Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Suurin osa peräsuolen syöpä (CRC) tapaukset ovat ehkäistävissä varhaisen havaitsemisen ja poistamisen precancerous polyypit. Vaikka CRC on toiseksi yleisin sisäinen syöpä Australiassa, vain 30 prosenttia väestöstä katsotaan olevan riskitekijöitä osallistua ulosteesta-pohjainen testi seulontaohjelmilla. Todisteet osoittavat vankka, veripohjaisten, diagnostinen määritys lisäisi seulonta noudattamista. Useita mahdollisia diagnostisia veripohjaisten proteiini biomarkkereita CRC on raportoitu, mutta kaikki puuttuu herkkyys tai spesifisyys käytettäväksi erillisenä diagnostinen. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää ja vahvistaa paneelin proteiiniperustaisista biomarkkerit itsenäisessä kohortit, jotka voitaisiin kääntää luotettava, ei-invasiivisen veripohjaisten seulontatestin.

Keskeiset havainnot

vuonna kaksi riippumatonta kohortteja (n = 145 ja n = 197), arvioimme seitsemän yksittäinen biomarkkereita seerumissa CRC potilaiden ja ikä /sukupuoli verrokeilla, jotka osoittivat merkittävää eroa valvontaa ja CRC, mutta erikseen puuttuu herkkyys diagnostisia sovelluksen. Käyttämällä logistinen regressio strategioita tunnistimme paneeli kolme biomarkkereita, jotka syrjivät tarkastukset ja CRC 73% herkkyys 95% tarkkuus, kun sitä sovelletaan kummankaan ikäryhmät. Tämä paneeli koostuu Insuliinin kaltainen kasvutekijää sitova proteiini 2 (IGFBP2), Dickkopf-3 (DKK3), ja pyruvaattikinaasia M2 (PKM2).

Johtopäätökset

Koska heterogeenisen luonteen CRC , yksi biomerkkiaine ei todennäköisesti ole riittävä herkkyys tai spesifisyys käytettäväksi erillisenä diagnostinen seulontatestinä ja paneeli markkereita voivat olla tehokkaampia. Olemme tunnistaneet 3 biomarkkereiden paneeli, joka on suurempi herkkyys ja spesifisyys alkuvaiheen (vaihe I ja -II) tautien kuin ulosteen piilevän veren testi, nostaa mahdollisuus sen käyttöä ei-invasiivisen verta diagnostinen tai Seulontatesti.

Citation: Fung KYC, Tabor B, Buckley MJ, Priebe IK, Puriņš L, Pompeia C, et al. (2015) Veri-pohjainen proteiini biomarkkereiden Panel havaitsemiseksi peräsuolen syövän. PLoS ONE 10 (3): e0120425. doi: 10,1371 /journal.pone.0120425

Academic Editor: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, SAKSA

vastaanotettu: 24 syyskuu 2014; Hyväksytty: 22 tammikuu 2015; Julkaistu: 20 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Fung et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ rahoitettiin CSIRO Ennaltaehkäisevä Health National Research lippulaiva ja National Health ja Medical Research Council (lupanumeroon 1017078) (https: //www. nhmrc.gov.au/) ja LJC. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin syöpä tyyppi diagnosoidaan maailmanlaajuisesti missä se muodostaa noin 10% kaikista syövän diagnoosit ja on arvioitu vuosittainen kuolleisuus yli 600000 [1]. Maat kuten Australian, Uuden Seelannin, Euroopassa, Yhdysvalloissa ja Isossa-Britanniassa on raportoitu olevan korkeimman sairastavuus kuitenkin esiintyvyys lisääntyy maissa, kuten Japanissa ja ne Itä-Euroopassa. Suurin osa tapauksista (jopa 80%) ovat satunnaisia, jossa ympäristö- ja elämäntapaan liittyvien tekijöiden uskotaan rooli sen kehittämiseen [2]. CRC on heterogeeninen sairaus, joka kehittyy kautta kertyminen geneettisten mutaatioiden ja epigeneettiset muutokset paksusuolen epiteelin, joka lopulta johtaa neoplastisten transformaatio [3-5]. Hidas ja progressiivinen tämän prosessin tarjoaa mahdollisuuden toteuttaa seulontaohjelmiin ja diagnoosivälineiden varhaistoteamiseen taudin, joilla on mahdollista vähentää ilmaantuvuutta ja kuolleisuutta liittyvät CRC. Yrittäessään vähentää esiintyvyys ja havaitsemaan sairauden alkuvaiheessa ennen oireet ovat ilmeisiä, seulonta ohjelmia on toteutettu monissa maissa, kuten Yhdysvalloissa, Britanniassa, Australiassa, Japanissa ja Euroopassa [6-8].

tällä hetkellä yleisimmin käytetty diagnostisia työkaluja ovat endoskooppiset toimenpiteet, kuten kolonoskopia ja sigmoidoskopia sekä guajakkipohjainen ulosteen piilevän veren testi (gFOBT) tai immunokemiallinen ulosteen piilevän veren testi (iFOBT), joka tunnetaan myös ulosteen immuuni testissä ( FIT) [9]. Vaikka kolonoskopia ja sigmoidoskopiaa ovat herkimpiä menettelyt havaitsemiseksi Kolorektaalituumorien ja syövän esiasteita (adenoomia ja polyypit), ja voi olla mahdollisesti parantava jos polyypit poistetaan, nämä menettelyt ovat vaikeita toteuttaa väestölle laajuisesti johtuen kustannuksia, invasiivisuus , asiantuntemusta tarvitaan, ja aikaa vievää luonne johtuu suolen valmisteluun tarvitaan [10,11]. Vaikka halpa ja ei-invasiivisia, The FOBT ja FIT on pienempi herkkyys ja spesifisyys kuin kolonoskopia (eli nämä testit ovat korkeammat vääriä positiivisia hinnat) ja ovat menestyksekkäin havaitsemaan myöhäisessä vaiheessa tauti [10,12]. Lisäksi diagnostinen suorituskyky FOBT ja FIT on vaihteleva, jossa ilmoitetaan herkkyydet CRC välillä 11-64% for gFOBT (79-98% spesifisyys) ja 56-89% FIT (83-97% spesifisyys) [13]. Nämä testit ovat myös haittaavat usein huono potilaan hoitomyöntyvyyttä, vaihtelut analyyttisiä menettelyjä, kuten erilaisia ​​menetelmiä ulosteen kerääminen ja käsittely, tarve useiden testinäytteiden, ja vaihtelut tulkintaa testitulosten [13,14]. Tällä hetkellä vain gFOBT on osoitettu vähentävän CRC kuolleisuutta suurten mahdollisille satunnaistetuissa kliinisissä tutkimuksissa [8,13].

Monissa tutkimuksissa on julkaistu raportointi biomarkkereita, jotka voidaan toteuttaa ei-invasiivisia toteamiseksi CRC etenkin sen alkuvaiheessa (vaihe I ja /tai syöpää edeltävä sairaus). Useita strategioita tunnistaa veren pohjainen proteiini biomarkkerit on raportoitu kirjallisuudessa, mukaan lukien proteomic ja /tai geenin ilmentymisen kolorektaalisen kasvainkudoksen ja eritetyt proteiinit. Vaikka jotkin näistä tutkimuksissa on todettu potentiaalia paneelien proteiinien tai geenien soveltuvat CRC havaitsemiseksi [15-19], dataa seurantatutkimuksissa, esimerkiksi suurempien potilasaineistoihin, ei ole saatavilla. Nykyisin lupaavin biomarkkerit näyttävät olevan DNA: n metylaatio markkereita, kuten metyloituja septin 9 (mSEPT9) mitattuna veren [20-23] ja ulosteet-pohjainen DNA-testi, joka koostuu metyloitua BMP3, NDRG4, VIM ja TFPI2 ja mutantti muoto of KRAS [24]. Viime aikoina, modifioitu uloste-pohjainen DNA-testi, joka koostuu metyloitu BMP3 ja NDRG4, KRAS ja ß-aktiini kontrollina yhdessä ulosteen hemoglobiinin testattiin oireeton seulonta populaation, joka koostuu 9989 potilaista [25]. Todettiin, että DNA-testi oli matalampi spesifisyys, korkeampaa vääriä positiivisia ja kärsi korkeampia teknisiä virhetaajuus koska sen monimutkaisen luonteen, jotka voivat haitata sen panemiseksi väestön laaja seulontatesti. Vaikka uloste-pohjainen DNA testit ovat osoittaneet lupaavia tuloksia CRC havaitsemiseksi kliinisissä tutkimuksissa, ne ovat vielä osaksi kliinisessä työssä tai sen koko väestöön seulontatestin.

Koska heterogeenisen luonteen CRC, joka on single biomarkkereiden tuskin on riittävä herkkyys tai spesifisyys käytettäväksi erillisenä diagnostinen seulontatestinä ja paneeli markkereita voivat olla tehokkaampia. Aiemmin arvioimme suorituskyky ja soveltuvuus 32 proteiinin biomarkkereiden seerumissa ja /tai plasman paksusuolisyövän potilaiden ja normaalit kontrollit [26] niiden kyky diagnosoida CRC. Vaikka tämä analyysi tunnistaa 12 proteiini biomarkkerit vaihtelevan merkittävästi ryhmien välillä, kukaan proteiini oli riittävä herkkyys ja tarkkuus käytettäväksi erillisenä diagnostinen. Havaitsimme myös mahdollisia biomarkkereiden yhdistelmiä edustavat eri näkökohtia sairaus, joka voi johtaa diagnostinen testi CRC. Kirjoittajat raportoivat arvioinnin seitsemän näistä proteiinin biomarkkerit (IGFBP2, PKM2, DKK3, MAC2BP, kudos metalloproteinaasien estäjiä 1 (TIMP1), interleukiini 8 (IL8) ja interleukiini 6 (IL6) mahdollisena diagnostinen tai seulonta testi CRC .

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki tutkimussuunnitelmissa tässä tutkimuksessa käytetyt hyväksyi asiaa Human Research eettiset komiteat Commonwealth Scientific Industrial Research Organisation, Adelaide (CFNS Human Research Ethics Committee-ehdotus 03/17 (a) (b)), ja Royal Melbourne Hospital, Melbourne (HREC hanke 2003,145 2003,146). kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan ennen verinäytteen keräämistä.

Näytteiden kerääminen

Potilaat hiljattain diagnosoitujen CRC ei aiemmin ollut lainkaan taudin. Verta otettiin ennen leikkausta peräsuolen leikkauksen preadmission klinikoilla verkosta sairaaloiden liittyvä Victorian Cancer Biopankkiverkosto, Melbourne, Victoria, Australia, vuosina 2005 ja 2011. Potilaat, jotka olivat jo saaneet kemo- ja /tai sädehoidon suljettiin pois tämän tutkimuksen. CRC potilaille, otettiin verinäytteet diagnoosin jälkeen, ja ainakin yksi päivä ennen leikkausta. Staging suoritettiin mukaan TNM luokituksen paksusuolen ja peräsuolen syöpä [27].

seeruminäytteet CRC potilaiden ja ikä /sukupuoli verrokeilla kerättiin käyttämällä vakiotoimintamenettely kuten aikaisemmin on kuvattu [28,29]. Veri kerättiin seerumia geeli putkiin (Scientific Specialties Inc., USA) ja kunkin näytteen annettiin seistä huoneen lämpötilassa 30 minuuttia ennen sentrifugointia (1,200g, 10 min, huoneen lämpötila). Seerumi fraktio siirrettiin sitten puhdistaa 15 ml putkiin ja sentrifugoitiin uudelleen (1,800g, 10 min, huoneen lämpötila) ennen kuin ne jaettiin näytteisiin (250 ui) ja varastoitiin (-80 ° C). Kaikki näytteet käsitellään ja tallennetaan 2 tunnin keräyksestä.

biomarkkereiden analyysiin ja tunnistaminen biomarkkereiden paneelin

Seuraavat biomarkkerit mitattiin käyttämällä kaupallisesti saatavaa ELISA sarjat kulloisenkin valmistajan protokollia: IGFBP2 (Diagnostic Systems Laboratories, USA tai Demeditec Diagnostics GmbH, Saksa), MAC2BP (Bender MedSystems GmbH, Itävalta), PKM2 (Schebo Biotech, Saksa), DKK3 (R 0,0001) ja 59% (p 0,0001) 95%: n spesifisyys CRC yleistä mitattuna koulutuksen ja kokeen kohortteja, vastaavasti. Samoin PKM2 myös osoittautunut menestynein merkki on tunnistaa CRC kussakin sairauden vaiheessa verrattuna vertailupopulaatiossa tässä nimenomaisessa tutkimuksessa, mukaan lukien alkuvaiheessa tauti (herkkyydet 48% (p = 0,0008), 52% (p 0,0001 ), 61% (p 0,0001) ja 75% (p 0,0001) vaiheissa I, II, III ja IV, vastaavasti koulutuksessa kohortin ja herkkyydet 52% (p 0,0001), 65% (p 0,0001) , 54% (p 0,0001) ja 80% (p 0,0001) vaiheissa I, II, III ja IV, vastaavasti testissä kohortti) (S1 taulukko). Suoritusarvot yksittäisten biomarkkereiden koulutukseen ja koe kohortit löytyvät S1 taulukossa. Kun tarkastellaan erillisenä, yksikään näistä biomarkkereiden oli riittävä herkkyys diagnosoida CRC.

tunnistaminen kolmen biomarkkereiden paneeli CRC diagnoosia

Käyttämällä eteenpäin askelittain logistinen regressio sovelletaan koulutukseen datajoukon (kohortti 1), kolmen biomarkkereiden malli koostuu DKK3, PKM2 ja IGFBP2 tunnistettiin, jotka voivat diagnosoida CRC 73% herkkyys 95% tarkkuus (taulukko 4). Lisäksi tämä kolmen biomarkkereiden malli osoittautui vankka kun validoitu testissä kohortin (kohortti 2, herkkyys 73% 95%: n spesifisyys), ja pystyi syrjiä valvonnan ja CRC potilaita eri TNM samanlaisia ​​herkkyys (taulukko 4). Tärkeää on, tämä biomarkkereiden malli pystyy tunnistamaan varhaisvaiheen potilaiden sairaus suurella herkkyydellä (eli 57% ja 76% herkkyys, 95%: n spesifisyys vaiheissa I ja II, vastaavasti, koulutuksessa kohortissa ja 59% ja 84% varten vaiheet I ja II, vastaavasti, testissä kohortissa). Kuva. 1 esittää ROC-käyrä kolmen biomarkkereiden malli ja suoritusarvot Mallin esitetään taulukossa 4.

Keskustelu

Aiemmin mittasimme 32 proteiinia biomarkkerit plasmassa ja seerumista CRC potilaiden ja verrokkien [26]. Nämä biomarkkerit alunperin tunnistettu olevan potentiaalisesti käyttökelpoisia CRC diagnoosi perustuu biologia, geenien ilmentymisen microarray ja proteomiikka tiedot, sekä omien tutkimusten ja kirjallisuudesta. Aiemmissa tutkimuksessa mittasimme PKM2 plasmassa ja todennut, että se oli 19% herkkyys (95%: n spesifisyys) taas seerumin havaitsimme herkkyys 56% 95%: n spesifisyys. Kun mitataan seerumista, PKM2 oli tehokkaimpiin biomarkkereiden CRC diagnoosiin verrattuna muihin biomarkkerit mittasimme. Lisäksi se oli myös parhaiten toimiviin merkki erilaistamisprosessissa alkuvaiheessa tauti (48% herkkyys). Edelleen laajennus Tässä tutkimuksessa olemme sitoutuneet lisäarviointia seitsemän näiden proteiinien kaksi riippumatonta tapauksessa ohjaus kohortteja (kohortti 1 ja 2). Lisäksi olemme tunnistaneet paneeli kolme proteiinia biomarkkerit joka pystyy diagnosoimaan CRC peräisin ohjaus väestöstä 73% herkkyys 95% tarkkuus sekä koulutukseen (n = 145) ja koe (n = 197) kohortteja tutkimuksessamme. Vaikka nämä alkuvaiheen tutkimukset ovat lupaavia, olemme parhaillaan tutkimassa lisäkokeita meidän biomarkkereiden paneelin potilaan kohortin joka sisältää ei-pahanlaatuisia peräsuolen sairauksien (esim tulehduksellinen suolistosairaus, diverticulutis), adenoomia, hyvänlaatuisia ja /tai precancerous polyypit ja muita syöpiä. Näin voimme määrittää spesifisyys paneelin CRC havaitsemiseksi ja sen herkkyys alkuvaiheessa tai syöpää edeltävä sairaus.

kolme biomarkkereiden paneeli koostuu IGFBP2, DKK3 ja PKM2, ja jokainen näistä proteiinien tiedetään biologisesti tärkeitä CRC sairauden ja etenemistä ja edustavat epäyhtenäisyys tämä syöpä. Esimerkiksi on olemassa lukuisia kertomuksia osallistumista IGFBP2 vuonna jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja hyökkäys syöpäsolujen [31], ja kohonneet IGFBP2 on myös raportoitu seerumissa ja plasmassa CRC potilaista verrattuna normaaleihin kontrolleihin [32- 35]. Transkription vaiennettu DKK3 takia promoottori hypermetylaation CRC kudos on raportoitu [36,37], ja tämä voi selittää laski tasoja seerumissa CRC potilaiden me tässä tutkimuksessa havaitut. Kuitenkin korkea proteiinin ekspressiotaso endoteelisolujen mikrosuonten syövän kudos on myös raportoitu osoittaa mahdollista merkitystä DKK3 CRC etenemistä, koska angiogeneesiä ja neovaskularisaatioon [38]. PKM2 on sytosolinen entsyymi, joka osallistuu energia-aineenvaihduntaan, joka on ilmaistu sekä normaaleissa jakautuvat solut ja syöpäsolut. Kohonneita ilmentyminen kasvaimeen erityinen dimeerimuodoksi tämän proteiinin on raportoitu CRC ja muiden ruoansulatuskanavan syöpien [39-41] ja lukuisat tutkimukset ovat arvioineet sen käyttökelpoisuus ulosteen tai veripohjaisten merkkiaine CRC seulontaan ja /tai diagnosointiin [40 , 42-46]. Ensisijainen haitta koskee hyödylliseksi stand-alone diagnostinen markkeri on sen huono spesifisyys CRC.

Suorituskyky kolmen biomarkkereiden malli koostuu IGFBP2, DKK3 ja PKM2 (73% herkkyys 95% tarkkuus ) vastaa, että noteerattu FOBT ja FIT (herkkyys 61-79% on 86-95%: n spesifisyys) [12,14,47-49]. Lisäksi paneeli biomarkkereiden jotka olemme tunnistaneet näyttää toimivan hyvin varhaisen vaiheen tauti tunnistus (so vaihe I ja II sairaus). Tämä ylivoimainen suorituskyky varhaisessa vaiheessa, erityisesti I vaihe, tarjoaa tärkeän edun meidän biomarkkereiden paneelin yli nykyisin käytetään ei-invasiivisia testit CRC. Tämä on tärkeä näkökohta, koska varhainen taudin havaitseminen ja asianmukainen potilaan hoito parantaa yleistä eloonjäämistä tähän tautiin. Lisätestejä paneelin suuri tulevaisuuteen kohortin, joka sisältää potilaat, joilla on suuri riski adenoomia tai polyyppeja, tarvitaan täysin ymmärtää potentiaalia hyödyllisyys meidän paneelin diagnostisia tai seulonnassa. On myös mahdollista, että biomarkkereiden paneeli voidaan käyttää yhdessä nykyisen seulonta säännöt, kuten FOBT, FIT, tai raportoi äskettäin plasma mSEPT9 testi tai ulosteesta-pohjainen DNA-markkereita [20-24] edelleen parantaa diagnostista suorituskykyä.

Vaikka tiedetään, että seulonta ohjelmat voivat vähentää kuolleisuutta CRC, kehittyvien todisteet viittaavat siihen, että ei-invasiivisen veri-pohjainen testi korkea herkkyys ja spesifisyys taudin, erityisesti varhaisessa vaiheessa tauti, voi olla edullista voittaa koettu osallistumisen esteitä, jotka liittyvät käyttöön FOBT [50,51]. Vaikka ei-invasiivisia, The FOBT ei ole spesifinen CRC ja se ei pysty tunnistamaan tarkasti alkuvaiheessa tauti. Lisäksi arvo tämän testin rajoittaa niiden taloudellinen potilaiden hoitomyöntyvyyttä [50]. Tiedot tutkimuksista, jotka mittaavat potilaan mieltymys verikokeet vs. tähystys, kuten kolonoskopia tai sigmoidoskopiaa, ei ole saatavilla. Kuitenkin tutkimukset tutkivat potilaan etusija välillä FOBT ja kolonoskopia näyttää ristiriitaisia ​​tuloksia. Esimerkiksi Schroy et ai. viittaavat siihen, että potilaat ovat mieluummin ulosteen testaus Rutiiniseulontaan koska sen mukavuutta ja ei-invasiivisia luonteeltaan [52]. Toinen tutkimus Hol et al. päätteli, että seulonta endoskopialla tekniikoita olivat parempi keskuudessa seulonta väestöstä johtuen varmuutta diagnoosin ja väheneminen sairastumisriskin [53]. Tämä osoittaa, että voidaan onnistuneesti käyttöön yhteisössä, suuri herkkyys ja spesifisyys tarkasti ja luotettavasti diagnosoimaan CRC ja ilmoittaa potilaiden seurantaan menettelyt ovat tärkeitä ominaisuuksia tahansa diagnostisen testin, joka täytyy ottaa huomioon.

tukeminen tiedot

S1 kuvio. Sirontakaavioissa seitsemän biomarkkereita arvioitiin koulutuksen ja kokeen ikäryhmät.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0120425.s001

(PDF)

S2 Kuva. Vastaanotin operaattori ominaiskäyrät seitsemälle biomarkkereita arvioitiin koulutuksen ja kokeen ikäryhmät.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0120425.s002

(PDF) B S1 Taulukko. Suoritusarvot yksilön biomarkkereiden koulutukseen ja testin ikäryhmät.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0120425.s003

(PDF) B

Kiitokset

Tekijät haluavat kiittää Victorian Cancer Biopankkiverkosto (Melbourne, Victoria) niiden apua näytteen keräämistä.