Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tässä tutkimuksessa uusi apoptoottinen monoterpenoid indoli alkaloidi, subditine (1), ja neljä tunnettuja yhdisteitä eristettiin kuori

Nauclea subdita

. Täydellinen

1 H- ja

13C- NMR-tiedot uuden yhdisteen on raportoitu. Rakenteet eristetyt yhdisteet havainnollistetaan eri spektroskooppisin menetelmin, kuten 1 D- ja 2D- NMR, IR, UV ja LCMS. Kaikki viisi yhdisteet seulottiin sytotoksisia LNCaP-ja PC-3 ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa. Niistä viidestä yhdisteet, uusi alkaloidi, subditine (1), osoitti, että tehokkain solujen kasvun esto aktiivisuus ja selektiivisiä LNCaP kanssa IC

50 12,24 ± 0,19 uM ja PC-3, jossa on IC

50 13,97 ± 0,32 uM, verrattuna RWPE ihmisen normaalia epiteelisolulinja (IC

50 = 30,48 ± 0,08 uM). Subditine (1) indusoi apoptoosin LNCaP ja PC-3 osoituksena solujen lisääntynyt läpäisevyys, häiriöitä solun tukirangan rakenteiden ja lisääntynyt ydinvoiman pirstoutuminen. Lisäksi subditine (1) tehostettu solunsisäistä reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tuotanto, mikä heijastuu lisääntynyt ilmentyminen glutationireduktaasin (GR) kaivella haitallisia vapaita radikaaleja sekä eturauhassyövän solulinjoissa. Liiallinen ROS voi johtaa Mitokondrioiden kalvon potentiaali (MMP), sytokromin c vapautumiseen ja myöhemmin kaspaasi 9, 3/7 aktivointi. Lisäksi Western blot-analyysit osoittivat subditine (1) aiheuttama säätely alaspäin Bcl-2 ja Bcl-xl ilmaisu, kun taas p53 oli säädellään ylöspäin LNCaP (p53-villityypin), mutta ei PC-3 (p53-null) . Kaiken meidän tiedot osoittivat, että uusi yhdiste subditine (1) saa aikaan anti-proliferatiivinen vaikutus LNCaP-ja PC-3 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen läpi apoptoosin induktion.

Citation: Liew SY, Looi CY, Paydar M, Cheah FK, Leong KH, Wong WF, et al. (2014) Subditine, New Monoterpenoid Indoli- Alkaloidi alkaen Bark of

Nauclea subdita

(Korth.) Steud. Indusoi apoptoosia ihmisen eturauhassyöpä solut. PLoS ONE 9 (2): e87286. doi: 10,1371 /journal.pone.0087286

Editor: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan

vastaanotettu: 16 elokuu 2013; Hyväksytty: 20 joulukuu 2013; Julkaistu: 14 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Liew et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ rahoittivat Malayan yliopisto Research Grant RP001 /2012; Malayan yliopisto High Impact Research Grant UM.C /625/1 /HIR /Mohe /SC /37 ja HIR: E00002-20001; Ranskan National Center for Scientific Research CNRS myöntää 57-02-03-1007; ja jatko tutkimus Rahastojen Malayan yliopisto (PV050 /2012A). Tämä työ tehtiin puitteissa virallisen välisen sopimuksen CNRS ja Malayan yliopisto (Malesia). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Rubiaceae perhe (Madder perhe) on yksi suurimmista ja angiosperms yli 637 sukujen ja lähes 10700 lajien [1]. Suvun

Nauclea

joka kuuluu tähän perheeseen, koostuu noin 35 lajia maailmanlaajuisesti [2] ja Malesiassa on kaksi

Nauclea

lajeja;

N. officinalis

ja

N. subdita

[3].

Nauclea subdita

(Korth.) Steud. on trooppinen kasvi, joka kasvaa lowland kukkulalle metsiä, soinen paikoissa ja usein pitkin ja jokien [4]. Se on pieni tai keskisuuri puu 25 m pitkä ja 60 cm ympärys [3]. Kasvit Tämän suvun tiedetään tuottavan mielenkiintoisia monoterpenoid indolia alkaloideja, joilla on korkea rakenteellinen monimuotoisuus kuten naucline [5], nauclealines B [6] ja naufoline [7]. Monet heistä näytteillä merkittäviä biologisia vaikutuksia; antikonvulsiivinen [8], antiproliferatiivinen [9] ja vasorelaxant toimintaa [5].

Eturauhassyöpä on useimmin diagnosoitu syöpä miehillä teollisuusmaissa. Arviolta 238590 uutta tapausta diagnosoidaan ja 29720 kuolemantapausta johtaa eturauhasen syöpä Yhdysvalloissa vuonna 2013 (Cancer Facts ja kuviot 2013, American Cancer Society, 2013). Vaikka mekanismeja, jotka ohjaavat eturauhassyöpä ei ole täysin ymmärretty, ikä, rotu, ja suvussa eturauhasen syöpä potilaiden on osoitettu olevan mahdollisia tekijöitä tiiviisti tämän tappavan taudin [10].

meidän jatkuvia ponnisteluja etsiä uusia ja bioaktiivisten kemiallisia ainesosia päässä Malaysia kasviston [11] – [15], uusi sytotoksinen ja apoptoottisten monoterpenoid indoli alkaloidi, subditine (1), on eristetty kuori

Nauclea subdita

yhdessä neljä tunnettua alkaloidit; angustoline (2) [11], [16], [17], angustidine (3) [18], [19], angustine (4) [20], [21], nauclefine (5) [22], [23 ] (Kuvio 1). Esillä olevassa paperi, raportoimme eristäminen ja karakterisointi subditine (1), sytotoksista toimintaa alkaloidien 1-5 sekä apoptoottisen mekanismin 1 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen LNCaP-ja PC-3.

rakenne uusi yhdiste, subditine (1) on selvitetty käyttäen erilaisia ​​spektroskooppinen menetelmää, joka oli 1D-NMR (

1H,

13C, DEPT), 2D-NMR (HSQC, HMBC, NOESY), UV-, IR- ja LCMS vaikka rakenne muut neljä tunnettujen yhdisteiden vahvistettiin vertailemalla NMR-data kirjallisuusarvoihin.

Materiaalit ja menetelmät

Yleiset menettelyt

1D – ja 2D-NMR rekisteröitiin deuteroitu kloroformi (CDCI

3) (Merck, deuterointikohdaksi asteen min. 99,8%) käyttäen JEOL LA 400 MHz FT NMR ja JEOL ECA 400 MHz FT NMR-spektrometrillä. Massaspektrit saatiin Shimadzu LCMS-IT-TOF. UV-absorptiospektrit saatiin käyttäen Shimadzu UV-250 UV-Visible Spectrometer. Käytetty liuotin oli metanoli (CH

3OH). IR-spektrit saatiin Perkin Elmer Spectrum 400-FTIR Spectrometer CHCI

3 liuottimena. Kaikki liuottimet, lukuun ottamatta käytetään irtotavarana louhinta ovat AR laatu. Silikageeliä 60 (Merck, ,040-0,063 mm) käytettiin pylväskromatografialla (CC). Alumiini tuettu silikageeli 60 F

254 levyjen 20 × 20 cm käytettiin ohutkerroskromatografialla (TLC) (Merck, Saksa). Preparatiivisella ohutlevykromatografialla (PTLC) silikageeli 60 F

254 lasilevyjen 20 x 20 cm: n (Merck, Saksa) käytettiin yhdisteiden erottamiseksi, joita ei voida erottaa tavanomaisin sarakkeessa. TLC täplät tehtiin näkyviksi UV-valossa (254 ja 365 nm), jonka jälkeen suihkuttamalla Dragendorffin reagenssin alkaloidi havaitsemiseen. Positiivinen testitulos oli merkitty muodostumista oranssi täplät.

Plant Materiaali

Kuori

Nauclea subdita

kerättiin Hutan Simpan Bukit Kinta, Chemor, Perak, Malesiassa phytochemical ryhmä kemian laitoksen, Faculty of Science, University of Malaya. Seteli yksilöt (KL 5254) näiden kasvien talletettiin kasvimuseossa laitoksen yliopiston kemian Malaya, Kuala Lumpur, Malesia. Kasvien keräys on hyväksynyt johtajan Jabatan Perhutanan Negeri Perak (Perak State metsäosaston). Kentän tutkimukset eivät liity uhanalaisten tai suojeltujen.

Extraction ja eristäminen

kuivattu, maadoitettu kuori kasvin (1,7 kg) ensin rasva on poistettu heksaanilla (17 litraa) 3 vuorokautta huonelämpötila. Heksaani Uute suodatettiin ja kuivattiin huoneen lämpötilassa. Sitten kuivatut kasvimateriaalit kostutettiin ammoniakkiliuoksella ja liotettiin 2 tunnin ajan. Ne uutetaan uudestaan ​​CH

2CI

2 (17 litraa) kahdesti 3 vuorokauden ajan. Supernatantti saatu konsentroitiin pyöröhaihduttimella alennetussa paineessa tilavuuteen 500 ml, ja tutkitaan sen alkaloidipitoisuus (käyttäen TLC: tä ja varmistettiin suihkuttamalla Dragendorffin reagenssi). Uute lopuksi konsentroitiin, jolloin saatiin dikloorimetaani raakaa uutetta (5,0 g). Raakauute suoritettiin CC silikageelillä 60 käyttäen CH

2CI

2 ja MeOH liuottimena (100:0, 99:1, 98:2, 97:3, 96:4, 95:5, 94 :6, 90:10, 83:17 ja 75:25), ja lopuksi 100% MeOH käytettiin eluenttina. Vertaamalla TLC malleja näiden jakeiden, viisitoista jakeet saatiin lopulta.

puhdistus Yhdisteen

lisäpuhdistus osa 5 PTLC- tuotti alkaloidi 1 (10,6 mg, MeOH-CH

2CI

2; 98:2: kyllästetty NH

4OH). Sekä tunnettuja yhdisteitä 3 (5,5 mg, MeOH-CH

2CI

2; 98:2: kyllästetty NH

4OH) ja 5 (6,2 mg, MeOH-CH

2CI

2 ; 98:2: kyllästettyä NH

4OH) saatiin puhdistuksen jälkeen PTLC: lla fraktion seitsemän, kun taas yhdisteet, 2 (7,5 mg, MeOH-CH

2CI

2; 95:5: kyllästettyä NH

4OH) ja 4 (12,5 mg, MeOH-CH

2CI

2; 98:2: kyllästettyä NH

4OH) saatiin osa kaksitoista ja kuusi vastaavasti.

Alkaloid 1

Kellertävä amorfinen kiinteä aine; UV (MeOH) λ

max (log ε): 393, 377, 210 nm; IR (CHCl

3) ν

max: 3430, 1640 cm

-1; for

1 H- ja

13C-NMR-spektroskooppiset tiedot, katso taulukko 1; LCMS -IT-TOF osoitteessa

m /z

330.1018 [M + H]

+ C

20H

15N

3 O

2 (lask. C

20H

15N

3 O

2:330.1237).

Cell Culture

ihmisen eturauhasen normaalia solulinjaa (RWPE-1) ja ihmisen eturauhasen syöpäsolu linjat; LNCaP-ja PC-3, hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia, USA). LNCaP-ja PC-3-soluja kasvatettiin Roswell Park Memorial Institute (RPMI), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä. RWPE-1-soluja ylläpidettiin Keratinosyyttien Serum Free Medium (K-SFM, ATCC), jota oli täydennetty naudan aivolisäkeuutetta (BPE) ja ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää (EGF). Lajit täydennettiin 10% lämpöinaktivoitua vasikan sikiön seerumia (Sigma)., 100 U /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä (Flowlab, Sydney, Australia). Kaikki soluja pidettiin kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2 ilmassa 37 ° C: ssa inkubaattorissa.

proliferaatiomääritystä

anti-proliferatiivinen aktiivisuus arvioitiin suorittamalla MTT-määrityksissä kuten aikaisemmin on kuvattu vähäisin muutoksin [24]. Lyhyesti, solut ympättiin 24 tuntia ennen käsittelyä 96-kuoppalevyllä 5 x 10

4 solua /kuoppa, jotta saadaan 70%: sta 80% konfluentteja viljelmiä. Yhdisteet liuotettiin DMSO: hon (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) ja sen jälkeen 2 x sarjalaimennosta 10 pistettä vaihteli 0,825 100 um. 96-levyä inkuboitiin 24 tuntia 37 ° C: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2. Lopussa inkubaation 50 ui MTT-liuosta (2 mg /ml; Sigma) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Sitten levyä inkuboitiin 4 tunnin ajan. Kaikki väliaine poistettiin ja lila formatsaania kide on muodostettu alaosassa kuoppien liuotettiin 200 ui DMSO: ssa 20 minuuttia. Absorbanssi 570 nm: ssä luettiin spektrofotometrisellä levynlukijassa (Hidex). Osuus eloonjääneiden solujen laskettiin:

.

Annos-vaste-käyrät muodostettiin saamiseksi IC

50-arvot. Kokeelliset tiedot on saatu 3 itsenäisestä kokeesta. Selektiivisyysindeksi saatiin keskimääräinen IC

50 RWPE-1 /keskiarvo IC

50 LNCaP tai PC-3.

Cellomics Multiparametrimäärityksessä Pitoisuus

Sytotoksisuus 3 Kit (Thermo Scientific ) käytettiin kuten aiemmin on kuvattu [25]. Lyhyesti, 24 tuntia sen jälkeen, kun subditine (1) käsittely, MMP väriaineen ja solun läpäisevyyttä väriaine lisättiin elävät solut ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solut kiinnitettiin, permeabilisoitiin, blokattiin 1 x estopuskurilla ennen koettimena ensisijaisesti sytokromi c ja toisen DyLight 649 konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-aineita 1 tunti kutakin. Hoechst 33342 lisättiin värjäävä liuos. Maljat analysoitiin sitten käyttäen ArrayScan korkea pitoisuus seulonnan (HCS) järjestelmä (Cellomics, PA, USA). Data otettiin kiinni, uutetaan ja analysoidaan ArrayScan II tietojen hankinnan ja tietojen Viewer versio 3.0.

ROS Pitoisuus

tuotanto solunsisäinen ROS havaittiin kuten aiemmin on kuvattu [26]. DHE väriainereagenssia muunnetaan loisteputki etidiumhomodimeerin ja tunkeutuu DNA vastauksena solunsisäisten ROS. Lyhyesti, 10 mM DHE varastoliuosta (metanolissa) laimennettiin 500-kertaisesti HBSS ilman seerumia tai muita lisäaineita, jolloin saadaan 20 uM käyttöliuos. Altistumisen jälkeen subditine (1), solut 96-musta levy pestiin kaksi kertaa HBSS: llä ja inkuboitiin sitten 100 ul: aan työliuoksessa on DHE 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Fluoresenssi DCF jokaisessa solussa oli kaapattu, uutetaan ja analysoidaan ArrayScan II Data Acquisition ja Data Viewer versio 3.0 (Cellomics).

geeniekspressioprofilointi

LNCaP ja PC-3-soluja käsiteltiin subditine (1) (12,5 uM) 18 tunnin ajan. RNA uutettiin PC-3 tai LNCaP-soluissa käyttäen RNeasy plus mini -kittiä (Qiagen). 1 ug RNA: ta käänteistranskriboitiin cDNA: ksi käyttäen RT2 ensimmäisen juosteen kit (SA Biosciences, Qiagen) .cDNA sekoitettiin RT2 Real Time ™ SYBR Green /fluoreseiini PCR master-mix ja ladataan kuhunkin 96 kuoppaan Human oksidatiivinen stressi ja Antioksidantit Defense qPCR array mukaan valmistajan protokollan (SA Biosciences, Qiagen). Lyhyesti, kokonaistilavuudessa 25 ui PCR-seosta, joka sisälsi 12,5 ui perusseosta, 11,5 ui kahteen kertaan tislattua vettä, ja 1 ui cDNA: ta lisättiin kuhunkin 96wells. qPCR tehtiin käyttäen StepOne PLUS reaaliaikainen PCR-laite (Applied Biosystems). PCR-monistus suoritettiin 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C 1 min. MRNA ilmentyminen Kunkin geenin normalisoitiin käyttäen keskimääräistä ilmaisua viisi taloudenhoito geenien:

β-aktiini (ACTB), β-2-mikroglobuliini (β2M), hypoksantiinifosforibosyylitransferaasin 1 (HPRT1), ribosomaalinen proteiini L13a ( RPL13A) ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH). ΔΔCt menetelmää käytettiin tietojen analysointia. Kertamuutoksia laskettiin jokaiselle geenin ero geenien ilmentyminen välillä subditine (1) tai ei-käsitelty kontrolli käyttämällä RT Profiler qPCR-array data-analyysi-ohjelmisto.

Reaaliaikainen qPCR Analysis

Kokonais-RNA uutettiin PC-3 tai LNCaP-soluissa käyttäen RNeasy plus mini -kittiä (Qiagen). RNA (1 ug), tehtiin käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen iScript cDNA-synteesi Kit (Biorad). QPCR suoritettiin StepOne PLUS reaaliaikainen PCR-laite (Applied Biosystems) käyttäen SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad) valmistajan ohjeiden mukaisesti protokollia. Alukkeet kaupallisesti syntetisoitiin Integrated DNA Technologies (IDT). Kohde-mRNA arvot normalisoitiin käyttäen β-aktiini-mRNA ja data ilmaistiin suhteessa normalisoidut arvot vastaavien valvontaa. Näytteet analysoitiin kolmen erillisen kokeen kolmena rinnakkaisena. Käytetyt alukkeet olivat alla,

GR Forward pohjamaali, AACATCCCAACTGTGGTCTTCAGC

GR Käänteisaluke, TTGGTAACTGCGTGATACATCGGG

β-aktiini Forward pohjamaali, GATGACCCAGATCATGTTTGAGACC

β-aktiini reverse-aluke, AGTCCATCACGATGCCAGTGGT

Bioluminescent-määritykset kaspaasi-3/7, -8 ja -9

ajasta riippuvainen tutkimus kaspaasi-3/7, -8, ja -9 toiminta oli suoritettiin kolmena rinnakkaisena käyttämällä määritystä sarjat kaspaasi-Glo 3/7, 8, ja 9 (Promega Corp., Madison, WI, USA) valkoinen 96-kuoppaisen mikrolevyn kuten aiemmin on kuvattu [27]. Yhteensä 10000 solua kuoppaa kohti ympättiin ja sitä käsiteltiin 12,25 uM subditine (1) 6, 12, 18, 24, ja 30 tuntia. Sitten 100 ui kaspaasi-Glo-reagenssia lisättiin, inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 minuutin ajan ja mitattiin käyttäen Tecan Infinite 200 Pro (Tecan, Mannedorf, Swizerland) mikrolevylukijalla.

Western-blottaus

määrittämiseksi proteiinin ekspression, 1

x

10

6 solua /ml ympättiin ja käsiteltiin subditine (1) tai paklitakselin 24 tuntia. Koko solu-uutteet valmistettiin, kuten aiemmin on kuvattu [28]. Lyhyesti, solut kerättiin, hajotettiin ja eroteltiin 10% SDS-polyakryyliamidigeeleillä. Elektroforeesin jälkeen, proteiinit siirrettiin PVDF-kalvoille (Millipore), salvattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa PBS-T: n (0,05% Tween 20) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kalvoja hybridisoitiin ensisijainen kanin anti-Bcl-2, Bcl-x L ja p53-vasta-aineiden ja sen jälkeen piparjuuriperoksidaasiin (HRP) konjugoidun sekundaarisen anti-kani-vasta-ainetta (Cell Signaling Technology Inc., CA, USA). Kalvot riisuttu ja uudelleenseulottiin hiiren anti

β

aktiini-vasta latauskontrollina (Santa Cruz Biotechnology Inc.). Proteiini-vasta-aine-kompleksit tunnistettiin Amersham ECL prime Western blotting detektioreagenssi (GE Healthcare, USA).

Tilastollinen analyysi

Kaikki arvot ilmaistiin keskiarvona ± S.D. Tilastolliset analyysit arvioitiin Studentin t-testillä. Todennäköisyys arvot * p 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

Tulokset ja keskustelu

dikloorimetaani uute kuori

Nauclea subdita

alistettiin pylväskromatografiaan silikageelillä 60 gradienttieluoimalla järjestelmän dikloorimetaania (CH

2CI

2) ja metanolia (MeOH), jolloin saatiin 15: n fraktioita. Lisäpuhdistusta fraktioista käyttäen preparatiivisella ohutkerroskromatografialla tuottivat subditine (1) ja neljä tunnettu alkaloidit; angustoline (2), angustidine (3), angustine (4), nauclefine (5). Rakenteelliset tunnistaminen 1 tehtiin 1 D-, 2D-NMR, UV-, IR- ja LCMS vaikka rakenne tunnettujen yhdisteiden (2-5) tunnistettiin vertailun NMR-data kirjallisuusarvoihin.

karakterisointi Subditine (1) B

Subditine (1) eristettiin kellertävänä amorfisena kiinteänä aineena. LCMS-IT-TOF-spektri paljasti pseudomolekulaari- ioni huippu [M + H]

+ osoitteessa

m /z

330,1018, joka vastaa molekyylikaava C

20H

15N

3O

2 (lask. 330,1237). IR-spektri 1 osoitti absorptionauha 1645 cm

-1, joka ilmaisee konjugoidun laktaamikarbonyyliin toimivuus [18].

1H-NMR-spektri, että käytössä on kaksi dubletti at δ

H 7,62 (1H,

d

,

J

= 7,8 Hz, H-9) ja δ

H 7,47 (1H,

d

J

= 8,2 Hz, H-12), kaksi kaksinkertainen kaksoispiikki on δ

H 7,34 (1 H,

dd

,

J

= 8,2, 7,1 Hz, H-11), ja δ

H 7,19 (1 H,

dd

,

J

= 7,8, 7,1 Hz, H-10), kaksi metyleenit on δ

H 4,51 (1H,

m

, H-5) ja δ

H 3,16 (1H,

m

, H-6), mikä viittaa naucleamide johdannaisen substituutiomalli renkaassa A ja C [29]. Lisäksi tämä tetrahydro-

β

karboliini luuranko (rengas A, B, ja C) osoitetaan HMBC korrelaatiot H-5 C-3 (δ

C 139,4) ja C-7 ( δ

C 117,1), H-6 C-2 (δ

C 127,3) ja C-7, H-9 ja H-11-C-13 (δ

C 138,7) (kuvio 2 ). Laaja singletti δ

H 8,94 hiljaista läsnäollessa NH yksikkö. Tunniste

13C-NMR ja DEPT-spektrit 1 osoitti yhteensä kaksikymmentä hiilen signaaleja; yksi metyyli, kaksi metyleeni-, kuusi metaani, yhdeksän kvaternäärinen hiili ja kaksi karbonyyli (taulukko 1). Karbonyylin laktaamirengasrakenteeseen resonoi δ

C 161,7. Lisäksi HMBC-spektrissä esiintyi korrelaatiota H-14 (δ

H 7,97) ja C-3, H-14 ja C-16 (δ

C 119,3), H-5 (δ

H 4,51) ja C-20 (δ

C 161,7), mikä tukee läsnäolo δ laktaamirengasta. Lisäksi HMBC korrelaatiot H-14 C-16 ja C-21 (δ

C 127,6), H-17 (δ

H 9,57) ja C-15 (δ

C 141,1) ja C -16, H-18 (δ

H 2,98) ja C-22 (δ

C 165,9), H-19 (δ

H 10,72) ja C-21 (δ

C 127,6) osoitti, että rengas D on kytketty nicotinaldehyde rengas (rengas E), jossa on metyyliryhmä muodostaa 2-methylnicotinaldehyde yksikkö. Subditine (1), on nauclefine tyyppi luuranko [30], ja se on hyvin samanlainen kuin tunnettu yhdiste, angustidine (3) paitsi, että entinen on lisäksi karbonyyliryhmä C-21.

1 H ja

13C-arvot sekä yhdisteet on lueteltu taulukossa 1. Täydellinen

1 H ja

13C-NMR toimeksiantoja vahvistettiin perusteellinen analyysi COSY, HMBC, HSQC ja NOESY tiedot.

Biologinen määritys

Subditine (1) esti voimakkaasti solujen kasvun LNCaP-ja PC-3 eturauhasen syöpäsoluja.

syövän vastaisen vaikutuksen dikloorimetaania raakaa, subditine ( 1), angustoline (2), angustidine (3), angustine (4), nauclefine (5) ja arvioitiin ihmisen eturauhasen syöpäsolujen LNCaP-ja PC-3 MTT määrityksissä. IC

50-arvot (annos, joka tarvitaan estämään proliferatiivinen vaste 50%) kunkin yhdisteen esitetty taulukossa 2. Subditine (1) osoitti hyvää inhiboivaa vaikutusta kohti LNCaP-solujen IC

50 12,24 ± 0,19 uM, kun taas IC-

50 angustoline (2), angustidine (3), angustine (4), nauclefine (5), olivat 58,09 ± 0,05 uM, 140,27 ± 0,10 uM, 149,16 ± 0,09 uM ja 86,35 ± 0,09 uM. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin PC-3-solut, joissa subditine (1), osoitti suurinta aktiivisuutta (IC

50 = 13,97 ± 0,32 uM) verrattuna muihin yhdisteisiin. Nämä havainnot tukevat tätä subditine (1) on kaikkein voimakas sytotoksinen yhdiste Viidestä testattu.

Seuraavaksi testasimme sytotoksisuuden vaikutuksesta subditine (1) RWPE-1 (ihmisen normaalin eturauhasen epiteelisolujen ). MTT-analyysi osoitti suurempaa IC

50-arvoon 30,48 ± 0,08 uM, mikä osoittaa, että subditine (1) on 2,5 ja 2,2 taittuu tehokkaampi vastaan ​​LNCaP-ja PC-3 (selektiivisyys (SI): [LNCaP /PC-3] = 2.49 /2.18) syöpäsolujen kuin normaalissa eturauhasessa solut; RWPE-1. Sen sijaan standardi huumeiden paklitakseli osoittivat vähemmän valikoivuus (SI: [LNCaP /PC-3] = 1,24 /1,19) mukaan esillä IC

50-arvot 1,27 ± 0,04 uM, 1,33 ± 0,02 uM ja 1,58 ± 0,06 uM vastaan ​​LNCaP, PC-3 ja RWPE-1 vastaavasti.

Subditine (1) indusoi solun tukirangan uudelleenjärjestelyn ja ydinvoiman pirstoutumista.

Koska subditine (1) merkittävästi estivät LNCaP-ja PC-3 solujen kasvua, tämä yhdiste oli valitaan edelleen mekaaniset tutkimukset. Solun tukirangan ja ydinvoiman morfologiset muutokset LNCaP ja PC-3-soluja tutkittiin falloidiinia (havaitsee F-aktiini) ja Hoechst 33342 värjäystä. Tulokset osoittivat, että jotkut subditine (1) käsiteltiin-soluilla solujen kutistumista pistemäinen värjäytymisen F-aktiini on perifeerinen kalvoon (kuvio 3). Pitoisuus 12,5 uM ja 25 uM, ydin- tiivistyminen ja pirstoutuminen havaittiin 24 tunnin kuluttua subditine (1) käsittely (kuvio 4). Ydin- intensiteetti, joka vastaa apoptoottista kromatiinin muutoksia nousseet merkittävästi subditine (1) käsittely LNCaP-ja PC-3-solut (kuvio 4,

P

0,05). Nämä tulokset viittaavat siihen, että subditine (1) indusoi apoptoosin LNCaP-ja PC-3 eturauhasen syöpäsoluja.

LNCaP-ja PC-3-soluja käsiteltiin subditine (1) eri pitoisuuksilla 24 tunnin ajan. Solut kiinnitettiin ja värjättiin Hoechst (sininen) ja phalloidin (punainen) väriainetta, joka värjätään tuma ja polymeroitunut aktiini (F-aktiini), tässä järjestyksessä. Bar kaavio keskimäärin fluoresoiva intensiteetti phalloidin (keskiarvo ± S.D .; * p 0,05). Annoksesta riippuva lisääntynyt ja phalloidin intensiteetin LNCaP-solujen havaittiin sen jälkeen, kun subditine hoidon.

LNCaP-ja PC-3-soluja käsiteltiin subditine (1) (12,5 uM ja 25 uM) 24 tuntia. Sitten solut kiinnitettiin ja värjättiin Hoescht 33342 (sininen). Punaiset ympyrät osoittavat DNA kutistumista tai pirstoutuminen. Kuvat otettiin käyttäen Cellomic arrayscan järjestelmää.

Subditine (1) edisti reaktiivisen hapen (ROS) tuotanto.

ROS ovat luonnollisia sivutuotteita normaalin aineenvaihdunnan happea. Kuitenkin ROS taso voi kasvaa dramaattisesti, kun ympäristö- tai kemiallista rasitusta (esim läsnäolo sytotoksisen aineen). Sen tutkimiseksi, onko altistus subditine (1) edistää ROS tuotanto, me värjättiin eläviä soluja DHE väriaine, 24 tunnin kuluttua subditine (1) käsittely. DHE nopeasti hapettuu DCF ROS ja fluoresoiva intensiteetit määrällisesti Cellomics korkea pitoisuus Screening. Kuten kuviossa 5 on esitetty, tasot DCF-fluoresenssin LNCaP-ja PC-3-soluja käsiteltiin subditine (1) on merkittävästi lisääntynyt annoksesta riippuvalla tavalla.

LNCaP-ja PC-3-soluja käsiteltiin subditine (1) (12,5 uM, 25 uM, 50 uM) 24 tuntia. Sitten solut kiinnitettiin ja värjättiin DHE väriainetta. ROS tasot epäsuorasti määritettiin mittaamalla DHE väriaineen sisällyttäminen ydinvoiman avulla Cellomic HCS arrayscan. Lisääntynyt DHE väriaine intensiteetti tumassa havaittiin käsiteltäessä of subditine. Hoechst (sininen) ja DHE väriaine (vihreä). Pylväsdiagrammi, joka esittää keskimääräisen fluoresoiva intensiteetti DHE tahra (keskiarvo ± S.D .; * p 0,05).

Association between eturauhassyövän riskiä ja oksidatiivisen stressin on hyvin tunnustettu. On huomattava todisteita viittaa siihen, oksidatiivisen stressin edistää etiologia ja patogeneesi, eturauhasen syöpä. Kun otetaan huomioon, että mitokondriot ovat merkittävä lähde ROS, muuttunut mitokondrioiden bioenergetiikan voi taustalla kehitystä eturauhassyöpää. Lisäksi korkea ROS on havaittu useissa ihmisen solulinjoissa sekä eri ihmisen kudosta. Jotkut tukevat todisteet viittaavat siihen, että lisääntynyt ROS sukupolvi voisi johtua syövän syntyyn. Luontainen oksidatiivista stressiä voi vaikuttaa useita toimintoja syöpäsoluissa tai kasvain kudoksen, kuten solujen lisääntymisen edistäminen mutaatioiden ja geneettinen epävakaus, muutoksia solujen herkkyyttä syöpälääkkeet, invaasiota ja etäpesäkkeiden. Kohdistaminen ROS tuotanto sen sijaan ROS neutralointi saattaisi tarjota uuden mekanismin torjunnassa eturauhassyövän ja mahdollisesti muiden pahanlaatuisten kasvainten.

Subditine (1) aiheuttama gluthatione reduktaasin geenin ilmentymisen.

Kuten olemme osoittaneet, että subditine (1 ) on osoittanut, että se voisi aiheuttaa ROS soluissa, päätimme käyttää ihmisen oksidatiivista stressiä ja antioksidanttipuolustuksen reaaliaikainen profiler qPCR-array määrällisesti geeniekspression muutoksia PC-3 tai LNCaP käsitelty subditine (1). Tämä qPCR-array sisältää 84 osallistuvien geenien solustressiä vasteen ja redox-ohjaus ja sisältää kaikki kuusi jäsentä antioksidantin peroxiredoxin (PRDX) perhe.

oksidatiivista stressiä ja antioksidantit liittyvät geenit ilmentyvät differentiaalisesti PC-3 tai LNCaP-solut vasteena subditine (1). Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että glutationireduktaasi (GR) oli merkitsevästi säädelty (

P

0,05) sekä eturauhassyövän solulinjoissa suhteessa kontrolliin soluihin (Fig. 6A). Taitos muutos on jyrkempi LNCaP ( 100-kertainen) verrattuna PC-3 ( 20-kertainen) soluissa. Myöhempää erillistä qPCR analyysi osoitti myös, että tämä geeni on säädelty vahvistavasti subditine (1) hoidettujen soluja, vastaa meidän qPCR array tuloksia (Fig. 6B).

LNCaP ja PC-3-soluja käsiteltiin subditine (1) (12,5 uM) 18 tunnin ajan. (A) Ihmisen oksidatiivisen stressin ja antioksidanttipuolustuksen qPCR-array käytettiin geenien tunnistamiseksi merkittävästi up- tai säädellä vähentävästi subditine (1) hoidetun LNCaP tai PC-3-solut. Gene profilointi analyysit tehtiin kolme kertaa itsenäisestä kokeesta. (Nuoli osoittaa sijainti GR sirontakuvaajiin) (B) Transcriptional muutoksia GR arvioitiin käyttämällä kvantitatiivista reaaliaikaista-PCR. Tasot GR mRNA normalisoitiin käyttäen β-aktiini siivous geeni ja ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna käsittelemättömään kontrolliin.

GR on tärkeä entsyymi, joka osallistuu huuhteluilman aktiivisen hapen lajeja. Tuloksemme viittaavat siihen, että tehostettu ROS tuotanto subditine (1) voisi stimuloida GR

de novo

synteesiä. GR on hyvin tunnettu antioksidantti toiminto ja yleensä käytetään indikaattorina oksidatiivisen stressin. Säätelyä GR voi olla yksi solu antioksidantti puolustusmekanismi vasteena yhä ROS. Kuitenkin tarpeeton reaktiivisten hapen lajien voi hukuttaa antioksidantti järjestelmä, joka laukaisee cascade tapahtumia, jotka johtavat lipidi-proteiini-vaurioita, irrottamista oksidatiivisen fosforylaation ja johtaa lopulta apoptoosiin.

Subditine (1) lisääntynyt kalvo läpäisevyys, alennetaan mitokondrio Membrane Potential (MMP) ja lisääntynyt sytokromin c vapautumista.

saadaksesi paremman käsityksen mekanismi subditine (1) aiheuttaman sytotoksisuuden muutokset kalvon läpäisevyyden, mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) ja sytokromi c: lokalisointi jälkeen subditine (1) hoidot mitattiin. Kuten odotettua, subditine (1) hoidetun LNCaP-ja PC-3-soluja osoitti korkeampaa kalvon läpäisevyys verrattuna hallita, sillä useimmat käsiteltyjen solujen apoptoosia, koska sytotoksisen yhdisteen aktiivisuuden (kuvio 7A ja 7B). Lisäksi tulokset osoittivat, että subditine (1) käsittely aiheutti menetys MMP, mikä viittaa siihen, järkeenkäypää mekanismia solukuoleman. Kuten on esitetty kuviossa 6A, MMP väriaine värjättiin voimakkaasti sytoplasmassa kontrollisolujen verrattuna subditine (1) hoidetun soluja. LNCaP-ja PC-3-soluja käsiteltiin subditine (1) 24 tunnin ajan osoitti annoksesta riippuvaa alentaminen MMP fluoresenssi-intensiteetin (kuvio 7B), mikä heijastuu romahdus MMP. Toisaalta, subditine (1) käsiteltiin-LNCaP-ja PC-3 osoittivat lisääntynyttä fluoresoiva värjäytyminen sytosoliin verrattuna kontrolliin, osoittaa, sytokromi c: n vapautumisen (kuvio 7A ja 7B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että subditine (1) laukaisee menetys MMP ja myöhemmin translokaatiota sytokromi c: mitokondrioista sytosoliin LNCaP-ja PC-3-soluja.

LNCaP-ja PC-3-soluja käsiteltiin subditine (1 ) 24 tuntia. Sitten solut kiinnitettiin ja värjättiin kalvon läpäisevyyttä väriaine, MMP, sytokromi c: n ja Hoechst, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. (A) Mosaiikki soluja tarkasteltiin käyttämällä HSC arrayscan järjestelmä tarkistaa ydinaseiden morfologia, kalvon läpäisevyyden, MMP eheys, sytokromi c release; Sininen (ydinvoiman), Green (Membrane läpäisevyys), Red (MMP), Cyan (sytokromi c release). (B) Bar kuvaava keskimääräinen fluoresoiva intensiteetti kalvonläpäisyn, MMP ja sytokromi c (keskiarvo ± SD; * p 0,05).

Subditine (1) aktivoitu kaspaasi 9 ja 3/7.

vapautuminen sytokromi c: mitokondrioista aktivoi alavirran kaspaasi molekyylien ja johtaa apoptoottisen solukuoleman. Tämän tutkimiseksi bioluminescent intensiteetit kaspaasi-3/7, -8, -9 toimintaa subditine (1) hoidetun LNCaP-ja PC-3-soluja 6, 12, 18, 24, tai 30 tuntia aikapisteissä mitattiin . Kuten kuviossa 8 on esitetty, merkittävä kasvu kaspaasi-3/7, -9 toimintaa havaittiin sekä LNCaP-ja PC-3-soluissa, sen jälkeen 12 ja 24 tunnin subditine (1) altistumista. Korkein aktiivisuus kaspaasi-9 molemmissa solulinjoissa havaittiin 24 tunnin kuluttua hoidon subditine (1). Toisaalta, kaspaasi-3/7-aktiivisuus saavuttanut huippunsa 18 tunnin kuluttua hoidon ja laski asteittain myöhempinä ajankohtina (24 ja 30 tuntia). Kumpikaan LNCaP tai PC-3-solut osoittivat mitään induktiota kaspaasin 8 aktiivisuuden aikana 30 tuntia subditine (1) käsittely.