Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

pyrkimyksistä eri molekyyli- alatyyppejä määritelty genomista epävakautta, jotka voivat liittyä varhaisen kuoleman ja uusiutumisen paksusuolensyöpä.

Methods

pyrkimyksistä eri molekyyli- alatyyppejä määritelty epävakauden mikrosatelliitteihin (MSI), muutokset metylaation (CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi, CIMP) tai kopioluvun vaihtelu (CNV) 8 geenejä. Vaihe II-III koolonsyöpien (n = 64) tutkittiin metylaatiospesifistä multiplex liitettiin koetin monistamisen (MS-MLPA). Korrelaatio CNV, CIMP ja MSI, joissa mutaatiot KRAS ja BRAFV600E arvioitiin päällekkäisyyttä molekyyli alatyyppejä ja varhainen uusiutuminen riskiä yksi- ja monimuuttuja regressio.

Tulokset

CIMP fenotyyppi tapahtui 34% (22/64) ja MSI 27% (16/60) kasvainten, jossa huomattava CIMP /MSI päällekkäisyyttä. Niistä molekyyli alatyypeistä, korkea CNV fenotyyppi oli liittyvien kerroinsuhde (OR) varten toistumisen 3,2 (95% CI 1,1-9,3; p = 0,026). Tappioita CACNA1G (OR 2,9, 95% CI 1,4-6,0; P = 0,001), IGF2 (OR 4,3, 95% CI 1,1-15,8; p = 0,007), CDKN2A (p16) (OR 2,0, 95% CI 1,1-3,6; p = 0,024), ja RUNX3 (OR 3,4, 95% CI 1,3-8,7; p = 0,002) liittyi varhain toistumista, kun taas MSI, CIMP, KRAS tai BRAF V600E mutaatioita ei. CNV oli merkitsevästi suurempi kuolleen potilailla (CNV 6 8) verrattuna perhe (CNV 3 8). Vain vaihe ja menetys RUNX3 ja CDKN2A olivat merkittäviä, että monimuuttuja riski-malli varhaisen uusiutuminen.

Johtopäätökset

suuren kopiomäärän vaihtelu fenotyyppi on vahva ennustaja varhaisen uusiutumisen ja kuoleman, ja voi osoittaa annoksesta riippuva suhde geneettinen epävakaus ja tuloksista. Menetys tuumorisuppressoreilla RUNX3 ja CDKN2A liittyivät uusiutumiseen riskin ja optio lisätutkimuksia.

Citation: Berg M, Nordgaard O, Kørner H, Oltedal S, Smaaland R, Søreide JA, et al. (2015) Molecular alatyypit Stage II-III Colon Cancer Määritellään perimän epävakaisuuden: Early uusiutuminen-riskejä korkean kopioluvun vaihtelu ja menetys

RUNX3

ja

CDKN2A

. PLoS ONE 10 (4): e0122391. doi: 10,1371 /journal.pone.0122391

Academic Editor: Robert Dante, Institut national de la Sante et de la Recherche médicale, FRANCE

vastaanotettu: 13 lokakuu 2014; Hyväksytty: 20 helmikuu 2015; Julkaistu: 16 huhtikuu 2015

Copyright: © 2015 Berg et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimuksen rahoittivat osittain avustusta Folke Hermansens Cancer Foundation (avustus # 424508 KS MB post doc mies, http: //www.folke-fondet.org/Folke_Hermansen.html) ja Mjaaland Cancer Research Fund (avustus # 424506 KS).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on maailmanlaajuisesti merkittävä terveys- taakka, ja kehittyy kertymistä geneettisten ja epigeneettiset muutokset [1-3]. Geneettinen epävakaus ohjaa prosessin neoplastisten muodostumista invasiivisia kasvua ja etäpesäkkeiden kehittymisessä. Siten tarkentamatta molekyylitason muutoksia ja niiden suhde kliinisen päätepisteiden (sairauden eteneminen, uusiutumisen tai kuoleman) voi tuottaa paremmin ymmärtämään sairaudesta. CRC, kolme fenotyypiltään eri alaryhmiin on määritelty kautta epävakautta kromosomeja, mikrosatelliitteihin tai epigeneettiset muutokset [3-5].

Kopioi numero vaihtelu (CNV) viittaa rakenteellisiin ja numeeristen muutosten kromosomissa tasolla, kun taas mikrosatelliittimarkkereita epävakaus (MSI) tapahtuu, kun toistuvia emäsparin yksiköitä on eri määrä toistoja kasvainsoluissa verrattuna vastaaviin normaaleihin soluihin, jotka voivat tuottaa siirtymän lukukehyksessä DNA. Viime on CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP), joka tarkoittaa poikkeava metylaatio spektri DNA (hypo- tai hypermetylaation), joka muuttaa geenin ilmentymistä ilman suoraan liittyy geneettisiä muunnoksia [6-8].

geneettisiä muutoksia voidaan joissa käytetään suuria rakenteellisia poikkeavuuksia klo kromosomitasolla, ja /tai numeerinen muutoksia kriittisissä alueet, jotka voivat johtaa kasvaimen edistämisessä geeniekspression. Suurimmalle syövistä, laaja kromosomi epävakautta (CIN) noudatetaan joko kokonaisina kromosomin kopioluvun muutosta voitot ja /tai tappiot kromosomialueita, tai rakenteelliset muutokset luoda -fuusiogeenit [9-11]. Toisin kuin kromosomi ja mikrosatelliittimerkkien muutoksia tai DNA mutaatioita, epigeneettiset muutos ei muuta itse DNA vaan liittyy kemiallisia muutoksia DNA kuten metylaatio ja histonimodifikaation [12]. Geenien ilmentyminen säädellään eri tavoin, mukaan lukien CpG-saari metylaatio, jossa lisäsi metylaation on sytosiineista CpG sivustoja vähentää geenien ilmentyminen.

Historiallisesti MSI ja CNV (CIN) pidettiin toisensa poissulkevia. Kuitenkin viime aikoina päällekkäisyydestä mainittujen fenotyypit on osoitettu [13]. Lisäksi CIMP fenotyyppi näyttää liittyvän MSI fenotyyppi, mutta yhdistelmät kaikkien fenotyypit, mukaan lukien ”Triple negatiiviset” on raportoitu [5]. MSI ja BRAF-mutaatio asema on pääasiassa havaittu samoissa näytteissä, ja molemmat ehdotetaan olevan kliinistä merkitystä [14,15]. Potilaat, joilla kasvainten MSI tyyppiä liittyy erityisiä kliinisiä, molekyyli- ja histopatologiset ominaisuudet [4,16-19], ja on parempi ennuste kuin potilailla, joilla CNV kasvaimia [20]. Lisäksi erityisesti kasvaimen sijainti pitkin peräsuolen jatkumon liittyy paikkakohtaisia ​​eroja geneettinen koostumus kasvaimia. Esimerkiksi peräsuolen syövät ovat alttiimpia CNV vaihtuu ja paksusuolen syöpiä (etenkin proksimaalisesta) ovat taipuvaisempia MSI fenotyypin [17]. Tutkiminen nykyinen lavastus CRC, joka perustuu suurelta osin imusolmuke tila [21], on tunnustettu puutteet ja ristiriitaisuudet että keskustellaan [22]. Näin ollen useat tutkijat ehdottavat vaihtoehtoisia molekyyli- pysähdyspaikan strategioita [5,23-26], jossa ryhmissä perustuvat läsnä CIMP, MSI, KRAS ja BRAF mutaatioita. Vaikka tämä ei ole vielä noussut kliinisen käytännön ajatus, että osa-sivustojen paksusuolen hautoisi molekyyli eroja, jotka liittyvät erityispiirteitä on merkitystä [17]. Aikaisemmin olemme osoittaneet, että imusolmuke luvut voivat olla riippuvaisia ​​sub päällä sijainti ja niihin liittyvät molekyylitason muutoksia, jotka voivat liittyä kliinisen tuloksen [19,27]. Siten lisätutkimusta perimän erot solmussa-negatiivisia ja paikallisiin imusolmukkeisiin paksusuolen syöpä kiinnostaa ymmärrettäisiin paremmin CRC ja niihin liittyvien sairauksien käyttäytymistä.

Kopioi numero variantteja (CNVs) on tunnustettu tärkeäksi tyyppinen geneettinen vaihtelu, joka muuttaa ihmisen fenotyypit [28,29], mukaan lukien ihmisen syövissä. Multiplex ligaation riippuva anturi vahvistus (MLPA) on yleistynyt käytetty tekniikka määrittämiseksi suhteessa DNA-sekvenssin annostusta (tai kopioi numero vaihtelu) [29]. MLPA on multiplex-PCR-määrityksen, jossa käytetään jopa 40 koettimia, jotka ovat kukin spesifisiä eri DNA-sekvenssin (pääasiassa eksonien tietyn geeni), voidaan arvioida suhteellisen kopioluvun kunkin DNA-sekvenssin [29]. MLPA voidaan myös käyttää metylaatiostatuksen määrittämiseen, kopioiden määrä analyysia segmentally kahdennettu alueilla, ilmaisun profilointi, ja siirtogeenin genotyypitys. MLPA on kustannustehokas vaihtoehto over enemmän työvoimaa ja kalliita menetelmiä, kuten array vertaileva genominen hybridisaatio (aCGH) [29,30]. Lisäksi MLPA mahdollistaa samanaikaisen tutkimus metylaatiostatuksen ja CNV tuumoreissa, kuten aiemmin raportoitu retinoblastoomapotilailla [31].

Näin Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia esiintyvyys molekyylitason alatyyppien vaiheen II ja III paksusuolensyöpä käyttävillä potilailla MLPA määrittää metylaatiokuvion ja CNVs tietyllä koetinsarjaa, ja arvioimaan sen suhde aggressiivinen tauti käyttäytyminen, määritellään varhainen uusiutuminen ( 3 vuotta) leikkauksen jälkeen.

Materiaalit ja menetelmät

Potilasnäytteet

tutkimus kohortti on peräisin peräkkäinen 213 vaiheen I-III hoidetuista koolonsyöpien Stavangerissa yliopistollisessa sairaalassa aikana 4 vuoden aikana, yksityiskohdat kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],32]. Tutkimuksen hyväksyi alueellisen eettisen komitean (# 197,04) ja kaikki potilaat antoivat tietoon perustuvan suostumuksen ennen osallisuuteen. Kaikki potilaat leikattiin kanssa parantava tarkoitus. Potilaat, joilla imusolmuke positiivinen (PN +) vaiheen III tauti, joka oli fysiologisesti sopivaksi (esim ECOG suorituskyvyn tila 0-1), tarjottiin adjuvanttihoito mukaan kansalliset ohjeet tuolloin.

Jotta nykyinen projekti, sub -cohort kärsivien potilaiden paksusuolensyöpä vaiheen II ja III rekrytoitiin. Potilaat, joilla oli joko seurantaa vähintään 36 kuukautta valintahetkellä (= 3 vuotta, johon mennessä 90% uusiutumista esiintyä) tai kuolleen CRC alkaessa nykyisen projektin olivat hyväksyttäviä. Kaikkiaan 64 potilasta täytti nämä kriteerit ja olivat mukana MLPA analyysiin.

Seuranta suoritettiin käyttäen 11-numeroinen sosiaaliturvatunnus ja pääsy sähköisiin potilaan tiedostoja mitään merkkejä uusiutuva sairaus tai vakavasta liittyvä paksusuolen syöpä. Valinta perustui tietoon 3 vuotta seurannan, mikä sulkee pois jos potilaalla lyhyempiä jatkotoimia alkaessa. Toistuminen määriteltiin sellainen Paikallista tai systeemisen uusiutumisen tauti klo seurata.

DNA: n eristämiseksi

DNA 64 potilaiden kasvain näytteet uutettiin ja eristettiin tuore kudoksesta käyttäen DNeasy Mini kit tai AllPrep DNA RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa), kuten aiemmin on kuvattu [33].

Multiplex ligaation riippuva anturi vahvistus (MLPA) B

multiplex ligaation riippuva koetin monistamisen menettelyä käyttäen SALSA MS-MLPA kit ME042-B1 CIMP koetinseosta (havaitsemiseksi metylaatiostatuksen että promoottorialueet 8 eri geenien, RUNX3, MLH1, NEUROG1, CDKN2A, IGF2, CRABP1, SOCS1 ja CACNA1G) esitetyn Taulukko 1, suoritettiin mukaisesti myyjät suositusten (MRC-Holland, Amsterdam, Alankomaat), ja kuten aiemmin on kuvattu [34]. Koska aktivoiva mutaatio BRAF

V600E on tiukasti liittyy CIMP positiivisuus [35], mutaatio spesifinen koetin sisältyy SALSA MS-MLPA kit, joka havaitsee V600E (1799T A) somaattinen mutaatio, jos se on läsnä näyte.

kaikista 64 DNA-näytteitä, 100 ng DNA: ta on lämpöä denaturoitu kokonaistilavuudessa 5 ui Tris-EDTA-puskuria, ja suoritetaan edelleen suosittelemia myyjä. Lyhyesti, seos koetin-yhdistelmä (ME042, MRC-Holland, Amsterdam, Alankomaat) ja puskuria lisättiin denaturoidun DNA: n, ja koettimia annettiin hybridisoitua DNA: han 60 ° C: ssa 16 tuntia. Kukin näyte jaettiin kahteen putkia: yksi, joka liitettiin, kun taas toinen ligoitiin ja sitten digestoitiin käyttämällä mety- restriktioentsyymillä

Hhal

. Molemmat reaktiot tehtiin sitten PCR-reaktion avulla lämpösyklilaitetta (GeneAmp 2700, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), ja fragmentti, joka suoritettiin kapillaari sekvensseri (ABI 3130

xl

, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

uutetut DNA on normaalia koolonin limakalvoa käytettiin normaalia viite (n = 12 näytettä). Lisäksi kolorektaalisyöpä kaupallinen solulinjoja Caco-2- ja HT-29 käytettiin syövän valvontaa (ks olevat tiedot, S1 Tiedoston, ja S1 ja S2 kuvioissa).

Raakadataa analyysi oli analysoitu Coffalyser.NET (beta-versio, MRC-Holland, Amsterdam, Alankomaat).

Määritelmät

CIMP.

perusteet pisteytystä CIMP fenotyypin oli yli 20 % metylaation vähintään kolmasosa koettimista kuluessa vähintään kolme viidestä geenien WEISENBERGER paneelin [35], kuten aikaisemmin on kuvattu [34].

CNV.

CNV fenotyyppi pisteytys, kaikki kahdeksan geenit tutkitaan käytettiin. Kopioi numero vaihtelu (CNV) käytettiin mittarina kromosomi- epävakaus (CIN) tutkimuksessa. Loss ja voitto määriteltiin käyttämällä suhteellista suhdetta näytteen vs viite koetin olivat vähemmän kuin 0,7 tai suurempi kuin 1,3, tässä järjestyksessä. Sillä alueella analyysi, poikkeavuus yhden tai useamman koettimia määriteltiin CNV alueen, ja korkea CNV fenotyypin, jos viisi tai useampia kahdeksasta alueesta (1p36.11, 3p22.2, 5q31.1, 9p21.3, 11p15. 5, 15q24.2, 16p13.13 ja 17q21.33) oli poikkeava.

MSI.

MSI fenotyyppi tutkittiin perustuu Bethesda paneelin geenien käyttäen fragmenttia analyysi, kuten aiemmin on kuvattu [36]. Lisäksi metylaatio tila MLH1 geenin avulla MLPA käytettiin korreloida metylaatiostatus suhteessa MSI. Seuraavassa MSI tila viittaa tulokset Bethesda paneelista, kun taas MLH1 tutkinut MLPA menetelmää kutsutaan MLH1 metylointi.

Mutaatioanalyysit

KRAS Mutaatioanalyysit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [37]. BRAF-mutaatio määritettiin perustuen kahdella eri menetelmällä. Yksi, MLPA menetelmä [34], jossa BRAF mutaatio spesifinen koetin tuotetaan signaali, jos V600E mutaatio oli läsnä, ja; Toinen, käyttämällä tavanomaisia ​​PCR ja sekvenssianalyysi, kuten aiemmin on kuvattu [38].

Ethics

Eettinen hyväksyntä Tutkimuksen saatiin alueellinen eettinen komitea, ja kaikki potilaat suostunut sisällyttämistä tutkimuksen kuten aiemmin on kuvattu [19].

tilastollinen

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä

Statistical Package for Social Sciences

(IBM SPSS v. 20). Tarkempi tieto esitetään numerot ja hinnat (%) tai medians kanssa kvartiiliväliä (IQR), ellei toisin mainita. Mann-Whitneyn U-testiä käytettiin vertaamaan jatkuvasti dataa ryhmien välillä, kun tietoja ei ole normaalijakaumaa. Fisherin testiä käytettiin 2×2 taulukoita vertailla kategorisen datan, ja kerroinsuhde (OR) esittelyyn 95%: n luottamusväli (95% CI) merkittäviä riskitekijöitä. Usean regressioanalyysimme käyttäen sekä syöttää ja eteenpäin mallinnus suoritettiin arvioimaan riippumattomien riski-tekijöiden varhaisen uusiutuminen (kyllä ​​/ei) kuin dikotomisen muuttuja. Sukupuoli ja ikä sisällytettiin malliin, ja malleja kontrolloitiin CIMP, CNV ja MSI sekä KRAS, BRAF-mutaatio tila. Merkittäviä tekijöitä löytyy yhden muuttujan riski-analyysit otettiin mukaan ennustemalli. Hosmer-Lemeshowin Goodness-of-fit Testi suoritettiin osoittamaan vakautta malli [39], ja panos mallin vaihtelu arvioitiin R-neliön tilastot regressioanalyysimme. Kaikki testit olivat kaksipuolisia ja P 0,050 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Clinical tietoa uusiutumisen ja eloonjäämisen

Näistä 64 potilasta, 58% oli naisia ja mediaani-ikä oli 76 vuotta leikkauksen aikana. Kliinis ja molekyylitason tiedot sisältyvät aineet on esitetty taulukossa 2. Early toistuminen havaittiin 26 potilaalla (41%), joista 16 oli systeeminen toistuminen, 7 oli paikallista alueellista toistuminen, ja kolme oli sekä paikallista alueellista ja systeemisen uusiutumisen . Niistä 26 potilailla, joilla on uusiutuva sairaus, 15 (58%) oli kuollut taudin (23% tutkimuksen kohortin) ajankohtana tutkimuksen sisällyttämisen. Kuten odotettua, 66% vaiheen III (imusolmukkeisiin) potilaista koki toistuminen verrattuna 23% II vaiheessa, sillä OR = 6,9 (95% CI 2,2-21,3; p 0,001).

mikrosatelliitti epävakaus ja mutaatiostatuksesta tietojen

MLPA analysoi tuumorinäytteistä oli teknisesti onnistunut kaikissa 64 mukana potilaita, mitä tulee metylointianalyysi, kromosomi-analyysi, ja BRAF

V600E mutaation analyysi. Lisäksi KRAS mutaatio analyysit onnistuivat kaikki 64 potilasta, ja 60 (94%) oli onnistunut MSI tila.

taajuus mutaatioiden KRAS, BRAF

V600E ja läsnä MSI kohti määrä metyloitua geenien tai lukumäärän mukaan kromosomipoikkeavuuksien on esitetty kuviossa 1A ja 1B.

(A) jakelu vs määrä metyloitua geenejä (ei yhtään oli metylaatio kaikissa geenit, joten 8 ei näytetä). (B) Distribution vs geenien lukumäärän kanssa kromosomipoikkeavuuksien

MSI löydettiin 16 (27%) näytteistä. Metylointi MLH1 havaittiin 17 (28%) näytteistä, ja metyloinnin MLH1 ja MSI samanaikainen havaittiin 14 (23%) potilaista (p 0,001, Fisherin tarkka testi). MSI ja CIMP fenotyypin sekä BRAF

V600E mutaatio, ja MLH1 metylointi merkittävästi tilastollisesti liittyy oikeanpuoleista kasvaimen sijainti (p 0,01, p 0,01, p 0,01 ja p = 0,01 MSI, CIMP , BRAF

V600E ja MLH1 met vastaavasti käyttäen Fisherin tarkka testi).

mediaani määrä metyloitua geenien välillä huomattavia eroja MSI ja MSS (mikrosatelliittimerkkien vakaa) näytettä, (7 ja 2, vastaavasti; p p 0,01), suurempi tuumorin koon ja pienempi kuin 5 cm (3 ja 2; p = 0,04), ja uros ja naaras sukupuoli (2 ja 4; p = 0,03).

BRAF

V600E mutaatio havaittiin 15 (23%) näytteistä, 11 sisällä MSI ryhmä, osoittaa merkittävää kovariaatiota kahden poikkeamia, (p 0,01). Lisäksi BRAF

V600E mutaatioita liittyivät merkittävästi naispuoliseen (p = 0,02), metylaatio MLH1 (p 0,01), ja CIMP fenotyypin (p 0,01). BRAF tulokset todensi osoittavat BRAF-wt kaikissa (n = 12) normaalia näytettä ja Caco-2 cell line, mutta BRAF

V600E mutaation läsnä HT-29-solulinja, odotetusti.

Mutaatiot KRAS havaittiin 20 näytettä (33%), joista kahdeksan näytettä olivat negatiivisia CNV, CIMP ja MSI. Mutaatiot sekä KRAS ja BRAF rinnakkain kahdessa näytettä, ja kolmessa tapauksessa KRAS-mutaatio ja MSI olivat samanaikaisesti havaittiin.

Genome monimutkaisuus

Näytteet luokiteltiin kaikkien fenotyyppejä, ja ryhmitelty perustuu niiden yhdistetyt molekyyli fenotyyppejä. Päällekkäisyyksiä kaikki fenotyyppiset alaryhmien havaittiin. Yhdistetty kasvain fenotyyppejä kaikille potilaille kuolleiden ja elävien on esitetty taulukossa 3, ja kuvio 1A ja 1B ja kuviossa 2A-2C, vastaavasti.

(A) Koko tutkimuspopulaatiossa, (B) Potilaat elossa ilman toistumisen (elossa varten 3 vuotta), (C) Potilaat, joilla varhainen uusiutuminen tai kuoleman (3 vuoden kuluessa leikkauksen jälkeen).

Verrattaessa taajuuksilla yhdistettyjen fenotyyppien osoitti tilastollisesti merkittävää eroa varten perhe ryhmässä verrattuna kuolleen (p = 0,037, binary logistinen regressio). On huomioitava, että kolminkertainen negatiivinen ja CNV ainoa fenotyyppi olivat erilaiset kuolleen potilaiden ja perhe: 13% vs. 41% ja 40% vs 18%, tässä järjestyksessä (kuvio 2B ja 2C). Eristetty MSI ja CNV rinnakkain vain yksi näyte (2%), kun taas 4 potilasta lisää oli myös CIMP (kolminkertainen positiivinen, 6%). MSI ja CIMP oli läsnä samassa näytteet 10 (16%) tapauksista, kun taas CIMP ja CNV havaittiin viisi (8%) näytteistä. MSI ja CIMP fenotyyppien useimmin esitetty yhdessä muiden fenotyyppejä, ja ainoana fenotyyppi vain yksi (2%) ja kaksi (3%) tapauksista, vastaavasti. Sen sijaan CNV fenotyypin olemassa ainoana fenotyyppi 15 (23%) näytteistä.

Joukossa eri fenotyyppejä, kolminkertainen positiiviset ja kolminkertainen negatiivinen olivat kaksi ryhmää näyttää vähiten toistuminen, 0 /4 (0%) ja 4/22 (18%), vastaavasti. Muiden fenotyyppiset ryhmissä uusiutumista vaihteli 40-100%. Lisäksi taajuus kolminkertainen negatiivit potilaan alaryhmässä ilman toistuminen (18/35) havaittiin olevan merkittävästi erilainen kuin toistumisen alaryhmä (4/25), p = 0,007.

Aberrations ja riskin varhainen uusiutuminen

CIMP fenotyyppi, tilastollisesti merkitsevä assosiaatio havaittiin naispuoliseen (p = 0,001), oikeanpuoleista sijainti kasvain (p = 0,001), ja kasvaimissa näyttää MSI fenotyypin (p 0,01 ).

korkea CNV fenotyyppi havaittiin 25 (39%) 64 näytettä, ja liittyi uusiutuva sairaus. Korkea CNV fenotyyppi havaittiin 14 25 (56%) toistuminen, mutta vain 11 39 (28%) näistä elossa, ja siihen liittyvän kertoimet suhde 3,2 (95% CI 1,1-9,3; P = 0,026).

tilastollinen merkitsevyys havaittiin myös useissa kromosomiin poikkeavien geenien välillä kuolleen potilaiden ja perhe (CNV mediaani 6, IQR 3-7 vs CNV mediaani 3, IQR 1-5; p = 0,001), kuvio 2A.

oli enemmän poikkeamia alussa toistumisen ryhmä yleistä kun erikseen vertaamalla määrä poikkeavien koettimien kunkin geenin välillä potilailla, joilla ei toistuminen ja ne, joilla varhainen uusiutuminen, kuvassa 3. ero määrä poikkeavien kantojen välillä perhe ja kuollut for CDKN2A, IGF2 ja CACNA1G oli tilastollisesti merkitsevä, kuva 4B. Käytettäessä kahtia tila (poikkeava /normaali) kunkin geenin poikkeavuuksia CACNA1G (p = 0,007), CDKN2A (p = 0,003) ja RUNX3 (p = 0,032) olivat merkitsevästi yhteydessä sairauteen liittyvä kuolema.

(A) Boxplot osoittaa määrä poikkeavien geenien kuolleen potilaalla (oikealla) ja eloonjääneiden (vasemmalla). (B) Boxplot osoittaa määrän poikkeavan kromosomin asemaansa kaikilla geenien tutkittu, in toistuvia (tai kuollut) potilasta (oikealla) ja potilailla, joilla ei varhainen uusiutuminen (vasemmalla).

Red pylväät edustavat menetetty alueet ja siniset palkit kuvaavat voittoja. Rivit havainnollistaa voitot ja tappiot potilailla elossa 3 vuotta (sininen ja violetti, vastaavasti), ja potilaat kuollut taudin (vihreä ja punainen, vastaavasti)

Tarkemmin menetys CACNA1G siirrettävä OR 2,9 (95% CI 1,4-6,0; p = 0,001) uusiutumisen, kuten 18 30 (60%) potilaista tällä CNV uusiutunut verrattuna vain 7 34 (21%) ja normaali tila. Menetys IGF2 liittyi OR = 4,3 (95% CI 1,1-15,8; P = 0,007), kun 23 47 (49%) uusiutui, verrattuna 2 17 (12%) ja normaali tila. Menetys CDKN2A oli KO 2,0 (95% CI 1,1-3,6; P = 0,024), 61% toistumisen niille menetystä, verrattuna 30% niille, joilla on normaali tila. Lopuksi menetys RUNX3 liittyi OR = 3,4 (95% CI 1,3-8,7; p = 0,002) ja toistuminen esiintyi 64% menetys verrattuna 16% niistä, joilla on normaali tila.

Oli mitään merkittävää eroa vaiheen II ja III suhteen taajuus kolmesta eri molekyyli- fenotyyppejä (MSI, CNV ja CIMP), ja yhdistetyt fenotyyppejä, sekä BRAF ja KRAS mutaatioita. Inaktivointi CACNA1G vuoksi metylaatio havaittiin yleisimmin BRAF mutatoitunut ja MSI kasvaimet (p≤0.01), ja useimmiten kasvaimia sijaitsee proksimaalisessa paksusuolessa.

Multivariable mallintaminen varhainen uusiutuminen riskin

useita logistinen regressiomalli kanssa muuttujat CNV, CIMP, MSI, KRAS, BRAF, vaiheessa kasvainpaikantumisen ja sukupuoli, ainoa muuttuja, joka säilyi mallin uusiutumisen riski oli vaiheessa. Analysoidaan syöpään kuoleman lopputulos käyttäen samoja muuttujia, CNV tila oli mukana yhdessä vaiheessa mallissa, mutta leveällä luottamusväli säädetyn syrjäisimpien.

Esittelyssä riippumattoman geenin harhautumista merkitsevästi yhteydessä aikaisin toistumisen riskiä (tappiot RUNX3, CDKNA2A, CACNA1G ja IGF2) ja kontrolloimalla edellä mainittuja molekyyli- alatyyppejä ja ikä, sukupuoli, vaihe ja kasvaimen sijainti, paljasti lopullinen malli, joka sisälsi vain RUNX3 ja CDKN2A yhdessä vaiheessa ennustajina varhaisen toistumisen (taulukko 4 ). Hosmer-Lemeshowin hyvyyttä testi (Chi-square 3,844; p = 0,572) osoitti vankkaa malli. R-neliön tilastojen (Cox Snell ja Nagelkerke) raportoitiin välillä 0,316 ja 0,427, mikä osoittaa, että malli selitti välillä 31,6% ja 42,7% vaihtelun riskin arviointia.

Keskustelu

nykyisessä tutkimuksessa selvitimme vuorovaikutusta ja päällekkäisyyksiä molekyylitason alatyyppien paksusuolensyöpä kehittymistä varhaisen uusiutuminen leikkauksen jälkeen. Kuten on kuvattu, välillä on päällekkäisyyttä useiden molekyylitason ominaisuuksia, mutkistaa selvä ero ryhmien Molekyylien ja kliinistä merkitystä. Käyttämällä MLPA paneelia varten 8 geenien, osoitimme, että geeni annostus vaikutuksen metylaation ja kromosomipoikkeavuuksien on osa liittyy molekyylien allekirjoitus ja mutaatioiden läsnäolon, ja se liittyy myös riski varhain toistumista. Lisäksi vaiheessa III, varhainen uusiutuminen liittyi menetys RUNX3 ja CDKN2A, jotka molemmat ovat tunnettuja kasvainten synnyssä CRC ja aiemmin raportoitu liittyvän kliinisen tuloksen CRC [40-43]. Tämä voidaan mahdollisesti käyttää varoituksia syntymässä olevista lisäksi nykyinen TNM-lavastus järjestelmä välttää luokitteluvirheet, kuten imusolmukkeesta tila (määritelmä solmun negatiivista tai positiivista tauti) on useita puutteita, jotka on käsitelty yksityiskohtaisesti muualla [21,22] . Myös määritellään potilaita, joilla on varhainen uusiutuminen voi helpommin tehdä kohdistettuja ja paremmin räätälöity valvonta leikkauksen jälkeen [44].

peräsuolen syöpä, kolme laajaa molekyyli- fenotyypit on kuvattu, kuten CNV, MSI ja epigeneettiset muutokset [3,7 , 8]. Tutkijat ovat ehdottaneet erillistä luokittelua 3, 4 ja 5 ryhmää aiemmin [14,24-26], mutta mikään niistä ei ole vielä saavuttanut kliinistä käytäntöä. Laajuus päällekkäistä näiden fenotyyppisen ryhmien on tutkittu [5,14,16,25,45-47], mutta kliininen merkitys molekyyli- fenotyypit ovat toistaiseksi epämääräisiä. Erilaisten menetelmien, määritelmien, pisteytys kriteerit, ja erot tyyppi potilaan materiaalin tutkittu vertailu on vaikeaa, joka alleviivaa päällekkäisyyttä löytyy tässä tutkimuksessa. Lisäksi ja kuten olemme dokumentoitu äskettäin, käyttämällä erilaisia ​​kriteereitä CIMP-asema voi eroaa käyttämällä mukana geenien ja anturit [34], ja siten tuottaa erilaisia ​​tuloksia tutkimuksesta toiseen, mikä estää vertailun.

yhteensä, MSI havaittiin 27% paksusuolen syövistä. Tämä on linjassa muiden tutkimusten jotka peräsuolen syövät eivät sisälly, kuten paksusuolen syövät kärsivät muita yleisemmin MSI. Sekä MSI fenotyypin ja MLH1 metylaatio havaittiin 14/60 näytteistä (23%). Kaksi näytettä näkyy MSI fenotyypin ilman MLH1 metylaatio, ja kolme näytettä osoitti MLH1 metylaatio ilman MSI. Laaja päällekkäisyys näitä ominaisuuksia kannattaa sitä, että MLH1 inaktivointi aiheuttaa MSI. Kuitenkin poikkeama MLH1 metylaation ja MSI on myös havaittu muiden [48,49], ja osoittaa, että useat DNA mismatch korjaus geenejä, mukaan lukien MLH1 syy MSI. Päinvastoin, metyloinnin MLH1 ei välttämättä johda heikentyvän korjausmekanismi.

BRAF

V600E mutaatiostatus ennustettiin käyttämällä sekä tavanomaisia ​​DNA sekvensointi ja MLPA erityisiä koettimia pistemutaatio. Molemmat tulokset olivat 100% concordance, ja näyttää MLPA menetelmät ovat luotettavia.

Mutaatiot BRAF

V600E ja KRAS alun perin ilmoitettiin toisensa poissulkevia [50]. Kaksinkertainen aktivointi MAPK-reitin on ehdotettu johtavan erilaistumista ja solujen vanhenemista, pikemmin kuin kasvun edistämiseen, koska on seurausta yhden mutaation [51]. Kuitenkin kaksi potilasta meidän näytesarjan, mutaatiot todettiin rinnakkain, vaikkakin numerot liian pieni, jotta mitään kliininen tulkinta.

Potilaat, joilla on varhainen uusiutuminen osoitti numeerisesti enemmän kromosomivirheitä (kuviot 3 ja 4) . Tämä tukee ehdotusta, että CNV voisi ennustaa huonompi ennuste [52], kuten on osoitettu korkean CNV nykyisessä tutkimuksessa. II vaiheen potilaille, numeeriset ero kromosomimuutosten välillä toistuminen ja toistuminen oli tilastollisesti merkitsevä (p = 0,022), kuten oli numeerinen ero kuolleiden tai elossa olevien potilaiden (p = 0,007). Tämä ero ei voitu havaita vaiheessa III potilaille. Kuten vaiheen II potilaita yleensä hoidettu leikkaus yksin, tämä voitaisiin käyttää ennustetyövälineenä merkkiaine toistuminen, ja mahdollisesti apuna valittaessa vaiheen II potilaat, jotka hyötyisivät adjuvanttihoito. Kuitenkin tulokset olisi tulkittava varoen perustuu otoskoko ja validoitu suurempia potilaan sarjassa vahvistamatta.

Yksi mielenkiintoinen havainto on, että kromosomipoikkeamakoe sijaan metyloinnin itse geenien mukana CIMP paneelissa näyttää olevan tärkein kliininen tulos tauti. Tämä merkitsee sitä, että geenit CIMP paneelissa on kasvaimia estävä aktiivisuus, ja että niiden mekanistinen toiminta on tärkeää suhteen paksusuolensyöpä, eikä vain metylaation. Itse asiassa sekä RUNX3 ja CDKN2A (tunnetaan myös p16) ovat tunnettuja kasvainten synnyssä. Poikkeamat RUNX3 on raportoitu varhainen tapahtuma paksusuolen ja peräsuolen syövän etenemisessä [40]. Normaali toiminta CDKN2A (tunnetaan myös p16) geeni on tuumorisuppressorina, estää kontrolloimattoman soluproliferaation aloittamalla solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin. Prognostisia merkitys CDKN2A inaktivaatiomenetelmät peräsuolen syöpä on tutkittu, mutta mitään selkeää yhdistyksiä on todettu [43]. Edelleen normaali tehtävä CACNA1G vaikuttaa solujen lisääntymisen ja apoptoosin, ja häiritsevä tämä kalsiumin signalointi saattaa olla tärkeää syövän, koska nämä prosessit ohjaavat lisätoimia solun elämään. Tämä osoittaa sen instrumentaalinen merkitys, ja että funktionaalinen CACNA1G kytkee solut siirrettiin aggressiivisempi toiminto [53]. Myös proteiini hormoni IGF2 on mukana kehityksen ja kasvun solun ja on mukana karsinogeneesissä [54,55].

Tutkiessaan lukumäärä metyloitu tehtävissä, oli merkitsevästi enemmän metylaation MSI kasvaimissa voimakkaammin kuin MSS ja BRAF mutatoitunut näytteissä verrattuna villin tyypin. Tämä on todennäköisesti siksi, metylaation CRC-kriittisten geenien aiheuttaa MSI ei-familiaalinen kolorektaalisyöpä [56]. Kuitenkin määrä metyloitua tehtävissä oli tilastollisesti merkitsevä suurempi suuria kasvaimia verrattuna pienempiin ja kasvainten miehiin verrattuna.

Johtopäätökset

Stage II-III paksusuolensyöpä jos potilaalla varhainen syövän uusiutuminen leikkauksen jälkeen oli huomattavasti enemmän kromosomivirheitä (mediaani 6 vs. mediaani 3 eläviä potilasta) kuin potilailla, joilla ei todisteita taudista 3 vuodessa seurata. Menetys kasvaimen synnyssä RUNX3 ja CDKN2A (p16) näyttävät pitämään tärkeitä kliinisiä tietoja lisäksi solmuun-aseman (vaiheen III; imusolmukkeisiin tauti).