Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Soluväliai- (ECM) remodeling välittyy pääasiassa fibroblastit käyttämällä solun sisäinen ja ulkoinen reittejä . Vaikka on hyvin tunnettua, että solunulkoinen hajoaminen ECM proteaasien, jotka ovat peräisin syöpäsolujen helpottaa solujen invaasiota, solunsisäisen hajoamisen ECM komponenttien syöpäsolujen ei ole selvitetty. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia luonnehtia kollageenia sisäistämisen, joka on ensimmäinen vaihe solunsisäisen hajoamisen väylän haimasyöpäsoluissa valossa epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT).

Menetelmät /Principal Havainnot

Analysoimme toiminta kollageenin internalisaation kaksi haimasyövän solulinjoissa, SUIT-2 ja KP-2, ja haiman tähtisolut (PSC) käyttäen Oregon Green 488-gelatiinia. PSC: t oli vahva kyky kollageenin ottoa, ja haiman syöpäsoluja myös sisäistänyt kollageenin vaikkakin tehottomammin. Kollageeni sisäistäminen kyvyt SUIT-2 ja KP-2 solut edistettiin EMT aiheuttama ihmisen rekombinanttia transformoivan kasvutekijä β1 (

P

0,05). Expression of Endo180, kollageeni otto reseptoria, oli korkea mesenkymaalisten haimasyövän solulinjoissa, määritettynä EMT merkki lauseke (

P

0,01). Kvantitatiivinen RT-PCR ja western blot-analyysit osoittivat, että Endo180 ilmentyminen lisäsi myös EMT induktion SUIT-2 ja KP-2-soluissa. Endo180 pudotus by RNA-interferenssi vaimenee kollageenin oton (

P

0,01) ja invasiivisia kyvyt (

P

0,05) SUIT-2 ja KP-2-soluissa.

Johtopäätökset /merkitys

Haimasyöpä solut pystyvät kollageeni sisäistämisen, jota korostavat EMT. Tämä ECM välys järjestelmä voi olla uusi mekanismi soluinvaasion ja mahdollinen terapeuttinen kohde haimasyövän.

Citation: Ikenaga N, Ohuchida K, Mizumoto K, Akagawa S, Fujiwara K, Eguchi D, et al. (2012) haimasyöpäsoluissa parantaa kykyä kollageeni Internalisaatio aikana epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon. PLoS ONE 7 (7): e40434. doi: 10,1371 /journal.pone.0040434

Editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 helmikuu 2012; Hyväksytty: 6 kesäkuu 2012; Julkaistu: 05 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Ikenaga et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat avustusta opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede- ja teknologiaministeri Japanissa, Uehara Memorial Foundation ja Fukuoka Foundation for Sound Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on yksi tappavan syövät, ja sen 5 vuoden pysyvyys on vain 5% [1]. Sille on ominaista liiallinen desmoplasia runsasta soluväliaineen (ECM), joka on keskeinen rooli sen aggressiivinen käytös [2], [3]. ECM sisällä haimatuumorien pääasiassa tuotetaan aktivoitua fenotyyppi haiman tähtisolut (PSCs), ja ECM remodeling mukaan PSCs ja haiman syöpäsoluja on yksi keskeinen vaiheiden aikana syövän etenemisen [2], [4], [5]. Tähän mennessä useat solunulkoisia proteaaseja peräisin syöpäsolut ovat todettu avustajat syövän invaasio ja etenemiseen, kuten matrix (MMP), joka on disintegriini- ja metalloproteinaasien (ADAM) ja urokinaasi plasminogeeniaktivaattori [6].

kollageenit ovat runsain ECM komponenttien elimistössä ja ovat jatkuvan synteesin ja hajoamisen fysiologisissa ja patologisissa tiloissa. Strooman fibroblastit, jotka ovat tärkeimpiä soluja ylläpitää ECM homeostaasiin, hajottavat kollageenisäikeiden solunsisäisesti lisäksi solunulkoiseen hajoamista välittävät useita proteaasien [7], [8]. Ensimmäinen askel kollageenin otto kollageenin sitoutumista kalvo reseptoreihin, kuten α

2β

1-integriini [7], [9] ja Endo180 [10], jota seuraa myöhemmät endosytoosin, kuljetuksen lysosomeihin ja hajoaminen by lysosomaalisen kysteiini katepsiinit [11]. Endo180 kuuluu makrofagin mannoosireseptoriin perheen kohteena konstitutiiviset sisäistämistä ja kierrätys [12] ja on välttämätöntä soluunottoa kollageenin fibroblasteissa [10]. Äskettäin Endo180 havaittiin ilmentyvän paitsi fibroblasteissa, vaan myös osajoukon kasvaimia, mukaan lukien glioblastoomat [13] ja pohjapinta-, kuten rinta- kasvaimia [14].

Epithelial-mesenkymaalitransitioon (EMT) on kehitysprosessia jossa polarisoitunut epiteelisolujen vaihtaa erittäin liikkuvia mesenkymaalisten fenotyyppi tehdään useita biokemiallisia muutoksia [15]. Vuonna epiteelin syöpä, EMT induktio on keskeinen prosessi syövän etenemiseen, ja antaa syöpäsolujen kanssa invasiivisen ja metastaattisen kykyjä. Alennettu ilmentyminen E-kadheriinin, joka on yksi epiteelin markkereita, osoittaa mesenkymaalitransitioon epiteelisyöpäsolujen, ja on mukana huonon ennusteen haimasyövän [16]. EMT-sukua olevien molekyylien odotetaan myös olevan terapeuttisia kohteita.

Näiden linjojen näyttöä siitä, että fibroblastit on vahva kyky hajottaa kollageenia, ja että mesenkymaaliset fenotyyppi liittyy syövän invaasio, me arveltu, että haimasyöpäsoluissa myös sisäistää kollageeni, samanlainen fibroblasteissa ja parantaa niiden invasiivisen kyvyn käymällä läpi EMT. Tähän mennessä ekstrasellulaarisen hajoamista säätelee ekstrasellulaaristen proteaasien, kuten MMP johdettu haimasyöpäsoluissa on vakiintunut. Kuitenkin intrasellulaarinen kollageenin hajoamista haiman syöpäsoluissa ei ole dokumentoitu. Me tutkimme, haimasyöpäsoluissa on kyky sisäistää kollageenin käytettäessä

in vitro

tutkimuksessa ja arvioinut kollageenin sisäistämisen on haimasyövän hyökkäystä valossa EMT.

Tulokset

Ei vain PSCs vaan myös haimasyöpäsoluissa on kyky sisäistää kollageenin

perustettu

in vitro

PSCs alkaen resektoidun haimasyöpä tutkia PSCs on tehtävä kollageenin oton, samanlainen fibroblasteihin. Identiteetti aktivoidaan PSCs varmistettiin immunohistokemiallisella värjäyksellä vimentiinista ja α-sileän lihaksen aktiini (α-SMA) kuten aiemmin on kuvattu [17]. Oregon Green 488-gelatiinia (OG-gelatiini), denaturoitu muodossa kollageenin, visualisoitiin sytoplasmassa PSCs inkuboinnin jälkeen 2 h (kuvio 1A), ja virtaussytometria-analyysit osoittivat, että yli 95% PSCs oli internalized kollageenia ( kuvio 1 B). Haimasyöpä solulinjat SUIT-2 ja KP-2 oli myös mahdollisuus sisäistää natiivi kollageeni I, vaikkakin vähemmän tehokkaasti (kuvio 1 B). Konfokaalimikroskopia analyysit vahvistivat solunsisäinen lokalisaatio OG-liivate haiman syöpäsoluissa (kuvio 1 C). Erityisesti kara-muotoinen syöpäsolujen kanssa mesenkymaalisten morfologia tuntui sisäistää kollageenin voimakkaasti. Soluja inkuboitiin fluoreseiini-konjugoitu naudan seerumin albumiinia (fluoreseiini-BSA) kontrollina ei sisältänyt signaaleja sekä fluoresenssin mikrovalokuvaus ja virtaussytometria (tuloksia ei ole esitetty).

(A) edustaja mikrovalokuva immunofluoresenssivärjäyksen of α- SMA PSCs. PSCs on stellate kaltainen tai kara-muotoinen morfologia ja express α-SMA (punainen). PSCs ovat sisäistäneet monia kollageenin molekyylejä (vihreä). Mitta-asteikko: 100 um. Alkuperäinen suurennus: × 200. (B) Virtaussytometria analyysit PSCs, SUIT-2-solut ja KP-2-solujen kanssa inkuboinnin jälkeen OG-gelatiinia 2 tuntia. Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena, ja prosenttiosuudet kollageenin sisäistetty solut osoitetaan keskiarvoina ± SD edustavan lukuihin. (C) Konfokaalimikroskopia kuvia kollageenin sytoplasmassa SUIT-2 ja KP-2-soluissa. Soluja inkuboitiin OG-gelatiinia (vihreä), kiinnitettiin ja värjättiin Alexa Fluor 647-konjugoitu phalloidin (punainen) visualisoida solun linjaa. Orthogonal osiot XY, XZ ja YZ lentokoneita näkyvät. Y ja Z akselit kuvaavat lokalisoinnin internalized kollageenin selvemmin (nuolenpäät). Erityisesti, Karan muotoinen syöpäsolujen kanssa mesenkymaalisten morfologia sisältävät monia kollageenin molekyylejä (nuolet). Mittaviivat: 100 pm. Alkuperäinen suurennus: × 400.

EMT haiman syöpäsoluissa parantaa heidän kollageeni sisäistämisen

olivatko EMT haiman syöpäsoluissa liittyy toiminta kollageenin sisäistämisen, koska PSCs, joka on mesenkymaaliset fenotyyppi, on vahva kyky kollageenin sisäistämisen. EMT induktioon syöpäsoluissa, käytimme transformoiva kasvutekijä (TGF) -β1, joka on tärkeä tekijä aikana EMT monia maksuihin rooleja [15]. Haimasyövän soluja käsiteltiin TGF-β1 osoitti kara-muotoinen fibroblastinen morfologia ja solujen sironnan verrattuna käsittelemättömiin syöpäsolujen (kuvio 2A). Western blotting analyysit osoittivat, että E-kadheriinin ilmentyminen väheni ja vimentiinin ekspressio lisääntyi SUIT-2 ja KP-2-solujen käsittelyn jälkeen TGF-β1 (kuvio 2B). Nämä havainnot osoittavat, että haimasyövän soluja muuttunut on mesenkymaalisten fenotyypin, mikä tarkoittaa, että EMT indusoitiin TGF-β1. Kollageeni sisäistäminen kyvyt SUIT-2 ja KP-2 solut edistettiin EMT induktion TGF-β1 hoito 72 h (

P

0,05, kuvio 2C, 2D).

(A) SUIT-2 ja KP-2 solut transformoidaan kara-muotoinen morfologia hoidon jälkeen TGF-β1: ssa 72 tuntia. Mittaviivat: 100 pm. Alkuperäinen suurennus: × 200. (B) Western blotting-analyysi osoittaa, että E-kadheriinin ilmentyminen vähenee ja vimentiinista ilmentyminen lisääntyy puku-2 ja KP-2 solujen TGF-β1 hoitoa. Taitteen erot edustava immunoblot määrällisesti densitometrialla näkyvät alapuolella kaistaa. Unt: käsittelemätön. (C) SUIT-2 ja KP-2-soluja viljeltiin kanssa tai ilman TGF-β1: ssa 72 tuntia, jonka jälkeen inkuboitiin OG-gelatiinia (vihreä) 2 tuntia. Solut kiinnitettiin ja värjättiin Alexa Fluor 647-konjugoitu phalloidin (punainen) visualisoida soluun ääriviivat. Fluoresenssimikroskopiaa paljastaa, että kollageeni sisäistää SUIT-2 ja KP-2-soluissa lisääntyy hoidon jälkeen TGF-β1. Mittaviivat: 100 pm. Alkuperäinen suurennus: × 400. (D) määrälliset tiedot kollageenin internalisaation by SUIT-2 ja KP-2-solut määritetään virtaussytometrialla osoittaa merkittäviä eroja kollageenin hapenottokyvyn välillä käsittelemättömän ja TGF-β1-käsiteltyjen syöpäsolujen. Kukin solulinja analysoitiin kolmena kappaleena ja prosenttiosuudet kollageenin sisäistetty solut ilmaistaan ​​keskiarvoja ± SD. Vertailuja käsittelemättömän ja TGF-β1-käsiteltyjä soluja suoritettiin käyttäen Studentin

t

-testi. Kaikki kokeet suoritettiin yli kolme kertaa ja edustavat kuvat on esitetty.

Endo180 ilmentyminen liittyy mesenkymaaliset fenotyypin haimasyöpäsoluissa

Seuraavaksi analysoimme ekspressiotasot EMT markkereita, kuten E-kadheriinin ja vimentiinista, suuret kollageenireseptorin α2β1-integriinin ja kollageenin otto reseptorin Endo180 että haimasyövän solulinjoissa selkeyttää suhdetta EMT ja kollageenin sisäistäminen. Haiman syövän solulinjat ilmensivät eri tasoilla EMT markkereita, α2β1-integriini ja Endo180 (kuvio 3A). Ensimmäinen, käytimme suhde E-kadheriinin ja vimentiinin luokitella solujen epiteeli- tai mesenkymaaliset fenotyyppi, ja sitten verrataan tasoja α2-integriini, β1-integriini ja Endo180 ilmentyminen solujen välillä luokitellaan kaksi fenotyyppiä. Endo180 on enemmän ilmentyy suuresti mesenkymaalisten haimasyövän solulinjoissa kuin epiteelin haimasyövän solulinjoissa, kun taas ekspressio β1-integriinin ja α2-integriinin ei korreloi solun fenotyyppejä (

P

0,01 ; kuvio 3B). Ekspression Endo180 mRNA puku-2 ja KP-2-soluissa oli voimistunut EMT induktion TGF-β1 hoitoa, yhdessä lisäyksiä ilmentymiseen solun pinnalla Endo180 9,3 ± 0,1%: sta 19,9 ± 2,4% puku-2-soluissa ja 19,1 ± 1,0%: sta 24,8 ± 1,5% KP-2-soluissa (

P

0,01, kuvio 3C).

(A) Suhteellinen ekspressiotasot E-kadheriinin, vimentiinistä , Endo180, β1-integriini ja α2-integriinin 10 haimasyövän solulinjoissa ja neljä PSC kulttuureissa. Ilmentymistasojen kaikkien geenien normalisoitiin vastaavan ekspressiotasot β-aktiini. Kukin näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena, ja tiedot on ilmoitettu keskiarvoina ± SD. Viidesosa hankitun tasot E-kadheriinin ja Endo180 esitetään kuvaaja viittausten helpottamiseksi. (B) haiman syövän solulinjat jaettiin kahteen ryhmään, joka esittää epiteelin fenotyyppi (SW1990, HS766T, BxPC-3, CAPAN-1 ja AsPC-1) ja mesenkymaaliset fenotyypin (SUIT-2, CFPAC-1, MIA PaCa- 2, Panc-1 ja KP-2) perusteella ilmaisun suhteen E-kadheriinin ja vimentiinin. Endo180 on korkeammin ilmaistaan ​​solulinjaa mesenkymaaliset fenotyyppi kuin niillä, joilla epiteelin fenotyypin, kun taas ilmaisuja β1-integriini ja α2-integriinin eivät korreloi solun fenotyyppejä. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Mann-Whitney

U

-testissä. (C) SUIT-2 ja KP-2-soluja inkuboitiin kanssa tai ilman TGF-β1 72 tuntia, ja ekspressiotasot Endo180, β1-integriini ja α2-integriini määritettiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä (ylempi paneeli). Ilmentymistasojen kaikkien geenien normalisoitiin vastaavan ekspressiotasot 18S rRNA. Kansi muutokset laskettiin mRNA tasot TGF-β1-käsitellyissä soluissa jaettuna tasot käsittelemättömillä soluilla. Endo180 mRNA: n ekspression SUIT-2 ja KP-2 solujen lisää suuresti kasvanut EMT induktion kuin β1-integriini ja α2-integriinin mRNA ilmaisun. Lisääntynyt ilmentyminen solun pinnalla Endo180 EMT-indusoidun SUIT-2 ja KP-2-solut (punaiset viivat) verrattiin käsittelemättömään SUIT-2 ja KP-2-solujen (siniset viivat), vastaavasti, varmistettiin virtaussytometrillä analyysit (

P

0,01 kullekin alempi paneeli). Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena, ja vertailuja käsittelemättömän ja TGF-β1 käsiteltyjä soluja suoritettiin käyttäen Studentin

t

-testissä.

knockdovvn Endo180 haiman syöpäsoluissa vaimentaa niiden kollageenin otto ja invasiivisia kyvyt

Sen tutkimiseksi, Endo180 ilmentyminen liittyy kollageeni sisäänotto haimasyöpäsoluissa, me pudotti Endo180 mRNA puku-2 ja KP-2-soluissa käyttäen RNA-interferenssi teknologiaa. Ohimenevä transfektio siEndo180-1 ja siEndo180-2 laski Endo180 ilmentymistä sekä mRNA ja proteiini tasoilla (kuvio 4A). Solu morfologiat SUIT-2 ja KP-2 solut eivät muutu, kun Endo180 knockdown. Kollageeni sisäistäminen kyvyt SUIT-2 ja KP-2-soluilla käsittely TGF-β1 dramaattisesti vaimennettu tukahduttaminen Endo180 ilmaisun (

P

0,01; kuva 4B). Lisäksi 3D kollageenimatriisilla määritykset osoittivat, että EMT aiheuttama syöpäsolujen näkyy vähemmän invasiivisia fenotyyppi kun Endo180 ilmentyminen suppressoitiin siRNA. TGF-β1 edelleen parannettu hyökkäys syöpäsolujen läsnäolo ohjaus siRNA (kuvio 5A, 5B). Toisaalta, Endo180 ilmentyminen ei ollut mukana solun proliferaatio ja migraatio SUIT-2 ja KP-2-soluja (tietoja ei esitetty).

(A) SUIT-2 ja KP-2-solut transfektoitiin kanssa siEndo180-1 tai siEndo180-2, ja knockdovvn Endo180 ilmentymisen verrattuna ohjaus siRNA-transfektoiduissa soluissa vahvistettiin kvantitatiivisen RT-PCR (ylempi paneeli) ja western blotting-analyysi (alempi kuva) vähintään 3 päivää. (B) Sen jälkeen EMT induktion kanssa 10 ng /ml TGF-β1, SUIT-2 ja KP-2-soluja inkuboitiin OG-gelatiinia 2 tuntia. Prosenttiosuudet OG-gelatiini-sisäistetään solut arvioitiin virtaussytometrialla. Piste tontteja osoittavat edustavia virtaussytometria tietoja käsittelemättömien SUIT-2 ja KP-2-solut ja solut transfektoitu ohjaus siRNA, siEndo180-1 tai siEndo180-2 (ylempi paneeli). Kollageeni sisäistämisen tulokset edustavat suhteellisesti vähiten kollageenin sisäistetty solujen joukossa transfektoitujen solujen ohjaus siRNA, siEndo180-1 tai siEndo180-2 niille käsittelemättömissä soluissa. Parannettu kollageenin sisäistämisen kykyjä puku-2 ja KP-2-solujen jälkeen TGF-β hoidon dramaattisesti vähentää knockdovvn Endo180 ilmaisun (alempi kuva). Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena, ja vertailuja TGF-β1-käsitellyt solut transfektoitu ohjaus siRNA ja muut solut tehtiin käyttämällä Studentin

t

-testi. *

P

0,01; **

P

0,001.

SUIT-2 ja KP-2-solut (4 x 10

4 solua /kuoppa) transected siRNA: illa suspendoitiin 50 ug 3D tyypin I kollageenin matriisin, ja kylvetään yläkammiot tai ilman TGF-β1. Sen jälkeen, kun geelin muodostuminen inkuboimalla 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, ylemmän kammiot pantiin kuoppiin 24-kuoppaisen viljelymaljalle, joka sisälsi 750 ui 10% FBS /DMEM. Solut, jotka tunkeutuivat alapintaan kunkin ylemmän kammion kalvon läpi kollageeni I matriisin fiksoitiin, värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla, ja laskettiin. (A) edustaja mikrovalokuvia hyökkäävän SUIT-2 ja KP-2 solut transfektoitu ohjaus siRNA, siEndo180-1 tai siEndo180-2. Mittaviivat 100 pm. Alkuperäinen suurennos, × 200. (B) Invasiivinen kyvyt SUIT-2 ja KP-2-soluja lisätään EMT induktion, mutta vaimennettu knockdovvn Endo180 ilmaisun. Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena, ja vertailut kahden ryhmän välillä suoritettiin käyttäen Studentin

t

-testi. *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,001. (C) Kollageeni sisäistämisen tulokset puku-2 ja KP-2-solujen jälkeen yhteisviljelmä kanssa PSCs 72 tuntia. Kollageeni sisäistäminen kyvyt ovat hieman parannettu SUIT-2 ja KP-2-solujen kautta syöpää stroomavuorovaikutuksiin. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja vertailun datan suoritettiin käyttäen Studentin

t

-testi. *

P

0,05; **

P

0,01.

PSCs parantaa kollageenin sisäistämisen haiman syöpäsoluja

Lopuksi tutkimme, PSCs ollut vaikutusta kollageenin sisäistäminen haiman syöpäsoluja, koska PSCs tiedetään edistävän etenemistä ja EMT haimasyövän kautta syöpään stroomavuorovaikutuksiin [18], [19]. Kollageeni sisäistäminen kyvyt SUIT-2 ja KP-2-solut viljellään kanssa PSCs oli hieman tehostunutta verrattiin vuonna monocultured syöpäsoluissa (

P

0,05 ja

P

0,01, vastaavasti, kuvio 5C). Nämä havainnot viittaavat siihen, että syövän stroomavuorovaikutuksiin myös edistää kollageenin ottoa haiman syöpäsoluja.

Keskustelu

Invasion syöpäsolujen, kriittinen vaihe syövän etenemisen koostuu ECM hajoamisen ja myöhemmän kulkeutumista syöpäsolujen vastaperustetun soluvälitilaan. MMP: t on pidetty suuria proteaasit kykenevät hajottamaan eri ECM komponentteja auttamaan taudin etenemiseen, ja pidetään lupaavia kohteita syövän hoidossa [20], [21]. Kuitenkin Useimmissa kliinisissä tutkimuksissa MMP-estäjien ovat tuottaneet pettymyksen, rajoitetulla menestyksellä [22], [23]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että ei ainoastaan ​​ekstrasellulaarisen hajoamista ECM mutta myös solunsisäistä sisäänottoa ECM komponentteja voi olla mukana solujen invaasiota. Proteolyysiä järjestelmä liittyy hajoaminen sisäistäneet kollageenien mukaan lysosomaalisen kysteiini katepsiinit on myös havaittu useissa maligniteettien ja oli raportoitu liittyvän kasvaimen invaasion ja metastaasin [24], [25], [26]. Quintanilla-Dieck et ai. [27] osoitti, että katepsiini K melanooman säätelee hyökkäystä välittämällä solunsisäisen hajoamisen ECM komponentteja. Immunohistokemiallinen analyysit haimasyövän kudosten osoitti, että ilmaukset katepsiini B ja katepsiini L ovat indikaattoreita huonoon ennusteeseen [28]. Nämä linjat todisteet saattaa ehdottaa, että solujen invaasio, on tarpeen luoda tilaa kulkeutumaan jonka sisäistäminen ja hajottamalla ECM komponentit solun lisäksi niiden Perisellulaarinen hajoamista. Puhdistuma järjestelmä ECM osien näytteillä syöpäsolut on mahdollisesti uusi mekanismi hyökkäyksen haimasyövän.

EMT pidetään ratkaiseva askel syövän etenemisessä, vaikka sen merkitys ja merkitys ovat pysyneet Kiistanalaista [15]. Menetys solu-soluadheesion, muutoksia solujen muoto ja lisääntynyt liikkuvuus lukemiin invaasio syöpäsolujen tyvikalvon läpi osaksi strooman kudokseen [15], [29]. EMT aiheuttama soluja tyypillisesti nähdään leviämisrintamassa primaarikasvainten, ja kehittyä seuraavat vaiheet syvälle kulkeutumisen ECM, intravasation, kuljetus kautta liikkeeseen ja muodostumista micrometastases [30]. Peräsuolen syöpä, pieni aggregaatteja kasvainsolujen ulottuu syöpäkasvaimen viereiseen strooman on esitetty morfologinen todiste EMT on invasiivisia etuosia ihmisen syövän [31]. Rhim et ai. [32] osoittivat, että merkityn pahanlaatuiset epiteelisolut tunkeutunut osaksi strooman kautta EMT ja sekoittunut stroomasolujen geneettisen hiirimallissa spontaaniin haimasyöpä. Huomasimme, että EMT aiheuttama haiman syöpäsoluja saattaa edistää niiden invasiivisen kyvyn, sillä se parantaa liikkuvuutta, mutta myös parantaa kollageenin sisäistämisen. Kollageeni sisäistäminen voi olla yksi osasyy syövän etenemisen tarjoamia EMT, ja nämä solupopulaatioiden kykenee kollageenin solunoton olla johtava solujen invaasiota. Fibroblasteissa α

2β

1-integriinin pidetään tärkeänä solujen vuorovaikutuksia kollageenin ja on ehdotettu rooli sisäistämisen prosessissa [33]. Kuitenkin Tutkimuksessamme α

2β

1-integriinin ilmentyminen ei ollut mukana solun fenotyyppejä haimasyövän solulinjoissa ja ei noussut EMT aiheuttama SUIT-2 ja KP-2-soluissa. Kokeiden mukaan käyttäen anti-β

1-integriini-vasta-aine ja Endo180 puutteesta fibroblastit [8] Endo180-välitteisen adheesion fibroblasteja kollageenimatriiseihin on β

1-integriini-riippumaton prosessi. Yhdessä solujen invaasio parantaa EMT voitaisiin katsoa Endo180 yksin eikä a

2β

1-integriiniin.

desmoplasia haimasyövän ilmentyy bändejä kuitu- strooman ympäröivän syöpäsoluja, jolloin kasvu fibrillar kollageenien. Tämä kuitu- strooman on pääasiassa koostuu tyypin I kollageeni, joka oli esitetty edistävän jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja chemoresistance haiman syöpäsoluissa [2], [34]. Toisaalta, kasvain-altis hiirillä, joilla Endo180 puutteesta fibroblastit osoittivat lisääntynyttä kertymistä kollageenin kasvainten [35], ja hiiret istutettu rintasyövän ilmentäviä sisäistämisen-viallisen Endo180 mutantti oli lisääntynyt kasvaimeen fibroosi [14]. Nämä havainnot korreloivat lasku kollageenin sisäistämistä ja vähensi kollageenin liikevaihtoa lopulta johtaa rajoitetussa kasvaimen kasvua. Tutkimuksessamme PSCs oli vahva kyky kollageenin sisäistämisen ja Endo180-riittävä haimasyöpäsoluissa osoittivat vahvempaa invasion kuin Endo180-vajaiden solujen. Siksi ECM liikevaihdon välittämä Endo180 voi olla ratkaisevaa merkitystä kasvaimen laajentamiseen ja syövän etenemistä.

Yhteenvetona paitsi mesenkymaaliset PSCs vaan myös haimasyöpäsoluissa on kyky sisäistää kollageenia. Kollageeni sisäistäminen syöpäsolujen tehostettiin yhdessä EMT. Knockdown kollageenin oton reseptorin Endo180 kumonnut kollageeni sisäistämisen syöpäsolujen ja vähentäneet invasiivisia kykyjä. Tämä aiemmin unappreciated invasiivisia mekanismi haimasyöpäsoluissa on vielä selvennettävä tunnistaa uusia terapeuttisia kohteita haimasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja viljelyolosuhteet

Seuraavat 10 haimasyövän solulinjoissa käytettiin: AsPC-1, KP-2, Panc-1, SUIT-2, BxPC-3 (Dr. H. Iguchi, National Shikoku Cancer Center, Matsuyama, Japani), MIA PaCa-2 (japanilainen Cancer Resource Bank), CAPAN-1, CFPAC-1, HS766T ja SW1990 (American Type Culture Collection). Ihmisen PSCs eristettiin tuoreista haimasyöpä kirurgisista näytteistä käyttäen seuraus menetelmää kuten aiemmin on kuvattu [36], [37]. Ensisijainen Ihmisen PSCs peräisin neljästä potilaasta, jolla invasiivisia haimasyöpä määritettiin laboratoriossamme kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea Kyushun yliopistossa ja noudatetaan sovittuja eettisiä ohjeita Human Genome /Gene Research säätänyt Japanin hallituksen ja Helsingin julistuksen. Identiteetti PSCs varmistettiin immunofluoresenssivärjäystä α-SMA (positiivisten määrä: lähes 100%) ja vimentiinista (positiivisia: lähes 100%) ja morfologian (stellate kaltainen tai kara-muotoinen solut) [17]. Kaikki soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) (Sigma), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), streptomysiiniä (100 ug /ml) ja penisilliiniä (100 ug /ml) 37 ° C: ssa kosteutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 10% CO

2.

Kollageeni sisäistämisen määritys

solut istutettiin 90-mm astiat tiheydellä 1 x 10

5 solua /malja ja inkuboitiin 1% FBS /DMEM kanssa tai ilman 10 ng /ml ihmisen rekombinantti-TGF-β1 (R 1:100 laimennos) 2 h, jonka jälkeen inkuboitiin Alexa Fluor 647-konjugoitu anti-kani-IgG: llä (Molecular Probes) 1 h. Nuclear DNA vastavärjättiin 0,05 ug /ml 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli. Laser-skannaus konfokaali- fluoresenssimikroskooppia (A1R, Nikon) käytettiin immunofluoresenssimenetelmällä mikrovalokuvaus. Kuvat hallittiin käyttäen NIS-Elements (Nikon).

eristäminen RNA

Kokonais-RNA eristettiin viljellyistä soluista käyttäen High Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics) DNaasi I (Roche Diagnostiikka) hoito. Uutettu RNA kvantitoitiin absorbanssilla 260 nm: ssä, ja sen puhtaus arvioitiin alkaen 260/280 absorbanssisuhde kanssa NanoDrop ND-1000 spektrofotometrillä (NanoDrop Technologies).

Quantitative käänteinen transkriptio-polymeraasiketjureaktion reaktio (RT-PCR) B

Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin käyttäen QuantiTect SYBR Green Reverse-Transcription PCR Kit (Qiagen) ja Chromo4 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories). Suunnittelimme alukkeina E-kadheriinin ja vimentiinista käyttäen Primer 3 ohjelmistoja ja suorittaa BLAST etsii varmistamiseksi pohjamaali erityispiirteet. Alukkeet Endo180, β1-integriini, α2-integriini, β-aktiini ja 18S rRNA ostettiin Takara Bio Inc. Alukkeiden sekvenssit, joita käytetään esillä olevassa tutkimuksessa on esitetty taulukossa 1. Kukin reaktioseos inkuboitiin ensin 50 ° C 30 minuutin ajan, jotta käänteistranskriptio, jossa ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin pohjustus kokonais-RNA geenillä-aluketta. PCR aloitettiin inkuboimalla 95 ° C: ssa 15 min aktivoida polymeraasi, jota seurasi 40 sykliä 94 ° C: ssa 15 s, 55 ° C: ssa 30 s ja 72 ° C: ssa 30 s (E-kadheriinin ja vimentiinin) tai 95 ° C: ssa 5 s, 60 ° C: ssa 20 s ja 72 ° C: ssa 30 s (Endo180, β1-integriini, α2-integriini, β-aktiini ja 18S rRNA). Ilmentymistasojen Geenien laskettu standardikäyriä rakennettu kokonais-RNA: SUIT-2-soluissa. Ilmaisu tasot normalisoidaan β-aktiini tai 18S rRNA ilmaisun ja ilmaista suhteena ilmentymisen kohdegeenin kuin β-aktiini tai 18S rRNA. Kaikki näytteet ajettiin kolmena kappaleena. Ei havaittavaa PCR-tuotteet monistettiin ilman etukäteen käänteistranskriptio. Tarkkuus ja eheys PCR-tuotteet varmistettiin Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc.).

Virtaussytometria

Viljellyt solut kerättiin altistuminen trypsiini /EDTA 5 min 37 ° C: ssa, ja pestiin 10% FBS /DMEM. Saadut yksittäiset solut suspendoitiin jääkylmään 1% FBS /PBS-liuosta ja analysoitiin käyttäen virtaussytometriä (EC800, SONY) varustettu laser, joka tarjotaan eksitaatioaallonpituudella 488 nm. Eclipse Analyysiohjelmisto (Sony) käytettiin määrällisesti fluoresoivat signaalit ja asettaa loogisen elektronisen-gating parametrit.

invaasiomääritys 3D-kollageeni I matrix ja migraatiokokeessa

invasiivisuus haimasyöpä solut arvioitiin perustuu solujen määrän valtaavat kautta transwell kammioiden (BD Biosciences) mukaisesti 3D kulttuurin olosuhteissa kollageeni I matriisi.