Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ihmisen Nanog1 on 305-aminohapon (aa) homeodomain sisältävä transkriptiotekijä kriittisiä pluripotenttisuuden alkion kantasolujen (ES) ja alkion karsinooma (EY) soluja. Somaattisten syöpäsolut pääasiallisesti ilmentävät retrogene homologia Nanog1 kutsutaan NanogP8, joka on ~99% samanlainen Nanog klo aa tasolla. Vaikka ennustettu M.P. on Nanog1 /NanogP8 on ~35 kD, sekä on raportoitu siirtyä, Länsi-blotting (WB), on näennäinen molekyylipaino massojen 29-80 kD. Ovatko kaikki nämä raportoitu proteiiniryhmänä edustavat aito Nanog proteiineja on epäselvä. Lisäksi yksityiskohtainen biokemialliset tutkimukset Nanog1 /NanogpP8 ovat puuttuneet. Yhdistämällä WB käyttäen 8 anti-Nanog1 vasta, immunosaostus, massaspektrometria, ja tutkimukset käyttäen rekombinanttiproteiineja, tässä Tarjoamme

suora

todisteita siitä, että Nanog1 proteiinin NTERA-2 EY-soluissa esiintyy useita MW lajien ~22 KD 100 kD, jolla on merkittävä 42 kD: n vyöhyke havaittavissa WB. Sitten osoittavat, että yhdistelmä-DNA-NanogP8 (rNanogP8) valkuaisaineita, bakteereissa käyttämällä cDNA: ita useilta syöpäsolujen myös siirtyä, denaturoivalla SDS-PAGE, on noin 28 kD: n 180 kD. Mielenkiintoista, erilaisia ​​anti-Nanog1 vasta-aineet ilmentävät ero reaktiivisuus rNanogP8 proteiineja, jotka voivat spontaanisti muodostaa suuren M.P. proteiinia lajeja. Lopuksi osoittavat, että suurin pitkäaikainen viljellyt syöpäsolulinjat näyttävät ilmaista hyvin alhainen tai erilaisia ​​endogeenisen NanogP8 proteiini, joka ei voi helposti havaita immunosaostuksella. Kaikkiaan nykyinen tutkimus paljastaa ainutlaatuinen biokemialliset ominaisuudet Nanog1 EY: n soluissa ja NanogP8 somaattisilla syöpäsoluja.

Citation: Liu B, Badeaux MD, Choy G, Chandra D, Shen I Jeter CR, et al. (2014) Nanog1 in NTERA-2 ja Rekombinantti NanogP8 somaattisista Syöpäsolut Hyväksyä Protein konformaatioita ja siirtäminen at Multiple M.P. Laji. PLoS ONE 9 (3): e90615. doi: 10,1371 /journal.pone.0090615

Editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 tammikuu 2014; Hyväksytty: 29 tammikuu 2014; Julkaistu 5 maaliskuuta 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustuksilla NIH (R01-CA155693), Department of Defense (W81XWH-13-1-0352), CPRIT (RP120380), The MDACC Center for Cancer Epigenetiikka ja RNA Center Laura John Arnold Foundation avustus (D.G. Tang), ja kahdella Centerin apurahat (CCSG-5 P30 CA166672 ja ES007784). C. Jeter, M. Henkilö, ja C. Liu tuettiin, osittain CPRIT RP120394, CPRIT RP110782 ja DOD tohtorintutkinnon apurahan (PC121553), tässä järjestyksessä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Dr. Dhyan Chandra on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One Pääkirjoitus politiikan ja kriteerit.

Johdanto

Nanog1 (yleisesti kutsutaan Nanog) koodaa

Nanog

geeni sijaitsee Chr . 12p13.31 (Fig. S1A). Geeni on 4 eksonien ja koodaa homeodomain transkriptiotekijä, joka on ratkaiseva itseuudistumisen alkion kantasolujen (ES-solut) [1], [2]. Nanog1 yliekspressio hiiren ES-soluissa (mESCs) voitetaan vaatimuksen leukemiaa estävä tekijä ylläpitää pluripotenttisuuden [1], [3], kun taas häiriöitä

Nanog

tuloksia mESC erilaistumista extraembryonic Endodermi [4]. Down-regulation Nanog1 ihmisen talous- ja sosiaalineuvostojen (hESCs) johtaa myös menetys pluripotenttisuuden ja erilaistumista extraembryonic solulinjasta [5]. Lisäksi yhdessä muiden uudelleenohjelmointi tekijöiden Nanog1 voittaa uudelleenohjelmointi esteitä ja edistää somaattisten solujen uudelleenohjelmointi [6], [7]. Siten Nanog1 on keskeinen luontainen osa transkription verkon ylläpitämisessä itseuudistumisen alakohtaisten neuvostojen.

Human Nanog1 proteiini on 305 aminohappoa (aa) ja 5 toiminnallinen aliverkkotunnusten eli N-terminaalista domeenia (ND ), homeodomain (HD), C1-terminaali verkkotunnus (CD1), tryptofaani-rikas domain (WR) ja C2-terminaalista domeenia (CD2) [8] – [11] (Fig. 1A). ND on mukana transkription häiriöitä ja C-terminaalinen alue sisältää transkription aktivaattori. HD domeeni vaaditaan Nanog ydinvoiman lokalisointi ja transaktivaatiota ja WR alue välittää dimerointi Nanog-proteiinia, joka tarvitaan pluripotenttisuuden toimintaa [12], [13]. Kiinnostaa, ihmisen

Nanog

on 11 pseudogeenien [14], joista

NanogP8

, joka sijaitsee Chr. 15q14, on täydellinen avoin lukukehys [14], [15] (Fig. S1B) että hallussaan Alu elementin 3′-UTR homologinen yksi

Nanog1

geeni, mikä viittaa siihen, että

NanogP8

on retrogene sijaan pseudogeeniä. NanogP8 on vähintään 6 konservoitunutta nukleotidin (nt) erot verrattuna Nanog1, mikä voi aiheuttaa joitakin aa muutokset [15].

(A) Kaavamainen ihmisen Nanog-proteiinin ja 8 anti-Nanog Abs käytetään tässä tutkimus. Suluissa ovat epitooppeja yksittäisten Abs. ND, N-pää domeeni; HD, homeodomain; CD1 ja CD2, C-pään domeeni 1 ja 2; WR, tryptofaani-rikas verkkotunnus. Tähti on ND ilmaisee Leu61 jäännös tunnustama eBioscience mAb (nuoli) kartoitettiin tämänhetkisiin tutkimuksista. (B-H) WB analyysi NTERA-2 NE (N, kaksi eri erissä) tai sytosoliin (C) käyttäen 8 anti-Nanog Abs. Yksittäiset Ab on alareunassa näkyvän ja M.P. vasemmalla. Musta nuolenkärki, ennustettu 35 kD Nanog proteiini; punainen nuolenkärki, pääasiassa 42 kD: n vyöhyke; Vihreät nuolet, lisävyöhykettä (varsinkin kun pidempi altistus).

Mielenkiintoista on, että monet somaattiset syöpäsolut on raportoitu ilmaista Nanog mRNA: han ja /tai proteiini [15] – [46]. Useita varoituksia liittyvät monet näistä tutkimuksista.

Ensimmäinen

, mRNA-tasolla, tiukka tutkimuksissa käytettiin ero RT-PCR yhdistettynä sekvensointi tai ero herkkyys restriktioentsyymillä AlwN1 [15], [17], [31], [32], [34] , [46], ovat osoittaneet, että somaattisia syöpäsoluja valikoivasti ilmaista transkriptio

NanogP8

geenin (Fig. S1B; katso jäljempänä) eikä

Nanog1

. Todellakin, olemme havainneet, että

nanog1

lokus vaimentuu joissakin somaattisten syöpäsoluja [15]. Sekvensointialustamme analyysit paljastavat, että alkion karsinooma (EY) NTERA-2-solut ilmentävät

Nanog1

mutta ei

NanogP8

mRNA taas kaikki somaattisten syöpäsolujen (6 erilaista lukien ensisijainen eturauhasen kasvain peräisin olevat solut) osoittavat 5 6 nt erot ominaisia ​​

NanogP8

[15]. Niistä 5 säilytetty nt muutokset

NanogP8

, yksi (nt759) pitäisi johtaa aa muutos (Q253H) vaikka syöpäsolut näyttää muille ei-säilyneitä nt muutoksia (eli polymorfismit), jotka voivat myös aiheuttaa aa muutoksiin (esim L61P varten HPCa6) [15]. Making erottelu Nanog1 ja NanogP8 on tärkeää, koska nämä kaksi selostukset ovat peräisin erillisten genomisesta loci ja ovat eroihin nt sekvenssin tasolla.

Toiseksi

, monet aiemmat tutkimukset ovat olleet pelkästään korrelatiivisten ilman luotaa toiminnallinen merkitys NanogP8 ilmentymisen syöpäsoluissa. Käyttäen ihmisen eturauhassyöpä (PCa) mallina, olemme osoittaneet, [15], että: 1) NanogP8 ilmennetään gradientti PCa solujen helposti havaittavissa ydin- NanogP8 on vain pieni murto-osa PCa solut; 2) NanogP8 proteiinia ilmentäviä soluja kasvatetaan perusterveydenhuollossa PCa verrattuna matching hyvänlaatuinen kudoksiin; 3)

NanogP8

mRNA ja NanogP8 proteiinia rikastuneet CD44

+ ja CD44

+ CD133

+ ensisijainen PCa soluja; 4) shRNA välittämää knockdovvn

NanogP8

estää kasvaimen uusiutuminen eturauhas-, rinta-, ja koolonkarsinoomasoluissa; ja 5) kasvainta inhiboiva vaikutus

NanogP8

pudotus liittyvät soluproliferaation inhibointi ja kloonilaajenemisen kasvainsolujen ja häiriöitä erilaistumista. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että indusoituvia NanogP8 ilmaisua irtotavarana PCa soluissa riittää antamaan syövän kantasoluja (CSC) ominaisuuksia ja edistää androgeenista riippumaton PCa kasvua [34] ja että NanogP8 rikastuu eriytymättömissä (PSA

– /lo) PCa solut ja sen knockdown hidastaa seuraus kastraation vastustuskykyisten PCa [41]. Tutkimuksemme [15], [34], [41] viittaavat mahdollisia pro-onkogeenisiä toimintoja NanogP8.

Kolmannen

, ennustettu Nanog1 ja NanogP8 proteiinit ovat ~99% identtisiä [15 ]. Vastaavasti ilmaisu ”Nanog” käytetään usein yleisesti viittaamaan joko proteiinia (joka pätee myös tässä asiakirjassa). Kuitenkin spesifisyys enemmistön kaupallisesti saatavilla anti-Nanog vasta-aineita (jotka kaikki nostettiin vastaan ​​Nanog1; taulukko 1) varten Nanog1 ja erityisesti, sillä NanogP8 edelleen tuntemattomia. Siksi on epäselvää, oletetun Nanog proteiinin bändit näkyy Western blotting (WB), jossa usein vain Rajattu kaistale näkyy, tai Nanog proteiinivärjäys esitetään immunohistokemiallinen (IHC) todella edustavat Nanog proteiinia.

Lopuksi

, kiehtovan, vaikka ensi kädessä molekyylimassa Nanog-proteiinin (sekä Nanog1 ja NanogP8) on ~35 kD, lukuisat tutkimukset ovat oletetun Nanog proteiineina, jotka kulkevat, SDS-PAGE, on näennäinen molekyylipaino 29 80 kD ES, EY, ja somaattisten syöpäsolujen (taulukko 1) [2], [5], [17], [24] – [26], [46] – [59]. Vieläkin puzzlingly, sama vasta-aine näyttää usein havaita eri ”Nanog” proteiinijuovat (taulukko 1). Ovatko kaikki nämä raportoitu otaksuttu Nanog proteiinin lajit ovat totta Nanog proteiineja ei ole vielä olla

suoraan

määritetty.

Tässä tutkimuksessa tehtiin käsitellä kaksi viimeistä kysymystä. Ensin tarjota suoraa näyttöä siitä, että Nanog1 proteiinin NTERA-2 EY soluja kulkeutuu osoitteessa 30 -100 kD. Sitten osoittavat, että yhdistelmä-DNA-NanogP8 proteiineja voidaan myös siirtää milloin noin 28 kD ~180 kD. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Nanog1 /NanogP8 proteiinit todennäköisesti soveltaa useita konformaatioita. Olemme vihdoin osoittavat, että suurin osa pitkän aikavälin viljellyt somaattisten syöpäsolut näyttävät ilmaista hyvin alhainen tai biokemiallisesti eriäviä endogeenisten NanogP8 niin, että sitä ei voi helposti immunosaostaa alas 8 kaupallisen anti-NanogP8 aineita.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja reagenssit

Erilaisia ​​ihmisen syöpäsolulinjoja, mukaan lukien eturauhassyöpä (PC3, DU145, LNCaP), rintasyövän (MCF-7), paksusuolen karsinooma (Colo320), ja melanooma (WM -562) soluja, saatiin ATCC: ltä (American Type Culture Collection, Manassas, VA), ja niitä viljeltiin suositeltu elatusaineessa, joka sisälsi 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää (naudan sikiön seerumia). Teratokarsinoomasolua (NTERA-2, klooni D, CRL-1973) hankittiin ATCC: stä ja viljeltiin mTeSR ™ 1 keskikokoinen (StemCell Technologies, Vancouver, Kanada). Nuclear Extraction Kit oli Thermo Scientific (Rockford, IL). Kahdeksan anti-Nanog primaaristen vasta-aineiden (Ab: t) saatiin kaupallisten yhtiöiden (taulukko 1, Fig. 1A). Toissijainen ja ohjaus Abs ostettiin Santa Cruz Biotechnology. ECL reagenssit ostettiin PerkinElmer, Inc (MA, USA). Nykyinen tutkimus ei liity eläinkokeissa tai ihmisillä (eli elävät yksilöt tai tunnistettavissa yksityisiä tietoja). Kaikki muut tutkimukset esitellään tässä olivat tutkinnan aloitti ja ei vaadi hyväksyntää muiden sääntelyelinten.

siRNA- ja shRNA välittämä Nanog knockdovvn kokeita

siRNA pudotus kokeita (Fig. 2 ), käytimme siGENOME SMARTpool siRNA ihmisen Nanog1 ja siCONTROL kuin kohdistaminen siRNA saadaan Dharmacon (Lafayette, CO). Solut maljattiin 24 tuntia aikaisemmin 6-kuopan astioihin transfektoitiin siRNA käyttäen Lipofectamine 2000 48 tuntia myöhemmin, solut kerättiin WB kokeita.

(A) Nanog siRNA kokeiluja NTERA-2-soluissa. NTERA-2 solut transfektoitiin pooli Nanog erityisiä siRNA 48 tuntia, kerättiin ja käytettiin eristämään NE WB kanssa Kamiya Ab. Vasen ja oikea paneeli edustaa lyhyellä ja pitkällä valotusajalla (SE ja LE, vastaavasti) kalvoja (huomaa, että vasen alapaneeli on lyhin alttiina kalvon havainnollistamaan merkittävää Knockdown 42 kD: n vyöhyke). Lamin A /C oli latauskontrollina. UT, transfektoimattomat; NC siRNA, negatiivinen kontrolli (siCONTROL ei kohdistus) siRNA: illa; Nanog siRNA, SMARTpool siRNA vastaan ​​Nanog. Punainen, musta ja sininen nuolenpäitä osoittavat suurta 42 kD, pienet 35 kD, ja 48 kD: n proteiini bändejä, vastaavasti, jotka oli alennettu kun Nanog knockdown. Vihreä nuolet viittaavat ylimääräistä bändejä, jotka myös osoittivat vähentäminen. (B) WB suoritettiin CS anti-Nanog kani pAb.

shRNA Nanog knockdown kokeita, lentivirukset lukien pLL3.7, Nanog-shRNA ja TRC-shRNA tuotettiin 293FT pakkauksessa soluja (Clontech Laboratories, Mountain View, CA) käyttäen muunneltua protokollia aiemmin kuvattu [15], [60]. Lyhyesti, genetisiiniresistenssit valittu, varhaisen läpikulun 293FT-soluja (6 x 10

6/15 cm: n malja) transfektoitiin RRE: n kanssa (6 ug), REV (4 ug) ja VSVg (4 ug) pakkaus plasmidit, sekä kanssa lentivirusvektori (6 ug) käyttämällä Lipofectamine 2000 suorittaa transfektio. Klo 36-48 h, sisältävät viruksia ja median kerättiin ja tuoretta väliainetta lisättiin. Vielä 12-24 tunnin viljelyn, Virussupernatantteja jälleen kerättiin, yhdistettiin ja ultrasentrifugoitiin tuottaa väkevää virusstokkeja. Yksittäiset tiitterit määritettiin GFP-koodattu virus käyttäen HT1080 soluja. Ei-GFP merkitty TRC-shRNA virus valmistettiin rinnakkain ja liitetään ohjaus (pLL3.7) tiitteri. Kohdesoluja maljattiin 24 tuntia aikaisemmin ja tartunnan noin 50% solutiheys ja korjattu

in vitro

tai

in vivo

kokeissa 48-72 tuntia infektion.

Bakteeri ilmentyminen ja puhdistus rekombinantti Nanog (rNanog) proteiinien

NanogP8

tai

Nanog1

cDNA viljellyissä NTERA-2, MCF-7, ja LNCaP-soluja tai ihmisen primaarisia PCa näytteet (HPCa1, HPCa5, ja HPCa6) monistettiin RT-PCR: llä käyttäen LDF1 /LDR1 alukkeita (LDF1 5′-TCTTCCTCTATACTAACATGAGT-3 ’; LDR1 5′-AGGATTCAGCCAGTGTCCA-3’) ja kloonattiin pCR2.1 [15]. EcoRI /Notl tai BamHI /SalI-fragmentit, jotka sisältävät Nanog koodaavan sekvenssin subkloonattiin sitten samoihin kohtiin joko pET-28a (+) tai pET-28b (+) bakteeri-ekspressiovektoriin tuottaa His-fuusioproteiinien. Sen jälkeen, kun insertti vahvistusta restriktioentsyymidigestioanalyysillä ja DNA-sekvensoinnilla, plasmidit transformoitiin BL21 (DE)

3 toimivaltainen bakteerien ilmaista fuusioproteiineja. Nanog-proteiini indusoitiin 0,5 mM IPTG: llä 3-6 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja bakteerien pelletti pidettiin -80 ° C: ssa. Puhdistamiseksi, bakteeri-pellettejä, jotka sisältävät His-merkitty Nanog proteiini hajotettiin hajotuspuskuriin (50 mM NaH

2P0

4, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM imidatsoli, proteaasiestäjäseostabletit, ja 1 mg /ml lysotsyymiä ), sonikoitiin 10 sekunnin (yksi pulssi). His-merkitty Nanog supernatantissa puhdistettiin nikkeli- helmiä valmistajan ohjeiden mukaisesti (Qiagen).

WB käyttäen yhdistelmä-DNA-proteiinit (rNanog), kokosolulysaatissa (WCL), tai tumauute (NE) B

rNanog proteiinit saatiin ja puhdistettiin, kuten edellä on kuvattu. WCL ja NE (viljellyistä soluista) valmistettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [15]. 50-80 ug proteiineja (rNanog ja NTERA-2 NE) analysoitiin 12,5% SDS-PAGE: lla ja geelit siirrettiin Immobilon-P siirto kalvolla (Millipore, Bedford, MA). Membraani blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa TBST (10 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI ja 0,1% Tween-20) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaarisen vasta-aineen. Membraanit pestiin kolme kertaa TBST-puskurilla, inkuboitiin sitten 1 h 1:2000 sekundäärisen vasta-aineen, ja kehitettiin ECL Plus WB detektioreagenssi (PerkinElmer).

immunosaostus (IP) B

Rekombinantti proteiinit (500 ug) tai NE (800 ug tai riippuen kokeellisiin tarkoituksiin) inkuboitiin ilmoitetuilla anti-Nanog vasta yön yli 4 ° C: ssa. Sitten liuosta inkuboitiin proteiini A /G-agaroosia (Sigma, MO, USA) vielä 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Inkuboinnin jälkeen helmet pestiin kolme kertaa RIPA-puskurilla. Sitoutuneet proteiinit proteiini A-agaroosi-eluoitiin SDS-PAGE-latauspuskurilla ja keitettiin 8 min ja suoritettiin SDS-PAGE.

Dialyysi laskostuskokeita

eristämiseksi ja puhdistamiseksi suuren määrän rNanog, bakteerien pelletit sonikoitiin 6 kertaa 10 sekunnin pulsseja. Sonikoinnin liuosta sentrifugoitiin 10000 rpm 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Pelletit pestiin kylmällä PBS: llä kolme kertaa. Saostunut aine oli sisällyttäminen elin rNanog proteiinia. Liuottamiseksi inclusion body, puskurissa, joka sisälsi 7 M ureaa on käytetty ja sitten liuos tehtiin dialysoimalla puskureita 1,5 M, 0,6 M, 0,3 M ja 0,1 M ureaa (1,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0). Dialyysi liuos altistettiin SDS-PAGE olemassaolon määrittämiseksi liukoisen Nanog-proteiinin.

Nanog-proteiinin tunnistus (ID) massaspektrometrialla (MS) analysoi

kolme sarjaa MS-pohjainen proteiini ID kokeet suoritettiin joko rNanog proteiineja tai NE valmistettiin NTERA-2-soluissa.

ensimmäistä

ID kokeilussa immunosaostettiin paljon NTERA-2 cell NE (~ 2 mg yhteensä) R 0,05 valitaan rajataajuus on merkittävä osuma, ja ne proteiinit ylittävät raja-arvo.

Tulokset

Seitsemän kahdeksasta anti-Nanog vasta havaita, WB, suuret 42 kD ja pienet 35 kD bändejä NTERA-2 NE

Human

Nanog1

geeni (gi 13376297), lokalisoitu Chr. 12p13.31 ja ensisijaisesti ilmaistaan ​​ES ja EY-solut, on 915 emäsparin avoin lukukehys (Kuva. S1A). Se koodaa 305-aa proteiinia, joka on yleisesti kutsutaan Nanog (Fig. 1A). Ihmisen Nanog1 proteiinin ennustetaan olevan molekyylimassa on ~35 kD. Kiehtovan, otaksuttu Nanog proteiinit vaeltavat todettavissa molekyyli- massat 29-80 kD WB on raportoitu ES, EY, ja somaattisten syöpäsolujen (taulukko 1). On kuitenkin epäselvää, ovatko nämä raportoitu Nanog proteiinilajit todella edustavat Nanog proteiineja. Tämän kysymyksen ja suoraan määrittää molekyylimassa (es) endogeenisen Nanog proteiinia, ensin suoritetaan kattava WB analysoi EY NTERA-2-soluissa käyttäen 8 kaupallista anti-Nanog (eli anti-Nanog1) vasta-aineet (Ab) suunnattu vastaan ​​eri alueilla ihmisen Nanog-proteiinin (Fig. 1A, taulukko 1, 8 ensimmäistä Abs). Niistä 8 anti-Nanog Abs, neljä [Kamiya Rb pAb, SC (Santa Cruz) vuohi pAb N17, Cell Signaling (CS) Rb pAb ja Rb mAb] ohjataan ND, kaksi (SC Rb pAb H-155 ja R 2) Kolme vasta-aineita vastaan ​​N-päässä, so Kamiya Rb pAb, CS pAb ja CS mAb, antaa puhtaat WB tuloksia kun lyhyt altistuminen elokuvia; 3) pidentämällä valotusaikaa, kaikki vasta-aineet tunnistamaan ylimääräisiä proteiiniryhmänä vaihtelevat noin 28 kD 100 kD. Kuitenkin eri Abs havaita eri mallien reaktiivisen proteiinin bändejä; 4) osalta herkkyys, CS mAb ja CS pAb ovat herkin seuraa Kamiya Ab taas eBioscience mAb on vähiten herkkä; 5) BioLegend anti-Nanog Ab ei tunnista 42 kD suurimpana proteiini bändi NTERA-2 NE; ja 6) Eri vasta-aineet voivat ensisijaisesti tunnistamaan erilaisia ​​proteiinia bändejä. Esimerkiksi Kamiya pAb, mutta ei CS pAb tai mAb reagoimaan 48 kD: n vyöhyke.

siRNA-välitteinen knock-alas paljastaa 42-kD proteiinin kaista vallitsevana Nanog proteiinin isoformi NTERA-2 solut

Koska ennustettu Nanog proteiini on ~35 kD, voimme päätellä, että pienet 35 kD proteiinia bändi yleisesti havaittu WB todennäköisesti on Nanog proteiini. Tämän vahvistaa päättely ja onko hallitseva 42 kD ja kaikki ylimääräiset kaistat myös Nanog proteiineja, suoritimme siRNA knock-down kokeiluja NTERA-2-soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 2A Kamiya Rb pAb johdonmukaisesti havaittu vahva 42 kD proteiinia bändi, joka laski vastauksena Nanog siRNA. Lisäksi pienet 35 kD: n vyöhyke, ja useita muita heikompia juovat, jotka liikkuvat 48 kD, 65 kD, 75 kD ja 90 kD: n kaikki laski Nanog siRNA-käsitellyt solut (Fig. 2A). Kun teimme WB käyttäen CS Rb pAb, Nanog siRNA: t myös tippuu alas 42 kD ja 35 kD bändit (Fig. 2B). Lisäksi, ylemmän 65 kD: n vyöhyke oli myös pienentää (Fig. 2B). Huomaa, että CS pAb ei havaittu 48 kD tai muu ylänauhastojen paitsi 65 kD: n vyöhyke (Fig. 2B), mikä on yhdenmukaista aikaisempien WB tuloksia CS pAb ja mAb (Fig. 1 D). Yhdessä siRNA knock-down kokeet viittaavat siihen, että

Nanog proteiinin NTERA-2-soluissa näyttää siirtyä, denaturoivalla SDS-PAGE, useilla molekyylimassat lukien noin

35

42

,

48

,

65

,

75

, ja

90

kD kanssa 42-kD: n vyöhyke on hallitseva ”isoformi”

.

karakterisointi Nanog proteiinin lajien NTERA-2-soluissa immunosaostuksella (IP) ja sen jälkeen massaspektrometrialla (MS) (ID) B

Tukeakseen siRNA knockdown tulokset, teimme kaksi MS-pohjainen proteiini ID kokeiluja.

Ensimmäisessä

, suoritimme IP joissa käytettiin 500 ug NE peräisin NTERA-2 ja somaattisten syöpäsolujen ja 5 anti-Nanog Abs eli eBioscience mAb, Kamiya pAb, CS Rb mAb, SC pAb H155 ja R tuloksia ei ole esitetty). Kaikki 5 vasta immunosaostettiin 42 kD Nanog bändi NTERA-2 NE. Esimerkiksi, kun IP tehtiin kanssa Kamiya pAb seuraa WB joko eBioscience mAb (Fig. 3A, kaista 9) tai R Fig. 3B, kaista 9). Kun IP tehtiin SC pAb H-155, joka on suunnattu kohti C-pään Nanog, jota seuraa WB joko eBioscience mAb (Fig. 3C, kaista 8) tai R