Krooninen sairaus

tiivistelmä

tunnistaminen estävien aineiden STAT-3, sytosolinen transkriptiotekijä mukana aktivoitumisen eri geenien osallistuvat kasvaimen etenemistä on lupaava strategia syövän kemopreventiossa. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet vaikutusta ravinnon astaksantiinin on JAK-2 /STAT-3 signalointia 7,12-dimetyylibents [a] antraseenia (DMBA) indusoima hamsterin posken (HBP) karsinogeneesin malli tutkimalla mRNA: ta ja proteiinin ilmentymistä JAK /STAT-3 ja sen kohdegeenien. Kvantitatiivinen RT-PCR, immunoblottauksen ja immunohistokemiallinen analyysit paljastivat, että astaksantiini lisäravinteiden estää tärkeimmistä tapahtumista JAK /STAT signalointi erityisesti STAT-3 fosforylaation ja myöhempää tumaansiirtymiseen STAT-3. Lisäksi astaksantiini vaimentua ilmaus STAT-3 kohdegeenien osallisena solujen lisääntymisen, invaasio ja angiogeneesi, ja pienempi mikrovaskulaarinen tiheys, estäen syövän etenemiseen. Molecular telakointi analyysi vahvisti estovaikutus astaksantiinin on STAT signalointi ja angiogeneesiä. Soluviljelmäkokeita kanssa endoteelisolujen linjan ECV304 toteen roolia astaksantiinin tukahduttamaan angiogeneesiä. Yhdessä meidän tiedot tarjoavat merkittäviä todisteita siitä, että ruokavalion astaksantiini estää kehittymistä ja etenemistä HBP karsinoomien läpi estämällä JAK-2 /STAT-3 signalointi ja sen loppupään tapahtumia. Siten astaksantiinin joka toimii voimakas estäjä kasvaimen kehittymistä ja etenemistä kohdentamalla JAK /STAT signalointi voi olla ihanteellinen ehdokas syövän kemopreventiossa.

Citation: Kowshik J, Baba AB, Giri H, Deepak Reddy G, Dixit M, Nagini S (2014) Astaksantiini Estää JAK /STAT-3: n signaloinnin kumota Cell Proliferation, Invasion ja Angiogeneesi on hamsteri malli Oral Cancer. PLoS ONE 9 (10): e109114. doi: 10,1371 /journal.pone.0109114

Editor: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 08 syyskuu 2014; Julkaistu: 08 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Kowshik et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustusta Department of Biotechnology, New Delhi, Intia alle 7. FP Indo-EU: n yhteisen Collaborative Project ”FUNCFOOD”. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Signal anturin ja aktivaattori transkription 3 (STAT3) proteiini on piilevä sytoplasminen transkriptiotekijä, joka lähettää signaalit solun pinnalta tumaan, kun on aktivoitu sytokiinien ja kasvutekijöiden [1]. Erityisesti, interleukiini-6 (IL-6) tai epidermaalisen kasvutekijän (EGF) edistää fosforylaation STAT3-proteiinin Janus-kinaasi ja aktivoitu STAT3 muodostaa homodimeeri, joka siirtyy tumaan, jossa se säätelee geenien ilmentymistä kriittinen normaalille soluprosessien kuten solujen kehitystä, erilaistumista, lisääntymistä, eloonjääntiä, angiogeneesiä, ja immuunijärjestelmän toimintaa [2] – [6].

Aberrant aktivoituminen JAK /STAT3 signalointi on dokumentoitu monenlaisissa ihmisen kasvaimissa, mukaan lukien hematopoieettiset maligniteetit ja kiinteiden kasvainten kuten pään ja kaulan, rinnan, ja eturauhasen syöpiä [7], [8]. Konstitutiivinen STAT3 aktivointi edistää proliferaatiota ja kasvaimen synnyssä ilmentymistä moduloimalla erilaisia ​​geenejä tarvitaan kasvainsolujen eloonjäämisen, proliferaatiota ja angiogeneesiä, sekä invaasiota ja etäpesäkkeiden ja yleisesti viittaa huonoon ennusteeseen [9] – [11]. Siten JAK /STAT3 signalointi on keskeinen rooli kasvainten synnyssä ja pidetään tärkeänä terapeuttinen kohteena uusille lääkekehityksen.

tunnistaminen aineita, joiden kohteena STST3 molekyyli on todennäköisesti olla merkitystä syövän kemopreventiossa. Useita ravinnon antioksidantteja kirjataan estää kasvaimen kehitystä kohdistamalla STAT3 signalointiverkon [12] – [15]. Astaksantiini, ei-esiasteina karotenoideja esiintyy lähinnä mikrolevästä, sienet, kasvit, meri elintarvikkeet ja jotkut linnut, kuten flamingoja ja viiriäisen on voimakas antioksidantti [16]. Astaksantiini oli havaittu olevan korkein antioksidantti joukossa karotenoidit ja sitä käytetään laajasti ehkäisyssä ja erilaisten sairauksien hoidossa [17]. AXT on myös osoitettu omaavan anti-inflammatorisia ja syöpälääkkeiden ominaisuudet [18], [19].

Viime aikoina olemme osoittaneet, että ruokavalion täydentäminen AXT indusoi luontaiset apoptoosia estämällä PI3 /Akt, MAPK, NF-KB ja Wnt /β-kateniinin signalointi piirien 7,12-dimetyylibents [a] antraseenia (DMBA) aiheuttaman hamsterin posken sisään (HBP) syövän synnyn malli [20]. Nämä havainnot houkutus voimme oletuksen, että AXT joka indusoi apoptoosin voivat estää vastakkaista prosessia solujen lisääntymistä estäen peräkkäinen mutaatioiden, jotka johtavat lopulta tuumorin invaasio ja angiogeneesi. Lisäksi AXT aiheuttama inaktivaatio transkriptiofaktoreiden NF-KB ja β-kateniinin, keskuksista vuonna kasvaimia synnyttävän signalointi voisi myös vaikuttaa JAK /STAT3 reitin. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että ruokavalion AXT estää syövän etenemisen perustuu kumoamisesta JAK /STAT3 reitin ja sen loppupään tavoitteet sykliini D1, MMP-2, -9, ja VEGF HBP karsinogeneesissä mallia. Lisäksi AXT vähentynyt mikrovaskulaarinen tiheys, joka on keskeinen rooli kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen. Soluviljelmäkokeita kanssa endoteelisolujen linja ECV304 tehtiin myös perustelemaan roolin astaksantiinin tukahduttamaan hypoksian angiogeneesissä.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit

Akryyliamidi, naudan seerumin albumiini (BSA), bromifenolisinistä, 7,12-dimetyylibents [a] antraseenia (DMBA), hydroksiurea, 2-merkaptoetanoli, natriumdodekyylisulfaatti (SDS) N, N, N ’, N’ – tetrametyleenidiamiinia (TEMED) ja Trizol hankittiin Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA. Astaksantiini hankittiin Bio-Real, Ruotsi. DMEM-F12 -alustassa, antibioottiliuosta koostuu penisilliiniä ja streptomysiiniä ja Alamar Blue olivat HiMedia Labs, Mumbai, Intia. Naudan sikiön seerumia Etelä-Amerikan alkuperää oli GIBCO, Invitrogen, NY, Yhdysvallat. Virta SYBR Green PCR Master Mix saatiin Applied Biosystems, Kalifornia, USA. Vasta-aineita IL-6, GAPDH, sykliini-D1, PCNA, p21, MMP-2, MMP-9, TIMP-2, RECK, VEGF, VEGFR2, HIF1α, ostettiin Santa Cruz Biotechnology, USA. pJAK-2

tyr1007 /1008, JAK-2, Pstat-3

tyr705, STAT-3 ja histoni (H2B-) vasta-aineet ja BrdU, STAT-3

tyr705 yhteensä sykliini D1 ja pVEGFR2

tyr1175 ELISA olivat Cell Signaling Technology, USA. CD-34-vasta-aine hankittiin Novocastra, Saksa. Matrigel oli BD Biosciences, USA. Kaikki muut käytetyt reagenssit olivat analyyttistä laatua.

Eläimet ja etiikka selvitys

Kahdeksasta kymmeneen viikkoa vanha mies syyrianhamstereille painavat 100-110 g, käytettiin tässä tutkimuksessa. Eläimet saatiin Central Animal House, Annamalai yliopisto, Intia. Eläimiä pidettiin neljä häkkiin ja varustettu standardin pelletti- ruokavalion ja vettä ad libitum. Eläinten terveyttä seurattiin päivittäin tutkimuksen aikana. Protokollat ​​että eläinkokeiden hyväksyi institutionaalisten Animal eettinen komitea, Annamalai yliopisto ja johdetaan ohjeiden mukaisesti vahvistamat komitean tarkoitus ohjaus ja valvonta on eläinkokeiden (CPCSEA).

Hoito aikataulu

eläimet satunnaistettiin koe- ja kontrolliryhmissä ja jaettu 4 ryhmään 5 eläintä kutakin. Ryhmässä 1, oikea bukkaalisen pussit hamstereiden maalattiin 0,5% DMBA parafiiniöljyn kolme kertaa viikossa 14 viikon [21]. Ryhmä 2 eläimet saivat lisäksi DMBA, perusruokavaliolla, joka sisälsi 15 mg /painokilo astaksantiinin [20], [22]. Ryhmä 3 eläimet saivat astaksantiinia (15 mg /kg) yksinään 14 viikon ajan. Ryhmä 4 eläimet saivat Perusruokavalioon yksin ja toimi käsittelemätön kontrolli. Koe lopetettiin 14 viikkoa, ja kaikki eläimet tapettiin katkaisemalla kaula yön yli paastoamisen jälkeen. Posken sisään kudokset otettiin heti jaettu ja käsitellään jaettavaksi kussakin kokeessa.

Soluviljely

ECV 304 solulinjaa käytettiin ja viljeltiin DMEM peruselatusaineessa 10% naudan sikiön seerumia antibiooteilla. ECV304 on endoteelisolujen joka on peräisin ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC: t) kautta, spontaani muutos [23]. Verrattuna ensisijainen HUVEC kulttuureja, käyttö ECV304 solujen on käytännöllinen etu, koska nämä solut ilmenee pa- ja toistettavissa mahdu in vitro angiogeneesin ovat siis ihanteellinen valinta soluviljelmässä perustuu angiogeneesin määrityksiä [24]. Konfluentit viljelmiä ECV304 soluja jatkoviljeltiin ja ylläpidetään CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Sillä Matrigel määritystä soluja pidettiin DMEM peruselatusaineessa 4% naudan sikiön seerumia. Sillä hypoksinen kunnossa, soluja inkuboitiin hypoksia kammiossa 1% O

2.

RNA ja kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR

kokonais-RNA posken sisään kudosten uutettiin käyttämällä Trizol-reagenssia edellä kuvatulla tavalla [25]. RNA-pitoisuus määritettiin optinen tiheys aallonpituudella 260 nm (käyttämällä OD260 yksikköä, joka vastaa 40 ug /ml RNA). 5 ug eristetty kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin cDNA: ksi reaktioseos, joka sisältää 4 pl 5 x-reaktiopuskuria, 2 ui dNTP-seosta (10 mM), 20 yksikköä RNaasi-inhibiittoria, 200 yksikköä linnun myeloblastoosiviruksen (AMV ) käänteistranskriptaasia ja 0,5 ug oligo (dT) aluketta (Promega, WI, USA) kokonaistilavuudessa 20 ui. Reaktioseos inkuboitiin 42 ° C: ssa 60 minuuttia ja reaktio pysäytettiin kuumentamalla 70 ° C: ssa 10 min. CDNA säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka.

Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin käyttäen Virta SYBR Green master mix mukaisesti valmistajan ohjeiden avulla StepOne Plus thermocycler (Applied Biosystems). -1 × PCR master mix, 2,5 ui kutakin cDNA: ta lisättiin 20 ul: n lopullisessa tilavuudessa. PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 95 ° C 5 min, 40 sykliä 30 s 95 ° C: ssa, 30 s 52-60 ° C: ssa (joka perustuu kohde), ja 60 s 72 ° C: ssa. Määrälliseen kertainen muutos verrattuna kontrolliin laskettiin käyttäen vertailevaa Ct menetelmä, jossa Ct on syklin numero, josta fluoresenssin ensin ylittää kynnysarvon. Ct-arvot kutakin näytettä, joka saadaan vähentämällä arvot GAPDH Ct kohdegeenistä Ct-arvo. Spesifisyys Saatu PCR-tuotteiden varmistettiin sulamiskäyrillä.

Western blotting

Proteiinit uutettiin kudosnäytteestä käyttäen lyysipuskuria, joka sisälsi 62,5 mM Tris (pH 6,8), 10% SDS, 5% 2-merkaptoetanolia, 10% glyserolia ja bromifenolisinistä. Nuclear ja sytoplasminen jakeet erotettiin kuten ovat kuvanneet Legrand-Poels et al. [26]. Yhtä suuri määrä proteiinia uutteet ladattiin SDS-PAGE ja Erotetut proteiinit siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja. Blotteja inkuboitiin sitten 2 tuntia 1X PBS: ssä, joka sisälsi 5% rasvatonta kuivamaitoa. Sitten membraanit tutkittiin ensimmäisen ja toisen vasta-valmistajan ohjeiden mukaisesti. Proteiinit visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssidetektiolla reagenssit (Sigma). Densitometria suoritettiin IISP tasaisella alustalla skanneri ja kvantitatiivisesti Total Lab 1.11 ohjelmisto.

ELISA

tasot Pstat

tyr705 yhteensä sykliini D1 ja pVEGFR2

tyr1175 määritettiin sandwich-ELISA kit (Cell Signaling Technology, USA) mukaan valmistajan ohjeiden.

immunohistokemia

Parafiini upotettu kudosleikkeet deparaffinised, vedettömät ja altistettiin antigeenille hakemiseen ja endogeeninen peroksidaasi esto. Sitten leikkeitä inkuboitiin Pstat-3 kanin monoklonaalista, PCNA, MMP-2: n ja VEGF kanin polyklonaalisia vasta-aineita huoneen lämpötilassa 3 tuntia. Objektilasit pestiin TBS ja sitten inkuboitiin biotiinilla leimatun sekundaarisen vasta-aineen ja sen jälkeen streptavidiini-biotiini-peroksidaasi (Dako, Carprinteria, CA, USA) 30 minuuttia kulloinkin huoneen lämpötilassa. Immunopresipitaattia visualisoitiin käsittelemällä 3,3′-diaminobentsii- ja counterstaining hematoksyliinillä. Kudokset valokuvattiin käyttämällä käännettyä fluoresenssimikroskooppia (Leica Microsystem Vertrieb GmbH, Wetzler, Saksa) kiinnitetty digitaalikamera DFC295.

mikrovaskulaarisia tiheys (MVD) B

mikrovaskulaarisia tiheyttä arvioitiin immunohistokemiallisella värjäyksellä anti-CD34-vasta-ainetta. Alueet korkeimman uudissuonittumisen sijaitsivat ja kuvat jää vähintään viisi eri aloilla. Mikrosuonten laskettiin kaksi riippumatonta tutkijat ja tiedot edustettuina alusten määrä /näkökenttä.

Molecular telakointi

Molecular telakointi tehtiin käyttäen Schrödingerin Suite 2013. astaksantiinia oli noudetaan pubchem (www .ncbi.nlm.nih.gov /pccompound) ja proteiineja STAT-3 ja VEGF haetaan proteiini tietopankin kanssa ATE ID: 3CWG ja 3V2A vastaavasti. Reseptorin grid sukupolvi ja ligandin telakointi tehtiin käyttämällä Glide Xp telakointi algoritmia.

Alamar Blue määritys

Solujen elinkelpoisuus mitattiin Alamar Blue määritys [27]. Lyhyesti, Alamar Blue (resatsuriinin natrium- suolaa Himedia) liuotettiin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen, pH 7,4, jotta varasto 5 mg /ml ja lopullisessa konsentraatiossa 0,1 mg /ml soluviljelmän elatusaineessa. Resatsuriini on redox-indikaattori, joka mittaa vähentää ympäristön solun vähentämällä erittäin fluoresoiva resorufiini. Astaksantiinia eri pitoisuuksilla (5, 10, 20, 50, 100, 200 ja 400 uM) lisättiin soluihin ja 24 tunnin kuluttua, Alamar sinistä väriainetta lisättiin ja levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h. Värin muutos seurattiin kolorimetrisesti 595 nm ja 570 nm arvioida hapettuneen vs. pelkistetyt muodot vastaavasti reagenssista käyttäen multi-mode plate reader.

BrdU määritys

Solulisääntyminen analysoitiin mittaamalla DNA-synteesin bromideoksiuridiinia (BrdU) entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) kit (Cell Signaling Technology, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 1 x 10

4-solut ympättiin 96-kuoppaisen mikrolevyn, ja viljeltiin tai ilman astaksantiinia (50 uM) 24 tunnin ajan. Sitten solut leimattiin BrdU: ssa 6 tuntia. Kiinnityksen jälkeen solut inkuboitiin 100 ui anti-BrdU-vasta-ainetta 60 minuutin ajan. Pesun jälkeen 100 ui sekundääristä vasta-ainetta lisättiin ja inkuboitiin 30 minuuttia, sitten 100 ui substraattia (tetrametyylibentsidiini), lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja levyjä inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 minuutin ajan. Absorbanssi 450 nm: ssä mitattiin ELISA-lukijalla.

migraatiokokeessa

Yhtenäisiä yksikerroksiset ECV 304 solua 24 kuoppalevyillä raaputettiin 200 ul pipetin kärki ja inkuboitiin normoxic ja hypoksinen kunnossa ja ilman 50pM astaksantiinia. 5 mM hydroksiurea lisättiin myös inhiboida soluproliferaatiota. Solut valokuvattiin mikroskoopilla suurennuksella 4x 0 ja 24 tuntia. [28]

Matrigel-putken muodostumiseen määrityksessä

Pre-jäähdytettiin 96-kuoppaisilla levyillä päällystettiin 80 ui Matrigel ( BD) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa puolen tunnin ajan. Sama määrä soluja (20,000 /kuoppa) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja ilman hypoksinen kunnossa ja läsnä ja poissa astaksantiinia (50 uM) ja inkuboitiin CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa 14 tuntia. Kuvat otettiin vuonna vähintään viisi eri alojen ja data edustaa lopulta kuin putkien määrä /näkökenttä [29].

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen epäparametrisia Mann-Whitneyn testi (Tilastot Direct, Yhdistynyt kuningaskunta)

in vivo

ja Tukey posthoc testi

in vitro

kokeita. Todennäköisyys arvo on alle 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Kasvaimen esiintymistiheys

kasvaimen esiintymistiheys on raportoitu aikaisemmassa tutkimuksessa [20]. Lopussa koejakson kasvain ilmaantuvuus oli 100% ja keskiarvo kasvain taakka 82,25 mm

3 hamstereille maalattu DMBA (ryhmä 1). Lisäravinteena astaksantiinia (15 mg /kg) ja DMBA maalattu hamstereita ei aiheuttanut brutto kasvaimia posken sisään ja histologinen tutkimus paljasti vain lieviä liikakasvua. Hamstereille syötettiin astaksantiinia yksin ja kontrolliryhmissä, epiteelin oli normaali, ehjä, ja jatkuva.

Astaksantiini estää JAK /STAT signaloinnin hillitsemällä fosforylaation STAT-3

STAT 3 on konstitutiivisesti aktivoitu monenlaisia ​​maligniteettien, ensin analysoitiin mRNA: n ilmentymisen JAK-2 ja STAT-3 kvantitatiivisen RT-PCR-analyysillä. Tuloksemme paljasti, että lisäravinteena astaksantiinin vähensi mRNA ilmaisun avainmolekyylejä mukana JAK /STAT signalointi verrattuna DMBA maalattu eläimillä (kuvio 1A). Merkittäviä eroja ei havaittu eläimillä, joita hoidettiin astaksantiini yksin verrattuna kontrolliin. Edelleen tutkia mekanismia, jolla astaksantiinia säätelee JAK /STAT signalointi, seuraavan kerran määritetty proteiinin IL-6, JAK-2, pJAK-2, STAT-3 ja Pstat-3 western-blottauksella. Olemme havainneet, että paikallinen käyttö DMBA huomattavasti ilmaisut näiden geenien verrattuna kontrolliin. Samanaikainen ravinnon anto astaksantiinin inhiboi JAK /STAT signaloinnin vähentämällä tasoja IL-6, JAK /STAT fosforyloidun muodot ja sen jälkeen translokaation tumaan (kuvio 1 B 1C). Tämä vahvistettiin myöhemmin alentunut taso Pstat

tyr705 (ELISA) in AXT hoidetussa ryhmässä (kuvio 1 D). Immunohistokemiallinen värjäys vahvisti myös, että astaksantiini lisäravinteen aiheutti merkittävää laskua ilmaus Pstat-3 verrattuna DMBA maalattu eläimillä (kuvio 1 E).

(keskiarvo ± SD, n = 3). A. transkriptioekspressiokuvio taso JAK-2 ja STAT-3 eri koeryhmään määritettynä kineettistä. Tiedot ovat keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

♣ p 0,05 vs. kontrolli. * P 0,05 versus DMBA. B. Edustavia immunoblot-analyysillä. Proteiininäytteet (100 ug /kaista) päätti SDS-PAGE koettimena vastaavien vasta-aineiden. GAPDH käytettiin kuormituksen valvonta sytosoliin ja koko kudoshomogenaateista. Histoni H2B käytettiin latauskontrollina ydin- proteiineja. Fosforyloituu proteiinit normalisoidaan niiden fosforyloitumaton muodossa. C. Densitometri analyysi. Proteiinin ilmentyminen ohjaus lysaateille kolmen määrityksen nimettiin 100% kaaviossa. Kukin pylväs proteiinin ilmentymistä kolmen määrityksen.

♣ p 0,05 vs. kontrolli. * P 0,05 versus DMBA. D. tasot Pstat

tyr705 (ELISA). E. edustaja mikrovalokuvia immunohistokemiallisella värjäyksellä Pstat-3 valvonta- ja koe-eläimillä (20X).

Astaksantiini estää solujen lisääntymistä, invaasiota ja angiogeneesin kautta estämällä JAK /STAT-reitin

STAT-3 aktivointi säätelee geenien transkriptiota osallistuvat solujen proliferaation, invaasio ja angiogeneesi, tutkimme seuraavaksi vaikutus astaksantiinin on merkkiaineiden solujen lisääntymisen. Lisäravinteena astaksantiinin vähensi mRNA ja proteiini ilmentymä sykliini D1 ja PCNA. Lisäksi AXT lisääntynyt ydinvoiman p21 ilmaus suhteessa sytosolifraktion. Lisäksi AXT lisäravinteiden väheni yhteensä sykliini D1 taso (ELISA) verrattuna DMBA ryhmään (kuva 2). Ei kuitenkaan tilastollisesti merkittäviä eroja ei havaittu välillä hamstereita ruokitaan astaksantiini yksin ja kontrolliryhmään.

(keskiarvo ± SD, n = 3). A. transkriptioekspressiokuvio taso p21, sykliini D1 ja PCNA eri koeryhmään määritettynä kineettistä. Tiedot ovat keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

♣ p 0,05 vs. kontrolli. * P 0,05 versus DMBA. B. Edustavia immunoblot-analyysillä. Proteiininäytteet (100 ug /kaista) päätti SDS-PAGE koettimena vastaavien vasta-aineiden. GAPDH käytettiin kuormituksen valvonta sytosoliin ja koko kudoshomogenaateista. Histoni H2B käytettiin latauskontrollina ydin- proteiineja. C. Densitometri analyysi. Proteiinin ilmentyminen ohjaus lysaateille kolmen määrityksen nimettiin 100% kaaviossa. Kukin pylväs proteiinin ilmentymistä kolmen määrityksen.

♣ p 0,05 vs. kontrolli. p 0,05 versus DMBA. D. tasot yhteensä sykliini D1 (ELISA). E. edustaja mikrovalokuvia immunohistokemiallisella värjäyksellä PCNA valvonta- ja koe-eläimillä (20X).

Voit selvittää, onko estyminen JAK /STAT-reitin astaksantiinia vaikeuttaa hyökkäyksen, me seuraavaksi analysoineet MMP-2 MMP-9 ja niiden inhibiittorit. Antaminen ravinnon Astaksantiini moduloidun mRNA ja proteiinin ilmentyminen näiden molekyylien verrattuna ryhmään 1 eläimille. Edelleen vahvistaa, että astaksantiini säätelee matriisimetalloproteinaaseja, tutkimme myös proteiinin MMP-2: n immunohistokemiallinen analyysi. Tuloksemme osoittivat, että astaksantiinin hallinto merkittävästi vähensi MMP-2 verrattuna ryhmään 1 eläimiä. Toisaalta, ei havaittu merkittäviä eroja eläimiin, astaksantiini yksin verrattuna kontrolliin (kuvio 3).

(keskiarvo ± SD, n = 3). A. transkriptioekspressiokuvio tason MMP-2, MMP-9 ja TIMP-2 eri koeryhmään määritettynä kineettistä. Tiedot ovat keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

♣ p 0,05 vs. kontrolli. * P 0,05 versus DMBA. B C. Edustavia immunobloteissa ja pylväsdiagrammin, jotka edustavat proteiinin MMP-2, MMP-9, TIMP-2 ja RECK varten vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

♣ p 0,05 vs. kontrolli. * P 0,05 versus DMBA. D. edustaja mikrovalokuvia immunohistokemiallisella värjäyksellä MMP-2 in ohjaus ja koe-eläimillä (20X).

Koska uudissuonittuminen on merkittävä rooli kasvaimen kasvussa ja on yksi tärkeimmistä alavirran tapahtumia laukaisi JAK /STAT-reitin, tutkimme vaikutus astaksantiinin angiogeneesiin. Kuten kuviossa 4 on esitetty, lisäravinteena astaksantiinin merkittävästi moduloidun VEGF: n ilmentymistä, VEGFR2 ja laski HIF-1α tumaansiirtymiseen verrattuna DMBA maalattu eläimiä. Lisäksi AXT lisäravinteen laski tasolle pVEGFR2 (ELISA). Immunohistokemiallinen värjäys vahvisti myös vähentynyttä ilmentymistä VEGF hamstereille syötettiin astaksantiini verrattuna DMBA maalattu eläimiä. Merkittäviä eroja ei havaittu eläimillä, joita hoidettiin astaksantiini yksin verrattuna kontrolliin.

(keskiarvo ± SD, n = 3). A. transkriptioekspressiokuvio taso HIF-1α, VEGF ja VEGFR2 eri koeryhmään määritettynä kineettistä. Tiedot ovat keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

♣ p 0,05 vs. kontrolli. * P 0,05 versus DMBA. B. Edustavia immunoblot-analyysillä. Proteiininäytteet (100 ug /kaista) päätti SDS-PAGE koettimena vastaavien vasta-aineiden. GAPDH käytettiin kuormituksen valvonta sytosoliin ja koko kudoshomogenaateista. Histoni H2B käytettiin latauskontrollina ydin- proteiineja. C. Densitometri analyysi. Proteiinin ilmentyminen ohjaus lysaateille kolmen määrityksen nimettiin 100% kaaviossa. Kukin pylväs proteiinin ilmentymistä kolmen määrityksen.

♣ p 0,05 vs. kontrolli. * P 0,05 versus DMBA. D. tasot pVEGFR2

tyr1175 (ELISA). E. edustaja mikrovalokuvia immunohistokemiallisella värjäyksellä VEGF valvonnan ja koe-eläimillä (20X).

AXT laski HIF-1α ja VEGF ilmaisu, keskeisten toimijoiden uudissuonittumista, meidän vieressä pyrittiin määrittämään, ovatko esto näiden molekyylien AXT on vaikutusta verisuoniston mittaamalla microvascular tiheys. DMBA maalattu eläimet osoittivat korkeaa verisuonitus ja keskiarvo MVD 185 verrattuna kontrolliin eläimiin. Ruokavalionsa täydennykseksi AXT vähensi merkittävästi alusten verrattuna DMBA maalattu eläimiä, osoittaa antiangiogeeninen potentiaali astaksantiinin (kuva 5).

. Edustavia mikrovalokuvia mikrovaskulaaristen tiheyden ohjaus ja koe-eläimillä (40X). B. Pylväsdiagrammi edustavat alusten määrää vähintään kolmen erillisen kokeen.

♣ p 0,05 vs. kontrolli. * P 0,05 versus DMBA. C. Pylväsgrafiikka edustaa aluksen pituus vähintään kolmen erillisen kokeen.

♣ p 0,05 vs. kontrolli. p 0,05 versus DMBA.

edelleen varmistamiseksi esto STAT-3 signalointi ja angiogeneesin astaksantiinin, suoritimme molekyylitason telakka -tutkimus astaksantiinin STAT-3 ja VEGF. AXT havaittiin sitoutuvan STAT-3: n ja VEGF kanssa telakka pisteet -5,081 ja -2,94 vastaavasti. AXT vuorovaikutuksessa dimerointi paikalle STAT-3 muodostamaan vetysidoksia Met 1482, Glu 1523, Arg 1593 ja Asn 539 ja vuorovaikutuksessa VEGF kautta vetysidoksen Asp 41 jäännöksen (kuva 6).

. Edustaa AXT muoto vetysidoksen kanssa Met 1428, Glu 1523, Arg 1593 ja Asn 538 STAT-3. B. Edustaa AXT muodossa vetysidoksen ASP 41 VEGF.

testaamiseksi antiangiogeenisen potentiaali astaksantiinin

in vitro

käytimme ECV 304 solua. Angiogeneesi on monimutkainen prosessi, johon solujen lisääntymistä, muuttoliike, ja putken muodostumiseen. Ensin määritettiin olevan astaksantiinin pitoisuus, jossa se estää elinkelpoisuus ECV-solujen 50%: lla (IC

50). Käytimme vaihtelevia pitoisuuksia astaksantiinin 5-400 uM. Huomasimme, että astaksantiini ei vähennä elinkelpoisuutta ECV 304 solua 50% pitoisuuksilla testattu. Solujen elinkelpoisuus oli 100% jopa 50 uM astaksantiinia, kuten on esitetty kuviossa 7; Siksi astaksantiinia 50 uM käytettiin lisäkokeita. Testata, onko astaksantiinin estää endoteelisolujen, teimme Alamar blue määritys ja BrdU-määritystä. Hypoksia indusoi soluproliferaatiota ei vaikuttanut astaksantiinia vahvistanut molemmat BrdU määrityksen sekä Alamar Blue määritys (kuva 7).

. IC

50 vastinetta astaksantiinin on ECV304 soluissa (Alamar Blue määritys). B. Vaikutus astaksantiinia (50 uM) happivajaus indusoi soluproliferaatiota (Alamar sininen määritys). * P 0,05 versus normoksia. C Vaikutus astaksantiinia (50 uM) happivajaus indusoi solujen lisääntymisen (BrdU määritys). * P 0,05 versus normoksia.

Migration endoteelisolujen on yksi keskeisistä vaiheista angiogeneesin ja metastaasin; Siksi seuraavan kerran määritti astaksantiinin muuttoliikettä. Tuloksemme osoittivat, että 50 uM astaksantiini estivät merkittävästi endoteelisolujen migraation. Kuten kuviossa 8, hypoksisia ECV solut vaelsivat noin 437 um 24 tunnin kuluttua; kun taas AXT käsitelty hypoksisia soluja siirtää vain noin 192 um, joka osoittaa anti-muuttoliike potentiaalia astaksantiinin.

A B. Edustavia mikrovalokuvia migraatiokokeessa valvonta- ja hypoksinen ECV solut 0 h ja 24 h (4X). C. Pylväsgrafiikka edustavat etäisyyttä muuttivat vähintään kolmen erillisen kokeen.

♣ p 0,05 versus normoksia. p 0,05 versus hypoksia.

Pääasiallinen vaihe angiogeneesin aikana on muodostumista ja yhdistämällä putket tuottamien endoteelisolujen muodostamalla kompleksi verkosto aluksia, joten seuraavan kerran määritti AXT on putken muodostusta suorittamalla Matrigel putken muodostumiseen määrityksessä. Hypoksisissa kunnossa, oli merkittävä kasvu putkien määrä muodostuu sekä putken pituus verrattuna normoxic kunnossa. Astaksantiini hoito vähensi merkittävästi putkien ja putken pituus hypoksisissa kunnossa. Merkittäviä eroja ei havaittu soluissa, joita käsiteltiin astaksantiinia alle normoxic kunnossa (kuva 9).

. Edustavia mikrovalokuvia Matrigel putken muodostumisen määritys, valvonta ja hypoksinen ECV soluja (4X). B. pylväskaavio edustaa no. putkien vähintään kolmen erillisen kokeen.

♣ p 0,05 versus normoksia. * P 0,05 versus hypoksia. C. Pylväsgrafiikka edustavat putken pituus vähintään kolmen erillisen kokeen.

♣ p 0,05 versus normoksia. * P 0,05 versus hypoksia.

Jos haluat tietää mekanismia, jolla AXT estää maahanmuutto- ja putken muodostumiseen endoteelisolujen, olemme analysoineet ilmentymisen angiogeneesiä molekyylien normoxic ja 4 h, 8 h, ja 16 h hypoksinen ECV soluja. Immunoblot-analyysi paljasti kasvua HIF1α lausekkeen 4 h, joka säilyi jopa 8 tuntia hypoksia. VEGF ja MMP-2: n ilmentymisen kasvanut 8 h lähtien ja pysyi till 16 h. Hoidon AXT vähentää hypoksian indusoiman ekspression lisääntymisen näiden molekyylien (kuvio 10).

A B. Edustavia immunobloteissa ja pylväskaavio edustaa proteiinin ilmentymistä HIF-1α, VEGF ja MMP-2 vähintään kolmen erillisen kokeen. * P 0,05 versus hypoksia.

Keskustelu

Useat tutkimukset ovat dokumentoitu, että poikkeava aktivaatio STAT-3 signalointireitti edistää neoplastisen muutoksen oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, ja ovat vahvistaneet tilas- 3 on lupaava kohde syövän hoidossa [11], [30], [31]. Kehittäminen aineita, jotka kohdistuvat STAT-3, jossa on riittävä teho ja kasvaimen selektiivisyys on osoittautunut vaikeaksi tehtäväksi. Tutkimukset muiden ja meidän on ilmoittanut, että phytochemicals ovat osallisina syövän kemopreventiossa modu- piirit poikkeavaa syövässä [32] – [35]. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että astaksantiini inhiboi JAK /STAT-3 signalointireitti sekä sen tavoitteen geenien HBP karsinooma malli.

toiminnot STAT-3-proteiinin riippuu lähinnä sen fosforylaatioon ja subsellulaarisista lokalisointi. Stimuloimattomissa soluissa, STAT-3-proteiinit ovat läsnä inaktiivisessa muodossa sytosoliin. Aktivointi STAT-3 tapahtuu kautta fosforylaation sen Tyrosiinitähteen sytokiinin tai kasvutekijän reseptorin signalointi. Fosforyloitua STAT-3 sitten dimerisoituu ja siirtyy tumaan, jossa se sitoutuu IFN-gamma-aktivoitu päällä (GAS) DNA, ja aktivoi kohdegeenien transkription [12]. STAT-3 havaitaan olevan konstitutiivisesti aktiivisia eri karsinoomat ja eston STAT-3 aktivaatio korreloi tukahduttaminen pahanlaatuisia soluja sekä

in vitro

ja

in vivo

[36], [37] . Tulokset Tämän tutkimuksen todistamaan, että astaksantiini lisäravinteiden kumoaa konstitutiivisen aktivaation STAT-3 estämällä sen fosforylaation ja myöhempää tumaansiirtymiseen. Lisäksi vuorovaikutus AXT kanssa dimeroinnin sivuston STAT-3 molekyyli- telakka tutkimukset validoi inhibitio STAT-3: AXT. Astaksantiini on osoitettu estävän rotan maksasolusyövän CBRH-7919-solujen moduloimalla JAK /STAT-3 signaloinnin [38].