Krooninen sairaus

tiivistelmä

proteiinit IQGAP perheen näyttö monimutkaista ja usein ristiriitaisia ​​toimintaa kasvainten synnyssä. IQGAP1 on hyvin dokumentoitu onkogeeninen ja IQGAP2 on otaksuttu kasvain heikentävän toiminto. IQGAP3 on viimeisin lisäys tähän perheeseen ja sen rooli syövän kehittymisessä on määriteltävä. Tässä osoitamme IQGAP3 ilmentyminen lisääntyy selvästi keuhkosyövän kudoksissa sekä mRNA ja proteiini tasoilla. Yliekspressio IQGAP3 edistää kasvainsolujen kasvua, ja muuttoliike ja invaasio, kun taas knockdovvn IQGAP3 näytteillä päinvastaisia ​​vaikutuksia. Lisäksi tukahduttaminen IQGAP3 on keuhkosyöpä solulinja vähensi tuumorigeenisyyden näiden solujen keuhkokudoksessa suonensisäisen injektion jälkeen. Lisäksi osoitimme, että IQGAP3 pystyy vuorovaikutuksessa ERK1 ja parantaa sen fosforylaatio hoidon jälkeen EGF. Nämä tiedot viittaavat siihen, että IQGAP3 voivat myötävaikuttaa patogeneesiin keuhkosyöpä moduloimalla EGFR-ERK-signalointia.

Citation: Yang Y, Zhao L, Xu QW, Wang XS, Zhang Y, Zhang J (2014) IQGAP3 Edistää EGFR-ERK Merkinanto ja kasvu- ja metastaasin Lung Cancer Cells. PLoS ONE 9 (5): e97578. doi: 10,1371 /journal.pone.0097578

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 helmikuu 2014; Hyväksytty: 21 huhtikuu 2014; Julkaistu: toukokuu 21, 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ sai tukea National Basic Research Program of China (2011CB946103), National Natural Sciences Foundation of China (31330025 ja 30830091), Peking Municipal Natural Science Foundation (7122104) ja 111 Project Kiina (B07001). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä ensimmäisellä sijalla syöpään liittyvän kuolleisuuden sekä Kiinassa että maailmanlaajuisesti [1], [2]. Kiinassa on noin 300000 uutta keuhkosyöpää ja yli 250.000 kuolemaa tähän tautiin vuosittain [3]. Histologisesti, peräti 85% keuhkosyövässä ovat ei-pienisoluinen tyypin keuhkosyöpä (NSCLC), ja suurin osa näistä ovat joko adenokarsinooma tai okasolusyöpä [4] – [7]. Koska keuhkosyöpä voi olla piilevä, useimmat potilaat ovat käyttökelvottoman ja on etäpesäkkeitä alueellisiin imusolmukkeisiin tai kaukaisiin kohtiin aikaan diagnosoitu. NSCLC potilaalla on etäispesäkkeitä hengissä lyhyen aikaa (9-12 kuukautta) [5], [8]. Siksi on kiireellisesti selvittää molekyylitason mekanismeja, jotka johtavat invaasiota ja etäpesäkkeiden keuhkosyövän [9], [10]. Tällaiset tiedot helpottavat kehittämistä Uusien hoitomuotojen mahdollistaa parantaminen tulos keuhkosyöpäpotilaita [11], [12].

hoitomenetelmät EGF tai EGFR tarjoavat lupaavan suuntaan keuhkosyövän hoidossa [13], [14]. EGFR ilmentyy normaaleissa soluissa epidermaalinen mesenkymaaliset ja neurogeeninen alkuperää, ja sen aktivointi on tarkasti valvottua normaaleissa kudoksissa [15], [16]. Kuitenkin sitovat EGFR sen ligandin tulokset reseptorin homo- tai heterodimerisaatio, ja aktivointi luontaisen tyrosiinikinaasiaktiivisuuden [17]. Alavirran signalointiryöpyn siis aloitetaan, lopulta johtaa muutoksiin kuten solujen käyttäytymistä kuten proliferaatiota, vaeltamisen ja erilaistumisen [15], [16]. Tärkeää on, että konstitutiivinen aktivointi EGFR tai parannettu EGF signalointia esiintyy usein erityyppisten syöpien, erityisesti keuhkosyöpä, jossa se liittyy syövän aloittamista, kasvaimen kasvua /eteneminen, metastaasin ja heikkoon ennusteeseen [17] – [20].

IQGAP proteiinien perhe on hyvin säilynyt organismien hiivasta nisäkkäisiin [21]. Se käsittää kolme jäsentä, IQGAP1, IQGAP2 ja IQGAP3 [22] – [24]. Näistä IQGAP1 on parhaiten tutkittu [25]. Nimi IQGAP on johdettu useista toiminnallisten domeenien näitä molekyylejä satama kuten neljä IQ motiiveja ja RasGAP liittyvä domeeni (GRD) [26], [27]. IQGAP1 sisältää myös otaksuttu kela-kela homodimerisoitumisessa verkkotunnuksia, tryptofaanin toista motiivi (WW) tuntemattoman funktion, joka on calponin-homologiadomeeni (CHD), joka on yhteydessä F-aktiini ja RasGAP_C-terminaalissa (RGCt), joka toimii yhdessä lukuisten proteiinien lukien E-kadheriinin ja β-kateniinin [27]. IQGAP1 on ehdotettu toimivan sääntelyn solun tukirangan ja solumigraatio [28] – [30]. On myös todisteita, jotka osoittavat, IQGAP1 on tärkeä rooli syövän etenemisessä [31], [32]. Sen sijaan, IQGAP2 näyttää toimivan tuumorisuppressorina [33]. IQGAP3 on viimeisin lisäys tähän perheeseen [24]. Käytettävissä olevien tietojen mukaan se osallistuu leviämisen epiteelisolujen [34], [35], mutta sen roolia kasvainten synnyssä on vielä määrittämättä. Esillä olevassa tutkimuksessa, tarjoamme ensimmäinen näyttö siitä, että IQGAP3 edistää keuhkosyöpää kasvua ja etäpesäkkeiden parantamalla EGFR-välitteisen ERK-signalointia. IQGAP3 voi siis olla rooli samanlainen kuin IQGAP1 kasvainten synnyssä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tämä hyväksyi tutkimuksen eettisten toimikuntien Pekingin yliopiston Health Science center (Beijing, Kiina) ja 306. sairaala kansan vapautusarmeija Kiinan (Peking, Kiina). Sillä Eläinkokeissa yritettiin minimoida kärsimyksen ja havainnoiminen kärsimys oli liian suuri, inhimillinen eutanasian käytettiin. Kirjallinen suostumus saatiin yksittäisten potilaiden käyttöön kudosnäytteiden.

Cell Lines and Patient näytteet

A549 ja Hela-soluja viljeltiin RPMI 1640-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Life Technologies , Carlsbad, CA, USA). HEK293T-soluja viljeltiin DMEM-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia. Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä.

soluviestitykseen määrityksissä solut seerumin evätty (0,5% naudan sikiön seerumia) 16 tuntia ennen stimulaatiota 100 ng /ml EGF (Peprotech, Rockville, NJ, USA) eripituisia aikoja kuten.

25 pariksi keuhko- kasvainkudoksessa ja viereisen normaali kudosnäytteet saatiin 306. sairaalan kansan vapautusarmeijan Kiinassa.

Plasmidit ja transfektio

Myc-pCAGGS-IQGAP3 ja ohjaus pCAGGS vektorit ystävällisesti tri Kozo Kaibuchi. HA-merkitty ERK1 tai ERK2 ilmentävillä vektoreilla konstruoitiin standardeilla molekyyligenetiikan tekniikoilla ja varmistettiin sekvensoimalla.

Solut transfektoitiin jetPRIME transfektioreagenssin (Polyplus transfektio, Illkirch, Ranska).

siRNA transfektio ja Lentivirusvektorikonstruktit Infektio

sirna oligonukleotidit (oligot) vastaan ​​IQGAP3 tai ohjata siRNA oligonukleotidit saatiin GenePharma Co., Ltd (Shanghai, Kiina). Kohdistuksen sekvenssit näiden siRNA: iden olivat seuraavat: si IQGAP3-1:5′- GAGCCAACCAGGACACUAA-3 ’; si IQGAP3-2:5’- GGCAGAAACUAGAAGCAUA-3 ’; ohjaus siRNA: 5’UUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ’. siRNA oligot (50 nM) transfektoitiin A549-soluihin jetPRIME transfektioreagenssin.

Vaihtoehtoisesti siRNA kohdesekvenssi kloonattiin lentivirusvektorin pLL3.7. Kun sekvenssi todentamisen shRNA plasmidi ja pakkaamista vektoreiden psPAX2 ja PLP /VSVG transfektoitiin pakkaukseen solulinjaan HEK293T- avulla jetPRIME. Väliaine vaihdettiin 8 h transfektion jälkeen. 48 tuntia myöhemmin, viruksen supernatanttia kerättiin ja inkuboitiin A549-solulinjan läsnä ollessa 8 ug /ml polybreeniä (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA). Stabiilisti transfektoitu solulinja valinta, GFP-fluoresenssi käytettiin lajittelu merkki. Solut, joissa 75% infektiotehokkuus käytettiin lisäanalyysiä.

käänteistransskriptaasi-PCR ja reaaliaikainen PCR

TRIzolia (Life Technologies) käytettiin eristämään kokonais-RNA ja sitten käänteistranskriboitiin cDNA: ksi, jonka Reverse Transcription System (Promega, Madison, WI, USA). Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR suoritettiin Bio-Rad Real-Time PCR-järjestelmä. Sekvenssit reaaliaikaisen alukkeiden IQGAP3 olivat seuraavat: eteenpäin, 5′-GTTCATCCATAGAGCCTGCCA-3 ’; käänteinen, 5’-GCGATGCTCTCACCAATAAGG-3 ’. Reaaliaikainen alukkeet GAPDH on kuvattu, ennen kuin [36]. Geenien ilmentyminen kvantifioitiin, koska saanto IQGAP3 suhteessa, että GAPDH.

immunosaostus ja Western blot -analyysi

Myc-IQGAP3 ja HA-ERK1 tai HA-ERK2 rakenteet transfektoitiin HEK293T-soluissa. Solut kerättiin ja lyysattiin lyysauspuskurissa proteinaasinestäjä cocktail (Roche, Basel, Sveitsi) ja fenyylimetyylisulfonyylifluoridia. Sitten solulysaateista inkuboitiin hiiren anti-HA-mAb (Sigma-Aldrich), anti-Myc-mAb (Sigma-Aldrich), tai kontrollivasta-ainetta (mIgG) (Sigma-Aldrich) ja proteiini-A-Sepharose (GE Healthcare, USA) ja SDS-PAGE. Endogeenisen immunosaostus, solulysaattia valmistettiin A549-soluja ja immunosaostettiin kanin anti-ERK1 mAb (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA).

western blot-analyysi, yhtä suuret määrät proteiinia kustakin näytteestä ladattiin ja ratkaistu SDS-PAGE ja siirrettiin blotteja. Sen jälkeen esto, blotit kanssa osoitti vasta-aineilla ja arvioidaan Odyssey Imaging System (LICOR Bioscience, Lincoln, NE, USA). Käytetyt vasta-aineet sisältyvät anti-GAPDH (Bioworld Technology, Inc., St. Louis Park, MN, USA), anti-IQGAP3 (Sigma-Aldrich), anti-ERK (Cell Signaling, Beverly, MA, USA), anti-fosfo-Erk

Thr202 /Tyr204 (Cell Signaling), anti-fosfo-p38

Thr180 /Tyr182 (Cell Signaling), anti-fosfo-Akt

Ser473 (Cell Signaling), anti-Myc, ja anti-HA.

Tissue microarray ja immunohistokemia

keuhkosyöpä kudosta mikrosiru (TMA) ostettiin Chaoying Biotechnology Co. (Xi’an, Kiina). Leikkeitä inkuboitiin anti-IQGAP3-vasta-ainetta (laimennos 1:50) yön yli 4 ° C: ssa. Primaarista vasta-ainetta tunnistettiin käyttämällä piparjuuriperoksidaasilla entsyymillä leimattu polymeeri on konjugoitu vuohen anti-hiiri-vasta-aineella (Promega). Värjätyt leikkeet tarkistetaan ja tekee patologi. Negatiivinen kontrolli oli normaali ihmisen keuhkokudoksen.

proliferaatiomääritystä

Solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 3 x 10

3 solua /kuoppa. Soluproliferaatiota arvioitiin 24 tunnin välein käyttäen Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Japani). Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena.

Cell Migration ja invaasiomääritys

Migration määritykset suoritettiin 24-kuoppaisella Kemotaksia kammio (8-um huokoskoko, Corning Life Sciences, Corning, NY, USA) päällystettiin 10 ug /ml fibronektiiniä (Sigma-Aldrich). Solut (3~5 × 10

4 solua /kuoppa) 200 ui seerumitonta RPMI 1640 ympättiin saliin. Sitten 600 ui RPMI 1640 10% naudan sikiön seerumia tai 100 ng /ml ihmisen EGF lisättiin alempaan kammioon. Solut ylemmässä kammiossa poistettiin vanupuikolla kuluttua 20 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Solut pohjaan kiinnitetyn kalvojen kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin kristallivioletilla. Aste maahanmuuton ilmaistiin keskimääräisenä solujen kuudella 10 x kentät.

Cell invasion määritykset suoritettiin olennaisesti samalla tavalla kuin migraatiokokeessa, paitsi, että ylempi kammio peitettiin 30 ui Matrigel (0,5 mg /ml; BD Biosciences). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Luciferase Reporter Assay

Elk-1 transkriptionaalisen aktiivisuuden mitattiin Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). IQGAP3 siRNA tai NC-siRNA oli kotransfektoitiin A549-soluja plasmideilla pFR-Luc (reportteriplasmidi), pFA2-Elk-1 (transaktivaattoria plasmidi) tai PRL-TK. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin solut olivat ilman seerumia 16 tunnin ajan, sitten stimuloitiin kanssa tai ilman 100 ng /ml EGF: ää ja 6 tuntia. Solut kerättiin ja lysoitiin. Kaikki reportteri määritykset toistettiin ainakin kolme kertaa kolmena kappaleena. Tulikärpäsen lusiferaasi ja Renilla lusiferaasin aktiivisuus mitattiin Centro LB960 luminometrillä (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Saksa). Tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuus laskettiin ja normalisoitu perustuvat Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Lusiferaasiaktiivisuutta hallinnassa siRNA-transfektoiduissa soluissa ilman EGR stimulaatiota asetettiin 1.

tuumorietäpesäke Analyysi

in vivo

NOD /SCID-hiiriä hankittiin Vital River Laboratory Animal Technology Co Ltd (Peking, Kiina). Hiiriä kasvatettu patogeenittomassa laitos Pekingin yliopiston Health Science Center (Beijing, Kiina).

A549-soluja infektoitiin ohjaus shRNA tai shIQGAP3 lentivirukset. -Soluja (1,5 x 10

6) 0,1 ml: ssa PBS: ää injektoitiin häntälaskimoon 6 viikon ikäisten NOD /SCID-hiiriin. Kuusi viikkoa infektion jälkeen, hiiret tapettiin taittamalla niiltä niskat. Sitten keuhkot poistettiin, punnittiin, valokuvataan, ja kiinnitettiin 4% formaliiniin. Kudosleikkeet myös värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla (H 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

IQGAP3 Expression on yliaktiivista Keuhkosyöpä Tissue

mahdollinen rooli kasvainten synnyssä oli ensimmäinen ehdottanut IQGAP3 bioinformatiikan analyysit IQGAP3 ilmaisun kasvainkudoksessa. ECgene (https://genome.ewha.ac.kr/ECgene/) osoitti kohonneita IQGAP3 erilaisia ​​kasvaimen kudoksia tai soluja alkuperää munasarja, keuhko, paksusuoli, mahalaukku, luuytimen ja rintojen (kuvio 1A ). RT-PCR ryhtyneet harjoittamaan tarkistaa nämä tiedot. Vaikka IQGAP3 ilmentyminen normaaleissa kudoksissa on rajoitettu paksusuolen, ohutsuolessa ja kiveksessä, korkea IQGAP3 mRNA havaittiin useita kasvaimia, mukaan lukien keuhkosyöpä, maksasyövän, munuaissyövän, mahasyövän, virtsarakon syöpä, paksusuolen syöpä ja leukemia ( dataa ei esitetty). Lisäksi näimme autovasta-aineiden tuotannon vastaan ​​IQGAP3 merkittävällä osalla potilaista, joilla IQGAP3-positiivisten keuhkosyöpä [37]. Tämä sai meidät edelleen tutkia toiminnan tämän molekyylin keuhkosyöpä kehittämiseen. IQGAP3 oli voimistunut mRNA tasolla 20 keuhkosyövän kudoksiin verrattuna viereiseen ei-syöpä kudosten 25 pariksi näytteistä reaaliaikaisella PCR-analyysi (kuvio 1 B). Olemme ensi tutkinut IQGAP3 proteiinin ilmentymistä kudoksessa array, joka sisältää 89 pariksi keuhkosyöpä kudoksia. Kohonneita IQGAP3 proteiinin havaittiin 80 syövän kudoksissa (kuvio 1 C ja taulukko S1). Huomattavaa on, että tilastollinen analyysi osoitti, että ei ollut olemassa merkittävää korrelaatiota IQGAP3 proteiinin säätelyä ja parametrit, kuten ikä, sukupuoli tai histologisia arvosana (taulukko S1).

(A) EST ilmentymisen analyysi IQGAP3 geenin normaalissa ja syöpäkudoksiin perustuu ECgene tietokantaan. (B) Quantitative real-time PCR for IQGAP3 ilmentymistä 25 paria keuhkosyöpää vastaan ​​viereisen ei-syöpä kudoksiin. IQGAP3 ilmentyminen normalisoitui vastaan ​​GAPDH. Suhteellinen tasot laskettiin kullekin näytteelle, ja arvo 1 annettiin viereisiin ei-syöpäkudoksessa potilaan 13. Kokeet toistettiin kolme kertaa. Tulokset yhdestä edustavasta kokeesta on esitetty keskiarvona ± SD. (C) immunohistokemiallinen analyysi IQGAP3 proteiinin ilmentymisen keuhkosyöpää vastaan ​​viereisen ei-syöpä kudoksiin. Kuvat ovat näytetään varten okasolusyöpä ja adenokarsinooma. Ca, Cancer kudos; Adj, viereisen ei-syöpä kudoksiin. Suurennos, × 200.

muuttaminen IQGAP3 Expression moduloi Growth, Migration ja Invasion kasvainsolujen

tutkimiseksi toiminnallinen seuraus yliaktiivista IQGAP3 ilmaisun syövän, me seurataan muutoksia solu käyttäytymiseen muuttamalla sen ekspressiotason syöpäsolulinjoissa. IQGAP3 ensin yli-ilmennetään HeLa-soluissa, jotka oli suhteellisen alhainen endogeenisen IQGAP3 ilmaisun. Yliekspressio IQGAP3 edistää solun proliferaatiota näissä soluissa (kuvio 2A). Lisäksi täytäntöön ilmentyminen IQGAP3 aikaan voimakkaampaa solumigraatioon ja invaasiota (kuvio 2B, C).

Myc-IQGAP3 tai kontrollivektoreihin transfektoitiin HeLa-soluissa ja sitten solut kerättiin 24 tunnin kuluttua transfektion maahanmuuton ja invaasiomääritys. Solujen lisääntymisen määrityksessä on korjattu ilmoitetuilla ajankohtana. (A) IQGAP3 proteiinin ilmentymistä transfektanttien varmistettiin Western-blottauksella. Solujen lisäkasvua tutkittiin käyttäen Cell Counting Kit-8. (B, C) Cell maahanmuutto- ja invaasion analyysit suoritettiin käyttäen Kemotaksia kammioita tai ilman pinnoitusta Matrigel. Kukin määritys toistettiin vähintään 3 kertaa. Tulokset yhdestä edustavasta kokeesta on esitetty keskiarvona ± SD. *,

P

0,05; ***,

P

0,001.

edelleen vaikutusten arvioimiseksi IQGAP3 on syöpäsolujen kasvua ja muuttoliike, IQGAP3 ilmentymistä tippuu alas keuhkosyövän A549 , joka oli suhteellisen korkea endogeenistä IQGAP3. Kaksi shRNA rakentaa erilaisille IQGAP3 sekvenssejä käytettiin, jotka molemmat johti tehokkaaseen downregulation IQGAP3 verrattuna epäspesifisen kontrolleihin (kuvio 3A). Kuten odotettua, pudotus on IQGAP3 tukahdutti leviämisen A549-soluja (kuvio 3B). Lisäksi vähennetään IQGAP3 ilmentyminen liittyi myös vähentynyt muuttoliike ja hyökkäyksen A549-soluja (kuvio 3C, D). On hyvin tiedossa, että EGFR signalointi on kriittisesti mukana keuhkosyöpä kehittämiseen. Siksi edelleen testata, onko IQGAP3 ilmentyminen voi moduloida solun herkkyyttä EGF ärsyke. Kuten kuvioissa 3E ja F, knockdovvn IQGAP3 aiheutti eston solumigraation ja invaasio samanlainen kuin aiheuttama EGF. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, IQGAP3 on onkogeeninen.

A549-soluja transfektoitiin shRNA konstruktioita, jotta pudotus endogeenisen IQGAP3 ilmaisua. (A) IQGAP3 proteiini tasoilla infektion jälkeen ohjaus (NC) tai kaksi erilaista shIQGAP3 Lentiviruksiin (KD1 ja Kd2). (B) lisäkasvua tutkittiin käyttäen Cell Counting Kit-8 lentivirus-tartunnan saaneiden A549-solut. (C, E) Migration of lentivirus-tartunnan A549-solujen kemotaktisen kammiossa määrityksessä ilman (C) tai läsnä ollessa (E), ihmisen EGF: ää (100 ng /ml). (D, F) Invasion of lentivirusta-tartunnan A549-solut poikki Matrigel puuttuessa (D) tai läsnä ollessa (F) ihmisen EGF. Kukin määritys toistettiin vähintään 3 kertaa. Tulokset yhdestä edustavasta kokeesta on esitetty keskiarvona ± SD. *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

0,001.

knockdovvn IQGAP3 Tukahdetut keuhkosyövän etäpesäke

Koska voimakas vaikutus IQGAP3 ilmentymisen lisääntymistä ja migraatio syöpäsolujen viljeltiin

in vitro

, me vieressä pyrittiin määrittämään, onko se vaikuttaa myös kasvainten synnyssä

in vivo

käyttäen vakiintunutta mallia metastaattisen keuhkosyövän [38], [39]. A549-solut kätkeminen lentivirusvektorilla ilmentävät IQGAP3-spesifisiä shRNA injektoitiin häntälaskimoon NOD /SCID-hiiriin. Eläimet lopetettiin päivänä 42 ja keuhkot poistettiin ja analysoitiin. Verrattuna mock valvontaa, IQGAP3 knockdown solut näyttivät olevan vähemmän tuumorigeenisia

in vivo

, ehdottivat vähentää huomattavasti suurimman ja paino vaikuttaa keuhkoihin (kuvio 4A, B). Immunohistokemiallinen värjäys paljasti, että suhteellisen normaali keuhkojen rakenne säilyy IQGAP3 knockdown ryhmiä, vaikka se oli lähes kokonaan tuhoutui useita kasvaimen kyhmyjä mock ohjaus (kuvio 4C). Ottaen liittyvä

in vitro

tiedot huomioiden, alennettu Tuumorigeenisuustutkimuksissa IQGAP3 Knockdown solujen

in vivo

voi johtua joko heikentynyt kolonisaation tai leviämisen tai molempia.

NOD /SCID-hiiret saivat suonensisäisenä injektiona 1,5 x 10

6 A549-soluja transfektoitiin stabiilisti shIQGAP3 (IQGAP3-Kd2) tai kontrolli-vektorit (NC), ja ne lopetettiin päivänä 42 tuumorin istuttamisen jälkeen (n = 7 kussakin ryhmässä). (A) Gross ulkonäkö keuhkojen kudoksia. (B) Lung paino. Vaaka- ja virhepalkkeja esittävät keskipaino ja keskihajonta. (C) H 0,01.

IQGAP3 vuorovaikutuksessa ERK1

Kuten ennusti Scansite (https://scansite.mit.edu/), IQGAP3 sisältää useita ERK D verkkotunnuksia, joiden tiedetään välittävän vuorovaikutuksen ERK perheenjäseniä. Tutkia tätä mahdollisuutta, transfektoimme HEK293T soluja Myc-IQGAP3 ja HA-ERK1 tai HA-ERK2 konstruktioita. Solulysaatti valmistettiin ja immunosaostettiin anti-HA tai anti-Myc-vasta-aineita. Saatu sakka rakenteellisesti havaittiin anti-Myc tai anti-HA. Se oli erityisen mielenkiintoinen, että immunosaostus IQGAP3 havaittiin ERK1, mutta ei ERK2 (kuvio 5A). Lisäksi olemme pyrittiin määrittämään, onko vastaavaa vuorovaikutusta tapahtuu endogeenisesti ilmaistuna proteiineja. Solulysaattia A549-soluja immunosaostettiin kanin anti-ERK1 mAb ja IQGAP3 todellakin havaittiin sakka anti-IQGAP3-vasta-ainetta (kuvio 5B). Nämä tulokset osoittavat, että IQGAP3 voi olla vuorovaikutuksessa ERK1, joko suoraan tai epäsuorasti suurempaa monimutkainen.

(A) Myc-IQGAP3 ja HA-ERK1 tai HA-ERK2 rakenteet transfektoitiin HEK293T soluihin. Solulysaatti valmistettiin ja immunosaostettiin hiiren anti-HA-mAb, anti-Myc-mAb tai kontrolli vasta-aineita (mIgG). Saatu sakka yhdessä käsittelemättömien lysaatin (Input) erotettiin SDS-PAGE, siirretään pyyhkii ja tutkittiin anti-Myc ja anti-HA. (B) vuorovaikutus IQGAP3 kanssa ERK1 tutkittiin myös A549-solujen endogeenisesti ilmaistaan ​​proteiineja. Solulysaatti valmistettiin A549-soluja ja immunosaostettiin kanin anti-ERK1 mAb. Läsnäolo IQGAP3, että sakka arvioitiin anti-IQGAP3 vasta-aineita. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa ja tulokset yhdestä edustavasta kokeesta on esitetty.

IQGAP3 Edistää EGF-indusoitu ERK: n fosforylaatio

vuorovaikutus IQGAP3 ja ERK1 pyydetään lisätutkimisesta vaikutus of IQGAP3 on ERK aktivointia ja signalointi. Yliekspressio IQGAP3 HeLa-soluissa oli vain vähäinen vaikutus fosforylaatiota ERK, toisin kuin on raportoitu IQGAP1 [40]. Kun on stimuloitu EGF kuitenkin IQGAP3 transfektantit osoitti suuresti parannettu ERK-fosforylaation verrattuna vale-ohjaus (kuvio 6A). AKT: n ja p38 aktivaation toisaalta ei muuttunut (tuloksia ei ole esitetty). Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, knockdovvn IQGAP3 ilmentymisen A549-soluja johti vaimennus EGF-indusoidun ERK-fosforylaation, kun taas AKT: n ja p38 fosforylaatio ei ollut vaikutusta (kuvio 6B). Lisäksi kaksi lusiferaasireportteri- määritykset osoittivat, että pudotus on IQGAP3 estää transkriptionaalista aktiivisuutta Elk1 joka on tunnusmerkki ERK aktivaation EGF stimuloi A549-soluja (kuvio 6C). Arvioimaan mahdolliset korrelaatio parannettu ERK signalointi ja nopeutettu leviämisen IQGAP3-transfektoitujen solujen, U0126 joka on MEK1 /2-estäjän lisättiin viljelmään. Kuten on esitetty kuviossa 6D, inhibitio ERK aktivointi poistetaan leviämisen edistävää vaikutusta IQGAP3. Nämä tulokset tukevat käsitystä, että onkogeeninen aktiivisuus IQGAP3 on todennäköisesti välittyy parannettu ERK-signalointia.

(A) Hela-soluja transfektoitiin ohimenevästi Myc-IQGAP3 tai kontrollivektori (mock) oli seerumin menettäisi (0,5% naudan sikiön seerumia ) 24 tunnin ajan ennen kuin niitä stimuloitiin 100 ng /ml EGF: ää. Solut kerättiin eri ajankohtina ja tutkittiin ERK fosforylaatio. (B) A549-soluja infektoitiin shIQGAP3 lentiviruksen (IQGAP3-KD1 tai Kd2) tai kontrolli-virus (NC) ja seerumin menettänyt (0,5% naudan sikiön seerumia) ennen stimulaatiota 100 ng /ml EGF: ää. Tasot fosforyloidun ERK yhteensä ERK, fosforyloitu p38 ja fosforyloidun AKT arvioitiin western blot eri ajankohtina jälkeen EGF stimulaation. (C) lusiferaasireporttiterilla analyysit suoritettiin mittaamiseksi Elk1 aktiivisuuden alavirtaan kaskadin EGFR-ERK signalointi A549-soluja, jotka on transfektoitu siRNA oligojen. (D) Leviämisen Hela-solujen kätkeminen IQGAP3 ilmentävien tai kontrollivektoreihin analysoitiin käyttäen Cell Counting Kit-8 lisäämällä 20 uM U0126 tai DMSO. Kukin määritys toistettiin vähintään 3 kertaa. Tiedot kokeen yhdestä edustavasta kokeesta esitetään keskiarvona ± SD. *,

P

0,05; **,

P

0,01.

Keskustelu

Toistaiseksi kolme jäsentä IQGAP perhe on kuvattu [22] – [24]. On näyttöä siitä, että IQGAP1 ensisijaisesti toimii onkogeenin [27]. IQGAP2 näyttää antituumorivaikutus, vaikka sen rakenteellista samankaltaisuutta IQGAP1 [33]. Tässä olemme osoittaneet, että IQGAP3 ilmentyy erittäin suuri osa keuhkosyöpään näytteitä. Vaikka täytäntöön ilmaus IQGAP3 aiheuttaa nopeutetun proliferaatio ja migraatio /invaasion syöpäsoluja, tukahduttaminen sen ilmaisun johtaa vähenemiseen Tuumorigeenisuustutkimuksissa. Molekyylitasolla, IQGAP3 vuorovaikutuksessa ERK1 ja edistää EGF-indusoidun aktivoitumisen ERK, mikä puolestaan ​​näyttää olevan tiiviisti sen kasvainta edistävää aktiivisuutta.

IQGAP3 sijaitsee 1q21.3, joka on hotspot geenivahvistus syöpä [24]. DNA: n monistuksen at 1q21.3 on esimerkiksi raportoitu olevan yhteydessä ruokatorven syöpä ja soluttautuminen ductal rintasyövän [41], [42]. Lisäksi lisäämisessä 1q21.3 on merkittävä korrelaatio alennetaan eloonjäämisaste kertaa leiomyosarkooma kohtu [43]. Bioinformatiikan analyysi osoittaa, että IQGAP3 ylössäädellään useita syöpiä, mukaan lukien munasarjojen, keuhkojen, paksusuolen, mahan, luuytimen ja rintojen pahanlaatuisia kasvaimia (kuvio 1A). Nykyinen tutkimus on erityisesti osoitettu sen rooli keuhkosyövän. Niistä 25 paria keuhkosyövän ja viereisen ei-syöpä kudoksiin, 20 syöpä kudoksiin osoitti kasvua IQGAP3 mRNA. Voimistumista IQGAP3 ilmentymisen vahvistettiin proteiinin tasolla näytön vahvempia immunohistokemiallisella värjäyksellä syövän kuin muilla syöpäkudokset 80 ulos 89 keuhkosyöpään näytteitä. Me spekuloida, että IQGAP3 voi olla tärkeä geeni, joka on kriittisesti mukana maligniteettien ominaista 1q21.3 vahvistusta. Olisi mielenkiintoista selvittää, 1q21.3 vahvistus edistää säätelyä IQGAP3 joka löytyy keuhkosyöpä, ja onko 1q21.3 vahvistus havaittu ruokatorven karsinoomat tai rintasyöpään liittyy lisääntynyt IQGAP3 ilme. Vaikka tutkimuksessamme, osoitamme, että upreguation of IQGAP3 on yleinen tapahtuma keuhkosyöpä, meidän pitäisi mainita, että on olemassa muutamia keuhkosyöpä näytteitä, jotka osoittavat ennallaan tai jopa vähentynyt ilmentyminen IQGAP3. Tämä ei ole yllättävää. Esimerkiksi Her2, edustavan onkogeeni rintasyövän, on vain yliaktiivista noin 20% rintasyövän [44], [45]. Jotkut geenit, kuten p16, joka voidaan yliaktiivista tai vaimentua tuumoreissa ja toimii joko tuumorisuppressorina tai onkogeeni riippuen yhteydessä kehon [46]. Siksi onko eri ekspressiokuviota IQGAP3 ehdottaa enemmän ymmälle sääntelyä ja toiminta IQGAP3 kasvaimen kehittämistarpeita lisätutkimuksia.

häiriöstä ilmentymistä IQGAP3 syöpäkudoksen viittaa mahdollinen rooli tämän molekyylin kasvainten synnyssä. Tämän mukaisesti käsite, yliekspressio IQGAP3 tehostetun kasvainsolujen kasvua, muuttoliikkeen ja invaasio, kun taas knockdovvn IQGAP3 ilmaisun näkyvissä päinvastaisia ​​vaikutuksia. IQGAP3 vuoksi on toiminnallisesti samanlainen kuin IQGAP1, joka on tunnetusti onkogeeninen [31], [32]. Kuten muut jäsenet IQGAP perheen, IQGAP3 hallussaan rakenteellisia motiiveja, jotka voivat sitoutua ERK. Vastavuoroinen coimmunoprecipitation, olemme vahvistaneet vuorovaikutusta IQGAP3 ja ERK1. Toiminnallista merkitystä tämän vuorovaikutuksen tukee täydennetty fosforylaatio ERK ja lisääntynyt Elk1 transkriptionaalisen aktiivisuuden, kun EGF-stimulaation IQGAP3-transfektoiduissa soluissa. Vielä tärkeämpää on, leviämisen edistävä vaikutus oli lähes kokonaan poisti ERK signalointi estäjä U0126, mikä osoittaa, että IQGAP3 kykenee sen funktio lähinnä sääntelyn ERK signalointi. On mielenkiintoista huomata, että vaikka niiden toiminnallinen samankaltaisuus, IQGAP3 ja IQGAP1 näyttää selvästi eri spesifisyydet sitoutumispartnereihin. Vaikka IQGAP1 ensisijaisesti sitoutuu ERK2, IQGAP3 vuorovaikutuksessa yksinomaan ERK1 [40]. Näiden merkittävyyden valikoivuus vielä ratkaistava, mutta me spekuloida, että IQGAP1 ja IQGAP3 voivat tehdä yhteistyötä sääntelyn ERK signalointi, joten se vaikuttaa synergistinen vaikutus syövän etenemiseen.

Suonensisäisesti rokotus nude-hiirten on laajalti käytetty arvioida metastaattisen potentiaalin syöpäsolujen [38], [39]. Mallin, pudotus on IQGAP3 keuhkojen syöpäsoluja havaittiin huomattavaa haittaa sen kyky luoda etäpesäkeleesioita keuhkoissa. Tämä tulos on yhdenmukainen meidän

in vitro

tiedot, jotka osoittavat muuttuneita solumigraatioon ja invaasiota seuraavaa manipuloinnin IQGAP3 ilmaisua. Kuitenkin yksityiskohtia näiden mekanismien edelleen epäselviä. Konfokaalimikroskopia paljasti, että IQGAP3 rikastuu kärjessä vaeltavia solujen (kuvio S1), mikä viittaa sen mahdolliseen osallistumiseen muodostumiseen johtavien reunat. Lisäksi, geenin ilmentymisen profilointi osoitti kohonnut taso E-kadheriinin in IQGAP3 taintumisen soluissa (kuvio S2). On hyvin tunnettua, että E-kadheriinin on erittäin tärkeää soluadheesiota. Downregulation se yhdessä siihen liittyvän kateniinin kompleksi on samanaikaisesti pienemmällä välistä adheesiota ja parantaa invasiivisen kapasiteettia [47], [48]. Sinänsä IQGAP3 voivat helpottaa solumigraatioon ja invaasion osittain tukahduttaminen E-kadheriinin ilmentymisen.

Yhteenvetona tutkimuksemme osoittavat ensimmäistä kertaa osallistumista IQGAP3 keuhkosyövässä kehitys ja mahdollisuudet molekyylitason mekanismeista sen kasvaimen edistävää aktiivisuutta. Nämä havainnot laajentaa tietomme monimutkaista roolia IQGAP perheen kasvainten synnyssä. Edelleen tutkimuksen potentiaalia näiden molekyylien kohteina terapeuttista keksintöä on perusteltu.

tukeminen Information

Kuva S1.

IQGAP3 rikastui kärjessä vaeltavia solujen. A549-solut asetetaan suojalasi päällystetty 10 ug /ml fibronektiiniä (Sigma-Aldrich).