Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Syöpäsolut esittää jatkuvaa de novo rasvahapposynteesissä kasvaessa tyydyttyneitä ja kertatyydyttymättömiä rasvahappoja (MUFA) tuotanto. Tämä muutos rasvahappojen aineenvaihdunta yliekspressioon liittyvän stearoyyli-CoA-desaturaasi 1 (Scd1), joka katalysoi tyydyttyneiden rasvahappojen tyydyttymättömiä rasvahappoja (esim. Öljyhappo). Useat raportit osoittivat, että inhibitio Scd1 johti esto leviämisen ja apoptoosin induktio syöpäsoluissa. Kuitenkin mekanismit solukuoleman aktivaation vielä ymmärretään paremmin.

Keskeiset havainnot

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että Scd1 sukupuuttoon siRNA laukaisi poistamisesta de novo MUFA synteesiä syövän ja ei- syöpäsoluja. Scd1 esto solu- kuolema havaittiin vain syövän solujen induktion kaspaasi 3: n aktiivisuuden ja PARP-pilkkominen. Eksogeeninen lisäravinteen öljyhappoa eivät muuttaneet sitä Scd1 ablaation välittämä solukuolema. Lisäksi Scd1 ehtyminen aiheuttama laskostumattoman proteiinivaste (UPR) tunnusmerkkejä kuten Xbp1 mRNA, fosforylaatiota eIF2α ja kasvua CHOP ilmaisua. Kuitenkin saattaja GRP78 lauseke, toinen UPR tunnusmerkki, eivät vaikuttaneet Scd1 Knockdown näissä syöpäsoluissa osoittaa erikoinen UPR aktivointi. Lopuksi osoitimme että CHOP induktio osallistui solukuolemaan aktivaation Scd1 sukupuuttoon. Todellakin, yliekspressio hallitseva negatiivinen CHOP konstruktio ja lakkaamista CHOP osittain palautettu elinkelpoisuuden Scd1-köyhdytettyä syöpäsoluja.

Johtopäätös

Nämä tulokset viittaavat siihen, että esto de novo MUFA synteesin Scd1 sukupuuttoon voisi olla lupaava syöpälääkkeen kohde- indusoimalla solukuoleman kautta UPR ja CHOP aktivointi.

Citation: Minville-Walz M, Pierre AS, Pichon L, Bellenger S, Fèvre C, Bellenger J, et al. (2010) esto Stearoyl-CoA desaturaasi 1 Expression indusoi CHOP-Dependent solukuolemaa ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 5 (12): e14363. doi: 10,1371 /journal.pone.0014363

Editor: Michael Polymenis, Texas A M University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 heinäkuu 2010; Hyväksytty: 26 marraskuu 2010; Julkaistu: 16 joulukuu 2010

Copyright: © 2010 Minville-Walz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia INSERM, Region Bourgogne ja Centre National interprofessionnel de l’Economie Laitiare. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpäsolut näyttelytila ​​aineenvaihdunnan muutoksia ominaista lisääntynyt Glykolyysivaiheen ja lipogeneesiin [1], [2]. Aktiivinen lisääntyviä syöpäsolut läsnä paitsi määrällisiä muutoksia

de novo

lipidien biosynteesin vaan myös muunnelmia lipidikalvoihin koostumus vaikuttaa solukalvon liikkuvuus, signaalitransduktion ja geenien ilmentymisen [3], [4]. Muutokset lipidikalvo koostumuksessa havaitaan monenlaisia ​​syöpiä, ominaista lähinnä kylläinen (SFA) ja kertatyydyttymättömiä rasvahappoja (MUFA) kerääntyminen, joka näyttää vähemmän johtuen suosia SFA ja MUFA kuin ylikorostuneisiin endogeenisen rasvahappojen synteesi, riippumatta riittävää lipidien ravitsemukselliset tarjonta [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Nämä muutokset SFA ja MUFA sisältö liittyy modulaatioon ilmaisun ja toimintaa lipogeeniset entsyymejä. Niinpä yli-ilmentyminen asetyyli-Co-A karboksylaasi α ja rasvahappojen syntaasia, mukana ensiaskeleita rasvahappojen biosynteesin, kuvattiin erilaisten syöpien [12], [13], [14], [15], [16], [17].

Lisääntynyt MUFA sisältöä voitaisiin myös johtua säätely ylöspäin stearoyyli Co-A-desaturaasin (SCD, delta-9-desaturaasia) lauseke, nopeutta rajoittavaa entsyymiä MUFA synteesin. Todellakin, SCD katalysoi käyttöön kaksoissidoksen hiilten 9 ja 10 useiden tyydyttyneiden rasvahappojen, kuten palmitiini- (16:0) ja steariinihapon (18:0) hapot, jolloin saatiin palmitoleiinihappo (16:1) ja öljyhappoa (18:1 ) hapot, vastaavasti. Tämä Endoplasmakalvosto asukas-entsyymiä on alle kaksi isoformia ihmisillä, Scd1 ja Scd5 [18]. Scd1 esiintyy lähes kaikissa kudoksissa, jolla on merkittävä ekspression maksassa, kun taas Scd5 ilmentyminen on rajoittunut haiman ja aivojen. Scd1 ilme, korreloi MUFA sisältöä, on lisääntynyt hepatosellulaarinen adenooma, paksusuolen ja ruokatorven karsinooma, sekä geneettisesti määräytyvät ja kemikaalien aiheuttamien kasvainten [19], [20], [21]. Eturauhasen syöpä, kaksi tutkimusta esittää ristiriitaisia ​​tuloksia Scd1 ilmaisun tasolla [22], [23]. Siten Scd1 ilmaisu voi liittyä syövän synnyn, joihin osallistuu muuttaminen leviämisen /apoptoosin tasapainossa. Todellakin, Scd1 yli-ilmentäviä soluja esittää kasvuetua taas Scd1 knock-down johtaa hitaammin hinnat solujen lisääntymisen ja solukuoleman

in vivo

ja

in vitro

[24], [25] , [26], [27]. Mekanismi solukuoleman havaittu Scd1 puutteesta keuhkosyövän soluja näyttää ottamaan muuttaminen SFA /MUFA-suhde, joka laukaisee inhibition Akt-reitillä ja aktivointi AMPK reitin [24], [28]. Itse asiassa ilman Scd1, SFA pitoisuus kasvaa joka lievittää Akt aktivointi normaalisti aikaan MUFA (esimerkiksi öljyhappo) ylläpitämiseksi solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen [29]. Lisäksi erilaiset syövän soluja, joista puuttuu Scd1 aktiivisuus vähentää

de novo

lipogeneesiin aktivaation kautta AMPK reitin [22], [24]. Muuttaminen lipidien tuotantoa Scd1-vajaiden solujen koskee pääasiassa vähentäminen fosfolipidin biosynteesin, joka laukaisee solujen stressiä ja ilmentyminen apoptoosin liittyvät proteiini C /EBP homologista proteiinia (CHOP /GADD153) [26], [27], [30 ], [31]. CHOP kuuluu erikoinen stressin reitti nimeltään solulimakalvostoon (ER), stressiä, joka voi aiheuttaa apoptoosin.

ER stressi laukaisee erilaisia ​​stressin olosuhteissa, kuten muutokset translaation jälkeisessä proteiinin asema ja lipidien synteesi, hypoksia, häiriöitä kalsiumtasapainoa ja ravinteiden puutetta, ja johtaa aktivoitumiseen adaptiivisen ohjelman, joka tunnetaan nimellä taitettuna Protein Response (UPR), palauttaa tasapaino [32]. Aktivointi kanoninen UPR tarttuu kolme erillistä yhdenmukaistetun signalointia oksat välittämän ER kalvo ankkuroitu anturit: RNA-riippuvaisen proteiinikinaasi (PKR) kaltaisia ​​ER kinaasi (PERK), aktivoiva transkriptiotekijä 6 (ATF6) ja inositoli vaativat entsyymi 1α (IRE1α) [ ,,,0],33]. Vuonna korosti soluissa kaperoniproteiinin GRP78 dissosioituu UPR anturit Perk, ATF6 ja IRE1α johtaa niiden aktivoinnin ensin lievittää ER stressiä. PERK fosforyloi eukaryoottitranslaatioon initiaatiofaktoria (EIR) 2α, mikä rajoitti globaali proteiinisynteesiä. Aktiivinen ATF6 translokoituu Golgin ja lohkaistaan ​​kalvon päällä-1 ja -2 proteaasit. Sitten katkaistiin ATF6 paikantuu tumaan ja indusoi transkriptio Xbp1 ja ER chaperones kuten GRP78. IRE1α luovuttaa sellaisen endoribonukleaasi toimintaa, joka vaihtoehtoisesti jatkoksissa Xbp1 mRNA (sXbp1), joka on käännetty aktiivinen transkriptiotekijä. Kuitenkin vakava tai pitkäaikainen stressi, UPR voi laukaista proapoptoottisten signaaleja aktivoimalla transkriptiotekijän CHOP, joka toimii tukahduttaa Bcl-2-geenin ilmentyminen, mikä alaspäin säätäminen antiapoptoottisia Bcl-2-proteiinin ja tekee solut herkkä pro-apoptoottisen vaikutusten BH3-vasta-proteiinit [34], [35], [36].

Vaikka nämä tiedot tukevat selvästi osallistumista Scd1 keskeisenä säätelijänä lipogeneesiä syöpäsolujen yhteys Scd1 ja induktio ER stressin ja solukuolemaa syöpäsoluissa vielä paremmin ymmärrettävissä. Tässä tutkimuksessa olemme siis olivat kiinnostuneita etsivät UPR induktioon syöpäsoluissa puuttuu Scd1 ilmaisun ja tutkittaessa roolia tämän stressin reitin päälle syöpäsolun elinkelpoisuuden aikana Scd1 sukupuuttoon. Olemme osoittaneet, että Scd1 ehtyminen syöpäsoluissa aktivoituu UPR markkereita ja indusoi syöpäsolun kuoleman ilman vaikutusta ei syöpäsolun elinkelpoisuuden. Lisäksi olemme osoitti, että CHOP osallistuneet Scd1 välittämä solukuolema.

Tulokset

tehokas estäminen Scd1 ilmaisun ja tukahduttaminen

de novo

MUFA synteesi

tässä tutkimuksessa tutkittiin vaikutusta Scd1 hiljentäminen käyttää siRNA eri ihmisen syövän solulinjoissa (U2OS, SW480 ja HCT116). Syöpäsolut transfektoitiin 75 nM siRNA kohdistaminen jotka eivät liity ihmisen mRNA (siRNA scr) ja Scd1 mRNA (siRNA Scd1.A ja Scd1.B). Molemmat vastaan ​​suunnattu siRNA Scd1 verrattuna kontrolliin siRNA (SCR) voimakkaasti tukahdutti ilmentymistä Scd1 mRNA: ta ja proteiinia, niin pian kuin 24 tuntia transfektion jälkeen (kuviot 1A ja 1B).

A) U2OS solut transfektoitiin siRNA ohjaus ( scr) tai siRNA vastaan ​​Scd1 (Scd1.A ja Scd1.B) ja kerättiin 24 ja 48 tuntia transfektion varten Scd1 mRNA: n ilmentymisen reaaliaikaisella RT-PCR. Scd1 mRNA: n ekspressio normalisoitiin p-aktiinin ilmentymistä. Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM suhteessa Scd1 mRNA: n ekspression scr-käsiteltyjen U2OS solujen 24 h. *, P 0,05 vs. siRNA scr-käsiteltyjen solujen ANOVA seurasi Tuckey testi. B) U2OS ja SW480-soluja käsiteltiin Oligofectamine (-), siRNA ohjaus (SCR) tai siRNA vastaan ​​Scd1 (Scd1.A ja Scd1.B). Solut kerättiin 24 tunnin kuluttua transfektion Scd1 ilmentymisen analyysi Western-blottauksella. C) U2OS ja SW480-solut käsiteltiin 72 h siRNA inkuboitiin vielä 6 h [

14C] steariinihappo ja yhteensä lipidien uuttaminen suoritettiin. SCD aktiivisuus arvioitiin HPLC: llä nopeudella [

14C] steariinihappo muuntaminen [

14C] öljyhappoa soluissa käsitelty siRNA 72 h. Scd aktiivisuus ilmaistiin% suhde [

14C] oleiinihappoa [

14C] öljyhappoa ja steariinihappojen. Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM vähintään kaksi erillistä koetta. *, P 0,05 vs. siRNA scr-käsiteltyjen solujen ANOVA seurasi Tuckey testi. Edustaja ilmentyminen Scd1 proteiinin osoitettiin 72 tuntia siRNA: n hoitoon. D) U2OS solut altistettiin DMSO ajoneuvon Scd1 estäjät (CVT-11127 tai MF-438), 10 uM: ssa 24 tuntia, ja valmistettu, kuten edellä on C) mittaamiseksi SCD toimintaa. Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta kokeesta. *, P 0,05 vs. ajoneuvon käsiteltyjen solujen ANOVA seurasi Tuckey testi.

Koska Scd1 katalysoi steariinihapon osaksi öljyhappoa, laskua öljyhappoa tuotanto olisi todisteita poistamisesta of Scd1 aktiivisuutta siRNA kohdentamalla tämän entsyymin. Ratkaistakseen SCD toimintaa sen jälkeen 72 h Scd1 hiljentämisen, me käsitellään edelleen U2OS ja SW480-soluja 6 h radioaktiivisesti [

14C] steariinihappo johtavat mitata tuotannon [

14C] öljyhappoa Scd1- vajaiden solujen verrattuna kontrolliin scr-käsitellyt solut. Sisällyttäminen [

14C] steariinihappo oli samanlainen siRNA scr ja Scd1-käsiteltyjä soluja (tietoja ei esitetty). Syöpäsolut transfektoitiin ei-kohdistaminen ihmisen mRNA siRNA (scr) esitti desaturation osuus 31,49% osalta U2OS ja 25.66% varten SW480. Kahdessa solulinjoissa, Scd1 sukupuuttoon johti drop-off öljyhappoa biosynteesin joiden jäljellä desaturaatioaika nopeudella 5,135% ja 5,28% vuonna U2OS hoitaa siRNA Scd1.A ja Scd1.B, vastaavasti, ja 5,89% ja 7,55% , vastaavasti, SW480 (kuvio 1C). Lisäksi olemme alttiina U2OS soluja 24 tunnin aikana, Scd1 inhibiittorit CVT-11127 ja MF-438 (10 uM). Saimme samanlaisia ​​valmiuden Scd1 estäjien kuin vastaan ​​suunnattu siRNA Scd1 estää tuotannon öljyhapon steariinihapon U2OS soluissa (kuvio 1 D).

Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittivat, jyrkkä inhibitio SCD toiminnan siRNA Scd1 saaneista soluista. Lisäksi näissä syöpäsolulinjoissa, Scd1 näkyy tärkein entsyymi osallistuu endogeenisen tuotannon öljyhappoa.

Scd1 sukupuuttoon edistää apoptoosia solukuolemaa

Sen arvioimiseksi vaikutusta Scd1 knockdown solujen elinkelpoisuus, ensin määritetään solujen määrä 24 h, 48 h ja 72 h transfektion jälkeen käyttäen CyQuant® reagenssia, joka määrittää, paljonko nukleiinihappoja. Niin pian kuin 48 tuntia transfektion jälkeen, solujen lukumäärän oli merkitsevästi vähemmän Scd1-köyhdytettyä U2OS soluja verrattuna kontrollisoluihin. Vaikka suhteellinen fluoresenssi (RF) kasvoi siRNA scr-käsiteltyjen solujen koko ajan 72 tuntia transfektion, RF ei merkittävästi muutu siRNA Scd1 hiljaiset solujen aikana kurssin. Havaitsimme, että RF oli kahdesti kertainen siRNA scr soluissa verrattuna siRNA Scd1 vaje U2OS 72 h transfektion osoittaa leviämisen estäminen tai solukuoleman induktio in Scd1-ablatoitu soluissa (kuvio 2A). Sitten osoitimme, trypaanisiniekskluusiolla solujen määrä 72 h transfektion jälkeen siRNA että Scd1 pudotus johti vähenemiseen solun elinkykyisyyden sekä U2OS ja SW480-soluja, mutta paljon enemmän rajusti U2OS soluissa (kuvio 2B). Yli 30% Scd1 siRNA saaneista U2OS ja noin 20% Scd1 siRNA saaneista SW480 oli positiivinen PI kasvua kolme ja kaksi taittuu verrattuna siRNA scr saaneista U2OS ja SW480-soluissa, vastaavasti (kuvio 2C). Esto Scd1 aktiivisuuden sekä yhdisteiden (CVT-11127 ja MF-438) johti myös lisätä solukuolemaa 48 h annosvasteellisella tavalla (kuvio 2D). Olemme kuitenkin havainneet, että nämä yhdisteet eri vaikuttavat solujen elinkelpoisuutta CVT 11127 voimakkaampi solukuoleman induktioon kuin MF-438 U2OS. Lisäksi olemme osoittaneet, että Scd1 ehtyminen indusoi apoptoosin aktivaatiosta, kuten on esitetty korkean tason induktio kaspaasi 3: n aktiivisuuden ja PARP pilkkominen (kuviot 2E ja 2F).

A) U2OS soluja käsiteltiin siRNA scr (kontrolli) ja kohdistaminen Scd1 (Scd1.A ja Scd1.B), ja kerättiin 24 h, 48 h tai 72 h transfektion jälkeen. Leviämisen tila määritettiin CyQuant® lisääntymisen määritys. Kukin arvo on keskiarvo suhteellisen fluoresenssin yksiköissä ± SEM kolmena kappaleena, ja edustavat kolmea riippumatonta koetta. B) U2OS ja SW480-soluja viljeltiin 72 tunnin ajan jälkeiseen siRNA transfektion ja korjattu trypaanisinivärin syrjäytymistä määrityksessä. Arvot ovat keskiarvo ± SEM kolmena kappaleena ja edustavan kahden muun itsenäisen kokeen. C) U2OS ad SW480-soluja käsiteltiin 72 tuntia siRNA: lla, kerättiin ja kokonais-solukuolemaa analysoitiin virtaussytometrialla värjäyksen jälkeen propidiumjodidilla (PI). Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. D) U2OS-soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan Scd1 estäjien ilmoitetuilla pitoisuuksilla ja kerättiin propidiumjodidivärjäys. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta kokeesta. E) U2OS Solut kerättiin 72 tuntia transfektion jälkeen ja valmistettiin kaspaasi 3 aktiivisuuden mittaus virtaussytometrialla yksityiskohtaisesti materiaaleja ja menetelmiä. Data näytetään kertainen lisäys kontrolliin verrattuna (siRNA scr) ja edustavat keskiarvoa ± SEM kahdessa riippumattomassa kokeessa. F) kokosolulysaateista valmistettiin 72 tuntia transfektion kanssa siRNA ja PARP pilkkominen (c-PARP) taso määritettiin Western-blot. G) U2OS-soluja käsiteltiin 72 tuntia siRNA-ohjattu (SCR) ja kohdentamalla Scd1 puuttuessa (ajoneuvo) tai läsnä oli 100 uM öljyhappoa BSA: han. Solujen määrä kvantifioitiin CyQuant® lisääntymisen määrityksessä, kuten aiemmin on kuvattu. Data näytetään kertainen muutos yli ajoneuvon siRNA scr-käsiteltyjä soluja, ja edustavat keskiarvoa suhteellisen fluoresenssin yksiköissä ± SEM kolmena kappaleena. *, ** P 0,05 vs. siRNA scr-käsitelty ajoneuvon ja öljyhappoa soluja, tässä järjestyksessä, ANOVA seurasi Tuckey testi.

Sitten oletetaan, että solukuolemaa laukaisi pelkistämällä öljyhappoa acid solun sisällön. Niinpä sitoutui täydentämään siRNA Scd1 vaje solujen 100gM öljyhappoa, jotta voidaan arvioida kykyä eksogeenisen lisäravinteen kääntää solukuolemaa. Kuva 2G osoittaa, että altistuminen Scd1-vajaiden U2OS solujen eksogeenisen öljyhappoa ei muuttanut määrä sytotoksisuuden.

inhibitio Scd1 ilmaisun aktivoi osittain laskostumattoman proteiinivaste

häiriöiden ER homeostaasiin lukemiin ER stressiä UPR aktivointi, joka voisi laukaista solukuolema. Voidakseen seurata aktivointi UPR koulutusjakson, tutkimme ilmentymistason GRP78, fosfo-eIF2α ja epäsovinnaisia ​​silmukoinnin Xbp1 mRNA. U2OS ja SW480-solut ovat toiminnalliset koneen vastaamaan thapsigargin aiheuttama ER stressiä, koska havaitsimme silmukoinnin Xbp1, säätely ylöspäin GRP78 ja fosfo-eIF2α lauseke (kuviot 3A ja B). Sitten analysoimme nämä ER stressin markkereita Scd1-vajaiden solujen. Poistaminen Scd1 on U2OS ja SW480-soluissa johti osittaiseen käsittely Xbp1 mRNA: spliced- ja hybridi-Xbp1 (s- ja h-Xbp1) mRNA korotettiin Scd1-vajaiden solujen osoittaa aktivoinnin IRE1α varren molemmissa solulinjoissa, ilmeisempi tavalla SW480-soluissa (kuvio 3A). Käännös s-Xbp1 tuottaa funktionaalisen Xbp1 transkriptiotekijä, joka osallistuu transkription ohjelma, jotta ensimmäisessä perustaa uudelleen ER-toiminto ja solujen eloonjäämistä. Saattaja GRP78 säännellään myös pro-selviytymisreittiin aikana ER stressin kautta säätelyä ylöspäin. Emme kuitenkaan pystyneet noudattamaan näitä sääntelyn U2OS ja SW480-solujen vaimentaa Scd1 48 tuntia transfektion jälkeen (kuvio 3C). Emme havainneet mitään muutosta mRNA ja proteiini tasolla GRP78 ilmaisun eri transfektion ajan (24, 48 ja 72 h, tuloksia ei ole esitetty). PERK kuuluu myös UPR ja sen aktivointi indusoi fosforylaation eIF2α liipaisu tukahduttaminen yleinen käännös. Havaitsimme 48 h transfektion jälkeen, että solut köyhdytetty Scd1 ilmaistuna suurempi määrä fosfo-eIF2α kontrolliin verrattuna soluihin viittaa aktivointi PERK varren (kuvio 3D). Jotta määrittää fosforylaation eiF2αto Scd1 sukupuuttoon eikä artefakti takia PKR aktivoinnin siRNA transfektiolla, analysoimme fosfo- eIF2α tasolla U2OS käsiteltiin 5 ja 10 uM Scd1 estäjän (CVT-11127 ja MF-438) 10 ja 24 h. Havaitsimme lisäys p-eIF2α ilmentymisen niin pian kuin 10 h sekä inhibiittorit osoittavat, että fosforylaatio eIF2α indusoitiin lakkaamista Scd1 aktiivisuuden (kuvio 3E).

U2OS ja SW480-soluja käsiteltiin siRNA ohjaus (scr ) ja siRNA vastaan ​​Scd1 varten 72h. A) Näytteet valmistettiin mRNA analyysejä Xbp1 käsittely semikvantitatiivinen RT-PCR. PCR-tuotteet ajettiin 3% agaroosigeelillä ja saumattu Xbp1 (sXbp1) silmukoitumattoman Xbp1 (uXbp1) ja hybridi Xbp1 (hXbp1) mRNA havaittiin siRNA-käsitellyissä soluissa (CTR) ja thapsigargine-käsiteltyjä soluja (Tg) positiivisena kontrollina UPR aktivointia. B) kokonaismäärä proteiinia lysaatit valmistettiin käsittelemättömästä ja thapsigargin käsiteltyjä soluja (Tg, 0,2pM, 16 h) ja analysoitiin eiF2α fosforylaatiota ja GRP78 ylössäätöä western-blottauksella. C ja D) Scd1-köyhdytettyä U2OS ja SW480-soluja valmistettiin kuten 3B) ja analysoitiin western-blotting varten Scd1, GRP78 ja fosfori-eiF2α ilme. E) U2OS soluja käsiteltiin 5 ja 10 uM Scd1 estäjien (MF-438 ja CVT-11127) ja kerättiin sen jälkeen 10 h ja 24 h hoidon fosfo-eiF2α ilmentymisen analyysi western-blottauksella. Blots edustavat vähintään kahdessa riippumattomassa kokeessa.

CHOP osallistuu sen Scd1 ehtyminen aiheuttama solukuolema

ER stressin välittämän apoptoosin, CHOP ilmaisun kasvaa ja näyttää olennaisena efektori tämän solukuolemaohjelmassa. Ensin käsiteltiin arviointi CHOP ilmentymisen syöpäsoluissa käsitelty siRNA scr tai vastaan ​​Scd1. Havaitsimme kasvua CHOP-mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen soluissa, jotka menettivät Scd1 ilmaisu kontrollisoluihin verrattuna (kuviot 4A ja 4B). Sen varmistamiseksi roolin CHOP solukuolemaan induktio, me ohimenevästi transfektoitu tyhjällä vektorilla (CTR) tai dominanttinegatiivivaikutus muoto CHOP (DN-CHOP) in U2OS soluissa. DN-CHOP rakentaa satamissa mutaatiot leusiinivetoketjudomeenissa (L134A /L141A), joka estää sen transkriptionaalinen aktiivisuus [37]. Osoitimme PI-värjäyksellä, että DN-CHOP yliekspressio vähentää sytotoksisuuden aiheuttama Scd1 inhibitio verrattuna kontrolliin-transfektoiduissa soluissa (CTR) (kuvio 4C). Lisäksi arvioimme vaikutus täytäntöön ilmentymisen DN-CHOP aktiivista kaspaasi 3 induktio in Scd1-vaiennetaan U2OS. Osoitimme laskua kaspaasi 3 aktivaation Scd1 pudotus-U2OS soluja, jotka ilmentävät DN-CHOP ja osoituksena suojaava vaikutus DN-CHOP vastaan ​​indusoiman apoptoosin Scd1 ehtymisestä (kuvio 4D).

A) U2OS ja SW480-soluissa hoidettiin siRNA ohjaus (scr) ja siRNA vastaan ​​Scd1 varten 72h. Kokonais-RNA eristettiin ja CHOP mRNA: n ilmentymisen normalisoidaan P-aktiinin mRNA: n ilmentyminen kvantifioitiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä. Tulokset olivat edustettuina keskiarvona kertaiseksi induktio ± SEM suhteessa siRNA scr-käsitellyt solut vähintään kolmen erillisen kokeen. *, P 0,05 vs. siRNA scr-käsiteltyjen solujen ANOVA seurasi Tuckey testi. B) Nuclear poimii U2OS valmistettiin 72 tunnin kuluttua siRNA lisäksi. CHOP ilmentyminen analysoitiin western-blottauksella ja Lamin A /C lataamisen valvonta tumauutetta näytteitä. C) U2OS soluja transfektoitiin ohimenevästi tyhjä (CTR) tai määräävän-negatiivinen CHOP (DN-CHOP) ekspressiovektoriin ja valitaan kolme päivää G418. Resistentit solut transfektoitiin CTR tai DN-CHOP konstrukti käsiteltiin siRNA-ohjaus scr vastaan ​​tai Scd1 (Scd1.A ja Scd1.B) 72 tuntia ja korjattu propidiumjodidivärjäys analyysi virtaussytometrialla. Arvot näkyvät kertainen lisäys yli säätimet (siRNA scr) ja edustavat keskiarvoa ± SEM kahden erillisen kokeen. *, **, P 0,05 vs. siRNA scr-käsiteltyjen CTR ja DN-CHOP-soluissa, tässä järjestyksessä, ANOVA seurasi Tuckey testi. #, P 0,05 ANOVA seurasi Tuckey testi. D) U2OS solut valmistettiin, kuten C) ja ne kerättiin aktiivinen kaspaasi 3-analyysi virtaussytometrialla. Arvot näkyvät kertainen lisäys yli säätimet (siRNA scr) ja edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. *, **, P 0,05 vs. siRNA scr-käsiteltyjen CTR ja DN-CHOP-soluissa, tässä järjestyksessä, ANOVA seurasi Tuckey testi. #, P 0,05 ANOVA seurasi Tuckey testi.

CHOP sukupuuttoon osittain lievittää Scd1 ehtyminen indusoiman apoptoosin

suoja noudatettava CHOP esto vastaan ​​Scd1 ehtyminen välittämä U2OS cell kuolema on myös tutkittu HCT116 paksusuolen kasvaimen solulinja. Tässä tavoite, käytimme tilapäinen CHOP pudotus-HCT116 ja BA1 solut, jotka ovat HCT116 pysyvästi transfektoitujen solujen antisense- ihmisen CHOP cDNA rakentaa [38]. Ehtyminen Scd1 kanssa siRNA HCT116 aiheuttama yli 30% solukuolema on osoituksena PI värjäytymistä (kuvio 5A). Osoitimme myös 72 h, että ekstinktio Scd1 aktiivisuuden siRNA ja inhibiittorit (tuloksia ei ole esitetty) indusoi apoptoosin HCT116 osoituksena aktiivinen kaspaasi 3 tai PARP-katkaisun havaitseminen (kuviot 5B ja 5C). Näissä soluissa, Huomasimme myös, että poistaminen Scd1 ilmaisun johti säätely ylöspäin CHOP mRNA ilmaisun kuten jo havaittu U2OS ja SW480-soluissa (kuvio 5D). Lisäksi olemme vahvistaneet kuten U2OS että vähentäminen CHOP ilmaisun osittain lievittää sytotoksisuuteen aiheuttama Scd1 hiljentäminen. Todellakin, havaitsimme vähenemistä PI-värjäyksen BA1 soluissa verrattuna niiden vanhempien HCT116 (p-HCT116) kollegansa kun Scd1 lauseke poistettiin (kuvio 5E). Lisäksi suojan Scd1 hiljentäminen välittämä solukuolema aiheuttama CHOP sukupuuttoon näytti olevan erityinen eikä suojan kaikkia proapoptoottisten tekijöistä. Todellakin, sukupuuttoon CHOP ei muuttanut apoptoosin etoposidin DN-CHOP U2OS tai BA1 verrattuna valvontaluetteloihinsa soluja (tuloksia ei ole esitetty). Olemme myös sitoutuneet arvioimaan vaikutuksen CHOP sukupuuttoon siRNA hoidon indusoiman apoptoosin Scd1 poistamista. Tätä varten suoritimme co-hoito HCT116-solujen siRNA ohjaus (scr) tai suunnattu Scd1 (Scd1.A ja Scd1.B), ja siRNA CHOP tai ohjaus (-). Me validoitu CHOP siRNA HCT116-soluissa ja osoittivat, että CHOP siRNA ei muuttanut Scd1 mRNA sammumisen tasolla indusoi Scd1 siRNA: ita (tuloksia ei ole esitetty). Sen arvioimiseksi CHOP toimintoa Scd1 indusoiman apoptoosin, me sitten tehdään siRNA kotransfektiojärjestelmää. Havaitsimme 72 tuntia transfektion jälkeen, että CHOP hiljentäminen suojattu HCT116 vastaan ​​apoptoosin indusoima solukuolema Scd1 sukupuuttoon (kuviot 5F ja 5G).

A) HCT116-solut käsiteltiin 72 h siRNA ohjaus (scr) tai kohdistaminen Scd1 ( Scd1.A ja Scd1.B) kerättiin ja kokonais-solukuolemaa analysoitiin virtaussytometrialla värjäyksen jälkeen propidiumjodidilla. Tulokset olivat keskiarvo ± SEM kolmesta kokeesta suoritettiin kolmena rinnakkaisena. B) HCT116-solut käsiteltiin siRNA kerättiin 72 h transfektion jälkeen ja valmistellaan kaspaasi 3 aktiivisuuden mittaus virtaussytometrialla yksityiskohtaisesti materiaaleja ja menetelmiä. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. C) HCT116 käsiteltiin kuten A) ja kerättiin analysointia varten Scd1 ja PARP-pilkkominen ilmentymisen Western-blottauksella. D) HCT116 käsiteltiin kuten A) ja korjattu kokonais-RNA puhdistusta. CHOP ja Scd1 mRNA: n ilmentymisen analysoitiin reaaliaikaisella RT-PCR normalisoinnin jälkeen ß-aktiini. Kaikki kokeet edustavat vähintään kahta toistoa kolmena kappaleena. E) HCT116-solut transfektoitiin stabiilisti antisense ihmisen CHOP cDNA konstruktio ja sen tyhjän valvontaa vektori. BA1 ja p-HCT116 ovat HCT116 klooneja antisense CHOP konstruktio ja ohjaus vektori, vastaavasti. Solut vaiennetaan siRNA Scd1.A ja Scd1.B 72 tuntia, ja korjataan yhteensä solukuoleman analyysi virtaussytometrialla värjäyksen jälkeen propidiumjodidilla. Tulokset olivat keskiarvo kertainen muutos PI-positiivisia soluja verrattuna vastaavaan siRNA scr HCT116-solut ± SEM yhdessä edustavassa kokeessa kolmesta kokeesta suoritettiin kolmena rinnakkaisena. *, **, P 0,05 vs. siRNA scr-käsitellyn p-HCT116 ja BA1 soluja, tässä järjestyksessä, ANOVA seurasi Tuckey testi. #, P 0,05 ANOVA seurasi Tuckey testi. F) ja G) HCT116-solut transfektoitiin siRNA: scr, Scd1.A tai Scd1.B 75 nM, ja joko 25 nM siRNA scr (-) tai siRNA CHOP. Solut kerättiin 72 tuntia transfektion jälkeen PI värjäystä ja aktiivinen kaspaasi 3 analyysejä virtaussytometrialla. Tulokset olivat keskiarvo ± SEM yhdessä edustavassa kokeessa kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta, jotka suoritettiin kolmena kappaleena. *, **, P 0,05 vs. vastaava siRNA scr-käsiteltyjen HCT116-soluissa ANOVA seurasi Tuckey testi. #, P 0,05 ANOVA seurasi Tuckey testi.

Scd1 ehtyminen ei vaikuttanut elinkelpoisuutta ei syöpäsolujen

Syöpäsolut olivat herkkiä Scd1 ehtyminen välittämä solukuolema Meillä oli niin kiinnostuneita analysoimalla mahdollisia vaikutuksia puuttumisen

de novo

MUFA synteesiä ei syöpäsoluja. Tässä tavoite, arvioimme vaikutus Scd1 inhibition avulla siRNA ihmisen normaaleista ihon fibroblasteista (NHDF). Nämä solut ovat perus desaturation nopeudella noin 15% pienempi kuin U2OS ja SW480-soluissa, kuten on esitetty aikaisemmin kuviossa 1C. Niiden käsittely siRNA Scd1.A tai Scd1.B vähensi SCD toiminnan päästä jäljellä aktiivisuus 8,3% ja 6,3%, vastaavasti (kuvio 6B). Jäljelle jäänyt SCD aktiivisuus oli samanlainen kuin joka saatiin syöpäsoluja käsitelty siRNA Scd1. Kuten edellä on esitetty, ablaatio SCD aktiivisuuden syöpäsoluissa johtivat sytotoksisuuden taas ehtyminen Scd1 ilmaisua ei aiheuttanut solukuoleman NHDF mutta vähensi hieman niiden solujen määrän (kuviot 6C ja 6D). Sitten ei syöpäsoluissa, Scd1 kumota saattaa estää leviämisen vaikuttamatta solujen elinkykyä.

Normaalit ihmisen ihon fibroblastit (NHDF) transfektoitiin siRNA ohjaus (scr) ja siRNA kohdistaminen Scd1 (Scd1.A ja Scd1.B ). NHDF solut kerättiin 72 tunnin kuluttua siRNA hoito ja korjatut jatkotutkimuksiin. A) Yhteensä proteiinit valmistettiin Scd1 ilmentymisen analyysi western-blottauksella. B) NHDF käsiteltiin 72 h siRNA inkuboitiin vielä 6 h [

14C] steariinihappo ja yhteensä lipidiuuttoon suoritettiin. Muuntaminen [

14C] steariinihappo osaksi öljyhappoa suoritettiin HPLC. Scd aktiivisuus ilmaistiin% suhde [

14C] oleiinihappoa [

14C] öljyhappoa ja steariinihappojen. Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM vähintään kaksi erillistä koetta. C) leviämisen tilan siRNA käsiteltyä NHDF määritettiin ilmoitetuilla ajoin CyQuant® runsaudenmäärityksessä. Kukin arvo on keskiarvo suhteellisen fluoresenssin yksiköissä ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. D) NHDF kerättiin 72 h transfektion jälkeen, ja yhteensä solukuolemaa analyysi suoritettiin virtaussytometrialla värjäyksen jälkeen propidiumjodidilla. Tulokset olivat keskiarvoa ± SEM PI positiivisten solujen (%) on yksi edustaja kahdesta kokeesta, jotka suoritettiin kolmena kappaleena. *, P 0,05 vs. siRNA scr-käsiteltyjen solujen ANOVA seurasi Tuckey testi.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että Scd1 ilmaisu Silencing johti induktion UPR markkereita (Xbp1 liittämiseen, s-eIF2α ja CHOP) ja CHOP-riippuvaista solukuolemaa syöpäsoluissa. Osoitimme myös, että kumoamisen de novo MUFA synteesireitti ekstinktiovaiheen sen nopeutta rajoittavan entsyymin Scd1 muuttunut elinkelpoisuus syöpäsolujen muuttamatta selviytyminen ei syöpäsoluja. Nämä tiedot viittaavat siihen erilaisia ​​tarpeita de novo MUFA synteesi normaaleille ja kasvainsolujen. Kuitenkin eksogeeninen öljyhappoa, suuret MUFA tuote Scd1 toiminnan, ei estänyt solukuolemaa syöpäsolujen, joissa endogeenisen MUFA biosynteesin tukahdutettiin.

Tässä raportissa olemme samaa mieltä edellisten toiminnallisiin että Scd1 sukupuuttoon johti solukuolema erityyppisissä syöpäsoluja [22], [25], [27], [39]. Todellakin, havaitsimme induktio kaspaasi 3: n aktiivisuuden ja PARP-pilkkominen (kuviot 2D et 2E) in Scd1-köyhdytettyä soluissa.

todistaa myös tässä työssä, että normaali ja syöpäsolujen ei vastannut samalla tavalla ehkäisy MUFA synteesin Scd1 sukupuuttoon. Todellakin, kun taas syöpäsolujen tapettiin Scd1 ehtyminen, ei syöpäsolut olivat vielä elossa. Olemme kuitenkin havaittu vähäinen lasku solujen määrä in Scd1 saaneilla NHDF että lohko tai hitaammin leviämisen voisi selittää. Voimme siis hypoteesin, että elinkelpoisuus ei syöpäsolujen pysyivät muuttumattomina johtuen siitä, että ne eivät edellytä tällaista nopeaa ja korkea MUFA synteesi. Itse asiassa ne lisääntyvät alemmalla teholla (kuvio 6C) ja edullisesti jatkuva uusien kalvo synteesi ulkoisista rasvahapoista ajan ottamaan taas syöpäsolut lisääntyvät korkeammilla nopeudella ja tarvitsevat de novo rasvahappojen synteesi [10].

ja