Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Selvitimme ilmaus forkhead laatikko Q1 (FoxQ1), E-kadheriinin (E-cad), Mucin 1 (MUC1), vimentiinistä (VIM) ja S100 kalsiumia sitova proteiini A4 (S100A4), kaikki epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) indikaattori proteiinien ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kudosnäytteistä. Tutkimme myös suhde näiden viiden proteiinien ilmentyminen ja muut ennusteeseen viittaavia tekijöitä NSCLC. Lopuksi arvioidaan mahdollinen arvo näiden markkereiden ennustetekijöiden indikaattorit selviytymisen NSCLC-potilailla.

Methods

Quantitative real-time PCR ja immunohistokemia käytettiin luonnehtimaan ilmaisua FoxQ1 mRNA ja proteiinin NSCLC. Expression selostukset ja transalaatiotuotteidensa muiden neljän EMT indikaattori proteiinien arvioitiin immunohistokemiallisesti samassa kliinisessä NSCLC näytteistä.

Tulokset

FoxQ1 mRNA ja proteiinia säädellään ylöspäin NSCLC verrattuna normaaliin kudokset (

P

= 0,015 ja

P

0,001, tässä järjestyksessä). Expression of FoxQ1 vuonna adenokarsinooma oli korkeampi kuin okasolusyöpä (

P

= 0,005), ja korkea ilmentyminen FoxQ1 korreloi menetys E-cad lauseke (

P

= 0,012), ja poikkeava positiivisuus VIM (

P

= 0,024) ja S100A4 (

P

= 0,004). Muita selviytyminen analyysi osoitti, että korkea ilmentyminen FoxQ1 (

P

= 0,047) ja E-cad (

P

= 0,021) olivat riippumattomia ennustavia tekijöitä.

Johtopäätös

FoxQ1 ehkä pelaa erityinen tehtävä EMT NSCLC, ja voitaisiin käyttää ennustetekijä varten NSCLC.

Citation: Feng J, Zhang X, Zhu H, Wang X, Ni S, Huang J (2012) FoxQ1 yliekspressio Vaikutteet huonon ennusteen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, Associates kanssa ilmiö EMT. PLoS ONE 7 (6): e39937. doi: 10,1371 /journal.pone.0039937

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 29 toukokuu 2012; Julkaistu: 28 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Feng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia sosiaalisen kehityksen ja Applied Research Projects (S2010041) Nantong hallituksen, Kiina; Kansainvälinen yhteistyö ja vaihto (2011) Department of Health Jiangsu; ja Jatko Fund (2010) ja Affiliated sairaalan Nantong University, Nantong, Kiina. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on useimmin esiintyvä syöpä tyyppi, ja suurin syy syövän kuolemaan maailmanlaajuisesti enemmän kuolleisuutta kuin rinta-, eturauhas- ja paksusuolen ja peräsuolen syövän yhdistetty [1], [2]. Viimeisten kolmen vuosikymmenen aikana Kiinassa, keuhkosyöpäkuolleisuus on kasvanut 465%, jossa nämä maligniteetit tulee toiseksi yleisin kuolinsyy jälkeen maksasyövän [3]. Huolimatta suuri edistysaskel syövän hoidossa viime vuosina, ennuste potilaille, joilla on keuhkosyöpä on edelleen heikko, 5-vuoden eloonjäämisluvut alle 15% [4], [5]. Useimmat potilaat, joilla keuhkosyöpä ovat edenneet ajan taudin aikaan diagnoosi, ja noin 85% näistä syövistä on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [1], [6].

monet viimeaikaiset tutkimukset ovat todenneet, että epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) on kriittinen tapahtuma kasvaimen invaasion ja metastaasin in epiteelin johdetun syöpien [7] – [10], mukaan lukien NSCLC [11] – [14]. Tietoisuus EMT ilmiöiden juontaa juurensa jo 1908. 1990-luvulla, EMT saanut enemmän tunnustusta mahdollisesti tärkeä mekanismi kroonisten sairauksien, kuten elinten fibroosia ja syöpään [15]. EMT on ominaista alas-säätely epiteelisolujen erilaistumisen merkkiaineiden E-kadheriinin (E-cad) [16] – [20] ja Mucin 1 (MUC1) [21], ja ylös-säätely mesenkymaalisten markkereita, kuten vimentiinista (VIM) [17] – [20], [22], [23], fibronektiinin [17], [20], [24] ja S100 kalsiumia sitova proteiini A4 (S100A4) [25] – [28]. Aiemmat tutkimukset ovat kuvanneet avainrooli forkhead laatikko Q1 (FoxQ1) säätelyssä EMT ja aggressiivisuus ihmisen syövässä [29] – [32].

FOXQ1, joka tunnettiin aiemmin nimellä HNF-3 /forkhead homologin 1 (HFH1 ), kuuluu jäsenenä forkhead transkriptiotekijän perhe [32] – [34], jotka on ilmaistu eri kudoksissa ja tärkeä rooli kehityksen, aineenvaihdunnan, syövän ja ikääntyminen [30], [34]. Koska yksi ensimmäisistä forkhead geenien tutkittu, FOXQ1 on liitetty tukahduttaa sileän lihaksen-spesifisten geenien, kuten Sm22α ja telokin on A10-soluissa [35]. FOXQ1 on osoitettu olevan alavirran välittäjä Hoxa1 alkion kantasoluissa [36]. Ihmisen FOXQ1, sijaitsee kromosomissa 6p23-25, on eristetty ja karakterisoitu [33] ja olennainen osa etiologiassa ihmisen syövän [31], [32].

Yksivaiheinen q RT-PCR suoritettiin vahvistamaan ilmentymistä FoxQ1 mRNA ihmisen kudoksissa. Tulokset normalisoitiin GAPDH mRNA-tasolla. FoxQ1 mRNA tasolla NSCLC kudoksissa olivat korkeampi kuin peritumoural kudoksiin tilastollista merkittävyyttä käyttäen pariksi-näytteet T testi. **

P

0,05. Viivat esittävät keskivirhettä (S. E.).

(A) 1 ja 2: keuhkojen okasolusyöpä kudos kuvio H 3 ja 4: korkea ilmentyminen FoxQ1; 5 ja 6: tappio E-cad ilmaisu; 7 ja 8: vahvat VIM-positiivista värjäytymistä. (B) 1 ja 2: keuhkojen adenokarsinooma kudosta kuvion H 3 ja 4: positiivinen värjäytymistä FoxQ1; 5 ja 6: negatiivinen värjäytyminen MUC1; 7 ja 8: sääteli ilmentymä S100A4. (C) 1 ja 2: keuhkojen adenokarsinooma kudoksen kanssa H 3 ja 4: negatiivinen IHC for FoxQ1; 5 ja 6: vahva immunologinen reaktio E-cad; 7 ja 8: negatiivinen S100A4. (D) 1 ja 2: keuhkojen okasolusyöpä kudosten H 3 ja 4: alhainen ilmaus FoxQ1; 5 ja 6: korkea ilmentyminen MUC1; 7 ja 8: heikko ilmaus VIM. Alkuperäinen suurennos oli x 40 1, 3, 5 ja 7; ja × 400 2, 4, 6 ja 8.

(A) käyrät laskettiin FoxQ1 ilme. Korkea ilmaisua FoxQ1 ryhmässä (punainen viiva) osoitti selvästi vähemmän selviytymisen kuin alhainen eikä ilmaisun FoxQ1 ryhmässä (sininen viiva). (B) käyrät lasketaan E-cad ilme. Elinkaaret potilaalla on positiivinen E-cad värjäystä ovat paljon lyhyempiä (punainen viiva) kuin potilailla, joilla on negatiivinen E-cad värjäytymistä (sininen viiva).

Viimeaikaiset tutkimukset ovat kuvanneet, että FOXQ1 on havaittu olevan yli-ilmentynyt kolorektaalisyövässä [29], [31] ja rintasyövän [31], [32], jossa potilailla on huono kliinisiä tuloksia [31], [32]. Vaikka yli-ilmentyminen FOXQ1 syöpäsolulinjoissa vahvisti, että geeni voisi olla rooli kehitettäessä keuhkosyövän [29], [33], korrelaatio FOXQ1 ilmaisun ja EMT tekijät määrittää sen kliinistä merkitystä NSCLC ei ole ollut aiemmin raportoitu.

Analysoimme ilmentymisen FoxQ1 geenin kvantitatiivisen käänteistranskriptio polymeraasiketjureaktioilla (RT-PCR: ää) pienissä, juuri jäädytetty NSCLC kudosnäytteitä. Ilmentäminen FoxQ1 proteiinin ja neljä yhteistä EMT indikaattori proteiinien (E-cad, MUC1, VIM ja S100A4) arvioitiin immunohistokemiallisesti käyttämällä samaa kudosta mikrosiru (TMA) kohdat. Lisäksi olemme tutkineet suhde ilmauksia viisi geeniä, jotka koodaavat näitä proteiineja ja muita kliinis tekijät NSCLC. Lopuksi arvioidaan mahdollinen arvo näiden markkereiden ennustetekijöiden indikaattoreita selviytymisen potilailla, joilla on NSCLC.

Methods

Potilaat ja TMA NSCLC näytteiden

Kun koko patologinen tarkastelu mukaan seitsemäs painos TNM Lung Cancer [37], paneeli formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut NSCLC kudosten vastaavien kasvaimeen viereisten kudosten parhaillaan kirurginen hoito saatiin Affiliated sairaalan Nantong yliopiston välillä tammikuussa 2005 ja joulukuussa 2006. kliiniset tiedot (mukaan lukien sukupuoli, ikä, histologinen tyyppi, luokka, vaihe, kasvaimen koon, erilaistuminen, imusolmuke etäpesäke tila) saatiin kunkin potilaan potilastiedot.

joukossa arkistomateriaalia, 103 kudoksen korttelin päässä pienisoluista keuhkosyöpää 5 vuoden seurannassa selviytymisen kirjaa olivat saatavilla ja määrittämiseksi käytetyt TMA. Edustava alue kunkin kasvaimen valittiin ja 2,0 mm kudoksen ytimet käytettiin konstruoimaan TMA Shanghai outdo Biotech (Kiina). Laatu TMA osien vahvistettiin käyttäen hematoksyliini-eosiini-värjäys (H taaksepäin, 5′-AGG TTG TGG CGC ACG GAG TT-3′) suunniteltiin, jolloin saatiin 92 bp: n PCR-tuotteen. Aineisto normalisoitiin käyttämällä glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), kuten viite-geeni (forward-aluke, 5′-TCG GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3 ’; taaksepäin-aluketta, 5’-TGC CAT GGG TGG AAT CAT ATT GGA-3 ’).

immunohistokemia (IHC) B

IHC suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [39]. Parafiini osat (4-pm paksu) päässä array lohkot erikseen värjättiin koskevasta Autostaineriin Universal Värjäys System (LabVision, USA) käyttäen seuraavia ensisijainen vasta: hiiren anti-FOXQ1 (1:300 laimennus; Abcam, UK), hiiren anti-E -cad (1:120; Invitrogen, USA), monoklonaalinen hiiren anti-MUC1 (1:200; Novocastra, UK), monoklonaalinen hiiren anti-VIM (1: 100; Invitrogen, USA), ja polyklonaalinen kanin anti-S100A4 (1 :100; Newmarker, USA). Sekundäärisiä vasta-aineita käytettiin: Envision vuohen anti-hiiri-HRP: tä (DAKO, USA), Envision vuohen anti-kani-HRP: tä (DAKO, USA). Arviointi immunovärjäyksen näistä kohdista tehtiin sokea kaksi koulutettua patologeja jotka eivät tienneet kliinisen taustan näytteiden.

prosenttiosuudet FoxQ1-positiivisten solujen pisteytettiin ja asetettiin neljään luokkaan sen mukaan, värjäys: 0 0%; 1 1-33%; 2 34-66%; ja 3 67-100%. FoxQ1 värjäytymisvoimakkuuksia myös pisteytettiin: 0, 1, 2, tai 3. summan välillä ja intensiteetin tulokset käytettiin lopullisessa FoxQ1 värjäys pisteet, jotka olemme edellä on selostettu [39], ja se on määritelty seuraavasti: 0-2, heikkoa ilmentymistä; ja 3-6, korkea ilme. Kuitenkin positiivisuus valitun EMT päättäjät (E-cad, MUC1, VIM ja S100A4), ei ole havaittavissa tai 10% positiivista värjäytymistä kasvainsolujen katsottiin negatiiviseksi, kun taas ≥10% positiivista värjäytymistä kasvainsolujen pidettiin positiivinen [40]. Kaikki näytteet arvioitiin 4 x ja 10 x suurennus.

Tilastolliset menetelmät

FoxQ1 mRNA tasolla juuri jäädytetty NSCLC kudosten ja vastaavat ei-syöpäkudokset normalisoitiin GAPDH ja analysoitiin käyttäen Wilcoxonin allekirjoitettu rank testi Nonparametric testit. Associations välillä ennusteeseen viittaavia muuttujien ja FoxQ1 proteiinin ilmentyminen tutkittiin χ

2 testiä. Chi-neliön käytettiin vahvistamaan korrelaatiota ilmentymisen FoxQ1 ja EMT ilmaisin proteiineja. Eloonjäämiskäyrät laskettiin käyttäen menetelmää Kaplan-Meier ja verrattiin käyttäen log-rank-testi. Tekijöitä osoitettu olevan prognoosi- merkitys Yksiulotteisissa malleissa arvioitiin käyttämällä Coxin monimuuttuja regressiomallin.

P

-arvo on vähemmän kuin 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä. Aineisto analysoitiin STATA 9.0 ohjelmistoa (Stata Corporation).

Tulokset

FoxQ1 mRNA: n ekspression NSCLC ja peritumoural kudosten

Yhteensä RNA eristettiin juuri jäädytetty NSCLC kudoksia ja altistetaan yhden askeleen qRT-PCR tutkimaan FoxQ1 mRNA: n ilmentymisen. Tutkimme myös näytteitä viereisten Hyväksytty kasvain kudoksiin. Vakioituna GAPDH, keskimääräinen ekspressiotasot FoxQ1 mRNA NSCLC ja vastaavat ei-syöpäkudoksen olivat 0,15 ± 0,02 ja 0,04 ± 0,02 (

P

= 0,015), tässä järjestyksessä. FoxQ1 ilme oli 3,75 kertaa suurempi keskimäärin syöpänäytteissä kuin ei-pahanlaatuinen kudosten (Fig. 1).

IHC havainnot FoxQ1 ja EMT indikaattori proteiinien NSCLC kudoksissa

Tyypillinen immunohistokemiallinen värjäyskuviot havaittiin viisi geeniä, jotka koodaavat FoxQ1 ja muut neljä ilmaisin EMT proteiinien NSCLC on esitetty kuviossa 2. Positiivinen värjäys FoxQ1 pääasiassa lokalisoitu kasvainsoluihin ja penumosyy- sytoplasmassa ja plasmalemma eri tasoilla. Vaikka positiivinen tumavärjäystä voitiin nähdä, FoxQ1 immunoleimaus ei havaittu stroomaan näiden kudosten. Korkea FoxQ1 ekspressiota havaittiin 82/103 (50,49%) NSCLC kudosten ja oli 38 (20,39%) ja viereisen sovitettu tuumorikudoksissa. Tiedot osoittivat tilastollista merkittävyyttä käyttäen χ

2 testianalyysin (χ

2 = 38,6450,

P

0,001) ja vastasi FoxQ1 mRNA tasojen NSCLCs.

Positive ilmentyminen E-cad ja MUC1 paikallistettiin solukalvon, ja yhdistelmä plasmalemma ja sytoplasmaan NSCLC tuumorisoluissa, vastaavasti. Positiivinen immunohistokemiallinen värjäys VIM ja S100A4 syöpäsoluissa havaittiin sytoplasmassa, ja yhdistelmä tumaan ja sytoplasmaan. Poikkeuksena tähän oli positiivinen strooman fibroblasteissa.

väliset ilmaus FoxQ1 proteiinien ja kliinis parametrit NSCLC

assosiaatiot FoxQ1 ilmaisun ja kliinis-NSCLC on esitetty taulukossa 1. FoxQ1 proteiinin ilmentymistä adenokarsinooma oli korkeampi kuin okasolusyöpä kanssa tilastollista merkittävyyttä (χ

2 = 10,7089,

P

= 0,005) mukaan χ

2 testianalyysiä. Sen sijaan ei ole merkitseviä havaittu potilaan iän, sukupuolen, kasvaimen halkaisija histologinen luokan kasvain, imusolmuke etäpesäke tila, ja vaihe ryhmittymä TNM.

Korrelaatio ilmaus FoxQ1 ja EMT indikaattori proteiinien

väliset suhteet ilmaus FoxQ1 ja neljä EMT indikaattori proteiinien laskettiin ja on esitetty taulukossa 2. Todettiin, että epiteelin proteiinia tappio taajuuksia 103 NSCLC kudokset olivat 66,02% E-cad ja 18.45 % MUC1. Epänormaali mesenkymaaliset proteiinin ilmentymisen taajuuksia samalla näytteistä oli 23,30% ja VIM ja 68,93% varten S100A4. Tulos osoitti myös, että korkea ilmentyminen FoxQ1 korreloi menetys E-cad ilmentymistä (χ

2 = 6,308,

P

= 0,012), ja poikkeava positiivisuus VIM (χ

2 = 1,396,

P

= 0,024) ja S100A4 (χ

2 = 8,374,

P

= 0,004) kliinisissä NSCLC näytteissä.

Survival analyysi

Useat tunnetut ennustavaa tekijää huono tulos NSCLC arvioitiin vahvistamaan Potilaskohortti edustaa tällä TMA (taulukko 3). Korkea ilmentymistä FoxQ1 proteiinia (

P

= 0,023) ja alhainen ilmentyminen E-cad-proteiinia (

P

= 0,002) havaittiin tilastollisesti merkitsevä assosiaatio viiden vuoden pysyvyys Coxin regressioanalyysin univariate analyysi. Näiden lisäksi kaksi geneettiset markkerit, muut NSCLC kliiniset ennustetekijät, kuten erilaistumista kasvaimen ja TNM sisällytettiin monimuuttuja Coxin regressiomallin. Tuloksemme osoittivat, että korkea FoxQ1 lauseke (

P

= 0,047) ja menetys E-cad lauseke (

P

= 0,021) varmistettiin olevan riippumattomia prognosticators alhaisen selviytymisen NSCLC.

Survival piirrettiin käyttämällä Kaplan-Meier-menetelmällä. Tulokset havaittiin, että potilaat, joilla on korkea FoxQ1 ilmaus tai menetys E-cad ilme oli huomattavasti lyhyempi elinaika, verrattuna heikosti tai säilöttyjen lauseke, vastaavasti (Fig. 3).

Keskustelu

tässä tutkimuksessa käyttämällä TMA korostimme ennustetekijöiden arvon FoxQ1 ilmaisun NSCLC. Korkea ekspressio FoxQ1 oli havaittavissa TMA kasvaimen näytteiden ja korreloi merkitsevästi vähentynyt elinaika. Lisäksi tulokset osoittivat, että FoxQ1 ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä EMT alaryhmässä potilaita. Kautta Monimuuttuja-analyysissä korkea ilmentyminen FoxQ1 ja alentunut E-cad ilmentyminen osoitettiin olevan riippumattomia prognostisia biomarkkereita huono kokonaiselossaolo. Sikäli kuin tiedämme, tämä on ensimmäinen raportti kliinis merkityksestä FoxQ1 ilmaisun liittyvien EMT kliinisissä NSCLC kudosnäytteistä.

Äskettäin kertyvät näyttöä siitä, että ihmisen FoxQ1 avainasemassa säätelyssä EMT rintasyövän [31], [32], ja aggressiivisuutta paksusuolensyöpä [29], [32]. On huomattava todiste siitä, että läsnäolo EMT ilmiö osoittaa lyhyt hengissä keuhkosyövän [11] – [14]. Tunnistaa suhde FoxQ1 ja EMT on keuhkosyöpä, neljä usein indikaattori biomarkkereita tutkittiin keuhkosyövän TMA avulla IHC. Mielenkiintoisesti meidän tulokset osoittivat, että korkeita lauseke FoxQ1 proteiinin korreloi vähentynyt E-cad-proteiinin ilmentymisen, ja nousu VIM ja S100A4 proteiinin ilmentymiseen.

Jotkut kirjoittajat ovat osoittaneet, että E-cad liittyy etäpesäkkeitä keuhkosyövän [12]. VIM ei uskota liittyvän hengissä keuhkosyöpä [14], vaikka S100A4 on korreloinut ennusteeseen keuhkojen okasolusyöpä [41] kliinisissä tutkimuksissa. Olemme myös päättäneet ennustetekijöiden vaikutus EMT merkki ilmaisun yhden ja usean analyysi. Tuloksemme osoittivat, että ainoa merkki liittyy tulos oli E-cad.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat vahvistaneet, että FoxQ1 arvokkaaksi prognostinen indikaattori huono hengissä rintasyövän [31], [32]. Kuitenkin, korkean ilmentymisen FoxQ1 geenin havaittiin myös keuhkosyövän, mahasyövän ja paksusuolen syövän solulinjat [29]. Siten meidän nykyinen tulokset tukevat aikaisempia havaintoja koskien FoxQ1 ilmaisun NSCLC, erityisesti keuhkojen adenokarsinooman.

Vaikka tarkkaa mekanismeja FoxQ1 n kasvaimia synnyttäviä vaikutuksia NSCLC ei ole kuvattu täysin meidän tässä tutkimuksessa, molekyylitason perustan assosiaatio FoxQ1 ja EMT ovat alalla hyvin kasvain. Saadut tulokset meidän tiedot ovat sopusoinnussa esitettyjen lukujen kanssa kehittyvillä kirjallisuudessa, joka oli ilmoittanut, että tukahduttaminen FoxQ1 lisännyt E-cad ilmentymistä ihmisen karsinooman [31], [32]. Yhdessä havainnot tämänhetkiseen tutkimuksessa tukenut tätä FoxQ1 voitaisiin mahdollisesti käyttää EMT markkerina NSCLC.

Yhteenvetona olemme osoittaneet, että FoxQ1 oli hyvin ilmaistu NSCLC ja voitaisiin käyttää suoraan prognosticator on kielteiseen tulokseen. Myös meidän tulokset tukivat sitä, että FoxQ1 on toiminnallista roolia suhteessa EMT liittyvien geenien NSCLC.