Krooninen sairaus

tiivistelmä

miessukupuoli on riskitekijä kehittämiseen maksasolusyövän (HCC), mutta mekanismit eivät ole täysin ymmärretty. RNA sitovan motiivin geeni Y-kromosomi (RBMY), joka koodaa mies sukusolujen erityisiä Silmukointi säädin spermatogeneesin aikana, on poikkeuksellisesti aktivoitu ihmisen miehen maksan syövät. Tämä tutkimus tutki

in vitro

onkogeeninen vaikutus ja mahdollinen mekanismi RBMY ihmisen hepatoomasolulinjassa HepG2 ja sen

in vivo

vaikutus, mitä tulee maksa ihmisen ja siirtogeenisiä hiiriä. RBMY ilmentyminen HepG2-soluissa tippuu alas RNA-interferenssi ja syöpäsolun fenotyyppi leimasi pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen ja herkkyys vedyn peroksidi aiheuttama apoptoosin. Tulokset paljastivat, että RBMY Knockdown vähensi muutosta ja anti-apoptoottisen tehokkuuden HepG2-soluissa. Ilmentymisen RBMY, androgeenireseptorin (AR), ja sen inhiboivaa variantti AR45, AR-kohdennettuja geenien insuliinin kaltainen kasvutekijä 1 (IGF-1) ja insuliinin kaltaista kasvutekijää sitova proteiini 3 (IGFBP-3) analysoitiin kvantitatiivisella RT -PCR. Up-regulation of AR45 variantin ja vähentää IGF-1 ja IGFBP-3: n ekspressio havaittiin vain RBMY pudotus soluissa. Lisäksi RBMY positiivinen ihmisen miespuolinen HCC ilmaistuna alhaisempi AR45 verrattuna RBMY negatiivinen HCC kudoksiin. Kasvaimia synnyttävän ominaisuudet RBMY oli edelleen arvioitiin siirtogeenisen hiiren mallia. Maksaspesifiset RBMY siirtogeenisiä hiirille kehittyi maksan syövän esiasteista, adenooma, ja HCC. RBMY myös nopeutettu kemiallinen karsinogeeni aiheuttama hepatokarsinogeneesin siirtogeenisissä hiirissä. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että Y-kromosomi-erityisiä RBMY on todennäköisesti osallisena säätelyssä androgeenireseptorin aktiivisuutta ja myötävaikuttaa miesvaltaisuus HCC.

Citation: Tsuei DJ, Lee PH, Peng HY, Lu SL, Su DS, Jeng yM, et ai. (2011) Mies sukusolujen-Specific RNA Binding Protein RBMY: uusi Oncogene selittäminen miesvaltaisuus maksasyöpää. PLoS ONE 6 (11): e26948. doi: 10,1371 /journal.pone.0026948

Editor: John D. Minna, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, Yhdysvallat

vastaanotettu: Kesäkuu 27, 2011; Hyväksytty: 06 lokakuu 2011; Julkaistu 4 marraskuuta 2011

Copyright: © 2011 Tsuei et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia NHRI-EX93-117BN, NHRI-EX95 (96, 97, 98) -9418BI National Health Research Institute of Taiwan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC) on yksi johtavista syövistä maailmassa [1]. Pääasiallisesti riskitekijöitä ovat hepatiitti B-virus (HBV) tai C-hepatiittiviruksen (HCV), altistuminen aflatoksiineille, ja miessukupuoli [2]. Uros-to-naaras suhde HCC kuulemma keskiarvojen 4-5:1 ja on erityisen suurempi HBV liittyvien HCC (5-11:1) [3]. Epidemiologiset tutkimukset osoittivat, että kohonnut seerumin testosteroni oli merkitsevästi liittyy suurentunut riski HCC miespuolisilla HBV-kantajien [4]. Kuitenkin miesvaltaisuus että suhde 3-4:1 havaitaan myös lapsuuden HCC varhain alkanut, niin nuoret kuin 10 vuoden iässä ennen murrosikää, eikä sitä voida selittää suoraan androgeenien vaikutus [5], [6] .

androgeenireseptorin (AR) on osoitettu edistävät miesten mieltymys hepatokarsinogeneesin HBV ja HCV kantajia [7], [8]. AR proteiini välittää toiminnan androgeenien ja voivat edistää miesten HCC hiirillä [9]. Sitoutumisen jälkeen ligandeihin, AR muodostaa homodimeerejä ja aktivoi kohdegeenien transkriptiota, kuten insuliinin kaltainen kasvutekijä 1 (IGF-1) ja insuliinin kaltaista kasvutekijää sitova proteiini 3 (IGFBP-3) [10], [11]. AR-toiminto säätelee yhdessä aktivaattoreita tai co-repressoreihin [12], estävä isoformi AR45 [13], ja lyhyempi CAG toistoja (joka johtaa suurempiin AR aktiivisuus) ensimmäisessä eksonissa AR-geenin [14]. HBV-X-proteiini on tunnettu AR koaktivaattoria [15], [16] ja sitä raportoitiin edistää miesvaltaisuus HBV liittyvissä ihmisen uros HCC [17]. Ei-HBV HCC, muut tuntematon sukupuoleen liittyviä tekijöitä edistävät HCC muodostumista miehillä on tullut tärkeä huolenaihe.

häiriöstä Y kromosomi-geenit on löydetty mies HCC, mutta niiden roolit miesvaltaisuus HCC toistaiseksi ei ole käsitelty [18], [19]. RNA-sitova motiivi geeni Y-kromosomin (RBMY) on mies sukusolujen ilmentymistä geenin, joka sisältää RNA: ta tunnustamista motiiveja N-päässä [20]. Sen ilmentyminen rajoittuu ytimet mies itusolujen ja poistamisen saattaa pidätyksen sukusolujen klo meioottista vaiheessa spermatogeneesin [21]. RBMY toimii uros sukusolujen erityisiä silmukoinnin säädin moduloimalla konstitutiivisesti ilmentyvän liitos tekijät [22], [23]. Sen poikkeava aktivaatio on havaittu noin 1/3 miesten HCC ja hepatoblastooma tuumorikudokset, mutta ei pariksi ei-kasvain maksan kudoksissa, naispuolinen HCC, tai muita syöpiä [24]. Vaikka RBMY voi olla vuorovaikutuksessa AR koaktivaattori Sam68 [25], [26], sen rooli AR signalointireitin ei ole vielä raportoitu.

Tässä tutkimuksessa pyrittiin arvioimaan muutosta ja anti-apoptoottisen tehokkuuden of RBMY ihmisen hepatoomasolujen sekä maksakasvaimia tehoa RBMY siirtogeenisissä hiirissä, ja tutkia sen mahdollista taustalla molekyylitason mekanismeja. Tuloksemme

in vitro

,

in vivo

, ja kliinisissä ihmisen mies HCC kudosten mukaan RBMY voi parantaa AR aktiivisuutta ja hepatokarsinogeneesin vähentämällä ilmaus AR estävää variantin AR45.

Materiaalit ja menetelmät

Human kudosnäytteitä

Pariksi kasvain ja ei-kasvain maksakudoksissa kerättiin 66 kirurgisen HCC miehillä (44 HBV liittyviä, 10 HCV-liittyvän, 5 HBV /HCV-liittyvä, ja 7 ei-HBV /HCV-liittyvä) National Taiwan University Hospital (NTUH) vuonna 2007. Kaikki kliiniset näytteet saatiin hyväksymisen jälkeen tutkimuseettinen komitea NTUH (NTUHREC hyväksyntä nro 9361701139) .

Soluviljely ja transfektio

ihmisen maksasyövän solulinjoja HepG2 ja Hep3B alun perin saatu Bioresource Collection ja Research Center (BCRC, Taiwan). HepG2, Hep3B ja Huh7 (Dr. Hui-Lin Wu NTUH hepatiitti Research Center) soluja kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (HyClone, Logan, UT). Transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, CA) valmistajan protokollan.

RNA-interferenssi

pSUPER-pohjainen strategiaa käytettiin pudotus RBMY ilmentymisen. RBMY pieni hiusneula-RNA (shRNA) muodostettiin ligoimalla kolme 19-nukleotidisekvenssit spesifinen RBMY SRGY alueen (eksonit 7-10) vektoriin (OligoEngine, Inc., Seattle, WA). Sekvenssit on esitetty taulukossa S1. Soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin transfektioon ja transfektoidut solut valitaan 300 ug /ml genetisiiniä.

Puolikvantitatiivinen RT-PCR: llä ja kvantitatiivisella PCR-

Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (QIAGEN, GmbH, Hilden, Saksa) ja alistettiin käänteistranskriptio käyttäen SuperScript III käänteistranskriptaasi (Invitrogen). Alukkeen sekvenssit ja reaktio-olosuhteet on esitetty taulukossa S1. Kvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttäen TaqMan Gene Expression Assay Mix kohde RBMY (Hs00359074_m1) tai endogeeniset ohjaus hypoksantiinifosforibosyylitransferaasi 1 (Hs99999909_m1) (Applied Biosystems, Foster City, CA). Kvantitatiivinen PCR AR, AR45, IGF-1, IGFBP-3, ja endogeeninen kontrolli S26 suoritettiin käyttäen MASTERMIX Plus SYBR Green (Applied Biosystems). Monistaminen signaaleja havaittiin ABI prism7700 tai 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems).

Pehmeä agar ja selviytymisen määritykset

pehmeä agar määritystä, 2500 solua per kuoppa kasvualustaan joka sisälsi 0,35% agaroosia laitettiin 6-kuoppalevyille 0,5% agaroosilla perusta. Sen jälkeen, kun 14 päivää inkuboinnin jälkeen pesäkkeet värjättiin 0,005% kristallivioletilla huoneenlämpötilassa 1 h ja laskettiin kullekin levylle.

-eloonjäämiskoe, HepG2-solut, jotka on transfektoitu shRNA plasmideja käsiteltiin 0,5 tai 0,75 mM vetyperoksidia 24 tunnin apoptoosin. Solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttäen Cell Proliferation Kit I (MTT) (Roche Diagnostics, Saksa). Absorbanssi mitattiin 590/690 nm: ssä käyttäen MRX mikrolevylukijalla (Dynex Technologies, Inc., VA), ja solujen eloonjääminen ilmaistiin absorbanssin että verrattuna käsittelemättömään kontrolliin.

määritys androgeenireseptorin CAG-repeat pituus ihmisen HCC kudoksissa

genomin alueella, joka sisältää CAG trinukleotidi toista PCR-monistettiin ja leimattu FAM, alistetaan ABI 3700 Genetic Analyzer, ja teki käyttäen GeneMapper ohjelmistoa (Applied Biosystems). Standardikäyrä laskemiseksi CAG toistolukumäärä perustui neljään kontrollinäytteistä CAG toistolukumäärät vaihtelevat 17 35. Sekvensointi analyysi suoritettiin HCC kudoksia 66 oppiaineista, joissa CAG toistolukumäärät ulos standardikäyrän.

perustaminen RBMY siirtogeenisiä hiiriä ja seuranta histopatologia

RBMY koodaava sekvenssi monistettiin ja kloonattiin pBS-HCRHPI-vektori, jossa on maksaspesifiset α1-antitrypsiini promoottori. Konstrukti hajotettiin

Spel

tuottaa siirtogeenin fragmentti injektiona pro-ytimet hedelmöittyneiden munien FVB /N-hiirissä. Instituutioannissa Animal Care ja käyttö komitea College of Medicine ja College of Public Health, National Taiwan University hyväksyi eläinten hoito ja kokeellisia toimenpiteitä (IACUC hyväksyntä nro 20060217).

Hiiret tapettiin 4-24 kuukautta vanha. Niiden maksat fiksoitiin 10% neutraalissa puskuroidussa formaliinilla tai upotettiin OCT yhdistettä (Sakura Finetek, Torrance, CA). Parafiinisektioista värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla histopatologinen tutkimus, kun taas jäädytetty leikkeet värjättiin oil red O havaita rasva- pisaroiden kerääntyminen. Vakavuus rasvamaksa arvioitiin osuus positiivista värjäytymistä käyttäen morfologisia semikvantitatiivinen menetelmä ja luokitellaan luokan 1 ( 33%), luokka 2 (33-66%), tai 3. asteen ( 66%) kuvattu aiemmin [27].

Diethylnitrosamine hoitoa ja histopatologia hiirillä

kemiallinen karsinogeeni malli, 14 päivän ikäisen RBMY siirtogeenisiä tai verrokkihiirten satunnaisesti saivat yhden vatsaonteloon ruiskuttamalla diethylnitrosamine ( DEN) (Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO), 10 mg /kg kehon painoa tai suolaliuosta sama tilavuus, vastaavasti. Hiiret tapettiin 26 ja 34 viikkoa hoidon jälkeen. Lisäksi aiemmin uhri 14 viikon ajan oli nimenomaan hyväksyttiin uroshiirillä, jotka olivat tiettävästi erittäin alttiita DEN aiheuttama hepatokarsinogeneesin. Mittaukset kasvainmassoja näkyvissä maksaan pinnalla kirjattiin. Mikroskooppiset vauriot laskettiin kahdesta edustaja osaan (50-um etäisyys) kunkin hiiren maksassa.

immunohistokemiallista

Immuno-histokemiallisella varten RBMY antigeeni suoritettiin jäädytetty maksan osissa. Sen jälkeen, kun antigeeni haku ja sammutus endogeenisen peroksidaation, kanin anti-SRGY vasta-aine [24] inkuboitiin leikettä 1:400 laimennuksen yön yli 4 ° C: ssa. HRP-DAB käytettiin tunnistusjärjestelmä (R 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä, kun taas

p

arvon välillä 0,05 ja 0,1 katsottiin jonka suuntaus eroa.

Tulokset

RBMY knockdown vähensi muutosta ja antiapoptoottisia tehokkuudet HepG2-soluissa

natiivisti ilmaistu RBMY ihmisen hepatoomasolulinjassa HepG2 häiritä shRNA nimenomaan kohdistuksen SRGY verkkotunnus RBMY. Kvantitatiivinen RT-PCR osoitti, että 95% RBMY transkriptit inhiboitui pSUPER-680 ja pSUPER-914 transfektoitujen HepG2-soluissa, kun taas pSUPER-778 ei ollut Knockdown vaikutusta verrattuna vektori transfektoiduissa soluissa (kuvio. 1A). Immunohistokemiallista analyysiä vahvistivat lisäksi tehokas knockdovvn RBMY in pSUPER-680 ja pSUPER-914 transfektoiduissa soluissa (Kuva. 1 B). Vektori Vain transfektantit esittänyt vastaavia tasoja RBMY verrattuna vanhempien HepG2-soluissa, joten ne käytettiin ohjauslaitteet

in vitro

Solukokeita.

(A) Quantitative RT-PCR-analyysi RBMY vuonna vanhempien (G2), vektoriplasmidiin (VC), pSUPER-680, pSUPER-778, ja pSUPER-914 plasmidit transfektoidaan HepG2-soluissa. (B) Immuno-histokemiallinen värjäys HepG2 ja vastaava transfektantit varten RBMY proteiinia. (C) Pesäkkeenmuodostusta vanhempien tai transfektoitu HepG2 solut pehmeällä agar. (D) Suhteellinen solujen elävyyden MTT: llä postitse 0,5 tai 0,75 mM vetyperoksidia (H

2O

2) hoitoa. Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD neljästä itsenäisestä kokeesta. *

p

0,05; **

p

0,01.

ankkurointiriippumattomuudeksi testi osoitti, että RBMY ilmentäviä HepG2-soluissa oli vahvempi klonogeeniset kyky verrattuna RBMY pudotus soluihin (

p

0,0001, yksisuuntainen ANOVA). Siirtomaa numerot pSUPER-680 ja pSUPER-914 transfektoitujen solujen pehmytagar vähenivät 45% ja 40%, vastaavasti, verrattuna tyhjän vektorin transfektanttien (Fig. 1 C). Colony muodostuminen RBMY ilmentävien pSUPER-778 transfektantit oli myös huomattavasti korkeampi kuin taintumisen transfektanteilla (680 vs. 778,

p

0,0001; 914 vs. 778,

p

= 0,001).

antiapoptoottista kyvyt RBMY ilmentävien ja pudotus HepG2 transfektantit analysoitiin -eloonjäämiskoe jälkeen vetyperoksidin hoidon. Verrattuna tyhjän vektorin transfektanttien, elinkelpoisuutta pSUPER-680 shRNA transfektanttien 0,5 tai 0,75 mM vetyperoksidia hoitoon väheni 46% ja 53% (

p

0,05), vastaavasti, ja niille pSUPER- 914 transfektantit vähenivät 34% ja 54% (

p

0,05), tässä järjestyksessä (Kuva. 1 D). Elinkelpoisuuden RBMY ilmentävien transfektanttien pSUPER-778 oli 16-19% alhaisempi kuin vektori transfektanttien (

p

= 0,5).

RBMY pudotus lisäsi ekspressiota inhiboivan androgeenireseptorin variantti AR45 ja laski AR trans-aktivaatioaktiivisuus, kun taas RBMY yliekspressio tukahdutetaan AR45 tasoilla

on raportoitu, että Sam68, vaihtoehtona silmukoinnin säädin ja vuorovaikutuksessa proteiinin RBMY, voisi moduloida AR-säädeltyjä transkription aktiivisuutta eturauhassyövän soluissa [ ,,,0],25]. Tutkia, onko ilmaus suhde AR ja sen estävän isoformin AR45 vaikuttivat RBMY semikvantitatiivisista RT-PCR suoritettiin RBMY ilmentävien tai pudotus HepG2-soluissa. Densitometria-analyysi osoitti kolminkertainen lisäys AR45 tasojen RBMY pudotus transfektanttien (pSUPER-680 ja pSUPER-914) verrattuna vain vektorin sisältävään (VC) transfektanttien (

p

0,05) (Fig. 2A) . AR45 tasot vanhempien HepG2-soluissa ja pSUPER-778 transfektantit olivat samanlaiset kuin vektori transfektanteissa. Ei ollut merkittävää muutosta AR tasojen RBMY ilmentäviä ja knockdown soluja. AR /AR45 suhdelukuja RBMY pudotus transfektanteissa (pSUPER-680 ja pSUPER-914) vähenivät 2- 2,5-kertainen verrattuna vain vektorin sisältävään (VC) transfektanteilla (Fig. 2A).

(A ) Semi-kvantitatiivinen RT-PCR ja densitometrinen analyysi RBMY, AR ja AR45 vanhempien (G2), vektoriplasmidiin (VC), pSUPER-680, pSUPER-778, ja pSUPER-914 plasmidit transfektoidaan HepG2-soluissa. (B) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi RBMY, AR45, IGF-1 ja IGFBP-3: RBMY pudotus transfektanttien (680 ja 914) ja ei-pudotus transfektanttien (VC ja 778). Arvot normalisoitiin vastaan ​​sisäisen valvonnan S26. Tiedot ovat keskiarvo ± SD taittuu yli vektorisäätö (VC). (C) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi AR ja AR45 vektorisäädön tai RBMY transfektoitu Hep3B ja Huh7 soluja. Tiedot ovat keskiarvo ± SD taittuu yli vektorisäätö (VC). (D) Puolikvantitatiivinen RT-PCR-analyysi RBMY kasvain (T) ja ei-kasvain (N) osaa ihmisen uros HCCs. S26 on sisäinen kontrolli ja alfafetoproteiini (AFP) kuin tuumorimarkkeri. (E) Immuno-histokemiallisella ydin- RBMY proteiinin HCC kudoksissa vain (x 400). (F) AR ja AR45 mRNA ilmaisun 7 RBMY ilmentävien ja 5 ei-ilmentävät ihmisen uros HCC kudoksiin. Tulokset olivat keskiarvoja kolmesta eri kokeesta. *

p

0,05; **

p

0,01.

AR45 raportoitiin tukahduttaa AR trans-aktivoitumisen toimintaa [13], ilmentyminen AR kohdegeenien IGF-1 ja IGFBP-3: arvioitiin ja verrattiin RBMY ilmentävien ja pudotus HepG2-soluissa. Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi paljasti, että RBMY pudotus solut ilmensivät runsaita tasoja AR45 mutta vähensi merkitsevästi IGF-1 (

p

0,05) ja IGFBP-3 (

p

0,01) tasoja (Fig. 2B), joka osoittaa, että RBMY pudotus korreloi parannetun AR45 ilme ja tukahdutettu AR toimintaa.

lisäksi tukahduttamista AR45 ilmaisun yli-ilmentävien RBMY osoitettiin myös Hep3B ja Huh7 soluja. AR45 tasot alenivat 42% vuonna RBMY transfektoiduissa Hep3B ja 60% Huh7 soluissa (

p

0,05) (Fig. 2C). Ei ollut merkittävää muutosta AR tasojen RBMY transfektoiduissa ja vektori-transfektoiduissa soluissa.

RBMY ilmaisu korreloi vähentynyt AR45 tasoja ja lyhyemmät AR-CAG-toistoa ihmisen mies HCC kudosten

Perustuen edellä mainitut tulokset osoittavat, että RBMY ekspressio oli heikompi AR45 tasoilla HepG2-soluissa, AR ja AR45 ilmaisuja lisättiin edelleen verrattiin RBMY ilmentävien että ei-ilmentävien ihmisen uros HCC kudoksissa. Semikvantitatiivinen RT-PCR osoitti, että RBMY havaittiin 35% (23/66) uros HCC kasvaimen kudokset, jotka vahvistettiin ilmentyminen tuumorimarkkeri alfafetoproteiini (Fig. 2D). Immuno-histokemiallisella vahvisti ydin- ilmaus RBMY vain HCC tuumorikudoksissa (Fig. 2E) kantavassa positiivinen nopeus RBMY selostukset oli 36% (16/44) HBV liittyvissä HCC, 40% (4/10) HCV liittyviä HCC, 20% (1/5) HBV /HCV-liittyvä HCC, ja 29% (2/7) ei-virusperäisen liittyvä HCC. Ei ollut havaittavissa RBMY transkriptien tai proteiinien ei-kasvain osat 66 HCC maksakudokseen.

ilmentyminen AR ja AR45 muunnos seitsemän RBMY ilmentävien ja viisi ei-ilmentävien uros ihmisen HCC kudoksissa määritettiin by 2exp

(- ΔΔCt) menetelmä suhteellista kvantifiointia. MRNA tasot HCC kudoksissa normalisoitiin vastaan ​​sisäisen valvonnan S26 ja pitoisuuksiin verrattuna vektori vain HepG2 transfektantit. Huomattavasti vähemmän AR45 havaittiin RBMY ilmentävien uros HCC verrattuna ei-RBMY ilmentävät HCC kudoksissa (

p

0,05) (Fig. 2F), mikä RBMY tukahduttaminen on AR45 transkriptiota. Ei ollut merkittävää eroa AR tasojen välillä RBMY ilmentävien että ei-ilmentävien HCC kudoksissa.

Arvioidaan tarkemmin yhdistyksen välillä RBMY ja AR toimintaa, CAG-toiston pituus AR-geenin, AR toimintoperusteisen liittyvä tekijä, määritettiin RBMY ilmentävien tai ei-ilmentäviä uros ihmisen HCC kudoksiin. Keskimääräinen CAG-repeat pituus 49 HBV liittyvien uros HCC kudoksissa (RBMY positiivinen /negatiivinen = 17/32) oli huomattavasti lyhyempi niissä kanssa kuin niissä ilman RBMY lauseke (21,0 ± 2,8 vs. 22,9 ± 2,8,

p

0,05). Yhdistys CAG-toiston pituus ja RBMY ilme paljasti suuntauksen ero (21,4 ± 2,54 vs. 22,7 ± 2,75,

p

= 0,064), kun HBV-HCC kudokset olivat mukana (RBMY positiivinen /negatiivinen = 23 /43).

RBMY siirtogeenisiä hiiriä kehitettiin maksan rasvahappojen muutoksen ja neoplastisia vaurioita

siirtogeenisiä hiiriä, joilla on maksan ilmentäminen RBMY perustettiin (Fig. 3A). Western blot osoitti alhainen RBMY ilmentymistä siirtogeenisissä perustajat RF1 ja RF2, mutta korkea RBMY tasolla RF4 ja RF6 (Fig. 3B). Ei ollut siirtogeenisiä RBMY havaittu aivoissa, sydän, munuainen, keuhko, perna, maha, tai kiveksissä RT-PCR: llä (Fig. 3C), mikä osoittaa maksan ilmentäminen RBMY siirtogeenisissä hiirissä. Kvantitatiivinen RT-PCR tuloksia tukee lisäksi RF4 kuin korkean ilmaus perustaja (Fig. 3d). IHC värjäys osoitti, että RBMY pääasiassa tumassa ja siirtogeenisten hiirten maksan kudoksissa (kuvio. 3E).

(A) Genetic kartta 4,2 kb RBMY siirtogeenin, mukaan lukien maksan lokuskontrollialuetta päässä apolipoproteiini E: geenin (ApoE-HCR), maksa-specific α1-antitrypsiini promoottori (Haat-Pr), katkaistu tekijä IX: n introni (hFIX-IA), ja naudan kasvuhormoni polyadenylaatiosignaali (BGHpA). (B) Western blot-analyysi RBMY valmistettu maksa yksittäisten siirtogeenisiä (RF1-6, RF2-265, RF4-89, RF6) ja ohjaus (NT1, NT2) hiirillä. (C) Maksa-ilmentäminen RBMY siirtogeenisissä hiirissä RT-PCR: llä käyttämällä GAPDH sisäisenä kontrollina. Reaktiot ilman mallia RNA (RTC) tai cDNA (NTC) olivat negatiivisia kontrolleja. (D) Expression of RBMY siirtogeenisissä (RF1-176, RF1-278, RF2-62, RF2-390, RF4-19, RF4-21) ja ohjaus (NT1, NT2) hiiret kvantitatiivisen RT-PCR. (E) Immuno-histokemiallisella siirtogeenisiä (RF4-89) ja ohjaus (NT) hiiret maksakudoksissa varten RBMY. Siirtogeenisen hiiren osoitti tumavärjäystä varten RBMY (x 400). (F) Öljyn punainen värjäys osoitti maksan rasva muutosten ohjaus hiirillä (NT1 ja NT2), matala RBMY (RF2-62 ja RF2-390) ja korkea RBMY (RF4-19 ja RF4-21) siirtogeenisiä hiiriä (x 400).

Hepatosellulaarinen muutoksia analysoitiin maksan osien 79 siirtogeenisiä hiiriä ja 30 ohjaus FVB /N hiirillä. Korkea RBMY ilmentäviä RF4 perustajat (RF4-19 ja RF4-21) näytetään vakavampia rasva talletus kuin alhaisen RBMY ilmentävien RF2 perustajat (RF2-62 ja RF2-390) (Fig. 3F). Vuonna RBMY siirtogeenisiä hiiriä, esiintyvyys kehittää kohtalainen-vaikea maksan rasvoittuminen oli 60-89% (keskiarvo 73%), mikä oli ~2.5 kertaa suurempi kuin kontrolliryhmän (keskimäärin 30%,

p

0,001) (taulukko 1). RBMY ilmaisu ei lisätä fibroosi tai kirroosi, että siirtogeenisissä hiirissä mallin.

Niistä 45 siirtogeenisiä hiiriä, jotka olivat vanhempia kuin 15 kuukautta, kolme niistä on kehitetty maksan pahanlaatuisten vaurioiden (taulukko 1). Kyhmy (1 mm: n halkaisija), havaittiin oikeassa koru RF1-278 hiiren (15 kuukautta) ja histologinen tutkimus paljasti ennalta kasvainleesioksi (Fig. 4A-C). RF4-21 hiiri (24 kuukautta) oli adenooma kyhmy (4 mm halkaisijaltaan) oikeaan lobe (Fig. 4D-F), kun taas RF2-390 (21 kk) oli kohtuullisesti erilaistunut HCC (6 mm halkaisijaltaan) on mediaani lohko (Fig. 4G-I). Medium tai vaikeaa rasva- muutoksia ei havaittu kasvaimen osissa kolme hiirtä. Yksikään 17 verrokkihiirten yli 15 kuukausien aikana maksan pahanlaatuisten vaurioiden.

(A-C) Pre-kasvainleesioksi on 15 kuukauden ikäinen uros hiiri RF1-278. (D-F) adenooma (AD) on 24-kuukauden ikäinen nainen hiiri RF4-21. (G-I) HCC on 21 kuukauden ikäinen uros hiiri RF2-390. Suurennus: B, E, H, x 50; C, F, I, × 200.

RBMY kiihtyi dietyyli nitrosamiini aiheuttama hepatokarsinogeneesin

kasvain edistävät vaikutukset RBMY oli arvioida tämän enempää kemiallista karsinogeneesissä mallia. Koska korkea herkkyys uroshiirten DEN, uros ryhmät tapettiin 14 viikkoa hoidon jälkeen. Suurempi esiintyminen pahanlaatuisten vaurioiden havaittiin siirtogeenisissä uroshiirillä verrattuna että kontrolliryhmässä (12/14 vs. 5/12,

p

0,05). Tällä 34 viikkoa hoidon jälkeen, uros RBMY siirtogeenisiä hiiriä kehittyi kasvaimia, joiden halkaisija 3 mm verrattuna kontrolliryhmään (52 vs. 19,

p

0,05) (taulukko 2). Siellä oli myös suurempi ilmaantuvuus trabekkeliluuhun pahanlaatuisten vaurioiden naarashiirillä siirtogeenisiä hiiriä verrattuna kontrolliryhmään viikolla 26 (7/9 vs. 1/10,

p

0,01) ja 34 viikon ajan (9/10 vs. 3/13,

p

0,01) jälkeinen DEN hoito (taulukko 2).

keskustelu

RBMY pidetään kives-specific pleissauksia tekijä spermatogeneesin [22], [23]. On raportoitu ekspressoituvan enemmän kuin yksi kolmasosa ihmisen uros HCC kudoksissa [24]. Tämä tutkimus osoittaa edelleen, että RBMY Knockdown korreloi lisääntyneeseen AR45 muunnos ilmaisua ja vähentää ankkurointi riippumattomaan kasvuun ja antiapoptoottisia kyvyt ihmisen hepatoomasolulinjassa HepG2. AR45 isoformi on raportoitu toimivan määräävän-negatiivinen estäjä AR toimintoa muodostumista AR-AR45 heterodimeerejä [13]. Osoitamme myös, että RBMY Knockdown vähentää AR trans-aktivaatioaktiivisuus HepG2-soluissa. Siksi RBMY voi toimia miesten erityinen onkogeeni ja lisätä riskiä ihmisen mies hepatokarsinogeneesin säätelemällä AR-geenin ilmentymisen ja aktiivisuuden.

AR-geeni, pikemmin kuin androgen, on osoitettu olevan keskeisessä asemassa että miesvaltaisuus HCC siirtogeenisessä HBV hiirimallissa [17]. Ihmisen AR koostuu N-päästä transaktivaatiodomeenin, keskeinen DNA: ta sitova domeeni ja C-terminaalinen ligandia sitovan domeenin. AR45, luonnossa esiintyvä variantti ihmisen androgeenireseptorin, puuttuu N-terminaalinen domeeni vaaditaan täyden ligandin aktivoitu transkriptionaalista aktiivisuutta [13]. Käänteisen yhdistys AR ja AR45 ilme on havaittu ihmisen sydämen ja lihaksen kudoksiin huippunimistä AR45 ja alhaisin AR [13]. Tässä tutkimuksessa, RBMY pudotus kasvaa ilmentymisen AR45 ihmisen hepatoomasolulinjasta HepG2-solulinja, kun taas RBMY yliekspressio vähentää AR45 tasoilla Hep3B ja Huh7 solulinjat. Lisäksi RBMY-positiivisia ihmisen uros HCC kudokset ilmentävät alhaisempia AR45 tasoja verrattuna RBMY-negatiivinen HCC. Alas-säätely AR kohdegeenien IGF-1 ja IGFBP-3 in RBMY pudotus HepG2-soluissa edelleen havainnollistaa tehostajavaikutuksen RBMY on AR trans-aktivoitumisen aktiivisuutta. HBV X-proteiinin on raportoitu toimia viruksen koodaava AR koaktivaattori, joka edistää merkittävästi miesvaltaisuus HBV: hen liittyvään ihmisen HCC [16]. Kuitenkin, se ei voi selittää sukupuolten erilaisuus ei-HBV liittyvät HCC. Variantit suhde RBMY ilmentymisen HBV: hen liittyvään, HCV-liittyvä, ja ei-virus-liittyviä uros HCCs viittaa siihen, että RBMY voi olla yhteinen riskitekijä kasvaa uros alttiutta maksasyövän. Havaintojemme aikaansaada uusi mekanismi tulkinnassa miesvaltaisuus kaikentyyppisissä maksan syövät kautta Y-kromosomi-spesifinen RBMY geenin.

AR45-spesifinen eksoni 1B välissä ensimmäisen ja toisen eksonin AR-geenin. Kaksi hypoteettinen sääntelymenetelmistä AR45 synteesiin on ehdotettu, mukaan lukien transkription valvonnan uusi ylävirtaan eksonin 1B tai vaihtoehtoisen silmukoinnin tapauksessa [13]. RBMY toimii kives-spesifinen liitos säädin ja tiettävästi vuorovaikutuksessa RNA-sitovan proteiinin Sam68 kiveksissä [26]. Sam68 on läsnä liitos säädin ja myös alavirran kohde Src signalointireitin [28], [29]. Se on toistaiseksi epäselvää, onko RBMY suoraan säätelee AR45 transkriptio /silmukoinnin kautta tai vuorovaikutuksessa Sam68. Lisäksi, Sam68 pidetään AR koaktivaattori, koska se voi moduloida AR transkriptionaalista aktiivisuutta eturauhassyövissä [25]. Src-signalointireitin on myös osoitettu olevan kriittinen HBV X-proteiini-välitteisen parantamiseksi Jälleenkytkentätoiminto [30]. Onko RBMY on mukana Sam68-välitteisen Src-signalointireitin on mielenkiintoinen kysymys, joka on tutkittu tulevaisuudessa.

onkogeenisyyttä RBMY on osoittanut muutosta hiiren fibroblastisolulinjaa NIH3T3 [24]. Tämä tutkimus osoittaa edelleen, että RBMY parantaa maksan syövän synnyn

in vivo

siirtogeenisessä hiirimallissa. Raportoitiin spontaani maksakasvain kasvu on 3% ja 0% 24 kk ikäisen miehen ja naisen villityypin FVB /N hiirille [31]. RBMY siirtogeenisiä hiiriä kehittynyt maksan kasvaimia 8,7% (2/23) mies- ja 4,5% (1/22) ja naarashiirillä yli 15 kuukautta, mikä on enemmän kuin 2 kertaa suurempi kuin spontaani maksakasvain ilmaantuvuus.

mallia DEN aiheuttama hepatokarsinogeneesin merkitys RBMY parantavaa vaikutusta syöpä leesionmuodostus havaitaan jo 14 viikkoa hoidon jälkeen mies siirtogeenisiä hiiriä. Lisäksi suurempi kasvaimia (halkaisija ≥3 mm) kehittyi siirtogeenisissä uroshiirillä 34 viikon ajan, mikä osoittaa RBMY vahvistuksen kytkemiseksi DEN aiheuttamaa hepatokarsinogeneesin. Jopa nainen RBMY siirtogeenisiä hiiriä on myös merkittävästi lisääntynyt ilmaantuvuus pahanlaatuisten vaurioiden sekä 26 ja 34 viikon kuluttua hoidosta. Vaikka villin tyypin naarashiirillä ovat resistenttejä DEN karsinogeneesin, koska suojaava vaikutus estrogeenin inhibitiota IL-6: n tuotantoa, jonka Kupfferin solut [32], [33], tulokset tästä osoittaa toimituksen ja aktivointi mieserityisyyttä RBMY geeni kiihtyi maksasyöpää kehitystä jopa naisten siirtogeenisiä hiiriä.

Yhteenvetona RBMY knockdown herättää estävät vaikutukset muutoksen ja antiapoptoottisia kyvyt ihmisen hepatoomasolulinjassa HepG2. Inhiboivaa vaikutusta RBMY on AR45 tasossa on osoitettu RBMY pudotus HepG2-soluissa ja RBMY yli-ilmentävät Hep3B ja Huh7-soluja. Näin ollen kasvaimia synnyttävän mekanismin RBMY voidaan yhdistää sen asetuksen AR trans-aktivoitumisen aktiivisuuden lisääntyminen AR45 variantti, estäjä AR. AR45 ilmaisu havaittu RBMY ilmentäviä ihmisen uros HCC on myös huomattavasti pienempi verrattuna ei-ilmentävien HCC kudoksiin. Lisäksi RBMY osoittaa kasvaimen edistävää aktiivisuutta

in vivo

on siirtogeenisiä hiiriä malli ja nopeuttaa kehitystä uudisvaurioiden on diethylnitrosamine aiheuttaman hepatokarsinogeneesin eläinmallissa. Karsinogeenisten vaikutus hepatoomasolulinjassa ja ihmisen HCC kudosten yhdessä

in vivo

kasvaimen edistämisen siirtogeenisiä hiiriä, tarjoaa uuden roolin RBMY kuin mies-erityinen onkogeenin selittää miesvaltaisuus maksasyövän.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Primer sekvenssit shRNA plasmidin rakentamiseen, semikvantitatiivinen ja reaaliaikainen RT-PCR: llä.