Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Eturauhassyöpä (PCA) on useimmin diagnosoitu syöpä Pohjois-Amerikan miehet. Androgeenipuutteen terapia (ADT) korostaa immuunisolujen soluttautumista sisällä eturauhanen. Kuitenkin immunosuppressiiviset reitit säätelevät androgeenien PCA eivät ole hyvin ominaista. Arginase 2 (ARG2) ilmentymistä PCa solujen johtaa alentuneeseen aktivaation kasvaimen spesifisten T-solujen. Meidän hypoteesi oli, että androgeenien voisi säätelemään ARG2 PCA soluja.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä raportissa osoitetaan, että molemmat ARG1 ja PAR2 ilmaistaan ​​hormoniherkän (HS ) ja hormoni tulenkestävät (HR) PCa solulinjat, jossa LNCaP, jolla on suurin arginase toimintaa. Eturauhasen kudosnäytteitä, ARG2 on enemmän ilmentyy normaaleissa ja ei-malignien eturauhasen kudosten verrattuna kasvaimen kudoksiin. Sen jälkeen androgeenistimulaation LNCaP-solujen kanssa 10 nM R1881, sekä ARG1 ja PAR2 oli yli-ilmentynyt. Sääntely arginase ilmaisun seuraavista androgeenistimulaation oli riippuvainen androgeenireseptorin (AR), koska siRNA hoito kohdistettu AR esti sekä ARG1 ja ARG2 yli-ilmentymisen. Tämä havainto korreloi

in vivo

potilailla immunohistokemiallisesti. Potilaita hoidetaan ADT ennen leikkausta oli alhaisemmat ARG2 ilmentymistä sekä ei-pahanlaatuisia ja pahanlaatuisia kudoksia. Lisäksi ARG1 ja PAR2 olivat entsymaattisesti aktiivisia ja niiden vähentynyt ilmentyminen siRNA vähensivät yleistä arginase aktiivisuutta ja l-arginiini aineenvaihduntaa. Vähentynyt ARG1 ja PAR2 ilmaisun kääntänyt vähentyneeseen LNCaP solujen kasvuun ja PBMC aktivointi altistuminen LNCaP kasvatusliuos. Lopuksi todettiin, että interleukiini-8 (IL-8) on myös säädelty seuraavat androgeenistimulaation ja että se suoraan lisääntynyt ilmentyminen ARG1 ja PAR2 puuttuessa androgeenien.

Päätelmä /merkitys

Tuloksemme tarjoaa ensimmäisen yksityiskohtaisen

in vitro

ja

in vivo

huomioon asianomaisen androgeenisäädellyn immunosuppressiivinen väylän ihmisen PCa ilmaisun kautta ARG1, PAR2 ja IL-8.

Citation: Gannon PO, Godin-Ethier J, Hassler M, Delvoye N, Aversa M, Poisson AO, et al. (2010) androgeenisäädellyn Expression of Arginase 1, Arginase 2 ja interleukiini-8 Human eturauhassyöpä. PLoS ONE 5 (8): e12107. doi: 10,1371 /journal.pone.0012107

Editor: Tšad Creighton, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu 17. maaliskuuta 2010 Hyväksytty: 06 heinäkuu 2010; Julkaistu: 11 elokuu 2010

Copyright: © 2010 Gannon et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat Sanofi Aventis tutkimus avustus (FS), kanadalainen Uro-Oncology Group /AstraZeneca apurahan (FS) ja avustusta Eturauhassyöpä Research Foundation of Canada (RL). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tietojen keruu ja analysointi, tietojen jakaminen, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Lisäksi F. S. omistaa University of Montreal Tuoli eturauhassyövässä. R. L. tukee apurahan päässä Fonds de Recherche en santé du Québec (FRSQ). P.O.G. on vastaanottaja Ph.D. stipendi päässä FRSQ ja sai lisätukea Institut du syöpä de Montreal /Canderel stipendin ja päässä molekyylibiologian ohjelma Université de Montréal.

Kilpailevat edut: Hanke rahoitetaan osittain jota Sanofi Aventis tutkimus avustus (FS) ja kanadalainen Uro-Oncology Group /AstraZeneca apurahan (FS). Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisimmin diagnosoitu syöpä ja kolmanneksi yleisin syy syövän liittyvät kuolemat Pohjois-Amerikan miesten [1]. Eturauhasen n organogeneesin ja syövän syntymistä luottaa androgeenien läsnäolon [2]. Sinänsä yleisin hoitomuoto miesten kanssa pitkälle edenneessä vaiheessa tai toistuva PCA androgeenipuutteen terapia (ADT). ADT johtaa apoptoosin hormoniherkkien eturauhasen epiteelisolut [3]. Valitettavasti Yhdestä viisi vuotta ADT aloittamisen, kehittyy useimmille potilaille hormoniresistentti PCa (HRPC), joiden käsittely on edelleen lievittävä [4]. Uusia hoitomuotoja, kuten immunoterapia, yritetään ratkaista nämä myöhemmissä vaiheissa PCa. Kuitenkin nykyinen immunoterapioiden vastaan ​​PCa ovat johtaneet rajoitettu menestystä hoitopaikassa. Yksityiskohtainen ymmärtäminen kasvain immunologisten microenvironment eturauhassyöpäpotilailla on hankkia uutta tietoa siitä, miten parantaa nykyistä immuuni-pohjaiset protokollat.

Viimeaikaiset tiedot osoittavat, että erilaiset immunosuppressiiviset mekanismit ovat läsnä eturauhasen ja saattaa haitata anti- kasvainten immuunivasteen yhteydessä immunoterapian (tarkistetaan [5]). Arginase 2 (ARG2) ilmentyy ihmisen PCa [6] ja sen estäminen, samanaikainen iNOS, kasvattaa aktivointi kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL) [7]. Vaikka immunosuppressiiviset ominaisuudet arginases kautta aineenvaihduntaa L-arginiini on hyvin dokumentoitu (tarkistetaan [8]), sääntely ihmisen arginase ilmaisun on kuitenkin tällä hetkellä määrittelemätön.

Androgeenit tiedetään olevan immunosuppressiivisia ominaisuuksia , joka on havainnollistettu sisäistä eturauhasen tulehdus ADT [9], [10]. Geenien ilmentyminen analysoidaan ja hiiren tutkimukset osoittavat, että androgeenien säätelemään ARG2 ja muiden entsyymien polyamiinin reitin [11], [12], [13]. Siten, kun otetaan huomioon perustavanlaatuinen roolit androgeenien eturauhasen syövän synnyn ja kuvanveistoa eturauhasen n microenvironment, arvioimme onko androgeenien voisi säätelemään arginases PCA solut

in vitro

ja

in vivo

.

tässä tutkimuksessa, me raportoimme että PCa solulinjat ilmentävät toiminnallisesti aktiivista ARG1 ja ARG2. Mielenkiintoista, hormoni herkkä (HS) ja hormoniresistentti (HR) kudoksiin ilmaistuna vähemmän ARG2 kuin ei-pahanlaatuinen kudosten. HS-LNCaP-solulinja, androgeenistimulaation johtanut lisääntyneeseen ilmentymisen sekä ARG1 ja PAR2 on androgeenireseptorin (AR) riippuvalla tavalla. Tämä androgeenisäädellyn ilmentyminen havaittiin myös primaarikasvaimen ADT saaneista potilaista, jotka ilmaisivat vähemmän ARG2 sekä ei-pahanlaatuinen kudosten vieressä kasvain ja kasvain kudosten vertailuryhmän potilailla. Lopuksi, huomasimme, että IL-8 myös säännelty androgeenien valvonnassa AR, ja osallistui säätelyssä ARG1 ja ARG2 ilme. Kaikkiaan meidän data tarjoaa ensimmäisen yksityiskohtaisen

in vitro

ja

in vivo

huomioon asianomaisen androgeenisäädellyn immunosuppressiivinen väylän ihmisen PCa.

Tulokset

ARG1 ja PAR2 ilmaisun PCA

arvioitiin ensin arginases ilmaisu PCA solulinjoista ja kliinisistä näytteistä. Tuloksemme osoittavat, että PCa solulinjat ilmentävät sekä ARG1 ja ARG2. Geenien ilmentyminen analyyseja qPCR osoittaneet, että

ARG1

mRNA oli runsaampaa 22Rv1 solulinjassa (kuvio 1A), kun taas ARG1 proteiini hieman ilmaisemat kaksi HR PCa solulinjoista (DU145 ja PC3) kuin LNCaP-soluja (kuvio 1 B, alapaneeli). ARG1 proteiinin ilmentyminen ei korreloinut geenin ilmentymisen analyysi viittaa mahdolliseen transkription jälkeisen sääntelyn. Kuten ARG2 ilmaisu, LNCaP-solulinjasta ilmaisi korkeimman

ARG2

mRNA (kuvio 1A). Low

ARG2

mRNA: n ekspressio havaittiin kahdessa HR solulinjat DU145 ja PC3 verrattuna kahteen HS PCa solulinjat. ARG2 proteiinia runsaasti korreloi qPCR tuloksia kanssa LNCaP-solut ekspressoivat merkittävästi enemmän ARG2 kuin muut kolme solulinjoissa (kuvio 1 B, alapaneeli). Lisäksi LNCaP oli korkein arginase aktiivisuus viittaa siihen, että ARG2 on hallitseva entsyymi suhteen arginase aktiivisuutta Eturauhassyövän soluja (kuvio 1 B, yläpaneeli).

PCa solulinjoissa (LNCaP, 22Rv1, DU145 ja PC3) pidettiin RPMI, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. A) Geenien ilmentyminen on

ARG1

(vasen paneeli) ja

ARG2

(oikea paneeli). Keskimääräinen suhteellinen lauseke (n = 3) tavallisella keskivirhe (virhepalkkeja). B) Ylälevy: Arginase aktiivisuus Eturauhassyövän solulinjojen määrällisesti mU /mg proteiineja. Pohjalevy: Western blot ARG1 ja ARG2. Ran toimi latauskontrollina. C) edustaja kuva Immunohistokemian värjäytymisen ARG2 ilmentymistä eturauhasen kudosta. Huomaa, että ilmentyminen ARG2 rajoittui epiteelisolujen ei ole strooman värjäytymistä. D) kvantifiointi ARG2 ilmentymisen immunohistokemia eturauhasnäytteissä. * Tilastollisesti merkitsevä ero ARG2 ilmaisun välillä PIN ja HR kudoksissa (p = 0,033, Mann-U). ** Tilastollisesti merkittävä ero ARG2 ilmentymisen välillä kasvaimen ja normaalit kudokset (p 0,001, Mann-U), ei-pahanlaatuisten kudosten vieressä kasvain (p 0,01, Mann-U) ja PIN kudoksissa (p 0,001, Mann- U).

ilmentäminen ARG2 proteiinin arvioitu kliinisissä näytteissä immunohistokemiallisesti kolmella eri kudosten mikroriveissä (TMA) yhdistämällä eturauhasen näytteitä kohortin 99 PCa potilaista ja 50 normaalissa eturauhasessa saatu ruumiinavauksia. Emme arvioi ARG1 proteiinin ilmentymisen kuten, meidän käsissämme, anti-ARG1 vasta testattiin eivät sovellu immunohistokemia arkistoitu formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudokset. Havaitsimme, että ARG2 ilmentyminen rajoittui eturauhasen epiteelin ja poissa strooman (kuvio 1C). ARG2 oli tilastollisesti merkitsevästi vähemmän ilmaistaan ​​kasvaimen kudoksissa verrattuna normaaliin (p 0,001, Mann-U), ei-pahanlaatuinen normaali viereinen (p 0,01, Mann-U) ja eturauhasen intraepiteliaalisten neoplasia (PIN) kudokset (p 0,001 , Mann-U) (kuvio 1 D). HR kudosten ilmaisivat myös vähemmän ARG2, vaikka vain poikkeavat merkittävästi PIN kudoksista (p = 0,033, Mann-U). Ei ollut mitään korrelaatiota ARG2 ilmentymisen viereisestä normaalista ja kasvaimen kudokset (taulukko S1). Lopuksi arvioitiin jos ARG2 lauseke korreloi kliinis-patologinen parametreja kuten Gleason Score, ennen leikkausta eturauhasen antigeenin (PSA) tasot ja biokemialliset toistumisen. Tuloksemme osoittavat, että ARG2 ilmaisu normaalilla vieruskudos korreloi käänteisesti rakkula uraauurtava invaasiota (taulukko S1). Kaiken kaikkiaan nämä

in vitro

ja

in vivo

tulokset osoittavat ero ilmaus ARG1 ja PAR2 eri vaiheiden Eturauhassyövän eteneminen riippumatta HR tilan.

androgeeni- säädellyn ekspression ARG1 ja PAR2

ero ilmaus ARG1 ja PAR2 välillä HS ja HR PCa solulinjoja johti meidät tutkimaan sääntelyn roolit androgeenit arginase ilme. Voit tehdä niin, arvioimme arginases geenin ja proteiinin ilmentyminen seuraavien androgeenistimulaation.

ARG1

mRNA ilmaisu ei ollut tilastollisesti merkitsevästi yläreguloituja joko LNCaP tai 22RV1 solulinjoja seuraavista R1881 stimulaation (kuvio 2A). Kuitenkin LNCaP,

ARG2

mRNA ekspressio lisääntyi 48 tuntia (p = 0,002, Mann-U) ja 72 tuntia (p = 0,016, Mann-U) jälkeen R1881 stimulaation (vasen paneeli, Kuvio 2B). Yli-ilmentyminen

ARG2

in 22RV1 ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,248, Mann-U) (oikea paneeli, kuvio 2B). Itse asiassa,

ARG2

ilmaisu korreloi korkeamman androgen herkkyys LNCaP verrattuna 22RV1 (kuvio S1A). Sellaisenaan, LNCaP-soluja käytettiin lisäkokeita varten. Vahvistavia PCR data, Western blotit alkaen LNCaP osoittivat, että R1881 stimulaatio lisääntynyt ARG2 proteiinin ilmentymisen (kuvio 2C). Mielenkiintoista, vaikka mitään merkittäviä muutoksia ei havaittu

ARG1

mRNA ilmaisun LNCaP käsitelty R1881, ARG1 proteiinin ilmentyminen oli merkittävästi lisääntynyt. Emme havainneet mitään korotuksia ARG1 tai PAR2 proteiinin ilmentymistä DU145 ja PC3 stimuloidaan 10 nM R1881 (kuvio S1B).

AB) LNCaP (vasemmanpuoleiset paneelit) ja 22RV1 (oikea paneeli) stimuloitiin yli ajan 72 tunnin ajan 10 nM R1881: n jälkeen, 72 tunnin inkuboinnin aikana in hiilellä erotettua median ja geeni-ilmentymisen A)

ARG1

ja B)

ARG2

analysoitiin qPCR. Ohjaus (vaaleanharmaa palkit) ja R1881-stimuloiduista (mustat palkit). * Tilastollisesti merkitsevä ero (p 0,05, Mann-U). Keskimääräinen, suhteellinen lauseke (n = 4), jossa keskivirhe (virhepalkkien). C) Lisääntynyt proteiinin ilmentymistä sekä ARG1 ja PAR2 seuraava R1881 stimulaation Western blotilla. LNCaP-soluja stimuloitiin 10 nM R1881: n, kuten edellä on kuvattu. PSA toimi positiivisena kontrollina. Edustavassa kokeessa (n = 6). D) esto AR toimintaa bikalutamidin (Casodex). LNCaP-soluja stimuloitiin R1881 72 tuntia kuten edellä on kuvattu, kun läsnä on kasvavia annoksia bikalutamidin (0, 10, 20 ja 40 uM). ARG1 ja PAR2 ekspressiotasot arvioitiin Western blot. Edustava koe on esitetty, (n = 3). Huomaa agonisti vaikutus bikalutamidi ilman R1881 havainnollistettu lisääntynyt PSA ja ARG2 ilmaisun. E) esto AR ilmentymisen siRNA. LNCaP-solut transfektoitiin kuten edellä on kuvattu. AR, ARG1 ja PAR2 ekspressiotasot arvioitiin Western blot. Edustava koe on esitetty, (n = 4). F) Arginase aktiivisuus määrällisesti mU /mg proteiineja. LNCaP-solut transfektoitiin siCTRL (vaaleanharmaa pylväät) tai SIAR (mustat pylväät) ja stimuloitiin sitten R1881 72 tuntia kuten edellä on kuvattu. Edustavassa kokeessa, (n = 3).

AR on sekaantunut ARG1 ja PAR2 ilmaisun

Koska tulokset viittaavat siihen, että androgeenien säätelevät arginase lauseke, arvioimme osuus AR . Me esti AR toiminnan kanssa steroideihin kuulumattomien antiandrogeeni bikalutamidin (Casodex) (kuvio 2D). Totesimme vähentynyt ilmentyminen ARG1 kanssa korkein pitoisuus (40 uM) bikalutamidin seuraavista R1881 stimulaatiota. Androgen induktio ARG2 ei tukossa, jopa korkein pitoisuus bikalutamidia. Kuten aiemmin dokumentoitu [14], havaitsimme, että bikalutamidi oli AR-agonistivaikutus LNCaP viljeltiin ilman androgeenien. Oli R1881-riippumaton induktio PSA ja ARG2 ilmaisun LNCaP stimuloidaan 20 uM ja 40 uM Bikalutamidin puuttuessa androgeenien. Tässä samassa tilassa, bikalutamidi vähensi ARG1 ilmaisua. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ARG1 ekspressio voi olla herkempiä AR inhibition kuin ARG2, jonka ilmentyminen indusoitiin agnostista vaikutusta AR-estäjällä.

Päätimme edelleen estää AR estämällä AR ilmentymisen LNCaP käyttämällä siRNA. Läsnäolo siRNA vastaan ​​AR johti merkittävään eston AR ilmaisun ja pelkistettynä PSA ilmaus seuraavat R1881 stimulaation (kuvio 2E). Sekä ARG1 ja PAR2 induktio seuraavat R1881 stimulaation inhiboi siRNA käsittely, joka käännettynä ilman säätelyyn ylöspäin arginase aktiivisuuden (kuvio 2F). Nämä tulokset viittaavat siihen, että AR säätelee ilmaus ARG1 ja PAR2

in vitro

ja että ARG1 ja PAR2 on erilainen herkkyys AR eston.

Vähentynyt ARG2 ilmaisun PCA potilaista ADT

koska meillä

in vitro

data, me arveltu, että androgeenien voisi moduloida ARG2 proteiinin ilmentymistä PCA potilaille. Havaitsimme, että verrattuna hallita syöpäpotilailla (leikkaus vain), ADT saaneilla potilailla (ADT ennen leikkausta) oli huomattavasti pienempi ARG2 ilmentymistä sekä ei-pahanlaatuinen kudosten vieressä kasvain (46,4 vs. 23,5 suhteellinen yksikköä; p 0,001 Mann-U) ja kasvainkudoksessa (41,7 vs. 31,5 suhteellinen yksikköä; p 0,01, Mann-U) (kuvio 3A). Havaitsimme myös, että androgeenideprivaatio

in vitro

saattaa vähentää ARG2, mutta ei ARG1 proteiinin ilmentymisen, LNCaP ja 22RV1 soluja viljeltiin seitsemän päivää ilman androgeenien (kuvio 3B). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että androgeenien säätelemään ARG2

in vivo

PCA potilailla ADT vähentää ARG2 ilme.

A) analyysi androgeenisäädellyn ARG2 ilmentymistä PCA potilailla immunohistokemiallisesti . Verrokeilla (vaaleanharmaa palkit, n = 40) ja ADT hoidetuilla potilailla (mustat palkit, n = 35). B) Vähentynyt ARG2 proteiinin ilmentymisen puuttuessa androgeenien

in vitro

määritettiin Western blot. Ran toimi latauskontrollina. PCa solulinjoja (LNCaP, 22Rv1, DU145 ja PC3) ylläpidettiin RPMI 10% FBS tai RPMI, jota oli täydennetty 10% hiilellä käsiteltyä FBS: aa ja 7 päivää (n = 3). Huomaa, että ARG1 ilmentyminen ei muuttunut, mutta että ARG2 väheni LNCaP ja 22Rv1 solujen puuttuessa androgen.

ARG1 ja PAR2 ovat metabolisesti aktiivisia

Sen arvioimiseksi, ARG1 ja ARG2 ilmaisemat LNCaP-soluja metabolisesti aktiivisia, me esti ilmentymistä joko ARG1 tai PAR2 siRNA. Verrattuna siCTRL, sekä siRNA esti merkittävästi ARG1 tai PAR2 ilmentymistä (kuvio 4A). Inhibitio joko ARG1 tai PAR2 johti vähentynyt arginase entsymaattisen aktiivisuuden (kuvio 4B). HPLC, me määritetään sitten vaikutusta inhibition ARG1 ja PAR2 ilmaisun aineenvaihduntaan l-arginiinista LNCaP-soluja. Koska joko ARG1 tai PAR2 johti suurempia pitoisuuksia L-arginiinin elatusaine viittaa alempaan aineenvaihduntaa l-arginiinista LNCaP-soluja (kuvio 4C). Lisäksi olemme huomanneet, että R1881 stimulaatio johti vähentynyt pitoisuus solunulkoisen L-arginiini, joka vahvistaa oikeaksi tuloksemme osoittavat lisääntynyttä arginase ilmaus seuraavat androgeenistimulaation. Olemme arvioineet ilmentymistä typpioksidisyntaasin (NOS), joka tunnetaan myös nimellä aineenvaihdunta l-arginiini. Emme kuitenkaan ole noudattanut iNOS- tai nNOS (proteiini) sekä ei NO: n tuotantoa (toiminto) mallissamme (tuloksia ei ole esitetty).

LNCaP-solut transfektoitiin joko siCTRL tai cocktail kolmen siRNA vastaan ​​ARG1 tai ARG2. Transfektion jälkeen (24 tuntia), solut maljattiin hiilellä erotettua seerumia täydennettyä elatusainetta 72 tunnin ajan ja stimuloitiin sitten 72 tunnin ajan 10 nM R1881. A) siRNA estyminen ARG1 ja PAR2 ilmentymistä arvioitiin Western Blot. Edustava koe on esitetty, (n = 4). B) Vähentynyt arginase seuranneesta transfektiota siARG1 tai siARG2 LNCaP-soluissa. Vastaava Western blot esitetään pohjapaneelin. Edustava koe on esitetty, (n = 3). C) Vähentynyt aineenvaihduntaa l-arginiini puuttuessa arginase ilmaisua. Esikäsitelty väliaine LNCaP-soluja, jotka on transfektoitu siCTRL, siARG1 tai siARG2 analysoitiin HPLC: llä L-arginiini pitoisuus. Esikäsitelty väliaine analysoitiin HPLC: llä olivat LNCaP soluista esitetty kuvassa 4A. * Tilastollisesti merkitsevä ero (p 0,05, Mann-U). D) Vähentynyt lisääntyminen LNCaP puuttuessa arginase ilmaisua. LNCaP-solut transfektoitiin kuten edellä on kuvattu. Proliferaatio mitattiin solujen määrä 96 tuntia transfektion jälkeen. * Tilastollisesti merkitsevä ero (p 0,05, Mann-U), (n = 3). E) inhibitio ARG2 ilmaisun aiheuttaa kasvavia PBMC lisääntymistä ja aktivoitumista. PBMC: t normaaleilta luovuttajilta aktivoitiin anti-CD3: lla (OKT3, 1 ug /ml) kanssa tai ilman IL-2: n läsnä ollessa tuoretta väliainetta tai väliaine LNCaP-soluja transfektoitiin joko ohjaus, siCTRL, siARG1 tai siARG2 kuten aiemmin on kuvattu. Ohjaus PBMC: itä inkuboitiin IgG isotyyppikontrollilla (1 ug /ml) ja PBS: llä eikä IL-2. Vasen paneeli: PBMC leviämisen kvantifioitiin BrdU seuraavat 120 tuntia OKT3 ja IL-2 stimulaation. Absorbanssien keskiarvo (n = 4) näytetään keskivirheen (virhepalkkien). Oikea paneeli: PBMC: IFN-γ kvantitoitiin ELISA-menetelmällä. Sama koe, kuten on aikaisemmin kuvattu, mutta PBMC: t aktivoitiin 24 tuntia ilman IL-2. Edustavia ilme näkyy (n = 4) tavallisella keskivirhe (virhepalkkeja).

Koska arginases ovat sekaantuneet polyamiini synteesireittiä välttämättömiä solujen lisääntymisen, arvioimme vaikutus ARG1 ja ARG2 solun kasvuun. Havaitsimme, että esto joko ARG1 tai PAR2 ilmaus johti alhaisempiin leviämisen LNCaP pitää täysin median (p = 0,02 ja p = 0,01, vastaavasti siARG1 ja siARG2) (kuvio 4D). Lisäksi jotta voidaan tutkia, onko ARG1 ja PAR2 ilmentyminen LNCaP vaikuttanut niiden immunosupressiiviset, PBMC terveistä luovuttajista aktivoitiin läsnä vakioitua elatusainetta LNCaP + siCTRL tai LNCaP + siARG1 tai LNCaP + siARG2. Estyminen joko ARG1 tai PAR2 käännetty kasvoi PBMC leviämisen kuin kvantifioidaan BrdU (kuvio 4E, vasen paneeli). Tämä lisääntynyt jakautuminen liittyy kohonnut IFN-γ erittymistä PBMC mitattuna ELISA (kuvio 4E, oikea paneeli). Ei merkittäviä eroja eritystä IL-2: n tai IL-10 havaittiin (tuloksia ei ole esitetty). Lopuksi arvioitiin, onko ARG2 ilmentyminen korreloi immuunijärjestelmän soluinfiltraatin primaarikasvaimen, että äskettäin julkaistu [10]. Totesimme, että ARG2 ilmaisu ei korreloivat käänteisesti soluttautuminen T-lymfosyyttien ja makrofagien sisällä eturauhanen (taulukko S2). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että ARG1 ja PAR2 ilmaistaan ​​LNCaP-solut ovat entsymaattisesti aktiivisia ja osallistua tärkeitä fysiologisia prosesseja, kuten solun proliferaatiota ja kasvaimen peräisin immunosuppressio.

IL-8 induktio ARG1 ja ARG2 ilmaisun

Koska arginases ovat hyvin dokumentoitu osallistua kuvanveistoa kasvaimen immunologisten microenvironment [15] ja että sytokiinien tiedetään aiheuttavan arginase ilmentymistä hiiren malleissa [16], me arvioi sytokiinien voi myös säädellä arginase ilmentymistä ihmisen PCa . Sytokiini ilmentymisen profiili LNCaP-soluja stimuloitiin 10 nM R1881 on kvalitatiivisesti käyttäen Proteome Profiler sytokiini array (R & D Systems) (Kuva 5A). Proteomiikan tiedot on esitetty, että R1881-stimuloitujen LNCaP-solut olivat lisääntynyt IL-8 ja Serpin E1 (kuvio S2A). Tutkimme lisäksi roolia IL-8 arginase ilmaisu kuin IL-8 on äskettäin yhdistetty ilmentymisen androgen geenien PCA [17]. Meillä on siis määrällisesti kohonnut IL-8: n LNCaP-soluissa R1881 ilmentymistä (kuvio 5B). Tämä IL-8 induktio oli riippuvainen AR estyminen AR ekspression siRNA estää IL-8: n erityksen seuraavasti androgeenistimulaation (kuvio 5C). Sitten arvioitiin, onko estyminen IL-8 voisi vähentää ARG1 ja PAR2 ilmaisun seuraava R1881 stimulaatiota. Käyttämällä siRNA IL-8, voimme vähentää merkittävästi IL-8 eritystä (kuvio 5D). Tämä vähensi IL-8 tuotantoa liittyi vähenemiseen ARG1 ja PAR2 24 tuntia seuraavat R1881 stimulaation (kuvio 5E). Hoito LNCaP-solujen Siil-8 myös käännetty vähenemiseen arginase aktiivisuuden (kuvio S2B). Lopuksi stimuloi androgeenille riistää LNCaP-solujen konsentraation kasvaessa eksogeenisen IL-8: ssa 72 tuntia ja seurattiin ilmentymistä ARG1 ja ARG2. Western blot-analyysi, olemme todenneet, että 50 ng /ml ja 100 ng /ml IL-8: lla indusoituvan ilmentymisen ARG1 ja PAR2 verrattuna ohjata LNCaP-soluja (kuvio 5F). Lasku ARG1 ja PAR2 proteiinin ilmentyminen 250 ng /ml IL-8 korreloi IL-8: lla indusoituvan solutoksisuuteen. Havaitsimme myös induktion

ARG2

, mutta ei

ARG1

, geenien ilmentyminen jälkeen 24 tunnin stimulaation (kuvio S2C). Lopuksi, koska se oli aiemmin raportoitu, että fenolipunaista voi aktivoida AR [18], myös stimuloi LNCaP-solujen IL-8 fenolipunaista RPMI-elatusaineeseen. Nämä ohjaus kokeet osoittivat, että IL-8-riippuvainen induktio ARG1 ja PAR2 voi tapahtua ilman fenolipunaista (kuvio S2D). Yhdessä nämä tiedot osoittavat selvästi, että androgeenien säätelemään IL-8, joka voi yksinään indusoida sekä ARG1 ja PAR2.

arviointi sytokiiniekspressiota profiilia LNCaP-solujen seuraavista R1881 stimulaatiota. A) väliaine LNCaP-soluja stimuloitiin aikaisemmin kuvatulla tavalla analysoitiin Proteome Profiler ™ (R & D Systems). B) väliaine LNCaP stimuloitujen solujen ajan joko etanolilla ohjaus (vaaleanharmaa palkit) ja R1881 (mustat palkit) analysoitiin IL-8 ELISA. Edustaja Kokeilu osoitti suoritettiin samalla elatusainetta käytettiin Proteome Profiler analyysi 5a, (n = 3). C) kvantifiointi IL-8 eritystä LNCaP-soluja, jotka on transfektoitu SIAR ja stimuloitiin R1881 kuten aiemmin on kuvattu. Edustava koe on esitetty, (n = 3). D) kvantifiointi IL-8 eritystä LNCaP-soluja, jotka on transfektoitu Siil-8 ja stimuloitiin R1881 kuten aiemmin on kuvattu. Edustava koe on esitetty, (n = 3). 5b ja 5c, ei ollut IL-8 eritystä havaitaan ilman R1881 stimulaatiota. E) ilmentäminen ARG1 ja PAR2 LNCaP-soluissa transfektion Siil-8 ja R1881 stimulaatio 24 tuntia. Edustava koe on esitetty, (n = 3). F) LNCaP-soluja maljattiin hiilellä erotettua seerumia täydennettyä elatusainetta 72 tunnin ajan ja 24 tunnin ajan seerumittomassa RPMI. Sitten soluja stimuloitiin 72 tunnin ajan 10 nM R1881: n kanssa tai 50, 100 tai 250 ng /ml IL-8 seerumittomassa RPMI. ARG1 ja PAR2 ekspressiotasoja havaittiin Western blot. Edustavassa kokeessa, (n = 3). Huomaa induktio sekä ARG1 ja PAR2 50 ja 100 ng /ml IL-8 pitoisuuden ilman R1881.

Keskustelu

tarkempi käsitys eturauhasen immunologisten microenvironment mekanismit voivat parantaa kliinistä tehoa nykyisestä immunoterapioiden vastaan ​​PCa. Me ja muut ovat osoittaneet, että ADT johtaa rajuja muutoksia eturauhasen immunologinen microenvironment [9], [10]. Arginase polku mukana kehittämässä immunosuppressiivista tilaan primaarikasvaimen Eturauhassyövän potilaista [7]. Kuitenkin sääntelyn arginase ilmentymisen PCA solujen määrittelemätön.

Tässä raportissa havaitsimme, että androgeenien indusoi ilmentymistä sekä ARG1 ja PAR2 HS PCa solulinjoissa. AR oli osallisena tähän asetukseen sekä bikalutamidia ja SIAR transfektio esti ARG1 ja PAR2 yli-ilmentyminen seuraavien R1881 stimulaatiota. Vastavuoroisesti androgeenideprivaatio ja ADT vähennetään ARG2 ilmaisun

in vitro

ja primaarikasvaimen Eturauhassyövän potilaista. LNCaP-solut ilmensivät entsymaattisesti toiminnallinen ARG1 ja PAR2, jotka sen jälkeen, kun heidän proteiinin ilmentyminen inhiboitui, vähensi solujen lisääntymistä ja niiden immunosuppressiivisten mahdollisia. Lopuksi osoitimme, että IL-8 myös säännelty R1881 ja voisi lisätä ilmaus ARG1 ja PAR2 riippumatta androgen. Kaikkiaan tuloksemme ovat ensimmäinen mekanistinen näyttöä androgen perustuva immunosuppressiivinen väylän PCa ilmaisun kautta ARG1, PAR2 ja IL-8 PCA soluja.

osoittaa, että PCa ilmentävät sekä ARG1 ja ARG2. ARG2 oli pääasiallisesti ilmaisseet HS PCa solulinjojen ja ei-pahanlaatuiset eturauhaskudoksiin. Nämä tulokset vahvistavat ne julkaistut tiedot kuvaavat alempaa ARG2 ilmaisun androgeeni-erottelua PCa solulinjoissa (DU145 ja PC3) sekä kasvaimen ja HR kudosten Eturauhassyövän potilaista [6], [19]. Kuitenkin tietojemme mukaan olemme ensimmäinen ryhmä tutkimaan ilmaus ARG1 PCA solut ja määrittää mekanistinen seuraukset johtavat sen androgeenisäädellyn induktio. Samanlaisia ​​ARG2 esto ARG1 ilmaisun vähensivät kasvainten solujen lisääntymistä, vähentää l-arginiini aineenvaihduntaa ja vähentää niiden immunosuppressiivisten potentiaalia. Perustuen proteiinin ilmentymisen (kuvio 1 B, alapaneeli) ja arginase aktiivisuutta Eturauhassyövän soluja (kuvio 1 B, yläpaneeli), meidän tiedot viittaavat siihen, että ARG2 voi kuitenkin olla merkittävämpi rooli kuin ARG1 vuonna arginase aktiivisuuden potentiaali Eturauhassyövän soluja [20].

Lisäksi meidän tiedot osoittivat, että ARG1 ja PAR2 oli differentiaalisesti säännelty androgeenien. Toisin kuin ARG2 geenin ja proteiinin ilmentyminen, me osoitti selvästi, että geeni ja proteiinin ekspression ARG1 ei korreloi. Tämä viittaa siihen, että androgeenien voivat vaikuttaa jälkeistä transkription säätelyyn ARG1 koska se oli aiemmin raportoitu Xenopus [21] ja hiiva malleissa [22]. Koska ARG2 ilmentyminen paikantuu mitokondrioita, arvioimme onko solujen lisääntymisen riippumaton androgeenien voisi aiheuttaa ARG2 ilmentymistä LNCaP. Proliferaatiomäärityksessä EGF sijaan R1881, ei ARG2 induktio havaittiin (tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä tuloksemme osoittavat, että vaikka molemmat aiheuttama R1881, signalointi johtavia reittejä ARG1 ja PAR2 ilmaisun eroavat kahden entsyymejä ja niitä tutkitaan edelleen.

Seuraus androgen-säänneltyjen ilmaus ARG1 ja ARG2 eturauhasen syövän synnyn vaatii lisätutkimuksia. Arginase ilmaisun ja polyamiinin synteesin ovat koholla PCa [23], [24] ja jotka liittyvät kasvaimen [25]. Korkea arginase aktiivisuus korreloi lisääntyneeseen leviämisen rintasyövän [26], paksusuolen syöpä [27] ja munuaissolulinjoissa [28]. Olemme kuitenkin havaittu, että kasvaimen tai HR kudosten ilmaista vähemmän ARG2 kuin ei-pahanlaatuinen kudosten. On mahdollista, että kasvainsolut eivät hankkia näiden entsyymien ilmentymää keinona edelleen hyödyntää immunosuppressiivista potentiaalia, näkökohta liittyy syövän etenemiseen. Itse asiassa, koska eturauhasen on elin, jolla on korkein polyamiinin tuotanto, arginase ilmentymistä eturauhasen solut voivat edeltää syövän kehittymistä, kuten polyamiini tuotanto on välttämätöntä leviämisen eturauhasen soluja. Siten immunosuppressiiviset saavutettu etu eturauhasen solut voivat olla toissijainen proliferatiivisia roolia arginases. Meidän data ja toisten oletamme, että arginase voi kohdistua aikaisempaan hormoniherkän vaiheissa eturauhasen syövän synnyn edistämällä syöpäsolujen lisääntymistä ja kehittämään androgeenisäädellyn immunosuppressiivisia ympäristössä.

Lopuksi havaittu, että IL-8 on voimistunut seuraavat androgeenistimulaation ja voi indusoida ARG1 ja ARG2. IL-8 välittää sen vaikutuksia aktivoitumisen kautta kaksi korkean affiniteetin G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien, CXCR1 ja CXCR2 [29], jotka molemmat ilmaistaan ​​LNCaP-solujen [30], [31]. On tärkeää huomata, että ilmaus ARG1 ja PAR2 seuraava IL-8 stimulaation ei ollut niin merkittävä kuin R1881 stimulaation viittaa siihen, että muut androgeenisäädellyn reittejä voisi olla mukana.