Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) on tappavin gynecologic syöpään Yhdysvallat. Valitettavasti validoitu proteiini biomarkkereiden-seulonta toteamiseksi varhaisessa vaiheessa sairaus ääreisverenkierron ei ole vielä kehitetty. Tässä tutkimuksessa arvioidaan kyky tunnistaa kasvaimen asiaankuuluvat proteiineja munasarjasyöpä proksimaalisesta nesteiden, mukaan lukien kudosten Kudosneste (TIF) ja vastaavia askites, potilailta, joilla papillaarikuvioiden vakavien EOC ja kääntää nämä löydökset kohdennettuihin veripohjaisten immunomäärityksissä.

Menetelmät /Principal havainnot

Pariksi TIF ja askites kerättiin neljältä papillaarisen serous EOC potilaiden leikkauksen aikana tehtiin immunodepletion, äänin 1D geelielektroforeesilla ja geeli ruoansulatus analysoitavaksi nestekromatografia-tandem-massaspektrometrialla, mikä johti yhteenlaskettu tunnistaminen 569 ja 171 proteiineja TIF ja askites, vastaavasti. Näistä peroxiredoxin I (PRDX1) valittiin validointi seerumin ELISA ja osoitettiin olevan läsnä ja merkitsevästi koholla (p = 0,0188) 20 EOC potilailla, joiden keskimääräinen taso 26,0 ng /ml (± 9.27 SEM) verrattuna 4.19 ng /ml (± 2,58 SEM) 16 potilaalla normaali /hyvänlaatuinen munasarjojen patologia.

Johtopäätökset /merkitys

Olemme hyödyntäneet työnkulun korjuu EOC-asiaa proksimaalisen Biofluids, kuten TIF ja askites, sillä proteomiikka-analyysi. Niistä differentiaalisesti runsaasti proteiineja tunnistettiin näiden proksimaalisesta nesteet, PRDX1 osoitettiin olevan läsnä seerumissa ja osoittaa ELISA koholla lähes 6-kertainen papillaarinen vakavien EOC: lla potilaista verrattuna normaaliin /hyvänlaatuinen potilaille. Meidän havainnot osoittavat pinnallinen kyky löytää mahdollisia EOC kannalta relevantteja proteiineja proksimaalisilta nesteissä ja vahvistaa niiden läsnäolo perifeerisen veren seerumin. Lisäksi meidän toteaminen kohonneet PRDX1 seerumissa EOC potilaiden vs. normaali /hyvänlaatuinen potilaille takaa arvioida tarkemmin kasvainspesifin biomarkkeri EOC.

Citation: Hoskins ER, Hood BL, Sun M, Krivak TC, Edwards RP, Conrads TP (2011) proteomiikan analyysi munasarjasyövän lähikehityksen Nesteet: validointi Elevated Peroxiredoxin 1 Patient ääreisverenkierron. PLoS ONE 6 (9): e25056. doi: 10,1371 /journal.pone.0025056

Toimittaja: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 23 elokuu 2011; Julkaistu: 30 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Hoskins et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Taloudellinen tuki tarjosi Scaife Foundation pilottihankkeen ohjelma. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Noin 22220 naista diagnosoidaan vuosittain epiteelin munasarjasyöpä (EOC) ja yli 13000 periksi tälle taudille [1]. Naiset, joilla EOC on 5 vuoden pysyvyys 18-34%, kun huono ennuste johtuu pääasiassa siitä, että suurin osa potilaista on pitkälle edennyt tauti [2]. Havaitseminen varhaisessa vaiheessa taudin optimaalinen seulontatesti olisi myönteinen vaikutus eloonjäämiseen; kuitenkaan ole käytettävissä biomarkkerit, jotka ovat riittävän herkkiä tai spesifisiä käyttöön sopivan testin olevan apuohjelma seulontaan väestössä. Musiinin 16, joka tunnetaan myös syövän antigeeni (CA) -125, havaittiin vasta-aineen tuotantoa tuumoriksenograftien [3], ja se on helposti havaittavissa seerumissa. FDA-hyväksytty CA-125 immunomääritys on käytössä seurata taudin vaste kemoterapian ja uusiutuminen; kuitenkin, mittaus CA-125 on tehoton seulontaan (off-label käytön) varten EOC väestössä [4]. Vaikka immuunidetektio kasvaimeen liittyviä antigeenejä on osaltaan tietämystä luonnon historiasta taudin, niiden toimenpiteitä ei ole vielä johdonmukaisesti tunnistaa varhaisessa vaiheessa EOC.

Korkea suoritusteho geeniekspressioanalyysiä normaali munasarjakudoksen verrattuna EOC on paljasti ainutlaatuinen geeni allekirjoitukset ilmaistu EOC. Vaikka nämä allekirjoitukset ovat antaneet lisää tietoa molekyylibiologian EOC, geenien ilmentyminen ei aina korreloi proteiinin runsauden [5], erityisesti ääreisverenkierrossa, joka edustaa kaikkein kliinisesti merkittävää näyte lähde rutiini määritys kehittämiseen ja mittaus [6]. Vaikka proteomic profilointi seerumin on houkutteleva lähestymistapa biomarkkereiden löytö, tämä strategia on analyyttisesti haasteellista johtuen suuren dynaamisen alueen proteiinia Tämän näytteen pitoisuus, joka vaikeuttaa löytämisen alemman runsaus, kasvaimeen liittyviä proteiineja. Johtuvat luontainen analyyttinen liittyvät haasteet seerumin proteomiikka, proksimaalinen nesteet ovat saaneet yhä enemmän huomiota johtamiseen ehdokas proteiinin biomarkkereiden löytö [7]. Kun kyseessä on EOC, askites on houkutteleva näyte lähde ehdokas löytö, koska se kylpee tarttumattomat syöpäsolujen ja viereisten mesoteelisolujen ja sisältää runsaasti tietoja, kuten kasvua, selviytymistä ja etäpesäkkeiden signalointi tekijät [8]. Vaikka Askites on tärkeä väline johtamiseen proteiinin biomarkkereiden löytö tutkimuksia, aivan kuten seerumi, se sisältää myös proteiineja poikki high dynamic range keskittyminen edellyttää eri fraktiointi tekniikoita, jotta voidaan määrittää alemman runsas proteiineja [9].

Tissue soluvälinesteessä (TIF) on toinen näyte, joka on saavuttanut kasvavaa huomiota alustana, josta ehdokas proteiini biomarkkereiden löytö kasvainkudoksen voidaan suorittaa. Tissue Kudosneste on proteiini rikas näyte lähde, joka on oletettu sisältävät erittyy, irtoa ja /tai effluksoidaan proteiineja kasvain ja lähialueiden strooman. Celis et al. oli ensimmäinen tutkia proteiinien rintasyöpä ja normaali TIF [10], jossa on osoitettu, että proteiinit tunnistetaan MS-pohjainen proteomiikan voidaan ulkoisesti validoitu kudoksessa microarray sisältää yli 70 rintasyöpä kudosnäytteitä [11]. Uudemmassa tutkimuksessa, MS-pohjainen proteomiikan työnkulku tunnistamiseksi differentiaalisesti runsaasti proteiineja munuaissolukarsinooma (RCC) osoittivat kohonneet enolaasin 2 (ENO2) ja trombospondiini-1 (TSP1) kasvaimen TIF. Nämä olivat myös todennettu läsnä ja korkeissa runsautta RCC potilaan seeruminäytteistä verrattuna valvoa seerumin [12]. Tämä tutkimus osoitti, että proteiinit löydettiin TIF hallussaan suuri alttius käännöksen seerumin perustuvissa määrityksissä.

Nykyisessä tutkimuksessa käytimme MS-pohjainen proteomiikkaa työnkulku tunnistaa kasvain tiettyjen proteiinien TIF ja vesivatsoja EOC potilailla. Niistä differentiaalisesti runsaasti proteiineja tunnistettiin näiden proksimaalisesta nesteet, peroxiredoxin 1 (PRDX1) osoitettiin olevan läsnä seerumissa ja osoittaa ELISA koholla lähes 6-kertainen papillaarinen vakavien EOC: lla potilaista verrattuna normaaliin /hyvänlaatuinen potilaille. Tutkimuksemme tuo lisätukea hypoteesia, että TIF on houkutteleva proksimaalinen biofluid johtamiseen ehdokas biomarkkereiden löytö lopulta varhaista havaitsemista EOC.

Tulokset

valkuaispitoisuus talteen TIF ja Askites visualisoidaan päätöslauselma 1D-PAGE-geelillä (kuva 1). Merkittävä määrä ihmisen seerumialbumiinia (HSA) oli mukana molemmissa näytteissä, vaikkakin alemmilla tasoilla TIF kuin askites. Tämä korkeammalle HSA vesivatsanes- on merkittävä, sillä se lisää tehokkaasti yleistä dynamiikan proteiinipitoisuus korkeimman (esimerkiksi HSA) ja alin runsas proteiineja tässä näytteessä tyyppiä. Suurempi esitys Proteomi ilmeiseksi TIF näytteessä hitaamman kokonaisvaikutuksesta HSA proteiinin kokonaismäärästä. Koska eri osuus HSA näissä kahdessa näytteessä, tutkimustemme hyödynnetään affiniteetti-pohjainen immunodepletion protokolla poistaa klassisen erittäin runsas seerumin proteiineihin kunkin näytteen. Tämä menetelmä johti tehokkaan poiston useita erittäin runsas proteiineja esitetty TIF näytteestä (kuvio 1), mikä mahdollistaa täydellisemmän vertailun proteomic sisällön vatsaonteloon sekä TIF seuraava LC-MS /MS-analyysi.

(A) edustaja vatsaonteloon sekä TIF näytteet havainnollistaa läsnäollessa runsaasti proteiinia lajien molemmissa näytteissä sekä monimutkaisuus korjattu TIF näyte. (B) Edustava TIF näyte ennen ja jälkeen immunodepletion kanssa Agilent MARS Hu-14 immunoaffiniteettikolonnilla.

Pariksi askitesta ja TIF kerättiin neljällä potilaalla (taulukko 1), immunodepleted ja vastaavat proteiinin määrät kukin ratkaista 1D-PAGE. Kukin geeli kaista leikattiin viiteen yhtä viipaleiksi, geelissä pilkottu ja peptidi-digestiot analysoitiin LC-MS /MS kahtena, jolloin 10274 tunnistettujen proteiinien kaikissa näytteissä, mukaan lukien tunnistetaan yhden peptidin. Päätimme asettaa poissulkuun niin, että ainoastaan ​​ne proteiinit edustaa kaksi spektrin laskee tai useamman kaikkien neljän potilaan näytteitä joko TIF tai askites säilyivät vertailukauden Proteomiikan data-analyysi, joka johti tietokokonaisuus koostuu 569 ja 171 proteiineja tunnistettu kaikissa neljässä TIF ja askites potilaan näytteitä, vastaavasti (taulukko S1, raaka LC-MS /MS-tiedot tiedostot ladata Tranche datataltiosta at https://proteomecommons.org/tranche/). Kekseliäisyyttä Pathway Analyysi merkinnästä solun lokalisoinnin proteiinien tunnistettiin paljasti suuren rikastamisen cytoplasmic- ja ydin- peräisin olevia proteiineja TIF suhteessa askites (kuva 2). Ei ole yllättävää, suuri osa solunulkoisen proteiinit olivat läsnä askites verrattuna TIF. Ekstrasellulaariproteiineista hallinnut yhteistä proteiinit tunnistettu, jossa valtaosa on peräisin askites. Subsellulaarisista proteiinit yleensä peräisin TIF; nämä proteiinit olivat korkeammat pitoisuus TIF vähentyneeseen tasoilla askites. Tämä vastakkaisia ​​ero alkuperä solun lokalisointi viittaa siihen, että TIF sisältää proteiineja heijastava matkapuhelinverkon kokoonpanon kudoksen microenvironment.

Tissue soluvälinesteessä ja askitesta proteiineja, jotka tunnistettiin kahden tai useamman spektrin laskee kussakin biofluid, kunnioittavasti, analysoitiin solujen eristämisen kanssa kekseliäisyyttä Pathway Analysis (IPA). Lähes 85% TIF proteiineista peräisin sytoplasmassa ja /tai tumassa. Askites oli seerumin kaltaista proteiinia profiilin 66% proteiineja on solunulkoisen alkuperää.

Niistä proteiinit tunnistettu, peroxiredoxin 1 (PRDX1) tunnistettiin suuremmassa määrin (keskimäärin 13 kertainen suurempi spektrinen count) TIF- näytteissä verrattuna askites. Olemme vahvisti läsnäolo ja ero runsaasti PRDX1 sekä biospecimens Western blot (kuvio 3). Vaikka PDRX1 rutiininomaisesti tunnistettu ja tutkittu kudoksessa, etsimme onko runsaasti PRDX1 kohosi seerumia naiivi kohortin (esim ei kuulu alkuperäiseen löytö sarja) 20 potilasta vaiheen II tai korkeampi EOC (taulukko 2) verrattuna potilaisiin, joilla on hyvänlaatuinen munasarjojen patologia (taulukko 3). Keskimääräinen taso PRDX1 Näistä 20 EOC potilaille määritettiin olevan 26,0 ng /ml (± 9,27 SEM) ja 4,19 ng /ml (± 2,58 SEM) päässä 16 ohjaus /hyvänlaatuisten munasarjojen populaatioiden mitattuna käyttämällä kaupallisesti saatavilla PDRX1 ELISA. Tämä arvioitu 6-kertaa suurempi runsaasti PDRX1 seerumissa EOC potilaista havaittiin olevan tilastollisesti merkitsevä (kuvio 4, p = 0,0188).

Peroxiredoxin 1 todentaminen kautta western blot analyysi askites (A) ja TIF ( B) esitetään yhteenveto tuloksista saatu spektrin count (SC) arvot mitataan nestekromatografia-tandem massaspektrometria analyysi näistä näytteistä.

Serum 20 potilaalla diagnosoitiin Stage IIC tai korkeampi munasarjasyöpä ( tapausta) ja seerumin 20, joilla on hyvänlaatuinen munasarjojen patologia (valvonta) arvioitiin PDRX1 läsnäolon ja määrän ELISA. Tilastollisesti merkittävä ero keskiarvon PDRX1 tasot (p = 0,0188) näissä kahdessa ryhmässä.

Keskustelu

Esitys vatsan täyteläisyyttä, varhainen kylläisyyden , lantion massa ja askites on tyypillistä naisten EOC valitettavasti kuitenkin, nämä oireet usein läsnä vain silloin, kun tauti on edennyt vaiheeseen. Seulonta toteamiseksi varhaisessa vaiheessa munasarjasyöpä, kun 5 vuoden pysyvyys on lähes 70-90% [13], on vielä kehitettävä. Alhainen ilmaantuvuus alkuvaiheessa EOC esteenä laajan tutkimuksen taudin synnyssä, joten suurin osa tutkimus tapahtuu myöhäisessä vaiheessa tauti. Havaitsimme naiset kehittyneitä EOC ja kerätään pariksi vatsaonteloon sekä TIF munasarjojen syöpäkasvainten jokaisesta potilaan Proteomiikan analyysiä. Askitesta ja TIF oli immunodepleted erittäin runsas proteiineja ennen LC-MS /MS-analyysi. Meidän tietojen mukaan vatsaonteloon sekä TIF satama hyvin erilaisia ​​proteiiniprofiilit. Askites hallussaan proteomic ominaisuudet ovat samankaltaiset kuin seerumin, se koostuu suureksi osaksi peräisin olevien proteiinien ekstrasellulaarisen osaston. Kääntäen, TIF koostuu proteiineista edustavampia kudoksen mikroympäristön, ja monet ovat peräisin eri osastoista soluista.

Meidän analyysi, 569 proteiinit tunnistettiin yhteistä kaikkien potilaiden TIF näytteet, verrattuna 171 proteiineihin yleisesti tunnistettu vastaava askitesnesteessä. Näistä PRDX1 todettiin runsaammin TIF- näytteissä verrattuna askites. TIF on arveltu sisältävän korkeamman suhteellisen pitoisuus valkuaista passiivisin /entsymaattisella irtoaminen, eritys, ulosvirtausta ja apoptoosin. Samalla tavalla, nämä samat prosessit todennäköisesti aiheuttaa ”vuoto” joidenkin tai kaikkien näiden samojen proteiinien verisuonistoon ja ääreisverenkierrosta. Havaittu korkeammalle PRDX1 TIF- suhteessa Askites ei ole odottamatonta varten pakosarja biologically- ja analyyttisesti liittyvistä syistä. Biologiselta kannalta, TIF on suurelta osin peräisin kasvaimen mikroympäristössä ja siten todennäköisesti sisältävät suurempia suhteelliset pitoisuudet kasvaimen /stroma-proteiineja verrattuna muihin reuna kehon nesteiden, kuten askites ja seerumin. Tämän seurauksena ero dynaaminen alue proteiinikonsentraatio näiden kehon nesteiden alentaa tehokkaasti dynaamisen alueen proteiinipitoisuus askitesta ja /tai seerumin verrattuna TIF. Näistä syistä sisällyttäminen proksimaalisen nesteiden, kuten TIF proteomic-pohjainen biomarkkereiden löytö tutkimuksiin edustaa uutta strategiaa korjuu irtoa ja erittyvien proteiinien proksimaalisesti kasvainkudoksen microenvironment joiden läsnäolo on todennäköisesti heijastuu seerumin samasta potilaista.

PRDX1 on läsnä kudosta johdettua proteiinia tunnetaan toiminta antioksidanttina. PRDX1 pääasiassa suojaa soluja DNA-vaurioita ja mahdolliset mutageneesi muodostamalla alkoholit seuraavan entsymaattisen reaktion kanssa reaktiivisten happilajien (ROS), kuten vetyperoksidi ja hydroksyyliradikaaleja [14]. PRDX1 on erityisen kiinnostava, koska sen tiedossa kohonnut geeniekspression lukuisissa syövissä [15], [16]. PRDX1 läsnäolo karsinoomissa liittyy apoptoosin inhibitio, mikä tarkoittaa lisääntynyt tuumorin eloonjäännin kannalta [16], [17], [18]. Vaikka tietoa on rajoitetusti suhteessa PRDX1 ja sen vaikutuksia EOC synnyssä ja kliinisiin tuloksiin, Chung et al. ovat ehdottaneet, että PRDX1 ilmaisua EOC on prognostinen indikaattori laski selviytymisen [19]. Lisäksi useat muut peroxiredoxin perheenjäsenet (PRDX2-6) arvellaan liittyvän munasarjojen Karsinogeneesin jossa nämä on raportoitu olevan koholla rajatapaus munasarjakasvaimia verrattuna hyvänlaatuisia munasarjan vaurioita [20]. Maxwell et al. hiljattain tehty laajamittainen proteomiikka-analyysi laser microdissected kohdun limakalvon syövän kudosta ja totesi, että jopa vaihe I endometriumin syöpiä oli kohonneita osallistuvien proteiinien oksidatiivista stressiä ja tulehdusta verrattuna normaaliin kohdun limakalvoon. PRDX1 kuului oksidatiivisen stressin proteiineja, jotka vahvistivat selvästi kohonneet I vaiheessa kohdun limakalvon syöpä kudoksen [21]. Esillä olevassa tutkimuksessa, läsnäolo PRDX1 TIF ja vesivatsoja munasarjasyöpä potilaiden varmistettiin western blot olevan koholla runsaasti TIF verrattuna askites. Perustuu oletukseen, että osajoukko TIF proteiinien edustavat irtoa /erittyy proteiineja microenvironment ja siten voivat olla vaihdettavia, ja näin ollen havaittavissa, sisällä ääreisverenkierron, yritimme määrittää tasot PRDX1 veren seerumin käyttäen erittäin validoitu, kaupallisesti saatavilla ELISA. Nämä tulokset osoittivat, että potilaat, joilla on edennyt EOC oli 6-kertainen kohonnut taso PRDX1 niiden seerumissa verrattuna potilaisiin, joilla on normaali /hyvänlaatuinen munasarjat (p = 0,0188).

Vaikka PRDX1 ei ole raportoitu aikaisemmin olevan läsnä seerumin, joka perustuu olettamukseen, että jotkut (jos ei kaikki) TIF proteiinit ovat vaihdettavissa ääreisverenkierron käytimme kohdennettua ELISA lähestymistavan varmista ensin tämän hypoteesin ja toissijaisesti kysyä onko tämä proteiini on erilaisesti runsaasti seerumia potilaalla on EOC verrattuna yksilöiden hyvänlaatuinen patologiat munasarjoissa. Me rajoitettu ulkoisen validointi PRDX1 seerumin koska kohonneet PRDX1 on jo osoitettu munasarjasyövän kudoksessa Western blot ja immunohistokemia [19]. Ihannetapauksessa paneelit valittujen biomarkkereiden todennäköisesti tarvitaan, jotta voidaan kehittää validoitu seulontatesti varhaisen EOC havaitsemiseen [22], meidän ainoa kohde oli osoittaa mahdollisuutta kääntää MS-pohjainen proteomic löydöt TIF kohdennettuihin seerumin perustuvissa määrityksissä, vuonna Tällöin PRDX1. Myönnämme, että emme voi päätellä, että PRDX1 on riittävän herkkä ja spesifinen pidettävä seulonta biomarkkeri EOC perustuu rajoitetun validointi näytteen kohortissa kuitenkin, että se on havaittavissa ja koholla munasarjasyövän Potilasseerumin verrattuna täsmäsi hyvänlaatuinen valvonta antaa lisää tukemalla todisteita hypoteesin, että proteiini ehdokkaita löydetty TIF ovat todennäköisesti läsnä ääreisverenkierron.

Materiaalit ja menetelmät

Potilasvalinta

Tutkimus toteutettiin alle University of Pittsburgh Institutional Review Board hyväksyi protokollan # IRB0406147. Kaikki näytteet saatiin tarkistuksen jälkeen kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen ja poistui tunnistamattomiksi sen keräämisen ja analysoidaan anonyymisti. Intraoperatiivisia kokoelma kasvain, vatsaonteloon sekä seerumin olivat potilailta, joilla epäillään munasarjasyöpä aikaan alkuperäisen leikkauksen ja esiintyi 30 minuutin kuluessa kirurginen poisto. Kaikki potilaat olivat kemoterapiaa ja sädehoitoa naiivi. Potilaat, joilla on kehittynyt EOC (vaihe IIC tai enemmän) ja patologian todistettu papillaarisen serous munasarjasyöpäpotilailla alatyyppi valittiin näytteen käsittelyyn ja analysointiin. Seerumin käytetään validoinnissa PRDX1 oli peräisin sisäisestä tietokannasta de-tunnistaa potilaat luokiteltiin EOC tai hyvänlaatuinen munasarjojen patologia. Kliinis tiedot näistä potilaista rajoittuvat niiden gynecologic historiaa.

Näytteiden käsittely

käsittelyyn TIF, noin 0,25-0,50 grammaa märkää-kudoksen painoa saadaan leikkauksen välittömästi pestiin kahdesti 5 min 5 ml: lla fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS). Kudoksia inkuboitiin sitten 1 ml: ssa PBS: ssä 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Inkubaation jälkeen kudos poistettiin ja TIF Supernatantti selkeytettiin Soluroskien sentrifugoimalla 1000

x g

2 min ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Askites näytteet alikvootteihin mikrosentrifugiputkille, selvitettävä 1000

x g

2 min ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Kokonaisproteiinia TIF ja askites näytteet kvantifioitiin bikinkoniini- (BCA) määritys (Pierce, Rockville, IL). Näytteet väkevöitiin käyttäen Microcon-3 keskipako- suodattimia (Millipore, Billerica, MA) mukaan valmistajan ohjeiden ja altistettiin immunodepletion 14 runsaimmin seerumin proteiineja käyttäen Multiple Affinity Removal System (Hu-14, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) valmistajan protokollan, korvaten 4 × näytelaimennuksen puskuri sijasta 1 × puskuri estämään mahdollisia näytteen menetyksistä laajoja pitoisuuden TIF ja askites. Köyhdytettyä TIF ja askites näytteet vaihdettiin 25 mM ammoniumbikarbonaattia ja proteiini kvantitoitiin BCA-määrityksellä. Vastaavat verinäytteet kerättiin punainen-top vacutainer laskimoiden keräysputkien (Becton, Dickson and Company, Franklin Lakes, NJ), sallittu hyytyä huoneenlämmössä 45 min, sentrifugoitiin 2200

x g

10 min seerumin keräämiseksi ja alikvootteihin ja varastoitiin -80 ° C: ssa.

In-gel Digestion Protocol

Kymmenen mikrogrammaa kutakin askites tai TIF erotettiin 1D-PAGElla ja geeli kaistoja visualisoitiin Coomassie sininen. Viisi geeli nauhat leikattiin irti tasaisesti kaikki näytteet ja väri poistettiin 25 mM ammoniumbikarbonaattia, 50% ACN. Geelipalat pelkistettiin 10 mM DTT: n kanssa 56 ° C: ssa 1 h, mitä seurasi alkylointi 55 mM jodiasetamidilla 45 min huoneenlämpötilassa pimeässä. Näytteet pilkottiin trypsiinillä yön yli ja peptidit uutetaan geelistä bändejä 70% ACN /5% muurahaishappoa. Kaikki näytteet lyofilisoitiin kuivaksi ja suspendoitiin uudelleen 0,1% trifluorietikkahappoa ennen analyysiä nestekromatografialla (LC) -tandem massaspektrometriaa (MS /MS).

massaspektrometria ja bioinformatiikka- analyysit

peptidi uutteita jokaisesta näytteestä geelivyöhykkeestä analysoitiin kahtena rinnakkaisena Dionex Ultimate 3000 nestekromatografiajärjestelmään (Dionex, Sunnyvale, CA) kytkettynä verkossa kautta sähkösumutusionisaatiota lineaarinen ioniloukku (LTQ) MS (ThermoFisher Scientific, San Jose, CA). Erotukset suoritettiin käyttämällä 75 pm id x 360 um od × 20 cm pitkä kvartsilasikapillaarikolonnissa sarakkeet (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ), joka pakattu talo 5 um, 300 Ä: n huokoskoko C-18 piidioksidi-sidottu stationäärifaasin (Jupiter, Phenomenex, Torrance, CA). Seuraavassa esimerkissä ruiskuttamalla C-18-esikolonnin (Dionex), kolonni pestiin 3 min liikkuva faasi A (2% asetonitriiliä, 0,1% muurahaishappoa), virtausnopeudella 30 ul /min. Peptidit eluoitiin käyttäen lineaarista gradienttia 0,33% liikkuvaa faasia B (0,1% muurahaishappoa asetonitriilissä) /minuutti 130 minuutin ajan, sitten 95% B: tä vielä 15 minuuttia, kaikki tasaisella virtausnopeudella 200 nl /min. Sarake Pesu suoritettiin 95% B 15 min kaikkien analyysien jälkeen kolonni tasapainotettiin uudelleen liikkuvaan faasiin Tunnetun myöhemmin injektiot. MS oli toiminut data riippuva MS /MS-tilassa, jossa jokainen täysi MS scan seurasi seitsemän MS /MS skannaa suoritetaan lineaarisen ioniloukku (LIT), jossa seitsemän runsain peptidimolekyylipaino- ioneja valittiin törmäyksen aiheuttaman dissosiaatio (CID) käyttäen normalisoidun törmäysenergia 35%. Tiedot kerättiin laajalla esiaste ioni valintajohtimeen alue (

m /z

375-1800) ja dynaaminen syrjäytyminen kykeni minimoida tarpeeton valikoiman peptidejä aiemmin valittu CID.

Tandem massaspektrit etsittiin vastaan ​​UniProt ihmisen proteiini tietokantaan (11/09 release) Euroopan bioinformatiikan instituutin (https://www.ebi.ac.uk/integr8) käyttäen SEQUEST (BIOWORKS 3.3.1, ThermoFisher Scientific). Hakuehtoja vahvistettiin seuraavasti: peptidit etsittiin täysin trypsiinisoija jopa kahdella jäi pilkkomiskohdat, dynaaminen muutoksia metioniinin hapetuksen (15,9949 Da) ja kysteiini carboxyamidomethylation (57,0215 Da), esiaste massa toleranssi 1,4 Da ja ioniosan toleranssi 0,5 Da . Peptidit katsotaan laillisesti henkilöllisyytensä kun he täyttivät erityisiä varaustila ja proteolyyttisen riippuva ristikorrelaatio tulokset 1.9 [M + H]

1 +, 2,2 [M + 2H]

2+ ja 3.5 [M + 3H]

3+, ja vähintään delta korrelaatio 0,08. Väärä peptidi löytö oli alle 2% määritettiin etsimällä ensisijainen tandem MS data käyttäen samoja kriteereitä vasten houkutuslintuna tietokanta, jossa proteiini sekvenssit ovat päinvastaiset [5]. Tulokset suodatetaan edelleen käyttäen ohjelmistoa itse kehittänyt, ja erot proteiinia runsaasti näytteiden välillä saatiin yhteen koko CID tapahtumia, jotka johtivat varmasti tunnistaa peptidi tietylle proteiinin liittymistä kaikissa näytteissä (spektrin laskenta) [23].

Western blot -analyysi

Kymmenen ug kokonaisproteiinia kustakin näytteestä erotettiin 1D-PAGE käyttäen 4-12% bis-Tris tai 7% Tris-asetaatti NuPAGE geelit (Invitrogen Carlsbad, CA) ja siirretään Immobilon-PSQ PVDF-kalvoille (Millipore) käyttäen Invitrogen Xcell II Blot Module mukaan valmistajan protokollaa. Primaarinen vasta-aine oli rotan monoklonaalinen anti-ihmis-PRDX1 (Abcam, Cambridge, MA) ja sekundäärinen vasta-aine oli piparjuuriperoksidaasiin konjugoidulla aasin anti-rotta (Abcam Cambridge, MA), esiabsorboitiin seerumin kanssa. Membraanit blokattiin 0,5% kuivattua maitoa TBS 0,1% Tween-20 (TBST) laimentimena. Primaarista vasta-ainetta levitettiin 1:1000 TBST ja kalvoja inkuboitiin yli yön 4 ° C: ssa. Membraanit pestiin TBST: llä ja niitä inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen (1:75,000 laimennos) 1 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa. Kalvot pestiin TBST: llä ja inkuboitiin Pico Super Signal ECL (ThermoFisher) 5 minuutin ajan ennen kemiluminesenssi altistumista.

Peroxiredoxin 1 ELISA

tasot runsaasti PRDX1 potilaiden seerumeista mitattiin peroxiredoxin 1 Human ELISA-kittiä (BioVendor, Candler, NC) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Seeruminäytteistä munasarjasyöpäpotilaalle ja hyvänlaatuisia patologian laimennettiin 1:03 ennen mittausta ja määritettiin samanaikaisesti ja kahtena kappaleena. Laimennussarjoja PRDX1 standardin analysoitiin rinnakkain seeruminäytteistä. Optinen tiheys piirrettiin standardi PRDX1 pitoisuudet tuottaa standardikäyrän mukaan valmistajan protokollaa. Ei-parametrinen Wilcoxonin-summa testiä käytettiin määrittämään merkitystä erotuksen mediaani PDRX1 määrät potilaiden seerumeista hyvänlaatuinen munasarjojen patologia vs. potilailla, joilla on edennyt EOC. Nollahypoteesina oli, että tiedot kaksi havainto ryhmää ovat riippumattomia näytteitä sama jatkuva jakaumat yhtä mediaanit vastaan ​​vaihtoehtoinen hypoteesi, että ryhmät eivät ole yhtäläisiä mediaanit. Merkitsevyys hyväksytään kaksisuuntaista p-arvo 0,05.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Proteiinit tunnistettiin neljä epiteelin munasarjasyöpä potilaalle Hyväksytty vatsaonteloon sekä kudosten soluvälinesteessä (TIF). Luettelo proteiinin tunnisteiden (rivit) ovat tiivisti spektrin määrä (arvot) analyyseistä vatsaonteloon sekä TIF, joista kukin erotettiin denaturoivalla geelielektroforeesilla, josta viisi geelistä bändit olivat geeli pilkottiin ja analysoitiin kahtena nestekromatografia-tandem massaspektrometrialla.

doi: 10,1371 /journal.pone.0025056.s001

(XLS) B

Kiitokset

kirjoittajat kiittää Christopher Vanselow, Maria VANDAMME ja Agilent Technologies varten 4 × puskuri A käytetty sanamuoto MARS ehtyminen protokollaa. Kirjoittajat myös kiittää arvokasta päässä nimettömän erotuomareiden koko vertaisarvioinnin tämän artikkelin.