Krooninen sairaus

tiivistelmä

Yhdistetty kohdistamista MAPK ja PI3K signaalireaktioteissä syöpä voi olla tarpeen optimaalisen terapeuttisen aktiivisuuden. Tukeakseen kliinisissä tutkimuksissa yhdistelmähoitoa, 3′-deoksi-3 ’- [

18F] -fluorothymidine ([

18F] -FLT) otto mitattiin positroniemissiotomografia (PET) arvioitiin ei-invasiivisia korvike vaste biomarkkereiden prekliinisissä malleissa.

in vivo

antituumoriteholla ja PK-PD ominaisuudet MEK estäjän PD 0325901 ja PI3K estäjä GDC-0941, yksin ja yhdessä, arvioitiin HCT116 ja HT29 paksu- ja peräsuolisyövän ksenografti- kasvain hiiret, ja [

18F] -FLT PET tutkittu hiirillä HCT116 ksenograftit. Dual kohdentaminen PI3K ja MEK aiheuttama merkittävä tuumorin kasvun estäminen

in vivo

ja parannettu antituumorivaikutus ennustettiin [

18F] -FLT PET skannaus 2 päivän kuluttua hoidon. Farmakodynaamiset analysoidaan käyttämällä yhdistelmä PI3K-estäjä GDC-0941 ja MEK-inhibiittori PD 0325901 paljasti, että lisääntynyt tehokkuus liittyy parannettu inhibition fosforylaation ERK1 /2, S6 ja 4EBP1, verrattuna tilanteeseen, jossa joko ainoana lääkkeenä, ja ylläpidetään esto AKT fosforylaation. Farmakokineettiset tutkimukset osoittivat, että ei ollut selvästi PK vuorovaikutus kahden lääkkeen. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että yhdistelmä PI3K ja MEK estäjät voivat aiheuttaa merkitsevää tehoa ja osoittaa ensimmäistä kertaa, että [

18F] -FLT PET voidaan korreloida parantunut tehokkuus yhdistettyjen PI3K ja MEK estäjähoidon.

Citation: Haagensen EJ, Thomas HD, Wilson, Harnor SJ, Payne SL, Rennison T, et al. (2013) Enhanced

In vivo

aktiivisuus Yhdistelmä MEK ja PI3K Inhibitor korreloi [

18F] -FLT PET paksu- ja peräsuolisyövän Vieraslajisiirteen Kasvainten hiirille. PLoS ONE 8 (12): e81763. doi: 10,1371 /journal.pone.0081763

Editor: Seema Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 heinäkuu 2013; Hyväksytty 16. lokakuuta 2013 Julkaistu: 10 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Haagensen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: HDT, IW, SJH, SLP, TR, KMS, RJM ja DRN rahoittaa Cancer Research Iso-Britannia (CRUK) Drug Discovery, Imaging and Medicinal Chemistry koulutusohjelmat (C240 /A15751 ja C29821 /A10348) EJH oli Medical Research Council (MRC) CASE Award tohtorikoulutettava tukee UCB Celltech, Slough, UK. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kaikki Kirjoittajat julistaa ole eturistiriitoja merkitystä sisällöstä paperia lukuun ottamatta David R. Newell kuka on neuvottelukunnan Wilex AG Board. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan jakamisesta saatekirje tiedot ja materiaaleja.

Johdanto

Lukuisat pienmolekyylisalpaajilla erityisiä signaalitransduktioreaktioteiden on kehitetty; erityisesti PI3K reitti, suuri selviytymisen reitti, ja MAPK-reitin, merkittävä mitogeeninen polku, on kohdistettu syövän. Kuitenkin yksittäinen aine kliininen aktiivisuus näiden estäjien on yleensä ollut vaatimaton, ja siksi yhdistelmät arvioidaan parhaillaan [1]. Monet yhdistelmiä PI3K ja MAPK inhibiittorit ovat osoittaneet lupaavia aktiviteetti

in vitro

mutta joitakin vaikuttavia tuloksia on nähty

in vivo

.

Koska yksittäisen edustaja, pan PI3K estäjä GDC-0941 on vaatimaton prekliinisissä

in vivo

tehoa, joissa annoksesta riippuvaa toimintaa annosalueella 25-150 mg /kg /päivä U87MG glioblastooma ksenograftimallia [2]. Sen jälkeen, annosta 75-150 mg /kg on osoitettu johtavan kasvaimen kasvun inhibition alueella ihmisen -tuumoriksenografti mallit mukaan lukien kasvaimet, jotka ovat

PIK3CA

mutantti,

PTEN

null,

EGFR

mutantti tai villityypin, ja siihen liittyvä lasku AKT ja S6 fosforylaatio [2], [3], [4], [5], [6]. GDC-0941 näkyy lupaava prekliinisissä farmakokinetiikkaa on hyvä oraalinen biologinen hyötyosuus (78% hiirissä), sekä näiden tietojen perusteella ja ennustettu farmakokinetiikkaa ihmisellä [2], [7], on nyt käynnissä vaiheen I ja II kliinisissä kokeissa kuin yksin tai yhdessä kemoterapeuttisten aineiden [8], [9].

allosteric MEK estäjä PD 0325901 myös näytteillä lupaavia selektiivinen prekliinisen syöpälääkkeen tehoa

in vivo

yhtenä agentti, annosta 10-25 mg /kg aiheuttaa merkittävää kasvaimen kasvun estäminen ja monissa tapauksissa regressio, on alueella hiiren ja ihmisen -tuumoriksenografti malleja, mukaan lukien ne, jotka olivat

BRAF

tai

KRAS

villityypin tai mutantti [6], [10], [11], [12], [13], [14]. Kasvun estäminen saavutetaan suurilla PD 0325901 liittyi lasku ERK1 /2 fosforylaatio, joka oli voimassa, vaikka pienemmillä annoksilla 1,5-3 mg /kg PD 0325901 käytettiin; kuitenkin, nämä pienemmät annokset olivat vain kykenee aiheuttamaan vaatimattoman kasvaimen kasvun viivästyminen [6], [10], [11], [12]. Suun ja i.v. annoksia PD 0325901 osoitettiin olevan vertailukelpoinen hyötyosuus olivat myrkyttömiä 100 mg /kg, ja aiheutti annoksesta riippuvaisen inhibition ERK1 /2 fosforylaatio rotan maksassa ja keuhkoissa estämällä MEK [15]. Kuitenkin kliinisissä tutkimuksissa, että yksittäinen aine PD 0325901 liittyi silmän ja neurotoksisuus, kuten verkkokalvon laskimon tukkeuma [16], ja näin kliinisissä tutkimuksissa monoterapiana PD 0325901 on päättynyt [8].

MEK estäjä PD 0325901 näytti lupaavalta monoterapiana mutta osoitti myrkyllisyyttä kliinisissä tutkimuksissa, ja kasvaimen kasvun estäminen oli vaatimatonta kanssa PI3K estäjän GDC-0941 jopa suurilla annoksilla, nämä ja muut PI3K ja MEK-inhibiittorit ovat nyt tutkitaan kliinisesti yhdistelmänä tutkimukset [8]. Tätä varten PD 0325901 tutkitaan yhdessä PI3K /mTOR-estäjä PF-04691502, ja GDC-0941 on kliinisessä tutkimuksessa yhdessä MEK estäjän GDC-0973 [8].

in vivo

pre-kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että yhdistelmät PI3K ja MEK estäjien johdonmukaisesti johtaa parempaan tuumorikasvun eston verrattuna joko ainoana lääkkeenä, ja monissa tapauksissa aiheuttaa regressio erilaisissa ihmisen -tuumoriksenografti ja hiiri kasvainmuodoista joiden valikoima geneettinen tausta, myös ne, joilla

KRAS

,

BRAF

ja /tai

PIK3CA

mutaatioita, ja /tai

PTEN

poistot [6 ], [12], [17], [18], [19]. Lisäksi vastaukset havaittu yhdistelmähoidon olivat usein kestäviä, vaikka suhteellisen pieniä annoksia molempia estäjiä käytetään monissa tutkimuksissa. Yhdistelmä PI3K ja MEK estäjien on osoitettu vähentävän fosforylaatiota S6, AKT ja ERK1 /2 [12], [19], ja annostelua tutkimukset ovat paljastaneet pitkäaikainen vaikutukset muuhun markkereita leviämisen ja apoptoosin, kuten jatkuvaa laskua sykliini D1 ja kasvua Bim tasoja, jotka voivat olla osittain vastuussa parantuneesta vaste nähdään yhdistelmähoito [6], [19].

Farmakodynaamiset biomarkkerit MAPK ja PI3K koulutusjakso modulaatio, kuten edellä mainittujen lisäksi vaatia toistuvia invasiivisia koepaloja ja siten ehkä ole kliinisesti toteutettavissa. Lisäksi muutokset kasvaimen koon tai taudin eteneminen pysähtyi, mitattuna tilavuuden kuvantamismenetelmät kuten CT ja MRI, saattavat ilmaantua vasta useita viikkoja hoidon, mikä voi viivästyttää kliinisten päätöksentekoa ja mahdollisesti aiheuttaa potilaille epäasianmukaisesti jääneet tehottomiksi ja myrkyllisiä hoitoja pitkiä aikoja. Vastatakseen rajoitukset perinteisen tilavuudeltaan kuvantamisen, positroniemissiotomografia (PET) käytetään prekliinisissä tutkimuksissa ja kliinisissä kokeissa toiminnallisena korvikkeena vastaus kuvantamisen biomarkkereiden [13], [14].

fluoria modifioitu tymidiinianalogi, 3′-deoksi-3 ’- [

18F] -fluorothymidine ([

18F] -FLT) on PET radiotracer, jota käytetään havaitsemaan anti-proliferatiiviset vaikutukset, kuten kertymistä soluihin määritetään ilmaisusta ja entsyymin aktiivisuus tymidiinikinaasi 1 ja erityisiä nukleosidin kuljettajat, jotka molemmat ovat valvonnassa S-vaiheeseen solusyklin säätävät [13], [14], [20], [21], [22], [ ,,,0],23]. Lisäksi otto [

18F] -FLT on osoitettu korreloivan standardin leviämisen markkereita, kuten Ki67, TK1 ja BrdU otto [24], [25], [26], [27], [28] , [29]. Käyttämällä [

18F] -FLT PET, muutokset leviämisen verrattuna lähtötasoon on osoitettu erilaisissa ihmisen tuumoriksenograftien jo 18, 24 ja 120 tunnin ajan käyttäen joko yksittäisenä aineena GDC-0941 tai PD 0325901 [13], [14], [30], [31]. Lisäksi [

18F] -FLT PET on jo käytetty ennustaa tehokkuuden kemoterapiaa ja sädehoitoa [32], [33], [34] ja äskettäin 2 kliinisissä kokeissa on aloitettu MEK estäjän AZD6244 monoterapiana sisällyttämällä [

18F] -FLT PET [8], [35].

tavoitteena esitettyjen tutkimusten tässä raportissa oli selvittää, [

18F] -FLT PET voidaan käyttää korvike vastaus biomarkkeri yhdistetyn MEK ja PI3K estäjähoidosta, alkusoittona kliinisiä kokeita.

Methods

Ethics lausunto

Kaikki kokeet tarkistettava ja hyväksynyt Newcastle University (UK) eläinten hyvinvointi komitea, ja suoritettiin ohjeiden mukaisesti hyvinvoinnin ja eläinten käyttöä syöpätutkimuksessa [36] ja kansallisen lainsäädännön mukaisesti hanke lisenssin (PPL60 /4442) antama kuningaskunnan hallituksen sisäministeriön alle eläimet ( tieteellinen menettely) teko 1986.

Cell Lines Reagenssit

HCT116 ja HT29 ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän solut hankittiin ATCC: ltä (American Type Culture Collection). Kaikki solulinjat kasvatettiin RPMI-1640-alustassa (täydennetty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia, 1% (v /v) penisilliiniä (50 U /ml) – streptomysiini (50 mg /ml) ja 2 mM L -glutamine) ja vahvistettiin vailla mykoplasmakontaminaation säännöllisillä testauksen Mycoalert (Cambrex, Iowa, USA).

estäjät

MEK estäjä PD 0325901 oli ystävällisesti toimittanut UCB Celltech, Slough, Berkshire, UK. PI3K estäjä GDC-0941 oli joko syntetisoitiin talon [37] tai ostetaan Stratech Scientific Oy, Newmarket, Suffolk, UK. Kaikki erät GDC-0941 oli täysin tunnettu, käyttämällä tavanomaisia ​​kemiallisia analyysejä, osoitettiin olevan 99%, ja se tuotti biologiset tulokset sopusoinnussa aitouden yhdistettä. Molemmat lääkkeet suspendoitiin 0,5% hydroksipropyylimetyyliselluloosaa (w /v) ja 0,2% Tween 80 (v /v) steriilissä tislatussa vedessä (MCT).

Eläimet

Eläinkokeissa olivat kaikki suoritetaan käyttäen naispuolinen kateenkorvattomia CD1 karvattomia hiiriä (Charles River, Kent, Iso-Britannia), istutettu HCT116 tai HT29 ksenografteja (1 x 10

7 solua 50 ul mediassa ihonalaisesti oikeaan kylkeen), ylläpidetään ja käsitellään isolaattorit alle erityiset patogeenittomassa olosuhteissa.

Farmakokinetiikka (PK) ja Farmakodynaamiset (PD) Tutkimukset

Hiiret, HCT116 ihmisen tuumoriksenografteja saivat joko 1 mg /kg PD 0325901, 100 mg /kg GDC -0941 tai yhdistelmä 1 mg /kg PD 0325901 ja 100 mg /kg GDC-0941, ja otettiin verta sydänpunktiolla alle terminaali anestesian valituissa ajankohtina jälkikäsittely (0,25-24 tuntia, 3 hiirtä /ajankohtana). Verta kerättiin heparinisoituihin putkiin, ja plasma erotettiin ja säilytettiin -20 ° C: ssa kunnes analysoitiin. Kasvaimet poistettiin, jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa ennen PK ja PD-analyysit, kuten alla on kuvattu.

PK-analyysit, huumeiden uutettiin 60 ul: n näytteitä proteiini saostamalla 9 tilavuusosaa asetonitriiliä (MeCN). Näytteet sentrifugoitiin 3000 g: ssä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja 500 ui supernatanttia haihdutettiin kuiviin typpikaasussa 30 ° C: ssa käyttäen Zymark Höyrystin (Etu Life Sciences Limited, Cheshire, UK). Näytteet liuotetaan 100 ul: aan HPLC: n liikkuvaa faasia, jossa oli 40% asetonitriiliä ja 60% (v /v), 0,1% muurahaishappoa, pH 4,0 (v /v), ja 50 ui supernatanttia laitettiin 10 cm: Xterra Waters 186000436 C18 3,5 um (Waters, Hertfordshire, UK) varustettu linjassa suodattimen. Yhdisteet eluoitiin edellä liikkuvana faasina 1 ml /min käyttäen Waters Millennium Chromatography järjestelmän (Waters, Hertfordshire, UK). Analyyttien havaittiin UV-absorbanssilla 275 ja 315 nm, retentioajoilla 6,8-7,3 ja 3,9-4,3 minuuttia PD 0325901 ja GDC-0941, vastaavasti. Analysoitaessa lääkkeen tuumorikudoksessa, kasvaimet homogenoitiin 3 tilavuutta PBS: ää (w /v) ja 50 ul: n uutettiin 9 tilavuuteen MeCN, ja sentrifugoitiin, haihdutettiin, ja analysoitiin kuten edellä on kuvattu. Total (ilmainen ja proteiiniin sitoutuneen) lääkeaineen pitoisuudet määritettiin käyttämällä standardia käyriä (0,1-10 mikrog /ml, r

2 0,98 kaikissa tapauksissa) tuottamat uuttamalla yhdisteiden asianmukaisessa matriisissa Uuttamisen tehokkuus on 97% kaikille matriiseja. Parillista t testejä käytettiin vertaamaan eri hoitoryhmään ja erot ap arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

PD-analyysit, kasvaimet (2 4~2.5 mm

3 kpl) olivat eritellyt 1 ml PhosphoSafe ™ uuttoreagenssi (Merck Chemicals Ltd, Nottingham, Nottinghamshire, Iso-Britannia), joka sisältää proteaasiestäjäseostabletit (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA) valmistajan suositteleman laimennus käyttäen Medimachine ™ (BD Biosciences, Oxford, UK), sentrifugoitiin, ja supernatantti poistettiin ja analysoitiin Western-blottauksella. Proteiinit erotettiin Novex® 4-12% (p /p) Tris-glysiini geeleillä (Invitrogen Ltd, Renfrew, Paisley, UK) ja sähköllä Hybond C nitroselluloosakalvolle (GE Healthcare Life Sciences, Hatfield, Hertfordshire, UK). Kalvoja inkuboitiin fosfo-4EBP1 (Thr37 /46) (# 2855), fosfori-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) (# 4370), fosfo-Akt (Ser473) (# 4060) tai fosfo-S6 ribosomaalisen proteiinin ( Ser235 /236) (# 4858) monoklonaalisia vasta-aineita saadaan Cell Signalling Technology (New England BioLabs (UK) Ltd, Hitchin, Hertfordshire, UK). Vasta-aineen sitoutuminen havaittiin inkuboimalla HRP-konjugoitua vuohen anti-kanin polyklonaalista vasta-ainetta (Dako, Glastrop, Tanska). Blotit kehitettiin käyttäen Piercen ECL (tehostettu kemiluminesenssi) western blotting alustan (Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA), tai SuperSignal® West Dura jatkettu kesto alustan (Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA), ja Kodak röntgenfilmin ( geneettinen tutkimus instrumentointi Ltd, Braintree, Essex, UK) on MediPhot 937 elokuva kehittäjä (Colenta, Weiner Neustadt, Itävalta), sitten digitaalisesti skannattu.

määritys Anti-Kasvaimen Activity

Hiiret laakeri HCT116 tai HT29 ihmisen tuumorin ksenografteja jaettiin satunnaisesti hoitoryhmiin, jotta vältetään bias ja varmistaa ryhmien välisten yhdenmukaisuus, ja käsiteltiin sitten oraalisella letkuruokinnalla joko MCT ajoneuvon (10 ml /kg), 1 mg /kg PD 0325901, 100 mg /kg GDC-0941 tai niiden yhdistelmää 1 mg /kg PD 0325901 ja 100 mg /kg GDC-0941 kerran päivässä 14 päivää. Kasvaimen tilavuus seurattiin calliper mittauksesta yhtälöä

2 x

b Twitter /2, jossa

on lyhin ja

b

suurin. Tiedot esitetään mediaanin suhteellinen kasvainten (RTV), jossa kasvaimen tilavuus kunkin hiiren alkuperäisestä hoitopäivänä (päivä 0) annetaan RTV-arvo 1. aika RTV3 ja RTV4 kunkin kasvaimen laskettiin tavallisella pisteen käyrä 1000 segmentit käyttämällä GraphPad Prism-ohjelmiston (CA, USA). Mann Whitney U testejä käytettiin vertailla eri ryhmien eli ohjaus

verrattuna

kussakin testiryhmässä yksittäinen aineet

verrattuna

toisiaan, ja jokainen agentti

versus

niiden yhdistelmä. Erot ap arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

[

18F] -FLT PET Studies

Ennen hoitoa ja 2 päivän hoidon kuten edellä on kuvattu, hiiret, joilla HCT116 ihmisen tuumoriksenografteja (7-9 hiirtä /ryhmä) nukutettiin, kanyyli

kautta

niiden häntälaskimoon ja sijoitetaan altis kannan mittatilaustyönä lämmitetty sänky, joka piti kolme hiiriä kerralla kuluessa MOSAIC PET-kamera (Philips, Eindhoven, NL). [

18F] -FLT saatiin PETNET (PETNET, Nottingham, UK), ja radioaktiivisuus mitattiin käyttäen Capintec hyvin laskuri (Capintec, NJ, USA). Noin 10 MBq [

18F] -FLT annettiin laskimoon ja 1 tunnin dynaaminen PET skannaus suoritettiin, joka koostuu kymmenestä 1 minuutti, kuusi 5 minuutin ja kaksi 10 minuutin aikaväleillä. Hiiriä toipuivat skannauksen ja jatkoivat hoitoa varten tutkimuksen loppuajan. Aineisto analysoitiin Imalytics ohjelmistoa (Philips, Aachen, Saksa); 3D alue kiinnostava vedettiin noin kasvain ja standardoitu oton arvo (SUV) laskettiin jakamalla kudoskonsentraatio (MBq /ml) injisoidusta annoksesta (MBq) /g painoa. Mean SUV-arvot olivat sitten ajan funktiona, ja alue käyrän alla (AUC) ja prosentuaalinen muutos AUC suhteessa perustason skannata laskettiin. Parillista t testejä käytettiin vertaamaan päivä 2

verrattuna

perustason SUV AUC-arvot kunkin yksittäisen hiiren kussakin hoitoryhmässä ja eroja ap arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

farmakokinetiikkaa ja farmakodynamiikkaa PI3K ja MEK-inhibiittorit, yksittäisinä aineina ja yhdistelmässä vuonna HCT116 ihmisen tuumoriksenografteja

Yksi annos PK /PD-tutkimus suoritettiin käyttäen PI3K estäjä GDC-0941 ja MEK estäjä PD 0325901, yksittäisinä aineina ja yhdistelmässä vuonna HCT116 ihmisen -tuumoriksenografti kantavien hiirten, yli ajan kuluessa 0,25-24 tuntia. Pitoisuudet huumeiden plasmassa ja kasvainkudoksen mitattiin käyttäen HPLC: tä (kuvio 1 ja taulukko 1). Pitoisuudet GDC-0941 ja PD 0325901 plasmassa väheni yli 24 tuntia kerta-annoksen estäjän (kuvio 1). 10-kertainen lisäys GDC-0941 annoksen, eli 100

versus

10 mg /kg, saavutettiin plasman AUC-arvot, jotka olivat 7 kertaa suurempi. Kun kyseessä on PD 0325901, vertailukelpoinen annoksen suurentamista, eli 10

verrattuna

1 mg /kg, johti 15-kertainen AUC-arvo (taulukko 1). Pitoisuudet GDC-0941 ja PD 0325901 kasvaimen oli vaihtelevampi, ja tasot PD 0325901 olivat havaittavissa plasmassa 24 tuntia (havaitsemisraja: 100 nM) käsittelyn jälkeen 1 mg /kg ja kasvainkudoksessa osoitteessa kaikkina ajankohtina (havaitsemisraja: 0,4 nmol /g kasvaimen materiaalin tai 100 nM kasvaimen Homogenaatti laimennettiin nelinkertaiseksi). Kasvaimen GDC-0941 AUC-arvot (taulukko 1) osoittavat, että kyseessä oli 15-kertainen nousu AUC jälkeen 10-kertainen annos.

Plasma ja kasvain pitoisuudet PI3K estäjän GDC-0941 (GDC ) (A) ja MEK-inhibiittori PD 0325901 (PD) (B) mitattiin HPLC: llä näytteistä HCT116 -tuumoriksenografti-hiirille osoitettuina ajankohtina sen jälkeen, kun yhden po annos joko 100 mg /kg GDC-0941 yksinään, 1 mg /kg PD 0325901 yksinään tai yhdistelmä 1 mg /kg PD 0325901 ja 100 mg /kg GDC-0941. Data esitetään keskimääräinen pitoisuus 3 hiirtä kussakin ryhmässä ± keskivirhe. Vaakasuora katkoviiva osoittaa

in vitro

GI

50 pitoisuus (määritetty aiemmin [38]).

Mielenkiintoista, plasman AUC data viittaa siihen, että voi olla vaatimaton kasvu pitoisuuksien PD 0325901 plasmassa samanaikainen annostelu GDC-0941 (taulukko 1), ja vaikka tämä ero oli rajoitettu (2-3 kertaa), oli johdonmukaista ja tilastollisesti merkitsevä ero AUC PD 0325901 annosteltuna yksin 1 tai 10 mg /kg PD 0325901, tai samanaikaisesti 100 mg /kg GDC-0941 (p 0,01). GDC-0941 anto näytti myös vaikuttaa kasvaimen säilyttämisestä PD 0325901, jossa se voitiin mitata (eli sen jälkeen kun 10 mg /kg PD 0325901), koska oli taas tilastollisesti merkitsevää eroa kasvaimen AUC annon jälkeen 10 mg /kg PD 0325901 yksin tai samanaikaisesti 100 mg /kg GDC-0941 (p = 0,01). Kuitenkin, toisin kuin plasman tietoja, seuraavat yhdistelmähoito kasvaimen pitoisuudet sekä PD 0325901 ja GDC-0941 olivat pienemmät kuin ne, jotka seuraavat yhden aineella, kun havaittu merkittävää eroa. Näin parannettu antituumorivaikutus yhdistelmällä havaittu MEK ja PI3K-estäjien (katso alla) ei johdu farmakokineettisestä vuorovaikutus johtaa lisääntyneeseen kasvaimen huumeiden tasolle. Kaiken kaikkiaan PK tiedot osoittavat, että ei ollut merkitty farmakokineettisiä yhteisvaikutuksia (ts 3-kertainen muutos AUC), kun GDC-0941 ja PD 0325901 annettiin yhdistelmänä.

Kun kerta-annos 100 mg /kg GDC-0941, yksin tai yhdessä 1 mg /kg PD 0325901, pitoisuudet GDC-0941 plasmassa ja kasvainkudoksen johdonmukaisesti ylitti

in vitro

GI

50-arvo 1081 nM (määritetty aiemmin [38]) 6 tunnin aikana (kuvio 1A). Samoin kun kerta-annos 1 mg /kg PD 0325901, yksin tai yhdessä 100 mg /kg GDC-0941, pitoisuudet PD 0325901 plasmassa johdonmukaisesti ylitti

in vitro

GI

50-arvo 21 nM [38] ensimmäisten kuuden tunnin kuitenkin, tasot olivat havaittavissa plasmassa 24 tunnin ja kasvainkudoksessa kaikissa aikapisteissä (kuvio 1 B). Kuitenkin, koska toteamisraja PD 0325901 sekä plasmassa ( 100 nM) ja kasvainkudoksen ( 0,4 nmol /g) oli suurempi kuin

in vitro

GI

50-arvon (21 nM), PK tiedot eivät välttämättä tarkoita, että farmakologisesti aktiivinen lääkeainepitoisuudet ei saavutettu.

Vaikka 1 mg /kg PD 0325901, pitoisuudet olivat alle määritysrajan kasvain ( 0,4 nmol /g), tämä annos vähensi (1 tunti) ja täysin ablate (3 ja 6 tuntia) fosforylaatiota ERK1 /2, jossa on hyvin vähän talteenotto 24 tuntia. Kuten odotettua, ei ollut merkittävää vaikutusta PD 0325901 on AKT, S6 tai 4EBP1 fosforylaatiota (kuvio 2A). GDC-0941 100 mg /kg, oli riittävä aiheuttamaan vähentää fosforylaation AKT, S6 ja 4EBP1 yli ajan tietenkin tutkittu, mutta vähennys oli epätäydellinen ja laajuus inhibition vaihdella ryhmissä (kuvio 2B). Mielenkiintoista oli myös vähentää fosforylaation ERK1 /2 annoksen jälkeen 100 mg /kg GDC-0941. Yhdistelmä 1 mg /kg PD 0325901 ja 100 mg /kg GDC-0941 aiheutti aiemmin täydellisen inhibition ERK1 /2-fosforylaation, verrattuna hoitoon yhden aineen MEK-estäjä, ja suurempi inhibitio S6 ja 4EBP1 fosforylaation verrattuna hoidon ainoana lääkkeenä PI3K estäjä (kuvio 2C). Kuitenkin, ei ollut huomattavia eroja eston AKT fosforylaatio yhdistelmähoitoa verrattuna monoterapiana PI3K estäjähoidon.

Vaikutukset MAPK ja PI3K /AKT signaalintransduktioreitteihin jälkeen HCT116 -tuumoriksenografti kantavia hiiriä hoidettiin yhdellä po annoksella joko 1 mg /kg MEK inhibiittorin PD 0325901 yksinään (A), 100 mg /kg PI3K-estäjä GDC-0941 yksin (B) tai niiden yhdistelmää 1 mg /kg MEK inhibiittorin PD 0325901 ja 100 mg /kg PI3K-estäjä GDC-0941 (C). Jälkeen 0,25-24 tuntia, tuumorit poistettiin, ja lysaatit suoritettiin elektroforeesi, mitä seurasi Western-blottauksella käyttäen ilmoitettua fosfo-spesifistä vasta-ainetta. Sitten blotit riisuttu ja uudelleen koetettiin niitä vastaavat proteiinin vasta vahvistamaan yhtäläiset Proteiinilisäyksen. A-C edustaa näytteitä kolmesta hiirtä kussakin hoitoryhmässä.

tehokkuus PI3K ja MEK-inhibiittorit, yksittäisinä aineina ja yhdistelmässä, vuonna HCT116 ja HT29 ihmisen tuumoriksenografteja

tulosten perusteella PK /PD-tutkimuksessa tehoa 100 mg /kg PI3K estäjän GDC-0941 ja 1 mg /kg MEK estäjän PD 0325901 annetaan suun kautta, yksittäisinä aineina ja yhdistelmässä, arvioitiin HCT116 ja HT29 ihmisen -tuumoriksenografti kantavissa hiirissä (kuvio 3). Yksittäiset annokset PI3K ja MEK inhibiittorit valittiin olemaan equi-aktiivisia, jotta peili

in vitro

olosuhteet, joissa synergia oli aiemmin osoitettu näissä solulinjoissa [38]. Tässä tutkimuksessa hiiriä käsiteltiin päivittäin 14 päivää ja kasvainten tilavuudet mitattiin kolme kertaa viikossa. Kuviot 3A ja 3B osoittavat, että hoito 100 mg /kg GDC-0941 ja 1 mg /kg PD 0325901, yksin ja yhdessä, aiheutti kasvaimen kasvun viivästyminen verrattuna apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään kasvaimia, ja että kasvun viivästyminen oli voimakkaampaa yhdistelmähoidon. Lisäksi kehon painoa tarkkailtiin päivittäin arvioimiseksi siedettävyyttä hoidon, ja molemmat monoterapialla ja yhdistelmähoidot havaittiin olevan myrkyttömiä, eli painon ei laskenut alle 90%: n alkupaino (kuviot 3C ja 3D).

HCT116 (A, C, E) ja HT29 (B, D, F) tuumoriksenograftien käsiteltiin joko ajoneuvon hallinnan, 1 mg /kg MEK inhibiittorin PD 0325901 ja 100 mg /kg PI3K estäjä GDC-0941 yksinään tai 1 mg /kg MEK inhibiittorin PD 0325901 ja 100 mg /kg PI3K-estäjä GDC-0941 yhdistelmänä, po kerran päivässä 14 päivän ajan. [A-B] Kasvaimen kasvukäyrät: Data esitetään mediaanin suhteellinen kasvaimen tilavuus (RTV), jossa kasvu lasketaan kullekin kasvaimen suhteessa sen kokoon päivänä 0. Pisteet edustavat mediaani 10 hiirtä kussakin ryhmässä. Katkoviiva osoittaa, missä vaiheessa kasvaimet saavuttivat neljä kertaa alkuperäinen tilavuus (RTV4). [C-D] Vaikutukset kehon paino: Tulokset esitetään prosentteina alkaa kehon painosta. Pisteet edustavat keskiarvoa 10 hiirtä kussakin ryhmässä ± keskivirhe. [E-F] kuluva aika vierassiirrännäisille tavoittaa neljä kertaa sen alkuperäisestä määrästä (aikaa RTV4): Data esitetään aika, jonka kukin yksittäinen kasvain kunkin ryhmän nelinkertaistaa kooltaan, ja linjat edustavat keskiarvoa hiiret kunkin ryhmän ± keskivirhe. P-arvot on annettu, jossa yhdistelmä on merkittävästi erilainen kuin kummallakaan aineella yksinään (p≤0.05).

aika kasvainten nelinkertaistaa koko (aika RTV4) laskettiin (kuviot 3E ja 3F ja taulukko 2), ja tilastolliset analyysit käyttäen Mann-Whitney testi osoitti, että oli olemassa merkittävä ero apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään kasvaimia ja yhdistelmä (p 0,01), ja niiden välillä yhden aineen inhibiittorin ja yhdistelmän ryhmät (p≤ 0,01), sekä HCT116 ja HT29 -tuumoriksenografti malleja. Lisäksi oli merkittävä ero apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään kasvaimia ja ainoana lääkkeenä estäjien HCT116 tuumoriksenografteja (p 0,01), mutta ei HT29 tuumoriksenografteja on 5%: n tasolla (p = 0,06).

[

18F] -FLT PET skannaus päivänä 2 korvikkeena vaste biomarkkereiden PI3K ja MEK-estäjän tehoa yksittäisinä aineina ja yhdistelmässä HCT116 ihmisen tuumoriksenografteja

Se on ollut ehdotti, että [

18F] -FLT PET voidaan käyttää korvikkeena biomarkkeri kasvaimen hoitovaste, ja dynaaminen PET oli siten suoritettiin kahden päivän hoidon, jolloin ei ollut merkittäviä eroja kasvaimen tilavuuden välillä ohjaus tai minkä tahansa käsiteltyjen ryhmien. Valitettavasti [

18F] -FLT ottoa HT29 kasvaimia oli alhainen ja tämä kasvain ei voida käyttää [

18F] -FLT PET tutkimuksissa. Sen sijaan, HCT116 kasvaimet olivat [

18F] -FLT innokas ja kuviot 4A-C esittävät, että ei ollut eroja, kun 2 päivää [

18F] -FLT kasvaimeen hoidon jälkeen ohjaus ajoneuvon 1 mg /kg PD 0325901 yksin tai 100 mg /kg GDC-0941 yksinään, verrattuna lähtötilanteeseen. Oli kuitenkin merkittävä lasku [

18F] -FLT HCT116 kasvaimeen 2 päivän PI3K /MEK estäjän yhdistelmä hoito (kuvio 4D).

[A-D] HCT116 -tuumoriksenografti [

18F] -FLT otto yli 1 tunnin dynaaminen PET skannaus lähtötilanteessa ja hoidon jälkeen joko ajoneuvon ohjaus (A) 100 mg /kg PI3K estäjän GDC-0941 yksin (B), 1 mg /kg MEK estäjän PD 0325901 yksinään (C) tai niiden yhdistelmää 1 mg /kg MEK inhibiittorin PD 0325901 ja 100 mg /kg PI3K-estäjä GDC-0941 (D), po kerran päivässä 2 päivää. Tiedot esitetään keskiarvona standardoitu oton arvo (SUV), jossa kudos pitoisuus lasketaan suhteessa injektoidusta annoksesta ja kehon painoa. Pisteet edustavat keskiarvoa 5-7 hiirtä kussakin ryhmässä ± keskihajonta. [E] prosentuaalinen muutos HCT116 -tuumoriksenografti [

18F] -FLT otto 1 tunti ennen ja jälkeen hoidon joko ajoneuvon hallinnan tai yhdistelmä 1 mg /kg PD 0325901 ja 100 mg /kg GDC-0941, p.o. kerran päivässä 2 päivää. Data esitetään prosentteina muutos pinta-ala (AUC) suhteessa vastaavaan perustason AUC, joka on johdettu kuvioissa A-D, ja pylväät esittävät keskiarvo 5-7 hiirtä kussakin ryhmässä ± keskivirhe. * Tarkoittaa, että [

18F] -FLT SUV AUC yhdistelmä hoidetussa ryhmässä olivat merkittävästi erilaiset 2 päivän kuluttua hoidon lähtötilanteeseen verrattuna (p 0,01).

tietojen perusteella kuvissa 4A-D, prosentuaalinen muutos alueella alle [

18F] -FLT SUV

versus

aika käyrän (AUC) in HCT116 kasvaimet laskettiin kunkin yksittäisen hiiren. Kuvio 4E esittää, että ei ollut merkitsevää eroa (p = 0,95) välillä [

18F] -FLT ottoa perustasolla ja 2 päivän hoidon valvonnassa tai yksittäisenä aineena PD 0325901- tai GDC-0941-käsitellyissä hiirissä. Sen sijaan, oli tilastollisesti merkittävää laskua 18% kasvaimen [

18F] -FLT otto kuluttua 2 päivää PI3K /MEK-estäjän yhdistelmä käsiteltyihin hiiriin (p 0,005). Nämä tiedot osoittavat, että muutokset [

18F] -FLT ottoa edeltävät vaikutuksia kasvaimen tilavuus, ja että [

18F] -FLT PET on voimassa varhaisen korvike vastaus biomarkkereiden havaitsemiseksi parantunut tehokkuus yhdistettyjen PI3K ja MEK estäjä käsittely.

keskustelu

muutamia merkittäviä poikkeuksia lukuun ottamatta, esimerkiksi imatinibin kroonisen myelooisen leukemian ja vemurafenib

BRAF

-mutant melanooma, ainoana lääkkeenä kliinistä kohdennettuja hoitoja on vaatimaton, oletettavasti koska läsnäolo useiden kuljettajan geneettisten vaurioiden ja nopea kehitys resistenssimekanismeja. Yhdistelmät kohdennettujen hoitomuotojen vuoksi laajalti tutkittu. Kuitenkin kehittää optimaalinen yhdistelmä, tavanomainen kliininen tutkimus metodologia on huomattavia rajoituksia, koska suuri määrä huumeita, potilaiden numerot tarvitaan ja aikaa kuluu vasteen ja elossaolopäätetapahtumiin saavutettava esteenä aikainen analyysi kaikista mahdollisista yhdistelmistä.