Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lichens tuottaa erilaisia ​​ainutlaatuisia kemikaaleja, joita voidaan käyttää farmaseuttisiin tarkoituksiin. Seuloa uusia jäkälä sekundäärimetaboliitteja osoittaa estävä vaikutus keuhkosyövän solun liikkuvuus, testasimme asetonia otteita 13 jäkälää kerätyistä näytteistä Chilessä. Physciosporin, eristetty

Pseudocyphellaria coriacea

(Hook f. Taylor) D. J. Galloway P. James, tunnistettiin tehokas yhdiste ja osoitti merkittävää estävää aktiivisuutta maahanmuutto- ja invaasion määrityksissä ihmisen keuhko- syöpäsoluja. Physciosporin hoito vähensi sekä proteiini ja mRNA tasot N-kadheriinin samanaikaisen vähenemistä tasot epiteelin-mesenkymaalitransitioon markkereita, kuten etana ja kierre. Physciosporin tukahdutti myös KITENIN (KAI1 C-terminaalinen vuorovaikutuksessa tetraspanin) -välitteisen AP-1-aktiivisuutta sekä poissa ja läsnä ollessa kasvutekijän stimulaatiota. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti, että ekspressio etäpesäkkeiden estävä geeni, KAI1, on kasvanut ja etäpesäke edistäjän geenin, KITENIN, on dramaattisesti vähentynyt physciosporin. Erityisesti aktiivisuus 3′-alue KITENIN väheni physciosporin. Lisäksi Cdc42 ja Rac1 toimintaa pieneni physciosporin. Nämä tulokset osoittivat, että jäkälä sekundaarimetaboliittien, physciosporin, estää keuhkosyöpä soluliikkuvuus hyödyntäen uutta vaikutusmekanismeja.

Citation: Yang Y, Park SY, Nguyen TT, Yu YH, Nguyen TV, Sun EG, et al . (2015) Lichen sekundaarimetaboliittien, Physciosporin, Estää Keuhkosyöpä solun liikkuvuus. PLoS ONE 10 (9): e0137889. doi: 10,1371 /journal.pone.0137889

Editor: Zhiqian Zhang, Peking University Cancer Hospital Institute, Kiina

vastaanotettu: 14 kesäkuu 2015; Hyväksytty: 24 elokuu 2015; Julkaistu: 15 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Research Foundation of Korea (NRF-2013R1A1A2004677, MRC-2011-0030132) ja Korean National Research Resource Center Program ( NRF-2014M3A9B8002115). Tutkimuksessa saanut tukea myös tutkimuksen apurahan rahoittamaa Sunchon Research Center for Natural Medicine. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Lyhenteet : DMSO, dimetyylisulfoksidi; EGF, epidermaalinen kasvutekijä; HPLC, korkean erotuskyvyn nestekromatografia; KITENIN, KAI1 C-terminaalinen vuorovaikutuksessa olevaa tetraspanin; NMR, magneettikuvaus; PBD, p21 sitova domeeni; TLC ohutkerroskromatografia

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin syöpä ja suurin syy syöpään liittyvät kuolemat ihmisissä maailmanlaajuisesti [1, 2]. Oli noin 1,8 miljoonaa uutta keuhkosyöpää diagnosoitu vuonna 2012, osuus 12,9% koko syöpätapausten [1, 2]. Puutteen takia tehokkaiden hoito edenneen taudin, ennuste keuhkosyöpään on edelleen huono, joissa on alle 15% elossa viisi vuotta diagnoosin jälkeen [3]. Kun keuhkosyöpä on diagnosoitu esityksen oireita, se kuljettaa erittäin huono ennuste, joiden kokonaispituus 5 vuoden pysyvyys oli 16% USA: ssa ja alle 10% Yhdistyneessä kuningaskunnassa [4]. Vuonna keuhkosyöpä, etäpesäke on johtava kuolinsyy, ja purkautuu mekanismi syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden on siten suuri merkitys [5]. Vuonna alkuvaiheet paikallisen invaasion, signalointi polkuja, jotka ohjaavat tukirankaproteiinin dynamiikkaa kasvainsolujen liikevaihto soluväliaineen ja solun soluliitos aktivoitiin [6]. Siksi uusien kemiallisten aineiden, jotka estävät syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota kohdistamalla edellä signaalia tarvitaan hoidossa pitkälle edenneitä syöpiä.

Jäkälät tuottaa monipuolisia sekundäärimetaboliitteja jotka osoittavat erilaisia ​​biologisia aktiviteetteja, kuten syövän vastainen vaikutus [7]. Tähän mennessä lähes tuhat sekundäärimetaboliitteja jäkälien on löydetty ja jotkut näistä ainutlaatuisia jäkälä aineenvaihduntatuotteiden tehoavat eri

in vitro

syövän mallit [8]. Vaikka jäkälien ovat lähde seulomiseksi syövän aktiivisia yhdisteitä, vain pieni määrä yhdisteitä on testattu [9]. Siksi nykyinen tutkimuksessa selvitettiin estoaktiivisuus 13 Chilen jäkälälajien vastaan ​​maahanmuuton ja hyökkäys kyky ihmisen keuhko- syöpäsoluja ja tutki tarkemmin mahdollisia molekyylitason mekanismeista niiden antimetastaattisia aktiivisuutta tunnistaa mahdollisia uusia anti-etäpesäkkeitä aineina.

Materiaalit ja menetelmät

valmistaminen jäkälien uutteiden

Thalli että jäkälien kerättiin Chile tammikuussa 2009 ja 2012 aikana opintomatkoihin kansallispuistossa Torres Del Paine, Patagonia, järjestäytyneen Dr. Pereira Talca yliopistossa, Talca, Chile. Lupa kerätä jäkäliä näytteet sijainti on antanut hallinnon metsähallitus Corporation (CONAF) Punta Arenas ja hallinto National Park Torres del Paine, Magallanes alueen ja Chilen Etelämantereen, joka on osa National System of Protected Wild alueet valtion Chile. Kentän tutkimuksissa ei liittynyt uhanalaisten tai suojeltujen. Kaksoiskappaleet talletettiin Korean jäkälät ja Allied Bioresource Center (KOLABIC) Korean Jäkälä Research Institute (KoLRI), Sunchon National University, Korea.

ohutkerroskromatografialla (TLC) analyysi jäkälä materiaalin

Lichen thalli liotettiin 1 ml: ssa asetonia 5 minuuttia 1,5 ml: EP putket, ja konsentroitu liuos täpliksi silikageeli 60 F254 ennalta päällystetyillä levyillä (Merck Millipore, Darmstadt, Saksa) käyttäen Microcap useita kertoja. Liuotin A [Tolueeni: Dioksiini: Etikkahappo 180: 45: 5 (v /v /v)], on kuvattu Culberson parantunut standardoitu menetelmä [10], käytettiin tässä tutkimuksessa. TLC-levy täplikäs näytteet ladattiin hengen aallonpohjasta kammion ennalta kyllästetty liuotinsysteemi A ja poistettiin kammiosta kun liuoksen etureuna saavutti 14cm päässä alkaen lähtötilanteesta. Tulokset visualisoitiin tarkastus ja merkintä päivänvalossa (pigmenttejä) ja UV 254 ja 350 nm. Tämän jälkeen levyt suihkutettiin 10% rikkihapon vesiliuoksella, ja sitä kuumennettiin 110 ° C: ssa varmistaa täydellinen visualisointi. Sen jälkeen charring, erityiset värit aineita, sekä päivänvalossa ja UV (350nm), havaittiin.

Kaksi jäkälälajien

Lethariella cladonioides (Nyl

.

) Krog

(Atranorin) ja

Usnea longissimi

(usnic happo) käytettiin standardin ohjaus. Perustuen standardoidun menetelmän [10, 11], suhteellinen R

f määritettiin auttaa tunnistamaan kunkin täplän [12].

erottaminen ja tunnistaminen physciosporin

Pseudocyphellaria coriacea

(CL090002) uute erotettiin TLC: llä kuten edellä on kuvattu. Paikalla tunnistettu physciosporin oli naarmuuntunut pois ja eluoitiin asetonilla. Supernatantti kuivattiin ja punnittiin sen jälkeen sentrifugoimalla. Korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) määritys suoritettiin vahvistamaan yhden piikin sisällä puhdistetun näytteen, ja sitten rakenne physciosporin vahvistettiin ydinmagneettisen resonanssin (NMR) analyysillä (kuviot A ja B S1 File).

Soluviljely

ihmisen keuhko- syöpäsoluja, kuten A549, H1650 ja H1975 käytettiin tässä tutkimuksessa. Soluja viljeltiin RPMI 1640 elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 1% penisilliini-streptomysiini liuokseen kostutetussa 5% CO

2-ilmakehässä 37 ° C: ssa inkubaattorissa.

Haavan paranemista määritys

A549-solut maljattiin tiheydellä 2,5 ~ 3 x 10

5 solua /kuoppa 6-kuoppaisille kudosviljelylevyille (Corning, New York, USA) ja kasvatettiin yön yli konfluenssiin. Yksikerrossoluissa raaputettiin steriilillä pipetin kärjen luoda haavan. Sitten solut pestiin kahdesti seerumittomalla RPMI 1640 poistaa kelluvat solut ja inkuboitiin RPMI1640-elatusaineessa, jota oli täydennetty 2% FBS: ää, jossa 5 ug /ml: ssa asetonia uutteen

P

.

coriacea

tai physciosporin. Valokuvia solujen otettiin 0, 24, 48, ja 72 h haavoittamisen jälkeen mitata leveys haavan. Kunkin näytteen, keskimäärin viisi haavan määritysten otettiin määrittämiseksi keskimäärin muuttoliikettä. Kokeet toistettiin ainakin kolme kertaa.

invaasiomääritys

Invasion määritykset suoritettiin Boyden kammioissa (Corning, New York, USA). Polykarbonaatti-suodattimet (8 um huokoskoko, Corning), jotka oli esipäällystetty 1% gelatiinia käytettiin hyökkäystä määrityksissä. Solut (2 x 10

6) 120 ui (RPMI 1640, joka sisälsi 0,2% BSA: ta PBS-liuos) kanssa tai ilman 5 ug /ml raakaa jäkälä uutteita tai physciosporin ympättiin ylemmässä kammiossa. Sitten 400 ui väliainetta, jossa 10 ug /ml fibronektiiniä, lisättiin alempaan kammioon toimimaan kemotaktinen aine. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen solut ylemmässä kammiossa kiinnitettiin Diff Quik Kit (Sysmex). Sitten solut kiinnitetään ylemmässä kammiossa olivat mekaanisesti poistettiin pumpulipuikolla. Solut kiinni alapinnalle suodattimen värjättiin ja laskettiin pystyssä mikroskooppi (5 ruutua /kammio). Kukin invaasiomääritys toistettiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Western blotting

Solut, jotka käsitelty 5 ug /ml: ssa asetonia uutteen

P

.

coriacea

tai physciosporin 24 h pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä ja lyysattiin lyysauspuskurissa [13]. Käytetyt vasta-aineet hankittiin Cell Signaling Technology (N-kadheriinin, α-tubuliinin) ja BD Biosciences (E-kadheriinin). Vasta-aineet havaittiin piparjuuriperoksidaasikonjugoiduilla sekundaarisen vasta-aineen (Thermo) käyttäen Tmmobilon Western Kemiluminesenssiin HRP Substrate Kit (Millipore) ja luminesenssikuvantamisessa (Image Quant LAS 4000 mini). Vyöhykkeet mitattiin Multi-Gauge 3,0 ja suhteellinen tiheys lasketaan tiheys α-tubuliinin bändejä kunkin näytteen. Arvot ilmaistiin mielivaltaisen densitometrinen yksikköinä, jotka vastaavat signaalin intensiteettiä.

Kvantitatiivinen RT-PCR

kvantitatiivinen RT-PCR: llä (qRT-PCR) suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [14]. Lyhyesti, kokonais-RNA eristettiin ihmisen keuhkosyövän soluja käyttämällä RNAiso Plus (TaKaRa, Otsu, Shiga Shiga 520-2193, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokonais-RNA kustakin ryhmästä käsiteltyjen solujen muutettiin cDNA: ksi käyttäen M-MLV-käänteistranskriptaasia (Invitrogen, Carlsbad, USA) ja SYBR vihreä (Enzynomics, Seoul, Korea). Käytetyt alukkeet reaaliaikainen PCR-oli Snail (forward) 5′-tcccgggcaatttaacaatg-3 ’ja (reverse) 5′-tgggagacacatcggtcga-3′; Twist (eteenpäin) 5’-cgggagtccgcagtctta-3 ’ja (reverse) 5′-tgaatcttgctcagcttgtc-3′; N-kadheriinin (forward) 5’-ctcctatgagtggaacaggaacg-3 ’ja (reverse) 5′-ttggatcaatgtcataatcaagtgctgta-3′; KAI1 (eteenpäin) 5’-gctcatgggcttgggct-3 ’ja (reverse) 5′-gagctcagtcacgatgccgc-3′; KITENIN (eteenpäin) 5’-cggaataaagacggcagagg-3 ’ja (reverse) 5′-tgctccgaggtgcctgtgat-3′; GAPDH (eteenpäin) 5’-atcaccatcttccaggagcga-3 ’ja (reverse) 5′-agttgtcatggatgaccttggc-3’. qRT-PCR-reaktiot ja analyysit suoritettiin käyttäen CFX (Bio-Rad, Hercules, USA).

Reporter määrityksessä

AP-1 reportterimääritys, HEK293T-solut transfektoitiin KITENIN ekspressioplasmidilla ja AP1 reportteriplasmidilla. 12 tunnin kuluttua transfektiosta solut käsiteltiin 5 ug /ml: ssa asetonia uutteiden

P

.

coriacea

tai physciosporin 48 h tai ilman EGF ja sitten analysoitiin käyttäen Dual-Luciferase® reportterianalyysi järjestelmän (Promega, Madison, WI, USA). Renilla lusiferaasireportteriplasmidi (PRL-TK) käytettiin sisäisenä kontrollina transfektiotehokkuudelle. Aktiivisuus on TOPFLASH reportteri, NF-KB: n ja STAT toimittaja testattiin myös tutkimukseen.

KITENIN promoottori reportteri määrityksessä ihmisen KITENIN promoottori (-2344: sta + 536), monistettiin PCR: llä genomisesta DNA: HEK293T -soluihin käyttäen suunniteltuja alukkeita genomisen sekvenssin KITENIN lokuksen (1p13.1). PCR-tuotteet digestoitiin

Kpnl

I /

Bgl

II ja kloonattiin pGL3basic-plasmidin (Promega, Madison, WI, USA) ylävirtaan lusiferaasireportterigeenin. Rakentaminen varmistettiin sekvensoimalla. KITENIN 3′-untranlated alue (3′-UTR) määritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [15]. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja vähintään kolme tulokset itsenäisen kokeen sisällytettiin analyysiin. Kertamuutoksia laskettiin käyttäen arvoja normalisoitu Renilla lusiferaasiaktiivisuutta.

Affinity-sademäärä solun GTPaaseja

Matkapuhelinverkko Rac1 ja Cdc42 toiminta määritettiin käyttämällä GST-RBD /PBD kuten aikaisemmin on kuvattu [16] . Lyhyesti, solut hajotettiin hajotuspuskuriin. Lysaatit inkuboitiin GST RBD /PBD helmiä huoneenlämpötilassa 1 tunti. Helmet pestiin sitten neljä kertaa pesupuskurilla. Sitoutunut Rac1 ja Cdc42-proteiinit havaittiin immunoblottauksella käyttäen monoklonaalista vasta-ainetta vastaan ​​Rac1 (MILLIPORE 05-389) ja Cdc42 (SANTA CRUZ SC-87). Suhteellinen aktiivisuus kunkin GTPaasi määritettiin määrällisesti kunkin kaistan GTP-sitoutuneen GTPaasina ja kokonaismäärä GTPaasi Multi-Gauge 3,0, ja arvot GTP: hen sitoutuneen bändejä oli normalisoitu kokonaismäärästä. Kaikki tulokset määritettiin käyttäen kolmea erilaista vastuut vähintään kolmen erillisen kokeen.

Tulokset

Asetoni otteita jäkälien kerättyjen Chilessä estävät A549 soluliikkuvuus

Invasion ja muuttoliike Pelaa ratkaiseva rooli etäpesäke syöpäsolujen. Löytää estävää ainetta jäkälää sekundäärimetaboliitteja, haavojen määritykset suoritettiin A549 ihmisen keuhko- syöpäsoluja alustavana seulonta asetonia otteita 13 Chilen jäkälät (taulukko 1) [17-20]. Kuten kuviossa 1A,

korujäkälät melanophthalma

,

Hypotrachyna sinuosa

,

Pseudocyphellaria coriacea

,

Pseudocyphellaria glabra

ja

nefrooma sp

. esti migraation A549-solut pitoisuudessa 5 ug /ml. Tämä pitoisuus käytettiin sytotoksisuutta ei havaittu tällä konsentraatiolla (tuloksia ei esitetty). Väliset etäisyydet reunojen haavoja soluja käsiteltiin viiden lichen uutteiden laajempi kuin ne, DMSO-käsiteltyjen solujen (kuvio 1 B).

(A) kvantitatiivinen analyysi maahanmuuton määritykset A549-soluja käsiteltiin 5 ug /ml: ssa asetonia uutteiden

Pseudocyphellaria glabra

,

Pseudocyphellaria coriacea

,

nefrooma

sp.,

Physcia

sp.,

Flavoparmelia caperata

,

Hypotrachyna sinuosa

,

korujäkälät melanophthalma

,

korujäkälät melanophthalma

,

Pseudocyphellaria argyracea

,

Pseudocyphellaria verrucosa

,

Xanthoparmelia

sp.,

Protousnea sp

. ja

Xanthoparmelia

sp .. (B) Kuvat ovat muuttoliikkeen määritykset A549-soluja käsiteltiin otteet

R

.

melanophthalma

,

H

.

sinuosa

,

P

.

coriacea

,

P

.

glabra

ja

nefrooma

sp. (C-D) Invasion määritykset A549-soluja käsiteltiin 5 ug /ml: ssa asetonia uutteiden

R

.

melanophthalma

,

H

.

sinuosa

,

P

.

coriacea

,

P

.

glabra ja nefrooma sp

. (C) ja kvantitatiivinen analyysi hyökkäsi solujen määrä kussakin hoidossa (D). Kvantitatiiviset tiedot saatiin kolmen erillisen kokeen, n = 3. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM (Vakio keskivirhe). *** P 0,001 verrattuna DMSO-käsiteltyjen A549-solut.

edelleen tarkistaa, onko edellä jäkälä otteet oli inhibitorinen vastaan ​​hyökkäystä A549-solut, invaasio määritykset suoritettiin käyttäen gelatiinipäällystetyille kaksi- hyvin kammiot. Kuten on esitetty kuviossa 1C, soluja käsiteltiin asetonilla uutteet viiden jäkälien osoitti harvemmilla tunkeutuu soluihin verrattuna DMSO-käsiteltyihin kontrollieläimiin. Kvantitatiivinen analyysi tiedoista ilmeni, että erot olivat suuria (kuvio 1 D). Nämä tulokset osoittavat, että asetonia otteet

R

.

melanophthalma

,

H

.

sinuosa

,

P

.

coriacea

,

P

.

glabra

ja

nefrooma sp

. osoittavat estävä vaikutus A549 solun liikkuvuus.

Physciosporin todettiin aktiivisena jäkälä sekundaarimetaboliittien iältään

P

.

coriacea

inhibitioon keuhkosyövän solun liikkuvuus

tutkimiseksi tärkein yhdiste näiden viiden ehdokkaan jäkälien, viisi lichen asetonia uutteet erikseen analysoitiin TLC: llä (kuvio 2A). Perustuen suhteelliseen R

f-arvot [12],

R

.

melanophthalma

,

H

.

sinuosa

,

ja nefrooma sp

. sama pääkomponentti, usnic happo (paikalla, kuvio 2A), kun taas

P

.

glabra

ja

P

.

coriacea

on erilaiset tärkeimmät yhdisteet (spot c, kuvio 2A). Kuten usnic happo on laajimmin tutkittu jäkälää aineenvaihduntatuote varten syövän vastainen vaikutus, päätimme ”paikka c” jatkotutkimuksiin. ”Spot c ’oli leimallisesti havaita

P

.

glabra

ja

P

.

coriacea

joukossa muun

Pseudocyphellaria

sukuun, jolla on käytössään tenuiorin (spot d) ja muita tuntemattomia aineenvaihduntatuotteita on tärkein yhdiste (vasen ruutu, kuvio 2B). Kuten ”spot c ’in

P

.

glabra

ja

P

.

coriacea

jakoi identtinen TLC

f arvoa physciosporin in

P

.

granulata

ja oli vaalean tai tumman harmaa päivänvalossa ja muuttui mustaksi ja tiheämpi UV (vasen ja oikea paneeli, kuvio 2B), tunnistimme spot c ”kuin physciosporin [21-23].

P

.

faveolata

ja

P

.

valdiviana

myös hallussaan physciosporin pääasialliseksi yhdistettä (oikea paneeli, kuvio 2B). Physciosporin Tässä tutkimuksessa käytetyt eristettiin

P

.

coriacea

kuin määriä muita physciosporin sisältävien jäkälien oli rajoitettu. Puhtaus ja rakenne physciosporin varmistettiin HPLC: llä ja NMR-analyysin (kuvio 2C; S1 File).

(AB) ohutkerroskromatografialla (TLC) analyysillä käyttäen (tolueeni: dioksiini: etikkahappo = 180: 45: 5 , v /v /v) liuotinjärjestelmä jäkälä otteita, joilla on estävää aktiivisuutta A549 soluliikkuvuus (A), jäkälien vuonna

Pseudocyphellaria

suku (B). ”A” tarkoittaa sijainti paikka usnic happo; ”B”, sillä atranorin; ”C”, sillä physciosporin; ”D”, varten tenuiorin. Jäkälälajien

L

.

cladonioides

ja

U

.

longissimi

käytettiin vakiona ohjaus atranorin ja usnic happo, vastaavasti. (C) kemiallinen rakenne physciosporin. (D-E) Migration määritys A549-solut käsiteltiin 5 ug /ml: ssa asetonia uutteen

P

.

coriacea

tai 5 ug /ml physciosporin (D), ja kvantitatiivinen analyysi haavan pituus (E). (F-G) Invasion määritykset A549-soluja käsiteltiin 5 ug /ml: ssa asetonia uutteen

P

.

coriacea

tai physciosporin (F), ja kvantitatiivinen analyysi hyökkäsi solujen määrä kussakin hoidossa (G). Kvantitatiiviset tiedot saatiin kolmen erillisen kokeen, n = 3. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM (Vakio keskivirhe). *** P 0,001 verrattuna DMSO-käsiteltyjen A549-solut.

Jotta onko physciosporin on aktiivisen yhdisteen estävä A549 solun liikkuvuus, physciosporin testattiin haavan paranemista määrityksissä ja invaasio määritykset. Verrattuna asetonilla uute

P

.

coriacea

, physciosporin osoittivat samanlaisia ​​estävä vaikutus muuttoliikkeen ja invaasion A549-solut (kuvio 2D-2G). Erityisesti, physciosporin inhiboi A549 soluinvaasion annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2F ja 2G). Mielenkiintoista on, että esto puhdistettiin yhdiste oli korkeampi kuin raakaöljyn uutteita invaasiomääritys, mutta hieman pienempi migraatiokokeessa (kuvio 2E ja 2G). Estovaikutusta asetonia uutteen

P

.

coriaea

ja physciosporin keuhkosyöpään soluliikkuvuus havaittiin myös H1650, H1975-soluissa (kuvio 3). Solujen elinkelpoisuus, ei vaikuta millään annetulla pitoisuus physciosporin (tuloksia ei ole esitetty). Ennen kaikkea nämä tulokset osoittivat, että physciosporin on aktiivinen jäkälä sekundaarimetaboliittien iältään

P

.

coriacea

inhibitioon keuhkosyövän solun liikkuvuus.

(AB) Invasion määrityksiä H1650 ja H1975 keuhkosyövän soluja käsiteltiin 5 ug /ml: ssa asetonia uutteen

P

.

coriacea

tai 5 ug /ml physciosporin (A), ja kvantitatiivinen analyysi hyökkäsi solujen määrä kussakin hoidossa (B). Kvantitatiiviset tiedot saatiin kolmen erillisen kokeen, n = 3. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM (Vakio keskivirhe). *** P 0,001 verrattuna DMSO-käsiteltyjen A549-solut.

Asetoni uute

P

.

coriacea

ja physciosporin laski tasolle epiteelin-mesenkymaalitransitioon markkeri

tutkimiseksi toimintamekanismi estoaktiivisuus physciosporin vastaan ​​keuhkosyövän solun liikkuvuus, vaikutukset asetonia uutteen

P

.

coriacea

ja physciosporin tutkittiin useissa signalointireittejä. Ensimmäinen, määrän muutoksia epiteelin-mesenkymaalisten (EMT) markkeri mitattiin käsitellyissä soluissa (kuvio 4). Tutkimuksessamme pienenee ilmaus N-kadheriinin olivat näkyvästi A549-soluja käsiteltiin asetonilla uute

P

.

coriacea

tai physciosporin sekä proteiini- ja mRNA-tasot (kuvio 4B ja 4C), kun taas E-kadheriinin pysyi marginaalinen (kuvio 4A ja tietoja ei ole esitetty E-kadheriinin mRNA). Lisäksi ilmaisuja Snail ja Twist olivat annoksesta riippuvaa laskua asetoniuute on

P

.

coriacea

tai physciosporin jälkeen (kuvio 4C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että asetonia uute

P

.

coriacea

ja physciosporin on estävä vaikutus keuhkosyövän soluliikkuvuus osittain estämällä EMT.

(AB) Western blot-analyysi E-kadheriinin (A) ja N-kadheriinin (B) A549-soluja käsiteltiin 5 ug /ml: ssa asetonia uutteiden

P

.

coriacea

tai physciosporin. (C) kvantitatiivinen analyysi mRNA-tasojen N-kadheriinin, Snail ja Twist A549-soluja käsiteltiin 5 ug /ml: ssa asetonia uutteiden

P

.

coriacea

tai physciosporin. Kvantitatiiviset tiedot saatiin vähintään kahdessa riippumattomassa kokeessa. Data edustaa keskiarvoa ± SEM (Vakio keskivirhe). * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001 verrattuna DMSO-käsiteltyjen A549-solut.

Asetoni uute

P

.

coriacea

ja physciosporin tukahdutetaan KITENIN-välitteistä AP-1-aktiivisuuden ja vaikuttaa ilmentymistä KAI1 ja KITENIN

Seuraavaksi, muutokset transkription toimintaan β-kateniinin /LEF-1 (TOPFLASH), AP -1 (AP-1-luc), NF-KB: n (NF-KB-luc) ja STAT (STAT-luc) mitattiin käsitellyissä soluissa. Alustavassa testissä vain AP-1-aktiivisuus väheni asetoniuute on

P

.

coriacea

tai physciosporin hoitoa annoksesta riippuvalla tavalla ilman koaktivaattori (tuloksia ei ole esitetty). Edellisessä tutkimuksessa osoitimme, että KITENIN (KAI1 C-terminaalinen vuorovaikutuksessa tetraspanin) edistää Tuumorigeenisuustutkimuksissa syöpien, ja epidermaalista kasvutekijää (EGF) stimuloi KITENIN-välitteistä AP-1 aktivaatio [24]. Edelleen vaikutusten testaamiseksi asetonia uutteen

P

.

coriacea

tai physciosporin on KITENIN-välitteisen AP-1-aktiivisuutta, AP-1 toimittaja määritykset suoritettiin soluissa kotransfektoitiin KITENIN. Kuten on esitetty kuviossa 5A, KITENIN-välitteinen AP-1-aktiivisuus väheni asetonia uutteen

P

.

coriacea

tai physciosporin hoitoa annoksesta riippuvaisella tavalla, sekä ilman EGF stimulaatiota. Tutkiakseen, miten asetoniuute on

P

.

coriacea

ja physciosporin tukahdutti KITENIN välittämän AP1 toimintaa, testasimme KITENIN tasoa käsitellyissä soluissa. KITENIN mRNA-tasot laskivat hoidon (kuvio 5B). Metastaattisen estävä geeni, KAI1, usein säädellä vähentävästi etäpesäkekasvainten soluissa [25, 26]. Koska KITENIN on käänteinen suhde KAI1 tai muiden etäpesäkkeiden synnyssä [27], testasimme mRNA-tasolla ja KAI1 käsitellyissä soluissa ja löysi samanlainen käänteinen suhde KITENIN ja KAI1 (kuvio 5C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että asetonia uute

P

.

coriacea

ja physciosporin estävät A549 soluliikkuvuus osittain läpi tukahduttaminen KITENIN välittämää AP-1 aktiivisuutta säätelemällä KITENIN ja KAI1 ilmaisuja. Voit tarkistaa, kuinka mRNA tasolla KITENIN voidaan muuttaa käsittelemällä, Lusiferaasimäärityksiä varten KITENIN promoottori ja 3′-UTR tehtiin. Tämän seurauksena aktiivisuus KITENIN 3′-UTR dramaattisesti vähentynyt hoitoon (kuvio 5E), kun taas KITENIN promoottorin pysyi vakiona (kuvio 5D).

(A) AP-1 lusiferaasianalyysissä of HEK293T solut, jotka on transfektoitu KITENIN ja käsiteltiin 5 ug /ml: ssa asetonia uutteen

P

.

coriacea

tai physciosporin puuttuessa tai läsnä epidermaalisen kasvutekijän stimulaatiota. (B-C) kvantitatiivinen analyysi mRNA tason KITENIN (B) ja KAI1 (C) A549-soluja käsiteltiin 5 ug /ml: ssa asetonia uutteen

P

.

coriacea

tai physciosporin. (D-E) KITENIN promoottori (D) ja 3′-UTR: n (E) Lusiferaasimäärityksiä on HEK293T-soluja käsiteltiin 5 ug /ml: ssa asetonia uutteen

P

.

coriacea

tai physciosporin. Kvantitatiiviset tiedot saatiin vähintään kolmen erillisen kokeen. Data edustaa keskiarvoa ± SEM (Vakio keskivirhe). * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001 verrattuna DMSO-käsiteltyihin soluihin.

Asetoni uute

P

.

coriacea

ja physciosporin vähennetään RhoGTPase aktiviteetti

Seuraavaksi muutoksia toimintaan RhoGTPases mitattiin käsitellyissä soluissa (kuvio 6). Vaikutusten tutkimiseksi, asetonia uutteen

P

.

coriacea

ja physciosporin toiminnasta Cdc42 ja Rac1, GST pull-down analyysit suoritettiin käyttämällä GST-PBD (p21 sitova domeeni). Tulokset osoittivat, että toiminta Cdc42 ja Rac1 pieneni 20% ja 33%, vastaavasti, kun läsnä on physciosporin (kuvio 6A ja 6B). RhoA aktiivisuus laski myös asetoniuute on

P

.

coriacea

ja physciosporin (tietoja ei ole esitetty). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että asetonia uute

P

.

coriacea

ja physciosporin estävät A549 soluliikkuvuus osittain läpi vähentäminen RhoGTPase toimintaa. Tulokset osoittavat, että jäkälä sekundaarimetaboliittien, physciosporin, estää syöpäsolun motiliteettia erityisiä vaikutusmekanismeja.

(AB) tasot GTP-sitoutuneen Cdc42 (A) ja Rac1 (B) mitattiin A549-soluja käsiteltiin 5 ug /ml: ssa asetonia uutteen

P

.

coriacea

tai physciosporin. GTP-Cdc42 ja -Rac1 mitattiin käyttämällä GST-PBD. Kokonaismäärät Cdc42 ja Rac1 osoitettiin mitata suhteellinen aktiivisuus. Kvantitatiiviset tiedot saatiin kolmen erillisen kokeen, n = 3. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM (Vakio keskivirhe). *** P 0,001 verrattuna DMSO-käsiteltyjen A549-solut.

Keskustelu

Monet ainutlaatuinen kemikaaleja on eristetty jäkälää käytetään farmaseuttisiin tarkoituksiin. Tässä tutkimuksessa tehokas kemiallinen yhdiste physciosporin on eristetty Chile lichen

Pseudocyphellaria coriacea

niiden estävä vaikutus keuhkosyöpään solun liikkuvuus. Physciosporin, kloorattu depsidone, eristettiin ensimmäisen kerran vuonna 1977 alkaen lichen

Pseudocyphellaria physciospora

ja tunnistaa metyyli-2-kloori-4-formyyli-3,8-dihydroksi-l, 6,9-trimetyyli-11- okso-11

H

dibentso [b, e] [l, 4] dioksepin-7-karboksylaattia (metyyli-5-chlorovirensate) [22], mutta niiden biologinen aktiivisuus ei ole raportoitu tähän mennessä. Tässä tutkimuksessa, löysimme seuraavat: 1) asetoni ote

P

.

coriacea

ja sen -aliosa, physciosporin, estävät liikkuvuusluokka keuhkosyöpäsoluissa; 2) ote

P

.

coriacea

ja physciosporin tukahduttaa EMT; 3) ote

P

.

coriacea

ja physciosporin vähentää KITENIN välittämää AP-1 aktiivisuutta ja vaikuttaa ilmaus KAI1 ja KITENIN; ja 4) uute

P

.

coriacea

ja physciosporin vähentää RhoGTPase aktiivisuutta.

EMT, olennainen fenotyyppinen muuntaminen alkionkehityksen aikana, kudoksen uudelleen ja haavan paranemista, on korvaamaton rooli tuumorin invaasiota ja etäpesäkkeiden [28-30]. Kohonneita N-kadheriiniekspressiota ja pienenee E-kadheriinin tason (nimeltään ”kadheriinin kytkentää”) ovat ratkaisevia EMT ja kohdata syövän etenemisen [31]. Erityisesti taso N-kadheriinin näyttää edustavan mesenkymaaliset fenotyypin solujen ja ryhmä transkriptiotekijöiden kuten Snail, Slug, ZEB ja Twist on keskeinen rooli valvonnassa EMT [32]. Snail, sinkki sormen transkriptiotekijä ensimmäinen tunnistettu Drosophila, on keskeinen EMT säädin [33]. Twist on myös tärkeä rooli syövän etäpesäkkeiden. Esimerkiksi esto Twist ilmaisun lyhyen häiritsevät RNA: t vaikuttavat metastaattinen elinvoima [34], ja asetus Twist-1 voivat vaikuttaa resistenssin paklitakselille ja antimikrotubulusaine lääkkeitä syöpäpotilailla [35]. Tuloksemme osoittivat, että tasot N-kadheriinin, Snail, ja Twist pieneni asetoniuute on

P

.

coriacea

ja physciosporin hoito kun taas E-kadheriinin pysyi marginaalinen (kuvio 4). Huomionarvoista on, että joissakin tapauksissa muutoksia E-kadheriinin tason eivät ole välttämättömiä EMT [36] tai metastaattisen aktiivisuuden kasvain [37].

KITENIN on etäpesäke lisäävä geeni. Viime aikoina olemme havainneet, että KITENIN /ErbB4-Dvl2-c-Jun akseli on ennakkoluuloton EGFR-riippumaton alavirtaan signaali EGF ja välittää invasiivisuus ja kasvaimen kehittymisen syöpäsolujen [24]. Meidän tulokset, KITENIN välittämää AP-1-aktiivisuus väheni ote

P

.

coriacea

ja physciosporin. Erityisesti ilmaus KITENIN väheni käsittelemällä, ja tämän, 3′-UTR: n aktiivisuus KITENIN dramaattisesti vähentynyt (kuvio 5). Harvat KITENIN kohdistamisen MikroRNA tukahduttaa migraation ja invaasion solujen kautta moduloiva KITENIN ilmaisun raportoitu ja miR-27a, miR-30b, ja miR-124 ovat esimerkkejä [15]. Tällä hetkellä emme tiedä, onko physciosporin todennäköisesti toimii MikroRNA tukahduttaa 3′-UTR aktiivisuutta KITENIN. Kuten epäsovinnainen KITENIN /ErbB4 välittämä alavirtaan signaali EGF soittaa yhden molekyylitason perustan resistenssin EGFR aineita, uute

P

.

coriacea

ja physciosporin voitaisiin mahdollisesti hyödyllistä aktiivisuutta voittamisessa rajallinen kliininen teho EGFR-terapia.

Rho GTPaasit jäsenet Ras superperheen pieniä GTPaaseja kuten Rac1, Cdc42, ja