa allekirjoitukset CSCS tai CSLCs, jotka liittyvät syövän etenemisessä ja uusiutumisen.

Edellinen prekliinisissä tutkimuksissa meidän laboratorio ovat osoittaneet, että indoli-3-carbinol (I3C) löytyy cruciferous vihannekset ja sen

in vivo

metaboliitin 3,3′-di-indolyylimetaani (DIM) erityisesti muotoiltu DIM (BR-DIM tai B-DIM), että me ovat käyttäneet meidän vaiheen I kliinisen tutkimuksen [31], ovat tehokkaita aineita kasvun inhiboinnissa Eturauhassyövän soluja, jotka oli välittämä muutokset useiden solun signalointi [32]. Viimeaikaiset tulokset osoittivat, että BR-DIM aiheutti ylössäätely miR-200b ja miR-200C, jotka ovat tyypillisesti menetetään PCA soluissa [33]. Nykyisessä tutkimuksessa, löysimme menetys ilmentymisen let-7 perheen johdonmukainen yli-ilmentyminen EZH2 PCA soluissa ja ihmisen PCa kudosnäytteet, erityisesti kasvaimissa, joissa korkeampi Gleason asteen. Tulokset korrelaatio analyysi osoitti, että let-7-ilmentyminen käänteisesti yhteydessä EZH2 ilme potilailla, joilla on korkeampi Gleason asteen kasvaimet. Täällä myös näyttöä rooli BR-DIM (muotoiltu DIM: 3,3′-di-indolyylimetaani, lyhennettynä joko BR-DIM tai B-DIM) säätelyssä anna-7 ja EZH2 PCA soluissa dokumentoitu meidän prekliininen löydökset sekä havainnoista meidän käynnissä vaiheen II kliinisessä tutkimuksessa PCA potilasta sai BR-DIM ennen eturauhasen.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja viljelyolosuhteissa

LNCaP, C4-2B, ja CWR22RV1 pidettiin RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 10 umol /l Hepes, 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä. Vakaa solulinjat yli-ilmentävät PDGF-D ja tyhjän pcDNA3 luotiin transfektoimalla PC3-solujen kanssa pcDNA3-PDGF-D: His tai vastaava tyhjän pcDNA3 Neo kuten on aiemmin kuvattu ja kutsutaan PC3 Neo tai PC3 PDGF-D soluihin [34], vastaavasti koko tämän käsikirjoituksen. PC3 Neo, PC3 PDGF-D, PC3, DU145-soluja viljeltiin RPMI 1640-elatusaineessa, jossa on 2 mmol /L glutamiinia, 10 umol /l Hepesiä (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 5% naudan sikiön seerumia (FBS), 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä. PZ-HPV-7 ja RWPE-1-solut hankittiin ATCC: ltä (Manassas, VA). Näitä soluja viljeltiin keratinosyyttien seerumivapaassa väliaineessa (K-SFM), jonka Invitrogen (GIBCO), ja toimitetaan 0,05 mg /ml naudan aivolisäkeuutetta (BPE) ja 5 ng /ml ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää (EGF). Kaikki soluja ylläpidettiin 5% CO

2-kostutetussa atmosfäärissä 37 ° C: ssa, ja genotyyppisesti tunnettu tukea aitouden näiden solujen, jotka oli sopusoinnussa sen alkuperästä.

Reagenssit ja vasta-aineet

Vasta vastaan ​​EZH2 hankittiin BD Biosciences (Bedford, MA). Vasta-aine glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) hankittiin Affinity Bioreagents (Golden, CO). Vuohen anti-hiiri-IgG (H + L), HRP-konjugaatti saatiin Bio-Rad (Reinach, BL). BR-DIM, joka on muotoiltu DIM on suurempi biosaatavuus, luovutti ystävällisesti Dr. Michael Zeligs (lyhennettynä BR-DIM tai B-DIM, Bio Response, Boulder, CO) ja liuotettiin DMSO tehdä 50 mmol /L kantaliuoksia ja varastoitiin -20 ° C: ssa useita erää

in vitro

tutkimuksessa.

Ethics selvitys

Patient kudokset kerättiin saatuaan hyväksynnän Wayne State University Institutional Review Board (IRB). Tämä kliininen protokolla on luokiteltu vapautettu # 4 luokat alla NIH politiikkaa, koska tällaiset tutkimukset ovat takautuva -tutkimukset arkistointia näytettä. IRB luopua tarvetta suostumuksen käytöstä arkiston näytteet, jotka oli yhdenmukainen NIH ohjeita, ja näytteet analysoitiin anonyymisti. Eturauhassyövän kudosnäytteiden meidän käynnissä kliinisessä tutkimuksessa BR-DIM (B-DIM) interventio ennen eturauhasen saatiin myös saatuaan hyväksynnän Wayne State University Institutional Review Board (IRB) ja tietoon perustuva suostumus saatiin kaikilta koehenkilöistä. Koska tutkimus on tavanomainen kliininen tutkimus, IRB edellytti kirjallisen suostumuksensa potilailta ennen Suoriteperusteiseen osaksi kliininen tutkimus, joka on rutiininomaisesti koordinoidaan kliinisen tutkimuksen toimisto (CTO). Hyväksyntä läpi IRB implicates noudattaa suostumuksensa ja suoriteperusteisen jota ilman potilaita ei voi kirjoilla osaksi tutkimuksen ja näin tutkimuksemme täytti kaikki vaaditut noudattamista suuntaviivoja CTO ja IRB. Paikallinen tutkimussuunnitelmassa numero on 2007-128, joka löytyy NIH kliinisessä trials.gov. (https://clinicaltrials.gov/show/NCT00888654). Tuolloin näytteen ottamisen nykyisen tutkimuksen tutkimussuunnitelman kertynyt 20 potilasta; kuitenkin, tutkimus on nyt kertynyt yhteensä 33 potilasta. On odotettavissa, että suljemme tässä tutkimuksessa 37 potilasta vuoden 2012 alussa

Potilaille ja eturauhasessa näytteenotosta

Saatuaan Institutional Review Board hyväksyntä, retrospektiivinen arkistointia esikäsittely PCa kudoksia ja Hyväksytty viereisten normaaleissa kudoksissa saatiin Biospecimen ydin Karmanos Cancer Institute (KCI) kerätään potilailta, joille tehtiin eturauhasen 2004-2010 KCI. Olemme myös saaneet PCa kudosnäytteiden meidän käynnissä kliinisessä tutkimuksessa BR-DIM (B-DIM) interventio ennen eturauhasen vasta diagnosoiduista PCa potilaita 2009-2011 KCI ja Henry Ford Health System (HFHS), Detroit, Michigan . Formaliini-parafiiniin upotetut (FFPE) kudokset leikattiin miRNA ja mRNA: n analyysi. Potilaiden kliininen ominaisuudet saatiin sairaalasta tietokannasta muun muassa rodun, kuten taulukossa 1. Patologinen piirteitä todenneessa mikroskooppisia arviointi Kasvaimen levyihin patologit sekä KCI ja HFHS. Gleason (laatu) saatiin kaikissa tapauksissa kliinisen tietokannasta.

klonogeeninen määritys

C4-2B, PC3 PDGF-D, ja PC3 PDGF-D transfektoitu let-7 perheen 24 tunnin kerättiin jälkeen trypsinaatiolla, ja suspendoitiin uudelleen koko väliaineessa. Yksisolususpensiot levytettiin säännöllisesti 10 cm halkaisijaltaan Petri ruokia siirtomaa tiheydellä 2000 solua per malja. Sen jälkeen kun 2-3 viikkoa inkubaation muuttuvat tuoreella väliaineella joka 3-4 päivä, pesäkkeet värjättiin kristallivioletilla vielä 10 minuutin ajan, ja pestiin 1 x PBS: llä. Pesäkkeet valokuvattiin.

Soft agar määrityksessä

C4-2B solut kerättiin ja suspendoitiin elatusaineeseen. Pehmeä agar-määritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu meidän laboratoriossa [18]. Soluja käsiteltiin 10 tai 25 uM BR-DIM muuttuvien tuoretta medialle BR-DIM 3 päivän välein. Kolmen viikon kasvun, pesäkkeet värjättiin inkuboimalla 0,5 mg /ml MTT: ssa 4 tuntia, ja sitten kuvattiin (40 x). Siirtomaa numerot laskettiin alle faasikontrastimikroskooppia. Tulokset esitettiin pesäkkeen numerot (% kontrollista).

kyky uusiutua määritys

Yksisolususpensiot of C4-2B ja PC3 PDGF-D-solut levytettiin Ultra Low kiinnittyvä kuoppiin 6 -kuoppaiset levyt (Corning, Lowell, MA) 2000 solua /kuoppa DMEM /F12 (Invitrogen), joka sisälsi 1 x B27 ja N2 (Invitrogen). Yhden solun tila vahvistettiin mikroskoopilla. Tuoretta kasvualustaa 10 tai 25 uM lisättiin 3-4 päivän välein. Viikon kuluttua, numerot prostaspheres laskettiin mikroskoopilla ja tiedot esitettiin pallo numerot 1000 solua ympätään. Prostaspheres valokuvattiin (40 x) mukaisesti faasikontrastimikroskoopilla.

Western blot-analyysi

Yhteensä solulysaatit saatiin hajottamalla solut RIPA-puskurissa. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce, Rockford, IL). Western-blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [35].

miRNA ja transfektio

Solut transfektoitiin 40 nmol /l let-7 esiasteita tai miRNA lähtöaineiden negatiivinen kontrolli # 1 (Ambion, Austin , TX) avulla DharmaFECT3 transfektioreagenssia (Dharmacon, Lafayette, CO). Jälkeen 1 päivä transfektion jälkeen solut trypsonized, ja suspendoitiin uudelleen täydellisellä alustalla. Yksisolususpensiot vahvistettiin mikroskoopilla klonogeenisten määrityksessä. Lisäksi, sen jälkeen 3 päivää transfektion solulysaatteja valmistettiin Western blot -analyysiä varten.

Lusiferaasiaktiivisuus määritys

PC3 PDGF-D-solujen alhaisempi let-7 ympättiin tiheydellä 6 x 10

3 solua /kuoppa 96-kuoppalevylle ja inkuboitiin 24 tuntia. Solut kotransfektoitiin EZH2 3’UTR lusiferaasiplasmidin (Origene, Rockville, MD) tai Renilla lusiferaasiplasmidin ja hallita miRNA, anna-7a, let-7b, let-7c, ja anna-7d esiasteita käyttäen DharmaFECT duo transfektioreagenssia (Dharmacon, Lafayette, CO). 48 tunnin kuluttua inkubaation lusiferaasin aktiivisuus määritettiin käyttäen Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega). Renilla lusiferaasiaktiivisuus käytettiin transfektiotehokkuuden kontrolloimiseksi.

Reaaliaikainen RT-PCR

määrittämällä mRNA: n tasoja, kokonais-RNA soluista eristettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen ) ja DNA poistettiin käyttäen RNaasi-vapaata NDase (Qiagen). Yksi mikrogramma RNA: ta käänteiskopioitiin cDNA käyttäen High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems, Fostor, CA) valmistajan ohjeita. PCR suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [18]. Suhteellinen määrä mRNA normalisoida ilmaus GAPDH. Testaamiseksi miRNA tasoilla, kokonais-RNA soluista eristettiin käyttäen miRNeasy Mini Kit (Qiagen) ja DNA poistettiin käyttäen RNaasi-vapaata NDase (Qiagen). 20 ng RNA: ta käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttämällä Universal cDNA Synthesis Kit (Exiqon, Woburn, MA) mukaan valmistajan ohjeiden. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen erityisiä miRNA alukkeita (Exiqon) määrittää miRNA ilmaisun käyttämällä SYBR® Green RT-PCR-reagenssit (Applied Biosystems). Suhteellinen määrä miRNA normalisoitiin ilmentymisen RNU48. Määrittämään mRNA: n tai miRNA tasoja eturauhassyövän potilaan kudoksiin, kokonais-RNA eristettiin FFPE kudoksista käyttäen miRNeasy FFPE Kit (Qiagen) mukaan valmistajan ohjeiden. RT-PCR-määritys, että miRNA ja mRNA: n ilmentymisen arvioitiin kuten edellä. Suhteellinen määrä mRNA normalisoitiin ilmentymisen beeta-aktiini ja suhteellinen määrä miRNA oli normalisoitu ilmentymisen RNU1A.

Microarray varten miRNA profiili eturauhassyövän potilaan kudosten

miRNA microarray sekä data-analyysi tehtiin seuraavat toimenpiteet ovat aikaisemmin kuvanneet Kong et al [18].

Kaikki tiedot MIAME mukainen ja että raaka data on talletettu on MIAME yhteensopiva tietokanta. GEO-hakunumero on GSE34310.

Tilastolliset menetelmät

Kokeet esitetty luvuissa solulinjan tutkimukset edustavat kolmen tai useamman itsenäisen toistoja. Tiedot esitetään keskiarvona ja keskihajonta (SD) baarissa kaavioita. Mirna ja mRNA tietoja potilaasta kudosnäyte oli log transformoitiin ennen analyysiä. Vertailuja jatkuvien muuttujien välillä kahdesta riippumattomasta tehtiin käyttämällä Wilcoxonin summa testi. Sillä pariksi liittyviä ryhmiä (ts Normaali kudosten ja pariksi G6 kasvainten kudokset), The Wilcoxonin testillä. Spearman korrelaatioita käytetään kuvaamaan vahvuus lineaarinen suhde kahden muuttujan. Tilastollinen testi merkitys korrelaatio perustui arviolta

t

jakeluun. Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolinen at merkitsevyystasolla 0,05 ellei toisin mainita. Vähentää vääriä positiivisuus, toisin sanoen ohjata perhe-viisas tyyppi I virheen, tässä alustavassa varhaisessa vaiheessa kartoittavassa tutkimuksessa käytimme oikaistu p arvoja kaksivaiheista step-up vääriä löytö määrä (FDR) ohjausmenetelmä [36] . Nimellinen virheprosentti määrän arvioiminen tosi nollahypoteesi in kaksivaiheisessa FDR menettelyn asetettiin 0,05.

Tulokset

ilmentäminen anna-7 perhe katosi eturauhassyövässä ( PCA) kudosnäytteitä

Voit selvittää tasot anna-7 perheen PCA kudosnäytteet, keräsimme esikäsittely PCa kudosten ja sovitettu viereisen normaalin kudosnäytteiden (käytettiin kontrollina vertailussa tuumorikudoksia). Tulokset miRNA ilmeitä mircroarray ilmaisun profilointi osoitti, että kaikki jäsenet let-7 perhe (miR-98 oli havaittavissa) väheni PCA kudoksissa verrattuna viereiseen normaaliin kudosnäytteiden (Fig. 1A). Lisäksi olemme havainneet, että ilmaus let-7a, let-7b, anna-7c ja anna -7d olivat tarkasti mitattavissa verrattuna muihin perheenjäseniin, koska heidän ilmaisuja olivat hyvin alhaiset (Fig. 1A). Siksi olemme selvittäneet ja vahvistaneet ilmaisuja let-7a, let-7b, let-7c, ja anna-7d kaikissa tapauksissa myös 129 PCa kudosnäytteet ja 94 viereisten normaali kudosnäytteet. Olemme havainneet, että ilmaus let-7 perheen histologisesti normaalissa eturauhasessa kudosten Gleason luokka 7 tai korkeampi kasvain laski verrattuna histologisesti normaaliin kudokseen Gleason luokka 6 kasvaimet (tietoja ei esitetä), mikä viittaa siihen, että histologisesti normaalit kudokset eturauhasen rauhanen potilaista, joilla on korkeampi laatu kasvaimia eivät ole normaaleja. Niinpä otimme normaalia eturauhasen kaikkien potilaiden diagnosoitu arvosana 6 kasvaimia tarkempaa analysointia ja käytetty että ”normaalin kudoksen ohjaus”. Havaitsimme, että ilmaukset Let-7 perheen palkkaluokkaan 6 kasvaimet eivät ole tilastollisesti erilainen verrattuna normaaliin valvontaa. Kuitenkin löysimme merkittävästi vähentynyt ilmentyminen let-7a, let-7b, let7c ja anna-7 d PCA Gleason arvosana 7 tai korkeampi kasvaimissa verrattuna normaaliin kudokseen ohjaus (Fig. 1 B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että menetys anna-7 perhe voisi liittyä PCa aggressiivisuus erityisesti koska alemman luokan kasvaimet eivät poikenneet normaalista kudoksesta ohjaus, kun taas korkeampi laatu kasvaimet olivat erilaiset.

(A) Microarray profilointi tehtiin arvioimiseksi ilmaus miRNA käyttäen kokonais-RNA kolmesta PCa kudosnäytteet ja sovitettu viereisten normaalin eturauhasen kudoksia. Tulokset osoittivat, että let-7a, let-7b, anna-7c ja anna-7d on erittäin ilmaistu eturauhasen kudosten ja niiden ilmentyminen oli kadonnut ihmisen PCa kudosnäytteiden (* p 0,05, ** p 0,01). (B) tulokset reaaliajassa-RT-PCR vahvisti, että tasot let-7b, anna-7c ja anna -7d merkittävästi alassäädetty kasvaimissa korkeampi Gleason asteen. (7 a: let-7, N: normaali; TG6: tuumorikudoksista potilaista, joilla Gleason arvosana 6. n = 39 normaalille, n = 44 TG6, n = 52 TG7, n = 33 TG8, 9). (C) Merkittävä säätely ylöspäin ilmentymisen EZH2 havaittiin PCa kudosnäytteiden kanssa Gleason arvosana 7 (n = 46) ja korkeampi (n = 33), mutta ei PCA näytteeksi, joista Gleason arvosana 6 (n = 39) . (D) EZH2 tasot korreloi käänteisesti let-7b ja anna-7c ilmaisuja kasvainten yksilöt Gleason arvosana 7.

ilmentyminen EZH2 nostettiin PCA kudosnäytteet ja sen korreloi käänteisesti ilmaisua että let-7 perheen

Koska ilmaus let-7 perhe katosi PCA potilaiden kudosten korkeamman Gleason asteen, se herättää kysymyksen, miten anna-7 perhe voisi säädellä PCa aggressiivisuus. Olemme etsineet tavoitteet let-7 sukulaisiin TargetScan ohjelmistoja ja huomasimme, että EZH2 voitaisiin säädellä let-7 perhe, koska on olemassa erityinen sitoutumiskohta 3’UTR on EZH2 mRNA. Näin ollen, olemme arvioineet ekspressiota EZH2 mRNA: n PCa kudoksissa. Tuloksemme osoittivat, että EZH2 ekspressio lisääntyi PCa kudosnäytteiden kanssa Gleason luokan 7 ja korkeampi kuin normaalin kudoksen valvonta (Fig. 1 C). Ekspression let-7b ja anna-7c on korreloi käänteisesti EZH2 lausekkeen r = -0,36 (95% CI: -0,61–0,06), p = 0,0414, ja r = -0,43 (95% CI: -0,65 ja – 0,15), p = 0,0132, vastaavasti (Fig. 1 D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että menetys anna-7 voi olla vastuussa lisääntyneen ilmentymisen EZH2.

Anna-7 tukahdutettu EZH2 ilmaisun ja esti klonogeeniset kasvu Eturauhassyövän soluja

tarkasteltiin ilmentymisen EZH2 PCA-solulinjoissa ja kuolemattomaksi eturauhasen epiteelisolujen linjat, ja totesi, että EZH2 ilmennettiin eturauhasen syöpäsolujen suhteellisen korkeampi verrattuna kuolemattomaksi eturauhasen epiteelisolujen linjat: PZ-HPV-7 ja RWPE-1-solut (Fig. 2A, ylempi paneeli ). Täsmentämiseksi biologinen seuraus let-7 perheen ilmentymisen säätelyyn EZH2 ilmaisun, transfektoimme PC3 ja PC3 PDGD-D solujen let-7 esiasteita, ja tulokset osoittivat, että let-7 perheenjäseniä voisi merkittävästi estää ilmaisun of EZH2 näissä kahdessa solulinjassa (kuvio. 2A, keskimmäinen ja alempi paneeli). Nämä tulokset viittaavat siihen, että let-7 perheen säätelee ilmentymistä EZH2. Jotta saataisiin edelleen mekanistinen käsitys, testasimme let-7 voi suoraan tukahduttaa ilmaisun EZH2 sitoutumalla 3’UTR EZH2 mRNA. Me kotransfektoidaan EZH2 3’UTR lusiferaasiplasmidin ja anna-7 esiasteita, ja havaitsi, että anna-7a, let-7b, let-7c, ja anna-7b voisi hidastaa voimakkaasti EZH2 3’UTR lusiferaasiaktiivisuuden verrattuna solujen transfektio ohjaus miRNA (Fig. 2B). Let-7 sitoutumiskohdat 3’UTR EZH2 mRNA on esitetty kuviossa 2C. Sitten testataan biologinen seuraus transfektoitujen solujen esi-let-7 perheen ja arvioidaan klonogeeniset kasvu epäsuorana

in vitro

mitta kasvaimen aggressiivisuus. Olemme havainneet, että yli-ilmentyminen let-7 perheen estivät merkittävästi klonogeenisten kasvua PC3 PDGF-D-soluissa, joka aluksi osoitti pienempi ilmentyminen let-7 (Fig. 2D). Kuitenkin tällä hetkellä ei ole menetelmää, joka voisi olla kliinisesti käyttökelpoisia säätelyä menetetty miRNA. Tätä varten testasimme hypoteesia testaamalla onko BR-DIM voisivat olla hyödyllisiä säätelyä miRNA.

(A) ilmentyminen EZH2 todettiin olevan suurempi PCA solulinjoissa verrattuna kuolemattomaksi eturauhasen epiteelisolujen linjat: PZ-HPV-7 ja RWPE-1 (ylempi paneeli) ja transfektointi anna-7 esiasteiden esti EZH2 ilmaisun PC3 ja PC3 PDGF-D solut 3 päivää transfektion jälkeen (keski-ja alemman paneelin). (B) anna-7 perheenjäsenten tukahdutettu EZH2 3’UTR lusiferaasiaktiivisuuden PC3 PDGF-D-soluja (alhaisempi let-7 perheen näissä soluissa) kotransfektoitiin let-7 ja EZH2 3’UTR lusiferaasiplasmidin. (C) anna-7 sitoutumiskohdat 3’UTR EZH2 mRNA esitetty. (D) transfektio let-7 esiasteiden vähensi klonogeeniset kasvukapasiteettia PC3 PDGF-D solujen (Con: ohjaus, 7a: pre-let-7a, ** p 0,01).

BR -DIM hoito johti säätelyä let-7 perheen ja siten alassäädetty ilmentymistä EZH2 PCA soluissa

Tässä tutkimuksessa olemme huomanneet, että BR-DIM käsittely lisäsi ilmentymistä let-7 perhe useissa PCa solulinjojen LNCaP, C4-2B ja PC3-solut (Fig. 3A ja kuvio. S1A-C). Lisäksi, BR-DIM hoito johti myös vähentynyt ilmentyminen EZH2 mRNA: ta (Fig. 3B) ja proteiinin eri PCa solulinjojen ja eri ajankohtina (Fig. 3C, 3D ja Fig. S1D). Lisäksi enemmän kiinnostavaa, tietoja meidän käynnissä vaiheen II kliinisessä tutkimuksessa BR-DIM hoito Eturauhassyövän potilaille ennen eturauhasen johti tehostetun ilmentymisen let-7a, let-7b, let-7c, ja kirjaimien 7d kasvaimen yksilöt jälkeen BR-DIM intervention (Fig. 4A-C), ja nämä tulokset ovat sopusoinnussa vähentynyt ilmentyminen EZH2 (Fig. 4D). Siksi tulokset viittaavat siihen, että BR-DIM voisi olla tärkeä aine uudelleen ilmaista menetetty miRNA erityisesti anna-7 perhe, mikä alentaa EZH2 ilmaisun ja kompromissi CSCS tai CSLCs toiminto.

( A) Totaali-RNA eristettiin LNCaP, C4-2B ja PC3-soluja käsiteltiin 25 uM BR-DIM: ssa 24 tuntia, ja tulokset reaaliajassa RT-PCR osoittaa, että ilmentymisen let-7 lisättiin seuraavat BR-DIM hoitoon verrattuna käsittelemättömään (c: DMSO-kontrollin). (B) tasot EZH2 mRNA tukahdutettu BR-DIM hoidon annoksesta riippuvaisella meaner. (C ja D) Solulysaatit valmistettiin soluista käsiteltiin BR-DIM: ssa 48 tuntia ja Western blot, joka osoittaa proteiinin tasot EZH2, joka on alas-säätelee BR-DIM hoidon (PC3 PD: PC3 PDGF-D-soluissa, *, p 0,05; **, p 0,01).

RNA saatiin BR-DIM interventio kliinisessä tutkimuksessa näytteitä, jos BR-DIM annettiin potilaille 2-4 viikkoa ennen leikkausta . RNA saatiin myös formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) kudosnäytteet Eturauhassyövän potilaiden Hyväksytty kasvain Gleason luokalla, kasvaimen vaiheesta ja potilaan iän kontrolliryhmään. Ilmaus miRNA ja mRNA: n arvioitiin käyttäen reaaliaikaista RT-PCR: llä. Suhteellinen miRNA ja mRNA-tasot normalisoitiin RNU1A1 ja beeta-aktiini, vastaavasti. (A) BR-DIM interventio johtanut lisääntyneeseen suuntaus tasoja Let-7a ilme. (B ja C) anna-7b, anna-7c ja anna -7d merkittävästi ajan säätelee BR-DIM interventio. (D) EZH2 ilmentyminen alassäädetty BR-DIM interventio.

BR-DIM hoito esti Itseuudistumisen ja klonogeeniset kapasiteetti Eturauhassyövän soluja

Voit testata, onko BR-DIM voisi säädellä kyky uusiutua ja klonogeeniset kyky Eturauhassyövän soluja, suoritimme palloja muodostavan määrityksiä ja totesi, että hoito C4-2B ja PC3 PDGF-D solujen 10 tai 25 uM BR-DIM lyhensi merkittävästi määrä ja koko ja prostaspheres käsittelemättömään kontrolliin verrattuna (DMSO-kontrollin) (Fig. 5A). Lisäksi BR-DIM hoito esti myös klonogeeniset kasvumahdollisuuksia PCa solulinjojen C4-2B ja PC3 PDGF-D-soluissa (kuvio. 5B). Tulokset pehmeän agarin määrityksen osoitti lisäksi, että hoito C4-2B soluja 10 tai 25 uM BR-DIM vähensi pesäkkeen koko ja numerot (Fig. 5C ja 5D), viittaa siihen, että BR-DIM voisi poistaa kasvainsolujen erityisesti solujen kanssa CSCS tai CSLCs ominaisuudet jopa säätelevä let-7 perheen ja siten alas- ekspressiota sääteleviä EZH2.

(A) Yksisolususpensiot of C4-2B ja PC3 PDGF-D-solut levytettiin ultra alhainen kiinnittyvä kuoppiin 6-kuoppalevylle 2000 solua /kuoppa DMEM /F12 täydennetty B27 ja N2 ja 10, 25 uM BR-DIM ja inkuboitiin 6 päivää. Prostasphere määrää supistettiin BR-DIM hoito (ylempi paneeli).