Krooninen sairaus

tiivistelmä

Progestiinipohjaisia ​​vastus on suurin este hoitoon varhaisessa vaiheessa, hyvin erilaistunut kohdun limakalvon syöpä sekä toistuvia kohdun limakalvon syöpä. Mekanismi takana suboptimaalisen progestiinia ei ole hyvin ymmärretty.

PTEN

tuumorisuppressorigeeniä usein mutatoitunut tyypin I endometriumin syövät ja tämä mutaatio johtaa hyperactivation että PI3K /AKT-reitin. Oletimme, että aktivoitunut AKT edistää riittävää vastetta progestiineja endometriumin syöpäsoluja. Ishikawa pysyvästi transfektoitujen solujen progesteronireseptori B (PRB23 solua) käsiteltiin AKT-estäjällä, MK-2206, joka alentaa tehokkaasti tasot p (Ser473) -AKT annoksesta riippuva (10 nM 1 uM) ja ajasta riippuvia tavalla (0,5 tunnista 24 tuntiin). MK-2206 inhiboi tasot p (Thr308) -AKT ja alavirran kohde, p (Thr246) -PRAS40, mutta ei muuta tasoa p (Thr202 /Tyr204) ERK tai p (Thr13 /Tyr185) SAPK /JNK, mikä osoittaa spesifisyyden MK-2206 varten AKT. Lisäksi MK-2206 hoidossa PRB23 solujen johti merkittävään kasvuun progesteronin reseptorin B (PRB) proteiinia. Microarray-analyysi PRB23 solujen tunnistettu PDK4 kaikkein erittäin säädelty geeni joukossa 70 yliaktiivista geenejä vastauksena R5020. Esto AKT edelleen voimistunut progestiinia välittämää ilmentymä PDK4 mutta ei vaikuttanut toista progestiinia reagoivaa geeni, SGK1. Hoito PRB23 solujen R5020 ja MK-2206 riippumatta laski elinkelpoisuuden solujen, kun taas yhdistelmä R5020 ja MK-2206 aiheutti suurimmat vähentää solujen elinkelpoisuutta. Lisäksi hiiriä ksenosiirrettyjä käsitellyt kasvaimet MK-2206 yksin tai progesteroni yksin näytteillä vaatimaton vähennyksiä niiden kasvaimen tilavuuden. Suurin lasku kasvaimen koon havaittiin hiirissä, joita käsiteltiin sekä MK-2206 ja progesteroni; Näiden kasvainten osoitti vähiten proliferaatiota (Ki67) ja kaikkein apoptoosin (pilkotaan kaspaasi-3) kaikkien hoitoryhmissä. Yhteenvetona esto AKT stabiloi progesteronireseptoriin B ja täydentää progesteroni vaste endometriumsyöpään solut, jotka ovat hyperactivated AKT.

Citation: Pant A, Lee II, Lu Z, Rueda BR, Schink J, Kim JJ ( 2012) esto AKT kanssa suun kautta allosteeristen AKT-estäjällä, MK-2206, sensitizes Endometrial syöpäsolujen Progestiinipohjaisia. PLoS ONE 7 (7): e41593. doi: 10,1371 /journal.pone.0041593

Editor: John P. Lydon, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 22 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 24 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Pant et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: National Institutes of Health R21 CA127674 (JJK), National Institutes of Health /National Cancer Institute koulutus avustus T32CA09560, ja siitä Malkin Scholars Program Robert H. Lurie Kattava Cancer Center of Northwestern University (IIL). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kohdun limakalvon syöpä on yleisin gynecologic syöpään Yhdysvalloissa. Vuonna 2010 43470 uutta tapausta ennakoitiin johti 7950 kuolemantapausta [1]. Valtaosa kohdun limakalvon syöpä tapaukset liittyvät pelkän estrogeenin toimintaa kutsutaan tyypin I endometriumin syöpiä. Yleisin geneettinen mutaatio, joka esiintyy noin 50-80% kaikista tapauksista tyypin I kohdun limakalvon syöpä on tuumorisuppressorigeenin

PTEN

[2], [3]. Mutaatio

PTEN

geeni aiheuttaa alavirtaan konstitutiivisen aktivaation fosfatidyyli 3′-kinaasi (PI3K) /AKT-reitin [4]. AKT on seriini /treoniini-kinaasi, joka aktivoi erilaisia ​​reittejä edistää solujen eloonjäämistä ja inhiboimaan apoptoosia [4], [5]. Aikaisemmin on osoitettu, että on olemassa kohonnut aktivoitu AKT endometriumin syöpä ja että tämä saattaa merkitä huono ennuste näillä potilailla [6]. Lisäksi on osoitettu, että estämällä AKT väylän endometriumsyöpään soluissa johtaa lisääntyneeseen apoptoosiin, mikä osoittaa, että modulaatio tämän reitin voisi olla tärkeä terapeuttinen merkitys [7], [8].

Kohdun limakalvon syöpä hoidetaan yleensä kirurginen poisto kohdun ja adjuvanttihoitona kuten on osoitettu tietyn patologian. Alkuvaiheen tauti tämä käsittely johtaa erinomainen 5 vuoden eloonjäämisluvut yli 90% [9]. Tämä lopullinen leikkaus vastaista muita hedelmällisyyttä. Koska lihavuus hinnat lisäävät väestön keskuudessa, tämä johtaa yhä nuorempia naisten kohdun limakalvon syöpä ja hedelmällisyys säästäviä hoito tulee enemmän korvaamaton. Nykyisin progestiinien käytetään ensisijaisina hoito edennyt tai uusiutuva sairaus, potilailla, jotka eivät ole operatiivisia ehdokkaita takia lääketieteellisiin sairastuvuutta ja potilaat haluavat säilyttää tulevaa hedelmällisyyttä. Useita tapauksessa sarja hoidetuista potilaista progestins on julkaistu rohkaisevia, joskaan ei ehdoton, tuloksia. Response hinnat endometriumhyperplasia kanssa atypia ovat vaihdelleet 67-82% ja hoitovaste huono laatu endometriumsyöpään välillä 50-70% (tarkistetaan [10]). Niille potilaille, jotka eivät reagoi keltarauhashormonia hoito, kohdun suositellaan. Tämä kliininen tilanne on yleinen kuin potilaiden osuus alle 45 diagnosoidaan kohdun limakalvon syöpä nyt alueella 5 29% [10],.

progesteroni välittää sen estävät vaikutukset endometriumiin ja kohdun limakalvon syöpä kautta progesteroni reseptorin (PR), solunsisäinen steroidireseptoriperheen A ja B isoformit. Nostamalla hoitovaste on progestiinia hoidon ja parantaa selviytymistä tapauksia on raportoitu kasvaimissa suurempi prosenttiosuus PR [12]. PRA puuttuu 164 aminohappoa N-päästä ja molemmat isoformit on muunnettu yksittäisten mRNA-lajin yhden geenin valvonnassa erillisiä promoottorit, ja niiden katsotaan toiminnallisesti erillisiä [13]. Vaikka erityiset roolit PRA ja PRB jäävät epäselväksi kohdun limakalvon syöpä, tutkimukset osoittavat, että Valvontaelin voi olla ensisijainen isoformin vastaavat kasvua estävän ja kasvaimen tukahduttava toimia progesteronin in vitro. In PRB-siirretty stabiilisti Ishikawa soluja, MPA-hoito johti lisäkasvun estäminen, siirtolaisuuden, ja invaasio, kun taas PRA-siirretty stabiilisti Ishikawa solut eivät estäneet näiden prosessien [14], [15]. Lisäksi PRB transfektoidut Hec50co soluja käsiteltiin progesteronin osoittivat merkittävästi vähentää solujen lisääntymisen ja invaasio, kun taas Hec50co solut, jotka ilmentävät PRA oli vain vaatimaton estäviä vaikutuksia [16].

MK-2206 on oraalisesti aktiivinen, allosteerinen estäjä AKT: tä. Lukuisat prekliiniset tutkimukset ovat osoittaneet tehoa estämään AKT ja edistää syöpäsolujen kuolemaa ainoana lääkkeenä sekä yhdessä muiden kemoterapia-aineiden [17], [18], [19], [20]. Kliiniset tutkimukset ovat käynnissä käyttämällä tätä uutta yhdistettä syöpäterapialle erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia. MK-2206 osoitettiin olevan yleensä hyvin siedetty annoksilla enintään 60 mg suun QOD ja johti plasman sisällä hyväksytty terapeuttisella alueella [21]. Tällä hetkellä on avoin vaiheen II tutkimus sponsoroi NCI potilailla, joilla on pitkälle edennyt tai uusiutuva kohdun limakalvon syöpä. Ensisijainen tulokset ovat progression- elinaika ja objektiivinen kasvaimen vaste.

Tässä tutkimuksessa, me raportoimme että inhibition AKT reitin MK-2206 tulokset laskivat elinkelpoisuuden ja lisääntynyt apoptoosin kohdun limakalvon syövän soluja. Lisäksi esto AKT lisää PRB proteiinin tasot, muuttaa ilmaus progestiinia geenien ja synergizes progestiiniriippuvuutta pienentää kasvaimen ksenograftien. Kombinatorisista progestiineilla ja AKT-inhibiittoreita voidaan katsoa herkistää limakalvon adenokarsinooma ja keltarauhashormonia terapia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin Northwestern University Animal Care komitea.

Endometrial Syöpäsolut

PRB23 Ishikawa solut saatiin L. Blok (Erasmus University, Alankomaat). Ishikawa solut peräisin hyvin erilaistunut kohdun limakalvon adenokarsinooma, joiden tiedetään PTEN mutaatio [14]. PRB23 solut muodostettiin stabiileja transfektoimalla pcDNA3.1 PRB ekspressiovektorin Ishikawa-soluja, joilta puuttuu endogeeninen PR [14]. PRB23-soluja ylläpidettiin DMEM /F12, jossa oli 10% FBS: ää, natriumpyruvaattia, penisilliiniä /streptomysiiniä, hygromysiini, ja G418: aa. Noin 60-80% konfluenssiin, solut seerumia yön yli DMEM /F12. Solut käsiteltiin sitten seuraavana päivänä ajoneuvon, 100 nM MK-2206 (2 h esikäsittely), 10 nM R5020, tai yhdistelmä MK-2206 ja R5020. MK-2206 (Merck) saatiin läpi Cancer Therapy Evaluation Program.

Western Blot

kokosolulysaateista saatiin jäillä käyttämällä M-PER Mammalian lyysiliuoksella (Thermo Scientific), johon oli proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorit (Sigma). Konsentraatio proteiinin lysaateissa mitattiin käyttäen Micro BCA-pakkausta (Thermo Scientific). Eristetty proteiini näytteet ajettiin 8% akryyliamidia geelejä ja sitten siirretään polyvinylideenidifluoridista kalvoja (Whatman). Membraanit blokattiin 5% naudan seerumialbumiinia (BSA, Sigma) TBS-T huoneenlämpötilassa yhden tunnin ajan. Membraanit inkuboitiin sitten yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden fosforyloidun (Ser473) -AKT, fosforyloitiin (Thr 308) -AKT, fosforyloitu PRAS40, PRAS40, fosforyloitu (Thr202 /Tyr 204) ERK, ERK, (pThr183 /Tyr185) SAPK /JNK, JNK, halkaistut PARP, halkaistut kaspaasi 3 (Cell Signaling), ja PR (Dako). Täplät pestiin neljä kertaa TBS-T huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin sitten toissijainen peroksidaasiin konjugoitua vuohen anti-kani tai vuohen anti-hiiri-vasta-aineen yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kalvot kehitettiin ECL Super Signal West Femto havaitseminen kit (Thermo Scientific). Kalvot stripataan käyttäen palautus Western Blot strippaus Buffer (Pierce) ja tutkittiin vasta-aineen beeta-aktiini (Sigma) latauskontrollina.

elinkykyyn

arvioimiseksi solun elinkelpoisuuden alamarBlue elinkykyyn reagenssia (Invitrogen) käytettiin. PRB23 solut ympättiin 96-kuoppaiselle kirkas pohja musta levy noin 1500 solua kuoppaa kohti 37 ° C inkubaattorissa. Solujen annettiin kiinnittyä yön yli ja seuraavana päivänä, pestiin PBS: llä ja sitten ilman seerumia yön yli seerumivapaassa DMEM /F12. Seuraavana päivänä solut on esikäsitelty 1 uM MK-2206: ssa yksi tunti ja sitten käsiteltiin 100 nM R5020 120 tuntia. Lopussa hoidon ajan, 10 ui alamarBlue-reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan kaksi tuntia ja sitten fluoresenssi-signaali mitattiin Synergy HT-levylukijaa Bio-Tek kanssa KC4 3,4 ohjelmiston 530/590 nm määrittämiseksi solujen elinkykyä.

microarray Analysis ja tilastollinen analyysi

Kolme erillistä PRB-Ishikawa soluviljelmät käytettiin mikrosiruanalyysillä. Koeolosuhteet olivat ajoneuvon tai käsittelemällä 10 nM R5020: ssa 2 tuntia. Kaikki RNA-näytteet prosessoidaan Genomics Core Facility in Center for Genetic lääketieteen Northwestern University (Chicago, IL). Laatu kokonais-RNA arvioitiin käyttämällä Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). 1.5 ug kutakin RNA-näytettä, jossa on 260/280 ja 28S /18S-suhde on suurempi kuin 1,8, käytettiin tekemään kaksijuosteinen cDNA. Laatutarkastukset ja koetin taso käsittelyn Illumina microarray tietoja edelleen tehty R Bioconductor paketti, lumi (https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/lumi.html). Tietojenkäsittely sisältyi myös normalisoinnin menettely hyödyntämällä kvantiili normalisoinnin menetelmää [22] vähentää peittäminen vaihtelu mikrosiruja, jotka voitaisiin ottaa käyttöön prosessien aikana näytteen valmistusta, valmistuksen, fluoresenssi merkintöjä, hybridisaatio ja /tai skannaus. Hierarkkinen klusterointi ja pääkomponenttianalyysiin tehtiin normalisoitu signaali tietojen arvioimiseksi näytteen suhteen ja vaihtelevuutta. Probes poissa kaikissa näytteissä erotettiin suodattamalla mukaan Illumina n havaitseminen p-arvot loppupään analyysiin. Differential geenien ilmentyminen eri olosuhteissa arvioitiin tilastollisella Lineaarinen analyysi käyttäen Bioconductor paketti Limma, jossa empiirinen Bayes menetelmää käytettiin kohtalainen keskivirheet arvioidusta log-kertaiseksi muutoksia geenien ilmentyminen, ja johti enemmän vakaa päättely ja parantunut teho, erityisesti kokeissa pieniä määriä mikrosiruja ([23]; https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html). Moderoitu t-tilaston p-arvot on johdettu Limma analyysin yllä, jota on mukautettu useita testaus Benjamini ja Hochberg menetelmän kontrolloida vääriä löytö määrä (FDR). Luettelot ilmentyvät eri geenien saatiin FDR kriteereitä 5% ja taita muutos cutoff 1,5, ja visualisoidaan tulivuori tontteja.

Real Time PCR

RNA eristettiin soluista käyttäen TRIzol-reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Pitoisuus ja puhtaus uutetaan RNA määritettiin käyttämällä ND-1000 spektrofotometri (NanoDrop). Yhteensä RNA-näytteet olivat DNaasi I (Zymo Research) käsitelty poistamiseksi kontaminoivan DNA. Kokonais-RNA käänteistranskriboitiin Smart MMLV-käänteistranskriptaasia (Invitrogen) ja cDNA: n synteesiin käyttäen valmistajan protokollaa. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen spesifisiä alukkeita (Applied Biosystems) ja PDK4 ja SGK1 ja siivous geenin TBP. Taitteen muutos ilmaisun laskettiin ΔΔCt menetelmää [24], jossa TBP sisäisenä kontrollina. Kaikki PCR-reaktiot suoritettiin ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) 40 sykliä (95 ° C: ssa 15 s, 60 ° C 1 min) sen jälkeen, kun oli inkuboitu 10 minuuttia 95 ° C: ssa.

tuumoriksenografteja

kuusiviikkoisilla CD-1 nude, joilta on poistettu munasarjat naisten hiiriä ostettiin Charles River Laboratories. Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin Northwestern University Animal Care komitea. Yksi miljoonaa PRB23 solut suspendoitiin 01:02 PBS /Matrigel (BD Biosciences) kokonaistilavuudessa 100 ui, ja injektoitiin ihonalaisesti oikeaan ja vasemman dorsum kunkin hiiren. Yhteensä 32 hiiriin ruiskutettiin jotta on 8 hiirtä per hoitoryhmä. Kasvainten annettiin kasvaa 8 viikkoa. Out of 32 hiirillä, kasvaimia kasvoi 28 hiirillä. Lisäksi 2 hiiret kuolivat tuntemattomista syistä. Loput 26 hiirtä jaettiin 4 ryhmään, ajoneuvon (6), progesteroni (7), MK-2206 (7), ja MK-2206 + progesteroni (6). Progesteroni pelletit (50 mg, 21-päivän luovutus 2,4 mg /vrk) istutettiin ihon alle. Hiirille annettiin 120 mg /kg MK-2206, 3 kertaa viikossa 9 päivää tilavuudessa 0,3 ml 30% Captisol. Kaikki toksisuustutkimukset on suoritettu jyrsijöillä Merck ja 120 mg /kg on suositeltu annos tutkimaan vaikutuksia kasvainten aiheuttamatta toksisuutta [25]. Vehikkelikontrolliryhmään hiirille annettiin 0,3 ml 30% Captisol. Hiiret punnittiin ennen ja jälkeen hoitojen. Kasvaimen koot mitattiin jarrusatulat läpi kurssin 8 viikon sekä käsittelyjen jälkeen. Kasvaintilavuudet lasketaan kaavalla:

Kasvaimen tilavuus

= 1/2 (

pituus

×

leveys

)

2 [25] . Kasvaimet leikattiin ja käsiteltiin immunohistokemiallisesti.

immunohistokemia

Kudokset kiinnitettiin formaliiniin ja parafiiniin, ja 4 um: kudosleikkeiden asetettiin lasilevyille. Kasvain leikkeet de-paraffinized. Lämmön epitooppisup- haku sitten suoritettiin 10 nM natriumsitraattipuskuria, jossa oli 0,05% Tween (Sigma) pH: ssa 6,0. Sitraattipuskuri on esilämmitetty vesihauteessa 99 ° C: ssa ja sen jälkeen levyt asetettiin puskuriin 45 minuuttia. Objektilasit annettiin jäähtyä 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa ja pestiin TBS-T 5 minuuttia. Dako EnVision HRP IHC kit käytettiin. 3% vetyperoksidia levitettiin kudosleikkeiden 10 minuuttia, jota seurasi 2 pesua 10 minuuttia TBS-T: llä. Proteiini estää levitettiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Kudos Sitten leikkeitä inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla ja PR (Dako) tai lohkaistaan ​​kaspaasi 3 (Cell Signaling), yön yli 4 ° C: ssa kostutetussa kammiossa. Anti-kani tai anti-hiiri-vasta-aine levitetään sitten kudosleikkeiden 1 tunti huoneenlämpötilassa ja pestiin sitten TBS-T kahdesti 5 minuutin ajan. DAB liuos pantiin kuhunkin kudosleikkeiden 5 minuuttia ja sitten huuhdeltiin. Mayerin hematoksyliinillä käytettiin vastavärjäämiseksi ja huuhdottiin. Sitten leikkeitä sijoitettiin liuokseen, joka sisälsi 28% ammoniumhydroksidia, ja sitten huuhdellaan. Leikkeet dehydratoitiin kautta 2 muutoksia 95% etanolia, 2 muutokset 100% etanolia, ja 2 muutokset Ksyleeni. Sitten leikkeet kiinnitettiin peitinlaseja käyttäen Cytoseal XYL kiinnitysväliaineet (Richard-Allan Scientific). Sitten lasit visualisoitiin käyttäen Axiovert 200 (Zeiss) mikroskoopilla ja otettuja kuvia Zeiss AxioCam kamera.

Tulokset

MK-2206 Estää AKT

Se on aiemmin kertoi, että Ishikawa solut kantavat PTEN mutaatio ja tämä johtaa konstitutiivisen alavirtaan aktivointi AKT [7], [8]. Sen määrittämiseksi, onko MK-2206 inhiboi AKT on PRB23 soluja, soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla MK-2206 (0-1 uM), ja niitä inkuboitiin eri aikoina (0-24 h) (Fig. 1A, 1 B). Fosforyloidun (Ser473) -AKT havaittiin soluissa, joita käsiteltiin vehikkelillä, ja tasot vähitellen laskivat kasvavilla pitoisuuksilla MK-2206 (Fig. 1A). Yhteensä AKT tasot eivät vaikuttaneet käsittelemällä MK-2206. Tasot p (Ser473) -AKT vähentynyt jo 1 h, ja pysyi alhaisella vehikkelikäsitellyt soluja 24 h (Fig. 1 B). Tasot p (Thr308) -AKT laski myös 100 nM MK-2206 periaatteita sekä 4 h ja 24 h (Fig. 1 C). PRAS40 on suora substraatti AKT ja tasot p (Thr246) -PRAS40 väheni, kun MK-2206 hoitoa 4 h ja 24 h, mikä osoittaa, että AKT-vaikutusta on vähentynyt (Fig. 1 C). Seuraavaksi, jotta voidaan osoittaa, että MK-2206 oli nimenomaan AKT väylän PRB23 soluissa, tasoja muiden fosforyloidun kinaasien, jotka eivät kohdistu suoraa AKT mitattiin. Tasot p (Thr202 /Tyr204) -ERK sekä p (Thr183 /Tyr185) -JNK ei muuttunut, kun MK-2206 hoito joko 4 h tai 24 h (Fig. 1 C).

PRB- erityisiä Ishikawa (PRB23) soluja käsiteltiin A) kasvavien pitoisuuksien (0-1 uM) MK-2206: ssa 24 tuntia ja B) 100 nM MK-2206 ja eri aikoina (0-24 tuntia). Proteiini tasot p (Ser473) -AKT, AKT ja aktiini mitattiin Western blot. C) PRB23 soluja käsiteltiin 100 nM MK-2206: ssa 4 h tai 24 h ja tasot p (Thr308) -AKT, AKT, p (Thr246) PRAS40, PRAS40, p (Thr202 /Tyr204) ERK, ERK, p ( Thr183 /Tyr185) SAPK /JNK, JNK ja aktiini mitattiin western blot.

esto AKT Korotukset PRB Protein Levels

Mielenkiintoista, hoito MK-2206 myös johti merkittävä kasvu PRB tasojen PRB23 soluissa, mikä osoittaa, että AKT vaikuttaa tasot PR proteiinia näissä soluissa (kuvio. 2A). Koska antagonistinen toiminta progesteronin endometriumin, vaikutukset moduloivan PR tasot ovat merkittäviä. Ensin microarray tehtiin tunnistamiseksi PRB geenien in PRB23 soluissa. Erityisesti, PRB23 soluja käsiteltiin 10 nM R5020: ssa 2 tuntia, ja siten vain alussa muuniresponssigeeneinä progestiineille olisi tunnistettu. Yhteensä 70 geenit merkittävästi voimistunut yli 1,5-kertainen ja 16-geenit vaimentua merkittävästi (Fig. 2B). Pisimmälle voimistunut geenit olivat PDK4 (9,92-kertainen), TIPARP (7,79-kertainen), ja SGK1 (4,41-kertainen). Geenit analysoitiin edelleen kanssa ”toiminnallinen merkintä klusterointi” väline Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery (DAVID) [26]. Geenit luokiteltiin SP-PIR Avainsanat tietokanta. Luokka, joka sisältyi eniten geenejä, jotka säätelevät R5020 oli ”fosfopro-” ja toiseksi korkein olivat geenit että sen tuotteet liittyvät tuman (Fig. 2C).

A) PRB-spesifinen Ishikawa (PRB23) soluja käsiteltiin ajoneuvon, 100 nM MK-2206, 10 nM R5020, tai yhdistelmä MK-2206 + R5020 (M + R) 4 tuntia ja proteiinin tasot p (Ser473) -AKT, AKT, PRB ja aktiini mitattiin Western blot. B) Microarray-analyysi PRB23 solujen vehikkeliä tai 10 nM R5020 suoritettiin ja geenien merkittävästi säätelee 1,5-kertainen tai suurempi tunnistettu. C) Gene ontologian luokat analyysi tehtiin käyttämällä DAVID geenejä säätelee yli 1,5-kertainen R5020.

Seuraavaksi vaikutus AKT on PRB kohdegeeneissä tutkittiin. PRB23 soluja käsiteltiin 10 nM R5020: n läsnä ollessa tai poissa ollessa 100 nM MK-2206. Expression of PDK4 ja SGK1 mitattiin sitten reaaliaikaista PCR: llä. PDK4 ja SGK1 luokiteltiin fosfopro-. Kuten kuviossa 3 on kuvattu, sekä PDK4 ja SGK1 merkittävästi voimistunut R5020, vahvistaa microarray tiedot. MK-2206 hoito yksinään ei vaikuta ilmaus tahansa geenien testattu verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin soluihin. Kun soluja käsiteltiin yhdessä R5020 ja MK-2206, ilmaus PDK4 huomattavasti kuitenkaan SGK1 ilme ei muutu yhdistelmähoitoa verrattuna R5020 yksin. Tämä ero säätely PRB kohdegeenien on PRB23 soluissa, kun AKT estyy vahvasti siihen monimutkaisempi mekanismi säädellä geenien kuin vain noustessa PRB proteiinia.

PRB23 soluja käsiteltiin ajoneuvon, 10 nM R5020, 100 nM MK-2206, tai yhdistelmä MK-2206 + R5020 (M + R) ja geenin ilmentymisen PDK4 ja SGK1 mitattiin käyttäen reaaliaikaista PCR: llä. Tiedot esitetään kertaiseksi muutoksia ajoneuvon käsiteltyjen näytteiden ja edustavat keskiarvoa ± sem 6 itsenäisestä kokeesta. ”*” Merkitsee tilastollista merkitystä verrattuna vehikkelikontrolliin. P≤0.05.

MK-2206 ja Progestiinipohjaisia ​​Vähentää elinkykyyn ja kasvaimen koko

Jotta voidaan mitata vaikutuksia AKT ja progestiinia syövästä solujen elinkelpoisuuden PRB23 soluja käsiteltiin R5020: n läsnä ollessa tai poissa ollessa MK-2206, ja solujen elinkyky mitattiin. Vaikka R5020 ja MK-2206 riippumatta laski Solujen elinkelpoisuus aikana 5 päivää yhdistelmä R5020 ja MK-2206 aiheutti suurimmat lasku elinkelpoisuuden (Fig. 4).

PRB23 soluja käsiteltiin ajoneuvon 100 nM R5020, 1 uM MK-2206, tai yhdistelmä MK-2206 + R5020 (M + R) 5 päivää ja solujen elinkyky mitattiin käyttäen Alamar Blue-määritystä. Tulokset on esitetty% elinkelpoisuus ajoneuvon käsiteltyjen näytteiden ja edustavat keskiarvoa ± SEM 4 itsenäisestä kokeesta.

Seuraavaksi, progesteronin vaikutuksia ja MK-2206 testattiin ksenosiirrettyjä kasvaimia, jotka kehitetty ihonalaisena injektiona n PRB23 solujen nude-hiirissä. Kasvaimet kasvatettiin 8 viikon ajan ja sen jälkeen käsitelty 9 päivän ajan ajoneuvon, progesteroni, MK-2206, tai progesteroni + MK-2206 (Fig. 5A). Paino hiiret eivät muutu merkittävästi hoitoja (Fig. 5B). Verrattuna vehikkelillä hoidetut hiiret, hiiret käsiteltiin MK-2206 yksinään tai progesteroni yksin esillä vaatimaton pienentämisestä kasvaimen tilavuuden perusteella kertainen muutos tuumorin koko ennen hoitoa. Suurin lasku kasvaimen koon havaittiin hiirissä, joita hoidettiin sekä MK-2206 ja progesteronin (Fig. 5C).

A) PRB23 soluja ksenosiirrettyjä subkutaanisesti CD1 nude-hiiriin. Sen jälkeen, kun 8 viikkoa, hiiriä käsiteltiin vehikkelillä, 120 mg /kg MK-2206 suun kautta, 3 kertaa viikossa 9 päivää, progesteroni tai yhdistelmä MK-2206 ja progesteronia. B) painot hiirten mitattiin ennen ja jälkeen hoitojen ja C) kasvaimet mitattiin ennen ja jälkeen hoitoja ja tilavuus laskettiin. ”*” Merkitsee tilastollista merkitystä verrattuna vehikkelikontrolliin. P≤0.05.

immunohistokemiallinen analyysi tehtiin tuumorisektioiden käyttämällä vasta-aineita progesteroni reseptorin, Ki67 ja halkaistut kaspaasi-3 (Fig. 6). Värjäys PR näkyi kasvaimissa, vaikka kaikki solut olivat positiivisia PR. Progesteroni hoito alentuneet PR sekä läsnä ja poissa ollessa MK-2206. Sen sijaan, MK-2206 hoito edistää kasvua PR-proteiinin tasoja kasvaimissa, samanlainen kuin mitä havaittiin kohdun limakalvon syövän soluissa (Fig. 2A). Solujen proliferaatio mitattiin Ki67 proteiini tasoilla, mikä laski progesteroni, MK-2206 sekä yhdistelmä progesteroni + MK-2206 hoitoa. Alhaisin Ki67 värjäytyminen havaittiin kombinaatio, mikä viittaa siihen, että yhdistetty hoito tehokkaammin vähentää leviämisen syöpäsoluja. Tasot pilkkoa kaspaasi-3, indikaattori apoptoosin, oli merkityksetön kasvaimissa ajoneuvon käsitellyistä hiiristä, kun taas värjäytymistä näkyi kasvainten progesteronin tai MK-2206 käsitellyillä hiirillä. Yhdistetty hoito johti korkein ilmentymä pilkotun kaspaasi-3, joka osoittaa lisääntynyttä apoptoosia.

ksenosiirrettyjä kasvaimet kiinnitettiin, sulautetut ja leikattiin. Immunohistokemiallinen värjäys kasvainten PR, Ki67 ja halkaistut casapse-3 (CC3) suoritettiin.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että MK-2206 tehokkaasti alentuneesta p (Ser473) -AKT ja p (Thr308) -AKT in PTEN-mutatoitunut Ishikawa soluissa. Tämän seurauksena tasot p (Thr246) -PRAS40, joka on alavirrassa oleva kohde AKT: n, väheni myös, indikoi, että aktiivisuus AKT inhiboitui MK-2206. Tämä estäjä ei vaikuttanut tasoa muiden kinaasien, kuten Perk ja pJNK osoittavat spesifisyyttä tämän yhdisteen AKT-reitin aktivaation. Esto AKT myös kohonneeseen PRB. Aiemmin olemme osoittaneet, että eri AKT-estäjällä, API-59CJ-OMe (EMD4Biosciences), lisääntyi myös merkittävästi PR tasoja PRB23 Ishikawa-soluissa [8]. Gu et ai., [27], osoittivat äskettäin, että esto PI3K käyttäen LY294002 kasvoi PR tasoja Ishikawa soluissa. Vaikutuksesta AKT-reitin PR ilmentymistä ja toimintaa ei ole tutkittu yksityiskohtaisesti ja mekanismeja, joilla tämä kasvu PR proteiinia esiintyy parhaillaan tutkitaan meidän lab. Nykyinen työhypoteesin keskittyy roolista AKT alenevassa herkkyys progesteroni kohdun limakalvon syöpä. Vähenevät PR tasot oli ensimmäinen todiste tukee hypoteesia. Oletettiin, että lisääntynyt PR tasoilla pitäisi tehostaa PR transkription toiminto on kuitenkin tietojen mukaan PR toiminta on monimutkaisempi, sillä kaikki progesteroni geenien vaikutti AKT esto. Se on vakiintunut, että, kuten muutkin steroidihormonireseptoreihin, säätely geenien PR liittyy lukuisia vuorovaikutus muiden transkriptiotekijöiden, DNA, jaksoihin, ja chromatin remodeling komplekseja. PR toiminta on geeni erityisasemassa, että eri mekanismien käytetään eri kohtiin kromatiinin. Meidän mikrosiruanalyysi tunnistettu PDK4 olevan pisimmälle voimistunut geeni (yli 50-kertainen lisäys) lyhytaikaisen progestiinia hoidossa. Tämä oli myös geeni, joka entisestään progestiiniriippuvuutta kun AKT estyi, mikä osoittaa, että yliaktiivinen AKT että Ishikawa soluissa vaimentaa progesteronin toimintaa tässä tietty geeni. On osoitettu, että PDK4 myös voimistuvan glukokortikoidit, kautta GR, HepG2-soluissa [28]. He osoittivat, että yli-ilmentyminen PKBα kumosi deksametasoni stimulaatio PDK4 promoottorin, joka tukee havaintoja. Lisäksi ne osoittivat, että FOXO1, joka on suoraan fosforyloituu AKT ja viedään solulimaan, vaadittiin GR-välitteistä säätelyä PDK4. Olemme osoittaneet yhteistyö PR ja FOXO1 säätelyssä geenejä endometriumin stroomasoluissa [29], [30], [31] ja näin ollen on todennäköistä, että PDK4 säätelyä by progestiinit vaatii sekä PR ja FOXO1 endometriumin syöpäsoluja. Niinpä, kun AKT on aktiivinen riittämättömiä FOXO1 ovat käytettävissä toimimaan tumaan ja ilmaus PDK4 vaimenee. Olisi mielenkiintoista määrittää merkitystä PR ja FOXO1 yhteistyötä muiden progesteroni-reagoiva geenejä, jotka vaikuttivat AKT inhibitio kohdun limakalvon syöpä.

PDK4 on kinaasi, joka inaktivoi pyruvaattidehydrogenaasikompleksi (PDC) . PDC tuottaa asetyyli-CoA, joka on esiaste rasvahappojen synteesi ja energian tuotantoon on Krebs sykli. PDC aktiivisuus säätelee PDKs ja PDC fosfa- fosfory- tai defosforyloimiseksi E1a moniosaisen. Tämä asetus on tärkeää valvoa sokeri- ja rasva-aineenvaihduntaan. Säätelyä PDK4 jonka progestiinien ja edistää edelleen tämän lisääntyisi MK-2206 hoito viittaa siihen, että progestiineja voi toimia inaktivoimiseksi PDC ja estää pyruvaatin asetyyli-CoA. Tämä esto asetyyli-CoA tuotanto voi siten johtaa hyödyntämiseen vaihtoehtoisen metaboliareitit kuten glykolyysiä. Koska keskeinen asema PDK4 pelaa säännellään valita Glykolyysivaiheen ja oksidatiivinen fosforylaatio, PDK4 on ollut mukana useita eri syöpiä. Aikaisemmin on osoitettu, että inhibitio PDK aktiivisuus on riittävä inhiboimaan proliferaatiota ja indusoivat apoptoosin keuhkosyövän soluja, mikä viittaa siihen, että PDKs voi kuljettaa kasvaimen kehittymisen [32]. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat myös osoittaneet, että yli-ilmentyminen PDK4 on riittävä estämään proliferaatiota rintasyöpäsolujen ja että PDK4 ilmentyminen säädeltiin useissa eri syövän kudoksissa [33]. Erityinen rooli, joka PDK4 pelaa endometriumsyöpään vielä avannut.

Prekliiniset tutkimukset ovat osoittaneet MK-2206 tehokkaasti estämään AKT-reitin aktivaation sekä vähentää lisääntymistä ja kasvaimen kasvua erilaisten syöpäsolujen linjojen [25]. On myös osoitettu, että yhdistelmä MK-2206 ja kemoterapeuttisten aineiden on tehokkaampi tuumorin kasvun estämisessä [25]. MK-2206 yhdessä MEK estäjän osoitettiin olevan synergistinen vaikutus kasvaimen kasvua ja lisännyt eloonjäämisluvut hiirillä erittäin aggressiivinen ihmisen keuhkokasvaimia [34]. MK-2206 kykeni palauttamaan herkkyyden resistenttien solujen sorafenibille, tyrosiinikinaasi-inhibiittori, apoptoosin indusoimiseksi maksasolukarsinoomassa soluihin [35]. Yhdessä Gefitinibi, pieni molekyyli estäjä EGFR tyrosiinikinaasin, MK-2206 tuetaan tehokkaasti apoptoosin pahanlaatuisen gliooman [17].