Krooninen sairaus

tiivistelmä

tunnistaminen entsyymejä, että kun käyttöön syöpäsolujen johtaa lisääntyneeseen tehokkuuden hoitoa on tärkeä tavoite biolääketieteen sovelluksiin. Käyttämällä alkuperäinen menettely, jossa mutantti geenejä perusteella syntyneet käyttää ehdollista lentivector genomin liikkeelle, olemme hiljattain kuvattu, ensimmäistä kertaa, tunnistaminen ihmisen deoksisytidiinikinaasiin (dCK) mutantti (G12), joka herkistää paneelin syöpäsolulinjojen käsittelystä seuraavan dCK analogisten gemsitabiinia. Täällä, alkaen G12 variantti itse, me tuottanut uuden kirjaston ja tunnistanut mutantti (M36), joka laukaisee jopa suurempi herkistymiseen gemsitabiinia kuin G12. Osalta G12, M36 on ylimääräinen mutaatio sijaitsee alueella, joka muodostaa rajapinnan dCK dimeerin. Yksinkertainen Tämän mutaation esiintyminen puolikkaat sekä IC 50 ja osuus jäljellä solujen vastustuskykyisiä hoitoon. Lisäksi se, että vektoreita, jotka liittyvät itse inaktivoiva LTR: t aiheuttaa lisääntynyttä herkkyyttä hoidon seurauksena yhteensopiva helpotus transkription häiriön kohdistama U3-promoottori sisäisen promoottoriin, joka ohjaa ekspressiota M36. Tärkeää on, merkittävä vaikutus havaitaan myös hoitojen kanssa syövän vastaisen yhdisteen sytarabiini (AraC), joille 10,000 kertaisesti alentunut IC50 tapahtunut. Laukaisemalla herkistyminen eri syöpäsolutyyppien huonon ennusteen kaksi yleisesti käytetty syövän vastaisia ​​yhdisteistä M36 on lupaava ehdokas itsemurhan geenin lähestymistapoja.

Citation: Coulibaly ST, Rossolillo P, Winter F, Kretzschmar FK, Braye M , Martin DP, et ai. (2015) Voimakkaat Herkistyminen syöpäsolujen syöpälääkkeiden jonka Neljän Mutant Human deoksisytidiinikinaasiin. PLoS ONE 10 (10): e0140741. doi: 10,1371 /journal.pone.0140741

Editor: Jean-Luc EPH Darlix, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, FRANCE

vastaanotettu: 11 kesäkuu 2015; Hyväksytty: 30 syyskuu 2015; Julkaistu: 20 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Coulibaly et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat rahoituksella Ligue Contre le Cancer (https://www.ligue-cancer.net), appel d’offre Conférence de koordinointi Interregionale du Grand Est 2012 MN. S. Coulibaly on vastaanottaja apurahan Ranskan ”Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche”.

Kilpailevat edut: Tällä retrovolution menetelmä ja mutanttien kuvattu esillä olevassa paperissa katettiin patenteissa, lisää tietoa lisenssejä ota yhteyttä vastaava tekijä.

Johdanto

kuoleman aiheuttaminen syöpäsolujen kautta geeniterapia on tärkeä tavoite biolääketieteen sovelluksiin. Suurin este tämä saavutus on mahdollisuus tuottaa nimenomaan osaksi syöpäsoluihin siirtogeenien, jotka johtavat solukuolemaan: prosessi saavuttaa huono hyötysuhde

in vivo

[1]. Ylimääräinen ongelma on muodostettu tehokkuutta, jolla siirtogeeni aiheuttaa kuoleman modifioitu solu. Solukuolemaa voidaan indusoida joko konstitutiivisesti tai vastauksena altistumisen kemialliset yhdisteet, kuten syöpälääkettä [1]. Lähestymistapa, jossa käytetään geenin indusoituvan toksisuuden on se etu, että kiinnostava alalla turvallisuuden geenejä, jotka mahdollistavat negatiivisen valinnan siirrettyjen solujen geeniterapiassa lähestymistapoja. Näissä tapauksissa, kun läsnä on turvallisuuden geeni on välttämätöntä siinä tapauksessa, neoplastisen transformaation jälkeen siirteen toimiminen on muokattuja soluja tai, adoptiivista immunoterapiaa, kun kyseessä on kehittää käänteishyljinnän vastaus [2]. Itsemurhageeniä yleisimmin käytetään tähän mennessä näihin tarkoituksiin on ollut tymidiinikinaasigeeniin herpes simplex -viruksen (hsTK) yhdistettynä gansikloviiri hoitoon [3-5]. Kuitenkin, koska sen viruksen alkuperää, hsTK huono puoli immuunivasteen TK-johdettujen epitooppien [6], mikä viittaa siihen, että sen korvaaminen vähemmän immunogeenisiä proteiineja saattaa tehostaa tätä lähestymistapaa. Näistä syistä ihmisen entsyymi muodostaisi ihanteellinen ehdokas.

Tässä suhteessa ihmisen deoksisytidiinikinaasiin (dCK) on herättänyt paljon kiinnostusta. Sen lisäksi, että mukana pelastus polku, joka muuntaa kierrätettyjä deoksiribonukleosidejä osaksi dNTP [7], tämä entsyymi katalysoi ensimmäinen nopeutta rajoittava, fosforylaatio askel aktivointia eri deoksisytidiiniä analogien (DCA) käytettiin kliinisissä hoidoissa eri syöpiä. Gemsitabiini on yksi näitä lääkkeitä. Sitä käytetään yleensä hoitoon useiden syöpien, kuten haimasyövän, metastaattinen ei-pienisoluinen keuhko- ja rintasyöpiä, sekä munasarjojen syöpien; jotka kaikki liittyvät huonoon ennusteeseen [8-13]. DCK: ta on mukana myös aktivointi muita yhdisteitä, jotka ovat rakenteellisesti sukua deoksisytidiinin ja niitä käytetään syövän tai viruslääkkeiden. Yksi tällainen huumeiden AraC (sytosiiniarabinosidin), jota käytetään enimmäkseen hoitoon leukemioiden, kuten akuutti myelooinen leukemia (AML) [14].

Monissa tapauksissa dCK määrittää herkkyys solujen jotta gemsitabiinihoidon tai AraC. Välinen korrelaatio tason dCK ilmaisun ja herkkyys hoidon DCA on itse asiassa havaittu potilailla, joita hoidettiin karvasolu- leukemia ja krooninen lymfaattinen leukemia [15] ja erilaisissa rintasyövän solulinjoissa [16]. Välinen yhteys ilmaisua dCK, kertymistä ja säilyttämistä solunsisäisten gemsitabiinin altaan tasoa ja gemsitabiinin yhdistyminen DNA: han on myös raportoitu [17-19], sekä yhdistyksen välillä ennen hoitoa Solunsisäiset dCK ja herkkyys gemsitabiinin [ ,,,0],20]. Vastaavanlainen riippuvuussuhde on raportoitu AraC [21]. Lisäksi eksogeeninen yli ilmentymistä dCK in gliooma soluissa retrovirus- tai telmäadenovirusvektoreita johtaa lisääntyneeseen herkkyyteen sytotoksisille toiminnan sytosiiniarabinosidia

in vitro

ja

in vivo

[22]. Sitä vastoin puutteita dCK aktiivisuus johti resistenssiä hoidon joko gemsitabiinin [18, 23, 24] tai AraC [25-27].

Tällöin mahdollisuus ennustaa geeniterapian lähestymistavat perustuvat lisääminen ylimääräisiä kopioita dCK geenin syöpäsoluissa näyttää lupaavalta ja mahdollisuus tuottaa varianttien dCK parannettu DCA fosforylaatioaktiivisuuden on tärkeä tavoite alalla. Rational yritetty suunnitella dCK mutantteja tällaisia ​​ominaisuuksia on tehty aikaisemmin, joko perustuen rakenteellisiin tietojen [28] tai vaikutuksista translaation jälkeiset modifikaatiot proteiinin, joka on havaittu parantaa sen entsymaattisen aktiivisuuden

in vivo

[29, 30]. Vaikka nämä tutkimukset onnistunut saamaan dCK variantteja, jossa on parannettu kyky fosforyloida ja aktivoida gemsitabiinin, tämä aktiivisuus rinnastettiin paljon merkitty parantaminen fosforylaation luonnollisen substraatin dC [28, 30]. Koska kilpailu dCK entsyymin välillä luonnollisen substraatin ja saapuvien huumeiden molekyylejä on ratkaiseva tehokkuuden solukuoleman induktio [31, 32], tämä ominaisuus, että tällaisten mutanttien kerran tuotu syöpäsolut eivät olisi aiheutti herkistymisen hoitoon. Yhdelle näistä (kolminkertainen mutantti A100V, R104M, D133A) [28], se oli todellakin raportoitu, että sen viemistä Messa10K soluihin, kohdun sarkooma solut vastustuskykyisiä gemsitabiinin [33], ei johtanut herkistymistä tälle lääkkeelle [34].

hiljattain kehittänyt kokeellinen lähestymistapa (retrovolution), jossa geeni insertoidaan ehdollinen replikaation VSV-pseudotyypitettyä HIV-1 johdettujen vektoreiden, joita käytetään matkimaan useita tarttuvan jaksoa, jonka aikana kiinnostuksen kohteena olevan sekvenssin kertyy mutaatioita johtuen virhealtista luonne HIV-1: n replikaation koneet [34]. Tämä tuottaa kirjaston varianttien mielenkiinnon kohteena olevan geenin, jotka on jo asetettu biologiseen vektoriin sopiva tehokas toimitus siirtogeenin ihmisen soluja, jotka voidaan sitten suoraan seuloa halutun fenotyypin. Käyttäen, kuten kiinnostuksen kohteena olevan sekvenssin, cDNA, joka koodaa ihmisen dCK, me eristetty mutantti, nimeltään G12, joka indusoi 300-kertainen herkistyminen gemsitabiinin soluissa alunperin tälle lääkkeelle resistenttejä (Messa 10K), vaikutus 60 kertaa voimakkaampi kuin on havaittu valvonnan soluissa, joissa ylimääräinen kopio paino- dCK oli lisätty [34]. Tämä mutantti on ominaista läsnäolo kolme mutaatiota, jotka sijaitsevat asemissa proteiinin kaukana aktiivisen ja jotka eivät todennäköisesti on ennustettu järkevästi. Yksi näistä mutaatioista, E171K, sijaitsee alueella mukana sukupolven rajapinnan dCK dimeerin. Kaksi muuta mutaatiota (E247K ja L249M) sen sijaan on sijoitettu ”base-sensing loop”, joka moduloi proteiinin laskostumisen yhteydessä sitoutuminen fosfaatin luovuttajan (ATP tai UTP), (S1 kuvio) [28]. Ei muuttaminen aste dimeroitumisen oli kuitenkin havaittiin

in vitro

mutantti, mikä viittaa siihen, että syy lisääntyneeseen gemsitabiinin herkkyyttä että se indusoi ei johdu muutoksesta ilmaisun ilmaisun taso [34], mutta johtuu mahdollisesti muuttamista yleinen rakenne entsyymin.

G12 eristettiin seulonnan jälkeen kirjaston tuloksena 17 perättäisellä retrovolution [34]. Näin tehtiin mutaatioita satunnaisesti geenin ilman ulkoista valinta paine menettelyn aikana että suosisi eristettyä haluttu fenotyyppi. Kysymys mahdollisuudesta eristetään mutantin, jossa on vieläkin enemmän gemsitabiinin herkistymistä aktiivisuus kuin G12 on lähtökohta tämän tutkimuksen.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

HEK-293T-solut saatiin American Type Culture Collection ja niitä kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (Gibco, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 100 U /ml pennicillin-100 mg /ml streptomysiiniä . Messa10K solut ystävällisesti toimitti LPJordheim (Lyon, Ranska) ja niitä kasvatettiin RPMI-10% FBS: ää ja penisilliini-streptomysiiniä.

Retrovolution jaksoissa lentivector hiukkasia

käynnistys johtavissa sen sukupolven F27-RL (jossa RL tarkoittaa random kirjasto), kahdeksan 10-cm levyille, jotka sisälsivät 5×10

6 solujen populaatio HEK 293T-solut, jota käytettiin tunnistamaan G12 kloonin (F16, viite [34 ]) transfektoitiin, käyttämällä kalsiumfosfaatti-protokollaa, 10 ug pCMVΔR8.91 plasmidia [35] ja 5 ug pHCMV-G-plasmidi [36], jotta saadaan aikaan viruksen kaltaisia ​​väestön F17-RL. Samaa menettelyä käytettiin alkaen kokeissa johtaa sukupolven F11-DL, mutta tässä tapauksessa ensimmäisen transfektion pCMVΔR8.91 ja pHCMV-G plasmidit suoritettiin HEK 293T-solulinja aiemmin luotu vakaasti ilmentämään lentivector genomista RNA: ta koodaavan G12 [34]. Tällöin viruksen kaltainen väestön tuotettu kutsuttiin F1-DL (missä DL tarkoittaa suunnattu kirjasto). Nämä viruksen kaltaisia ​​populaatioita (F17-RL ja F1-DL) käytettiin sitten itsenäisesti transdusoimaan tuoretta HEK 293T-solut jatkaa retrovolution menettelyä rinnakkain, kuten on kuvattu viitaten [34]. Suoritimme 11 edelleen retrovolution jaksoa, joka johtaa sukupolven F27-RL ja F11-DL solupopulaatioiden, vastaavasti. Transfektiot aikana sykliä retrovolution saatiin 10 ug: lla pCMVΔR8.91 ja 5 ug pHCMV-G-plasmidi 8 10 cm maljoille, jotka sisälsivät 5×10

6 solujen populaatio HEK 293T-solut edellisen retrovolution syklin . Sillä transduktiomenetelmän aikana sykliä retrovolution, The lentivector sisältävä supernatantti otettiin talteen 48 tuntia transfektion jälkeen, suodatettiin 0,45 um: n suodattimen ja väkevöitiin 40 kertaa Vivaspin 20 saraketta (MWCO 50 KDa, Sartorius STEDIM Biotech, Aubagne, Ranska). Transduktio olosuhteet erosivat kun suoritetusta geneettisen monimuotoisuuden (retrovolution sykliä), ja kun suoritetaan eristämään yhden kloonien seulonnassa kirjaston. Sillä retrovolution sykliä, 5×10

6 HEK-293T-solut transdusoitiin 1 ml väkevää lentivirusvektorien (katso edellä) ja puromysiiniselektion levitettiin 24 transduktion jälkeen. Näissä olosuhteissa 90-100%: n transdusoidut solut olivat resistenttejä puromysiinille, mikä osoittaa, että ainakin suurin osa soluista, moninaisuus transduktion oli suurempi kuin yksi. Transductions eristämiseen yhden kloonit olivat sen sijaan suoritetaan vaihtelevalla laimennoksilla lentivirusvektoreita perustuu ainetiitterit arvioitiin ELISA: lla suunnattu HIV-1 p24-kapsidiproteiinia (INNOTEST HIV-antigeeni-mAb, Innogenetics, Gent, Belgia). Sata solut ympättiin per kuoppa 96-kuoppalevyille DMEM: ssä. Puromysiiniselektion levitettiin 24 transduktion jälkeen lisäämällä puromysiiniä pitoisuuksilla 0,6 ug /ml HEK-293T-soluissa, 0,6 ug /ml HEK-293T-CD4

+ soluja, 0,5 ug /ml Messa10K soluja. Valitsimme olosuhteissa, joissa keskimäärin 5 kuoppiin levyä kohti aiheutti positiivisen solun kasvua puromysiinin läsnä ollessa. Näissä olosuhteissa, moninaisuus transduktion oli 5×10

-4 per solu varmistaa, että kussakin kuopassa solupopulaation tuotettiin transduktio yhdellä lentivirusvektori.

monistaminen ja sekvensointi dCK-koodausta osa proviraalisen DNA

Puromysiiniresistentit kloonit F27-RL ja F11-DL sukupolvien eristettiin rajoittavalla laimennoksella ja laajennettiin 6-kuoppaisilla levyillä. Solujen yksittäisistä klooneista otettiin sitten talteen ja lyysattiin 250 ui Cell Suora PCR (Viagen Biotech, Los Angeles, CA, USA). DCK: ta transgeenin monistettiin 1 ui lysaattia oligonukleotideilla on vektori, EF 1 (5′-gatgtcgtgtactggctccg-3 ’) ja PGK (5-gatgtggaatgtgtgcgagg-3’), jotka reunustavat siirtogeeniä. Sekvensointi PCR-fragmentti suorittaa GATC sekvensointi palvelu (GATC Biotech, Konstanz, Saksa).

laskeminen taajuuden mutaatioiden kirjastoissa

F27-RL ja F11- DL kirjastot määrä mutaatioita esiintyy dCK koodaavan sekvenssin laskettiin alkaen tiedot on esitetty taulukossa 1, kun: (m /(783 xc)) /y, jossa m on mutatoitujen kantojen, 783 on koko dCK koodaavan-sekvenssin emäsparia, c on määrä klooneja sekvensoitiin ja y on syklien lukumäärä retrovolution suorittaa. Sillä F11-DL kirjasto käynnistysjakso laskemiseksi mutaationopeudet oli sekvenssi G12.

Permutation testit esiintymistä synonyymejä ja muiden synonyymi mutaatiot pitkin dCK proteiini

permutaatio suoritettiin simuloimalla esiintyminen mutaatioiden kaksi puolikasta proteiinia koodaavan sekvenssin (eli kummallakin puolella kodonin 130), joka perustuu havaittu esiintymistiheyden satunnaisten mutaatioiden ja etuoikeutetut mutaatioiden APOBEC3F konsensussekvenssejä (29,1 ja 70,9%: lla, katso taulukko 1). Suhteellinen esiintyvyys synonyymi ja ei-synonyymi mutaatioita saatu kokeellisesti verrattiin 10000 simuloitu aineistoja. Osuus simuloitu aineistojen ulkopuolisten synonyymi /synonyymi (dN /dS) mutaatio suhdeluvut pienempi tai yhtä suuri kuin todellinen aineisto otettiin sitten niin todennäköisyys, että oli merkittävä taipumus alueella harkita esiintymisen enemmän synonyymejä mutaatioista kuin odotettiin on stokastinen pohjalta. Sitä vastoin osuus simuloitu mittausmuistien dN /dS suhde suurempi tai yhtä suuri kuin todellinen aineisto oli sitten otetaan todennäköisyys, että oli merkittävä taipumus alueella harkita esiintymiseen enemmän kuin synonyymi mutaatioita kuin odotettiin on stokastinen perusteella.

Testit herkkyys syöpälääkkeiden

solut, integroitu lentivirusvektorilla genomit (G12, M36, yhden tai kahden mutantit) ympättiin 5 000 solua per kuoppa 96 kuoppaiset levy ja kasvatettiin yön yli 37 ° C: ssa. Kunkin populaation kokeet suoritettiin kahtena kappaleena. Kaksitoista tuntia ymppäyksen jälkeen, kasvavien pitoisuuksien gemsitabiinin (0-400 nM), tai AraC (0-10 mM) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja jäljellä viljelmässä vielä 72 tuntia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttäen MTT-testiä (CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega, Fitchburg, WI, USA) ja elävien solujen lukumäärän kussakin kuopassa arvioitiin mittaamalla OD 570 nm: ssä. Kunkin väestön osa eläviä soluja laskettiin OD570 pitoisuus X Gem /OD570 pitoisuus 0 Gem, arvioida herkkyys väestön aihiolääke.

herkkyystestille viruslääkkeille

Lentivirusvektorit tuotettiin transfektoimalla käyttämällä kalsiumfosfaatti-protokollaa, HEK-293T-solut 10 ug pCMV ΔR8.91 plasmidi [35], 5 ug pHCMV-G-plasmidi [36], ja 10 ug genomista plasmidissa SDY-dCK (kuvattu Rossolillo et al. [34]) sen SIN versiossa (katso tulokset), joka koodaa joko villityypin sekvenssin ihmisen dCK tai M36 variantti. Useat transductions, käyttäen eri määriä lentivirusvektorin, suoritettiin 1×10

6 HEK-293T-CD4 + -solut [37], ja transdusoidut solut valittiin, kun läsnä oli 0,6 ug /ml puromysiiniä, lisätään 24 transduktion jälkeen. Vain transduktio olosuhteissa antaa 50-200 yksittäisiä puromysiiniresistenttejä klooneja (kukin klooni, joka on johdettu solusta transduktio yhdellä lentivirusvektorilla) on säilytetty ja kaikki kloonit yhdistettiin ja laajennettiin saatiin polyklonaalista HEK-293T-CD4 + solupopulaation joko ilmaiseminen ylimääräinen kopio wt dCK entsyymiä tai yhden kopion M36 (HEK 293T /CD4

+ – SINvec-wtdCK tai HEK 293T /CD4

+ – SINvec-M36, vastaavasti). Vektorit tehokkuuden valvomiseksi transduktion läsnä viruslääkkeiden tuotettiin transfektoimalla kaksitoista 10-cm maljoille, jotka sisälsivät 5×10

6 HEK 293T-solut 10 ug pTopo plasmidi, johon sekvenssi, joka koodaa HIV-1 vaipan ADA [38] oli lisätty [39], ja 10 ug pNL4.3-Env

-Luc +, joka koodaa tulikärpäsen lusiferaasi, kuten aiemmin on kuvattu [40]. Saatu lentivectors konsentroitiin kuten aikaisemmin on kuvattu [34]. Transduktio 2.5×10

5 HEK 293T /CD4

+ – SINvec-wtdCK solut ja HEK 293T /CD4

+ – SINvec-M36 soluja suorittaa rinnakkain käyttäen 1 ml: aan väkevää lentivirusvektorikirjastojen. Viisi tuntia transduktion jälkeen solut ympättiin 5×10

4 solua /kuoppa 6-kuoppaiselle levylle, kun läsnä on kasvavia pitoisuuksia anti-virus yhdisteitä ddC tai 3TC. Tehokkuutta transduktio seurattiin 48 tuntia transduktion jälkeen läpi lusiferaasi-geenin. Tätä varten väliaine poistettiin, solut pestiin kahdesti PBS: llä, lyysattiin, sentrifugoitiin ja supernatantti käytettiin sitten mitataan lusiferaasiaktiivisuus mukaan valmistajan protokollan (Promega, Fitchburg, WI, USA), jossa on Glomax luminometrillä (Promega, Fitchburg, WI, USA), kuten aiemmin on kuvattu [40].

Western blot -analyysit

Messa10K, jotka ilmentävät joko M36, niin yhteydessä lentivirus- vektori-DNA, jossa on funktionaalinen LTR tai inaktivoidulla LTR lysoitiin 1X RIPA-puskurissa (25 mM Tris-HCI, 1% IGEPAL, 0,1% SDS, 0,5% Natriumdeoksikolaatti, 150 mM NaCl: a, proteaasi-inhibiittori) ja 30, 60 ja 120 ug kokonaisproteiinia (arvioitiin Bradfordin menetelmällä) kunkin solutyypin ladattiin 12% bis-trisiini geeli (Invitrogen, Carlsbad, NM, USA). Siirron jälkeen PVDF-kalvo, dCK proteiinit analysoitiin Western Blot 1: 4000 laimennus polyklonaalista anti-dCK-vasta-ainetta (kanin, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja 1: 3000 laimennus anti- kani HRP konjugoituna sekundaarinen vasta-aine (BioRad, Hercules, CA, USA), jossa sitoutuminen on kemiluminesenssilla (Pierce ECL Western blotting alustan, Thermo Scientific).

tuotto ja puhdistus rekombinanttisen dCK proteiinien

wT-dCK ja M36 sekvenssit kloonattiin pET14b plasmidiin ja ilmentää

E

.

coli

solujen BL21 DE3 pLysE. Proteiinin ilmentyminen indusoitiin lisäämällä 0,1 mM IPTG: tä ja solut kerättiin sen jälkeen, kun 4 h kasvun 37 ° C: ssa. His-merkitty proteiinit eluoitiin 250 mM imidatsolia Hänen-Trap TM FF Pylväät (GE Healthcare Life Science, Little Chalfont, UK), histidiinileimasta poistettiin käyttäen S-Tag Trombiini Purification Kit (Novagen, Madison, WI, USA ), ja dCK ja M36 puhdistettiin edelleen geelisuodatuksella S-200 Sephacryl sarakkeet (GE Healthcare Life Science, Little Chalfont, UK).

fosforylaatiomääritys testejä

in vitro

tehokkuus fosforylaation luonnollinen substraatti deoksisytidiinin ja aihiolääkkeiden gemsitabiinin ja AraC mitattiin puhdistettua wt-dCK ja M36 on NADH perustuva määritys, kuten aikaisemmin on kuvattu [41]. Kaikki reagenssit hankittiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), lukuun ottamatta gemsitabiini (Lilly, Indianapolis, IN, USA). Entsyymit analysoitiin huoneenlämmössä pitoisuudessa 0,9 uM dC, ja 0,3 uM sekä gemsitabiinia ja AraC. dC käytettiin pitoisuuksina 5 ja 50 uM, gemsitabiini pitoisuuksina 20 uM ja 1 mM, ja AraC pitoisuuksina 10 uM ja 0,5 mM. ATP käytettiin pitoisuutena 4 mM.

Tilastolliset analyysit

Sen arvioimiseksi, onko keskimääräinen määriä solukuoleman esiintyvien Messa10K populaatiot sisältävät eri dCK variantteja olivat merkittävästi poikkeaa arvosta osoittama Messa10K wt-dCK, kahden otoksen t-testiä sovellettiin eri pitoisuuksia Gemsitabiini.

tulokset

Osuus yksittäisten mutaatioiden G12 herkistymiseen gemsitabiiniannokseen

käyttämällä uutta menetelmää suunnatun ihmisen geenin evoluutio, että olemme kehittäneet laboratoriossamme olemme aiemmin kuvattu eristämisen ja karakterisoinnin dCK mutantti, nimeltään G12, joka indusoi herkistyminen syöpäsolujen hoitoon syöpää torjuva yhdiste gemsitabiinin [34]. G12 on tunnettu siitä, että kolme mutaatiota suhteessa villityypin dCK entsyymiä. Se on kuitenkin pysynyt määrittelemätön onko herkistymistä aktiivisuuden havaittiin G12 riippuu läsnä kaikki kolme mutaatiota, ja jos on, mitä suhteellinen osuus kaikkien näiden mutaatioiden G12 fenotyyppi on. Näiden ongelmien ratkaisemiseksi, rakensimme kuusi mutantteja, kolme joissa on joko E171K, The E247K, tai L249M mutaatio yksin, ja kolme, jotka sisältävät kaksi mutaatiota kumpikin, joka kattaa kaikki mahdolliset yhdistelmät kaksoismutanteissa (E171K /E247K, E171K /L249M, ja E247K /L249M). Mutantit lisätään aiemmin kuvattu pSDY plasmidi [34], ja käytettiin transfektion transkomplementaatiota plasmideja, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät, jotta saadaan aikaan lentivirusvektoreita. Suhteessa pSDY plasmidit olemme aikaisemmin on kuvattu [34], plasmidit käytimme (pSDY-SIN) sisälsi osittain poistettu ja sen vuoksi ei-funktionaalisia version 3 ”U3-sekvenssi (kuvio 1A). Tuloksena lentivirusvektoreita syntyy, kun käänteistranskriptio, toimimaton LTR-sekvenssit ja siksi kutsutaan itsestään inaktivoiva (SIN) vektoreita (SDY-SIN meidän tapauksessamme). Nämä lentivectors valittiin tätä testiä varten niiden asiaankuuluvuus biolääketieteen sovelluksiin. Verrokkeina, G12 ja p- dCK sekvenssit myös lisättävä pSDY-SIN plasmidiin. Kunkin variantin dCK, The lentivectors käytettiin luomaan polyklonaalinen populaatio Messa 10K soluja. Nämä polyklonaaliset populaatiot (SINvec-G12 väestön G12, SINvec-wt dCK varten paino dCK, SINvec-E171K varten E171K mutantteja, ja niin edelleen) tuotettiin transdusoimalla 10

6 HEK 293T-solujen eri määriä lentivirusvektorikirjastojen vuonna saadakseen jälkeen puromysiiniselektion, 50-200 yksittäistä kloonia. Tällä tavoin kukin klooni lähes varmasti johdettu solu, joka sisältää yhden integroidun kopion proviraalisen DNA: ta. Kloonit yhdistettiin sitten varmistaa, että tuloksena oleva väestö koostuu solut, joilla on samat siirtogeenin, mutta geeni integroidaan eri paikkoihin genomissa, jolloin keskimäärin yli mahdolliset vaikutukset, jotka voivat johtua integraatiokohdan. Se, että solut sisälsi yhden kopion siirtogeenin sallittu poissulkemista, verrattaessa populaatiot toistensa kanssa, mahdollisten annosta johtuvat vaikutukset määrää siirtogeenin integroitu. Herkistyminen on gemsitabiinihoidon sitten arvioitiin MTT testeissä. Tätä varten eri Messa 10K polyklonaalisia populaatiot μded 96-kuoppaisille levyille, altistettiin vaihtelevia pitoisuuksia gemsitabiinin, ja solujen eloonjääminen mitattiin kunkin kunnossa, kuten aikaisemmin on kuvattu [34].

paneeli A. Structure genomisen RNA: n tuottama transkription transfektion jälkeen solujen pSDY-SIN plasmidit. R, toistuva sekvenssi HIV-1 genomin; U5, 5 ”ainutlaatuinen sekvenssi HIV-1 LTR; Cis-vaikuttavan, tarvittavat sekvenssit pakkaamista ja käänteistranskriptio genomisen RNA: n; EF1-alfa, ihmisen elongaatiotekijä 1-alfa-promoottorin; hPGK, ihmisen fosfoglyseraattikinaasipromoottorin; Puro, puromysiini-N-asetyyli-transferaasi-geenin; ΔU3, osittain poistetaan versio 3 ”ainutlaatuinen sekvenssi HIV-1 LTR. Paneelit B ja C. osuus elävien solujen yli kokonaismäärä solujen konsentraation funktiona on gemsitabiini annetaan suhteena suhteessa elävien solujen havaittiin lääkkeen poissaollessa. Valkoinen symbolit edustavat viite populaatiot sekä paneelien ja. harmaa symbolit edustavat yhden ja kahden hengen mutantit (kuten kuvattu varsinainen teksti). Koska yhden ja kahden hengen mutantit testattiin rinnakkain samassa kokeessa. Tiedot ovat keskiarvo 3 riippumattoman kokeen. Virhe palkit ei ole esitetty selvyyden vuoksi.

kolme yhden mutantit (harmaa symbolien kuvio 1 B) saatiin vastekäyrät samaa luokkaa kuin viite paino dCK väestöstä (valkoiset neliöt). Samat tulokset saatiin kaksoismutanteissa E171K /E247K ja E247K /L249M (harmaa kolmiot ja ympyröitä kuviossa 1C, vastaavasti). Kaikki kolme yksittäiset mutantit ja kaksi kolmesta kaksinkertainen mutantit testattiin kyenneet indusoimaan gemsitabiinin herkistymistä tehokkaammin kuin on saavutettavissa ylimääräinen kopio paino- dCK geenin. Kolmas Kaksoismutantissa E171K /L249M (harmaa neliöt kuviossa 1 C), saatiin samanlainen tulos kuin mikä todettiin paino- Messa 10K solut (valkoiset kolmiot kuvassa), mikä viittaa siihen, että inaktivointi dCK aktiivisuuden tapahtunut tämän mutantti, jättäen solut riistää dCK aktiivisuuden (kuten on laita alkuperäisen Messa 10K linja). Lopuksi koska mikään yhden ja kahden hengen mutantit osoittivat vastaus käyrä samanlainen kuin G12 (valkoinen piireissä kuvassa), samanaikainen läsnäolo kolme mutaatiota ilmeisesti saavuttaminen edellyttää herkistymistä fenotyyppi havaittu G12.

Generation kirjastojen avulla ”random” vs. ”suunnattu” evolution

G12 mutantti oli eristetty, alkaen paino dCK sekvenssi, kirjastosta dCK variantteja jälkeen saatu 17 sukupolvea retrovolution (nimeltään F16 , ensimmäisen sukupolven koostuessa vanhempien vektorit P [34]). Täällä, tutkimme suorittamista retrovolution alkaen G12-sekvenssin sijasta wt dCK järjestyksessä, antaisi mutanttien edelleen parannettu fenotyyppi. Tätä tarkoitusta varten HEK 293T-solulinja ekspressoi stabiilisti G12, että olemme aiemmin luotu [34], käytettiin aloittaa 11 sykliä retrovolution, transfektiolla transkomplementaatiota plasmidien pCMVΔR 8,91 ja pHCMV-G [35, 36], kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät sekä hahmoteltu kuviossa 2. Tämä johti sukupolven väestön HEK 293T solun kirjasto kutsumme F11-DL (varten F11 suunnattu kirjasto). Samanaikaisesti, voidakseen arvioida mahdollisuutta eristää mutantteja parannetun fenotyypin suhteen G12 yksinkertaisesti jatkamalla retrovolution menettely, joka johti eristämiseen G12, myös suoritetaan vielä 11 sykliä retrovolution koko F16 perusjoukko, josta G12 eristettiin [34], jotta saavutetaan F27 sukupolven (kutsumme F27-RL varten F27 satunnainen kirjasto).

yleisrakenne genomisen RNA: iden käytetty retrovolution annetaan huipulla, on vasemmalle varten F16 väestölle ja oikealla väestölle sisältää vain G12 variantti. Menettely on kuvattu aikaisemmin [34], ja koostuu toistuvista transduktion HEK 293T-solut lentivirusvektoreita seuraa valinta, puromysiinin, solupopulaatioiden, jotka ovat stabiilisti integroineet provirus-DNA, joka on valmistettu käänteistranskriptiolla. Transfektio tämän väestön transkomplementaatiota plasmideilla pHCMV-G ja pCMVΔ8.91 (katso varsinainen teksti) avulla voidaan valmistaa seuraavan vektorin sukupolven, jota sitten käytetään transdusoimaan tuoretta HEK 293T-solut aikana toistuvien valinta transfektio ja transduktio. Seulonnassa, kohdesoluja transdusoidaan vähemmän kuin yksi lentivector hiukkasen solua kohti, ja yksittäiset kloonit eristettiin puromysiinin läsnä ollessa. Seulonta herkistyminen erilaisten yhdisteiden suoritetaan kuvatulla varsinaisessa tekstissä.

yksittäisten kloonien eristämiseksi kustakin kirjastosta, viimeisen jakson retrovolution F10-DL ja F26-RL viruksen kaltaiset populaatiot käytettiin itsenäisesti transdusoimaan tuoretta HEK 293T-soluja lukuisia vektorin so- lua kohden, joka oli huomattavasti pienempi kuin 1. transdusoidut solut ympättiin 96-kuoppalevyille, ja valinta puromysiinin sovellettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät, niin siten, että kukin klooni sisälsi yhden kopion siirtogeenin. Yksittäisiä klooneja laajennettiin ja niitä käytettiin sekvenssianalyysi. Toiminnallisesta seulonta kirjastojen, HEK 293T kloonit eristettiin tällä menetelmällä transfektoitiin transkomplementaatiota plasmidit, ja tuloksena virusten kaltaiset populaatiot käytettiin transdusoimaan Messa 10K soluja polyklonaalisten populaatiot, kuten edellä on kuvattu. Saatu populaatiot käytettiin testausta varten herkkyyttä syöpälääkkeiden ja antiviraaliset yhdisteet.

sekvensointi kirjastojen

arvioimiseksi kirjaston kompleksisuuden ja luonnehtia luonne mutaatiot aikana 11 sykliä retrovolution jotka tehtiin DL ja RL kirjastoissa, 41 HEK 293T kloonit F27-RL ja 43 päässä F11-DL sekvensoitiin DCK-koodaavan alueen, PCR-monistamisen jälkeen päässä proviruksen DNA: sta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.