Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpäsolut hyväksyä Glykolyysivaiheen kuin päälähde metabolisen energian tuotannon nopeaan solujen kasvua. HIF-1 aiheuttama PFKFB3 avainasemassa tässä sopeutumista nostamalla pitoisuutta Fru-2,6-BP, voimakkain Glykolyysivaiheen stimulaattori. Koska tämä metabolinen konversio on ehdotettu olevan tunnusmerkki syövän, PFKFB3 on tullut uutena kohteena syövän kemoterapiassa. Täällä me raportoimme että pieni molekyyli estäjä, N4A, todettiin aluksi lyijy yhdistettä PFKFB3 estäjä. Yrittäessään parantaa tehoa, määritimme kiderakenne PFKFB3 • N4A monimutkainen 2,4 Å resoluutio ja hyödyntämällä tuloksena molekyylitason tietoa, saavutti voimakkaampi YN1. Kun testattiin viljeltyjen syöpäsolujen, sekä N4A ja YN1 esti PFKFB3, tukahduttaa Fru-2,6-BP tasolla, mikä puolestaan ​​tukahdutti Glykolyysivaiheen ja lopulta johti solukuoleman. Tämä tutkimus vahvistaa PFKFB3 tavoitteeksi uusien syövän hoitomuotoja ja tarjoaa puitteet tulevaa kehitystä ponnisteluja.

Citation: Seo M, Kim JD, Neau D, Sehgal I, Lee YH (2011) Structure-Based kehittäminen pienimolekyylisiä PFKFB3 estäjät: Kehys Mahdolliset Cancer Terapeuttiset aineet kohdistaminen Warburg vaikutus. PLoS ONE 6 (9): e24179. doi: 10,1371 /journal.pone.0024179

Editor: Anil Kumar Tyagi, University of Delhi, Intia

vastaanotettu: 02 toukokuu 2011; Hyväksytty: 02 elokuu 2011; Julkaistu: 21 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Seo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Cancer Institute avustuksen 1R01 CA124758-01 ja Y.-HL Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Toisin kuin normaalit solut, syöpäsolut on todettu siirtämään energia-aineenvaihdunnan kohti glykolyysin [1]. Tämä ilmiö, alun perin kutsutaan Warburg vaikutus ja tämän siirtymisen mahdollistaa syöpäsolujen tyydyttämiseksi lisääntynyt biosynteettisten vaatimuksia biomassan ja energia [2], [3]. Tutkimukset ovat johdonmukaisesti osoittaneet epänormaalin korkea glykolyyttisissä korko monenlaisia ​​ihmisen syövissä, mutta aiheuttajaa mekanismeja vastuussa tästä aineenvaihdunnan sopeutuminen yhä puutteellisia [4], [5]. Mahdollisia mekanismeja, mitokondrion hengityselinten viat ja hypoksiaa kasvaimen mikroympäristössä ovat johtuvan kaksi suurta tekijöitä Warburg vaikutus [6], [7], [8]. Huolimatta monimutkaisuus ja epämääräisyys perustana olevien mekanismien vastuussa Warburg vaikutus, metabolinen seuraukset ovat johdonmukaisesti muutosta kohti Glykolyysivaiheen kuin päälähde ATP tuotannon [4], [9]. Tämä metabolinen poikkeavuus syöpäsolujen abiochemical perustan ensisijaisesti tukahduttaa etenemistä pahanlaatuisten solujen estävät selektiivisesti Glykolyysivaiheen [10], [11], [12].

glykolyysijärjestelmän reitissä phosphofructokinase-1 (PFK- 1) katalysoi suurta nopeutta rajoittava vaihe, joka muuntaa fruktoosi-6-fosfaatti (Fru-6-P) fruktoosiksi-1, 6-bisfosfaatin (Fru-1, 6-BP), ja on allosterically säätelee fruktoosi-2,6 -bisphosphate (Fru-2,6-BP) [13], [14]. Under runsas energiahuollon, korkeita ATP voimakkaasti estävät PFK-1 toimintaa; kuitenkin, Fru-2,6-BP voidaan ohittaa estävä vaikutus ja parantaa glukoosin sisäänoton ja glykolyyttiset flux [15]. Ei ole yllättävää, Fru-2,6-BP synteesi on säädelty monissa syövän solulinjoissa, mikä viittaa siihen, että valikoiva ehtyminen solunsisäisen Fru-2,6-BP syöpäsoluissa voidaan mahdollisesti käyttää estämään glykolyyttisiä flux ja tukahduttaa pahanlaatuinen solujen eloonjäämistä ja etenemiseen [16], [17], [18].

perhe bifunktionaalisen entsyymejä, 6-phosphofructo-2-kinaasi /fruktoosi-2,6-bisphosphatases (PFKFB1-4), ovat vastuussa solunsisäisen tasot Fru-2,6-BP [18], [19], [20]. Näistä isotsyymien, PFKFB3 on vallitsevasti yli-ilmentynyt kilpirauhasen, rinta-, paksusuoli-, eturauhasen, ja munasarjojen kasvainsolulinjoja [18], [21], [22]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että induktio PFKFB3 ilmentymisen HIF-1 hypoksisissa ehto seuraa lisääntynyt invasiivisia potentiaalia ja kestävyys chemotherapies [21], [23]. Yhdessä nämä tutkimukset viittaavat siihen, PFKFB3 on potentiaalinen kohde uuden luokan anti-neoplastisia aineita, jotka estävät alkaminen syövän erityisiä glykolyysin estämällä Fru-2,6-BP aalto ja lopulta aiheuttaa kuoleman syöpäsoluja. Niinpä esto PFKFB3 terapeuttisena strategiaa syöpä on ehdotettu [22].

Huolimatta mahdollisista eduista, hyväksikäyttö PFKFB3 syövän hoito on edelleen heikko. Clem et ai (2008) raportoivat pyridinyyli sisältävän yhdisteen mahdollisena PFKFB3 estäjä, joka perustuu reseptorin rakenne ennustettiin, että on PFKFB4 [24]. Vaikka lupaavia, inhibiittorit perustuvat rakenteisiin muu kuin todellinen PFKFB3 entsyymi voi puuttua spesifisyyttä ja rajoittaa strategista parantaminen estäjän teho. Pystyimme voittamaan tällaisen synnynnäinen vika harjoittamalla rakenteelliset tutkimukset PFKFB3 ja sen komplekseja ligandien. Tässä raportissa olemme tunnistaneet N4A uutena kilpaileva estäjä ja testataan sen estävä vaikutus PFKFB3 toimintaa. Ymmärtää molekyylitason mekanismi estäjä-tunnustaa PFKFB3, määritimme rakenne PFKFB3 monimutkaisissa kanssa N4A.Guided jonka rakenteellinen perusta estäjä sitova; vuoksi pystyimme optimoimaan N4A käyttäen samankaltaisuus haku ja laskennallinen arviointi, jolloin seurannan lyijy yhdiste on 5-kertainen parannus teho.

Lisäksi molekyylitason mekanismi PFKFB3 eston ja estäjä parannus olemme myös tutkineet inhibitio Fru-2,6-BP tuotannon ja glykolyysin HeLa-soluissa, jotka PFKFB3 estäjää. Uuden PFKFB3 inhibiittorit, N4A ja YN1 vähensi Fru-2,6-BP tasoilla ja glykolyyttiset virtaus, mikä johtaa kasvun inhibition kasvainsolujen ja massiivinen solukuolema. Nämä tulokset tarjoavat paitsi näyttöä, joka vahvistaa kohdentamista PFKFB3 mutta myös ensimmäinen suora rakenteellinen käsityksen estäjää vuorovaikutuksia, perustamisesta pohjan rakenne-avusteisen optimoinnin ja kehittää uusia PFKFB3 estäjien kemoterapeuttisia aineita syövän.

tulokset

Kaiken strategia estäjän seulonta ja parantaminen

vuokaaviona kuvaavat strategian hyväksytty löytämisen ja parantaminen PFKFB3 estäjien on esitetty kuviossa 1. Ehdokkaita lyijy yhdiste valittiin laskennallinen seulonta käyttäen kiderakenteen PFKFB3 joita olemme aiemmin päättäneet 2,1 päätöslauselman [25] käytettiin molekyyliseulaa seulonnan (a). Saatu osuma yhdisteitä tältä molekyyliseula arvioitiin entsymaattisella inhibitiotesti ja yhdisteet, joilla on korkein estovaikutuksen valittiin johtomolekyylien harkinnan jälkeen lääkeaineen-todennäköisyyden (b). Seuraava yksityiskohtainen kineettiset ominaisuudet karakterisoitiin (c) ja biologisia vaikutuksia ihmisen adenokarsinoomasoluja tutkittiin mittaamalla glykolyyttiset flux, kasvun estäminen, ja solukuolemaa (d). Ymmärtää molekyylitason inhibition PFKFB3, X-ray kiderakenne analyysi PFKFB3 • inhibiittorikompleksista suoritettiin (e). Perustuen molekyylitasolla saatua tietoa vaiheesta (e), teimme etsiä uusia johdannaisen yhdisteitä, joilla on parantunut teho, käyttäen lyijy yhdistettä mallina (f). Tuloksena yhdisteet tästä samankaltaisuudesta haku arvioitiin kautta laskennallinen telakointi käyttämällä FLEXX [26] (a) ja paras optimoitu yhdiste läpäissyt tämän valintaprosessin uudelleen. Kautta iteratiivista kierrosta näiden prosessien, pystyimme saamaan yhdistettä, jolla on inhiboivaa aktiivisuutta suuruusluokkaa alkulämpötilaa lyijyä ja jolla on voimakas PFKFB3 inhibition in vitro.

Inhibitor seulonta ja sitovat ominaisuudet

aikana edellisessä tutkimuksessa useita yhdisteitä, jotka kykenevät sitoutumaan Fru-6-P tasku PFKFB3 tunnistettiin virtuaaliseulonnan. Vahvista estävää toimintaa ja poistaa vääriä positiivisia näiden lääke-ehdokkaiden, PFKFB3 inhibitio testattiin 10 uM kutakin yhdisteistä (kuvio 2A). Estämään ei-spesifinen esto aiheuttama satunnainen hydrofobisten vuorovaikutusten välillä estäjä ja proteiinin, joka on sama testi suoritettiin, kun läsnä oli 0,1% Tween-20. Testattujen yhdisteiden joukosta, ZINC04887558 (N4A, 5, 6, 7, 8-tetrahydroksi-2- (4-hydroksifenyyli) kromen-4-oni) inhiboi entsyymin aktiivisuus on suurempi kuin 65% alle alustan-kyllästää olosuhteissa, ja tämä inhibitio ei vaikuttanut läsnäolo Tween-20. Valitsimme N4A alustavana johtoa ”(kuvio 2B). Myöhempi kineettinen tutkimus paljasti, että N4A estää PFKFB3 kanssa IC

50 arvo of2.97 ± 0,16 uM (taulukko 1). Tehtiin vakaan tilan eston tutkimus osoitti, että N4A estää PFKFB3 kuin kilpaileva estäjä vastaan ​​Fru-6-Pwith K

i 1,29 ± 0,26 uM, odotetulla virtuaaliseulonnan ja kuten osoitettu Lineweaver-Burk-yhtälö (kuvio 2C) .

(A) esto vaikutustehoille lääkeaihioihin. Suuruudet esto yhdisteillä 10 uM kutakin mitataan kautta entsyymianalyysiä ja esitetään persentiilit vastaan ​​ohjaus (□). Sama koe suoritettiin myös, kun läsnä on 0,1% Tween-20 (▪), poistaa vääriä positiivisia aiheuttamat epäspesifinen hydrofobisia vuorovaikutuksia. (B) Rakenteet ja PFKFB3 estäjiä. (C) Lineweaver-Burk piirtää osoittaa kilpailukykyinen esto N4A vastaan ​​Fru-6-P. Inhibiittorin käytetyt konsentraatiot olivat: 0 uM (▪), 1 uM (○), 2 uM (▴), ja 3 uM (□) ja N4A. Ne ovat myös merkitty seuraavaan yksittäisten koealojen. (D) Lineweaver-Burk piirtää osoittaa kilpailukykyinen esto YN1 vastaan ​​Fru-6-P. Inhibiittorin käytetyt konsentraatiot olivat: 0 uM (▪), 1 uM (○), 2 uM (▴), ja 3 uM (□) ja N4A. (E) valikoivuus N4A ja YN1 päälle PFKFB isoformeja. Tulokset ilmaistaan ​​prosentuaalisena estona kaksi kertaa IC

50 konsentraatio vastaan ​​PFKFB3 (N4A = 6 uM, YN1 = 1,3 uM).

parantaminen inhibition tehoa johtoon yhdisteen, N4A, rakenteen ja ohjattu optimointi on tärkeä tavoite tämän tutkimuksen. Koska yksityiskohdista keskustellaan seuraavissa osissa, vain lyhyt lopputulos on otettu käyttöön tässä varhaiseen vertailuja. Kaksi muuta N4A estäjät, YN1 (7, 8-dihydroksi-3- (4-hydroksifenyyli) kromen-4-oni) ja YZ9 (etyyli-7-hydroksi-2-oxochromene-3-karboksylaatti) (kuvio 2B) on saatu käyttämällä rakenne-ohjattu optimoinnin. Jotka esitetään taulukossa 1, YN1 exhibitsIC

50 = 0,67 uM ja K

i = 0,24 ± 0,03 uM, osoittaa 5-kertainen estoon. Yhdiste YZ9 osoittaa vielä suurempi esto-kertaluokkaa lähtöaineena lyijyä, N4A. Kaikki tutkitut yhdisteet ovat liukoisia eri vesiliuoksissa jopa 50 uM vaihtelee läsnä ollessa 1% dimetyylisulfoksidia (DMSO).

lyijy- yhdisteen, N4A, ja johdannainen, YN1, testattiin niiden inhiboivia vaikutuksia muista ihmisen PFKFB isoformeja. Inhibiittorit oli voimakkaampi vaikutus PFKFB3 kuin muilla PFKFB isoformeja. Kaksi kertaa IC

50 PFKFB3 jossa PFKFB3 oli yli 80% estyy, N4A esiintyy alle 50%: n inhibitio ja YN1 osoittaa vähemmän kuin 40%: n inhibitio on PFKFB1, PFKFB2 ja PFKFB4 (kuvio 2E). N4A ja YN1 ovat suhteellisen selektiivisiä inhibiittoreita PFKFB3. Parantaminen isoformi erityispiirteet on tärkein tavoite seuraavaan vaiheeseen optimointi ja niin yritetään.

Vaikutukset N4A ja YN1 on Fru-2,6-BP tasoja, Glykolyysivaiheen, ja solujen kasvua

seuraava tutkittiin vaikutukset soveltamalla N4A ja YN1inhibitors elää HeLa-solut. Esto PFKFB3 odotetaan alentavan tasot Fru-2,6-BP HeLa-soluissa. Sen jälkeen 8 tunnin altistus N4A ja YN1, Fru-2,6-BP alennettiin noin 20%; jälkeen 48 tunnin altistus, Fru-2,6-BP väheni yli 40% (kuvio 3A). Down-sääntely Fru-2,6-BP tasot N4A ja YN1 liittyi alentunut Glykolyysivaiheen, odotetusti. Lasku Fru-2,6-BP tasot altistuminen N4A ja YN1 johti vähenemiseen laktaatin tuotantoa, joka näkyi enemmän kuin 30%: n lasku laktaattia eritteistä. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, N4A ja YN1 estävät PFKFB3 johtaa suppression glykolyysin (kuvio 3B).

Fru-2,6-BP tasot (A) ja tasot eritetyn laktaattia (B) määritettiin entsymaattisesti ajankohtina 0, 4, 8, 12, 24, tai 48 tuntia sen jälkeen, kun inhibiittori hoitoja HeLa-soluissa. Tulokset normalisoitiin näytteen proteiinin pitoisuuksien ja ilmaistiin suhteena arvoa ajoneuvon käsiteltyä. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM vähintään kolmesta kokeesta. Aikariippuvainen vaikutukset 25 uM kutakin N4A (linja timantti) ja YN1 (pisteviiva kanssa ontto neliö) matkapuhelinverkon Fru-2,6-BP tasot (A) ja laktaatti eritteiden (B) on esitetty. (C) Kasvun estäminen mukaan N4A, YN1, ja YZ9 HeLa ja T47D-soluissa. Solujen lukumäärät analysoitiin yli 36 tuntia, jonka trypansininen laskentaa tai XTT-määritys. Datapistettä ilmaistaan% solujen kasvun hallinnan sisältävien ajoneuvojen vastaan ​​Logaritmiasteikolla inhibiittorikonsentraatioita. Virhepalkkeja seistä intraexperimental jäljittelee keskihajonnan.

Lisääntynyt Fru-2,6-BP tasot edeltää lisääntynyt Glykolyysivaiheen usein liittyy leviämisen transformoitujen solujen, kuten syöpäsoluja [3]. Olemme tutkineet vaikutusta PFKFB3 inhibiittorit, N4A ja YN1, proliferaatioon määrä ihmisen adenokarsinoomasoluja. Hoidot 25 uM kutakin N4A ja YN1 aiheutti 70% ja yli 90% vähennykset, vastaavasti, solujen lisääntymisen, verrattuna valottamattoman soluihin (kuvio 3C). Tulokset solujen kasvun inhibition määritykset jatkuvasti vahvistetaan, että inhibitio PFKFB3 mukaan N4A ja YN1 estää solun energia-aineenvaihduntaa ja lopulta solujen kasvua ja että YN1 on tehokkaampi inhibiittori, jossa on GI

50 8,2 ± 0,8 uM verrattuna N4A (GI

50 = 14,2 ± 1,5 uM) (taulukko 1). N4A ja YN1 pystyivät myös estämään pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen HeLa-soluissa (kuvio 4). HeLa-solut maljattiin pehmeässä agarissa eri pitoisuuksilla N4A tai YN1 ja kasvatettiin 3 viikkoa, jotta pesäkkeiden muodostumista. Molemmat yhdisteet inhiboivat merkittävästi pesäkemuodostusta 25, 50 ja 100 uM. Pesäkemuodostusta estyi 64% ja 79%, kun läsnä oli 25 uM N4A ja YN1, vastaavasti.

(A) ankkurointi-riippumatonta solujen kasvua pehmeässä agarissa. HeLa-soluja kasvatettiin pehmeässä agarissa ja 21 päivää, kun läsnä on ilmoitettua pitoisuudet N4A ja YN1 vastaavasti (20 x). (B) tilastollinen analyysi kokeen. Pylväät, keskiarvo (n = 5); baareja, SD.

Jotta voitaisiin edelleen tutkia mekanismi, joka vastaa anti-proliferatiivinen vaikutus PFKFB3 inhibiittorit, flow-sytometria-analyysi solukuoleman suoritettiin. Tulokset osoittavat, että N4A ja YN1 indusoi sekä apoptoottisten ja nekroottisen solukuoleman. Tämä sekoitettu kuvio luonteeseen liittyvät apoptoosin, joka, toisin kuin nekroosi, on ATP-riippuvainen prosessi [27], [28]. Solukuoleman aiheuttama PFKFB3 estäjien tulisi vastata niiden kyky heikentävistä solujen ATP ehtyminen ja ATP suosii kuolemaan kuolion kuten aiemmin spekuloitu [11], [27], [28]. Meidän tiedot tukevat tätä väitettä: suhteellisen alhainen pitoisuus (25 uM) N4A tai YN1, ympäristö, jossa ehtyminen soluenergiaa ehtymisestä on kohtalainen, solujen havaittiin olevan altis apoptoosin, kun taas suuremmilla pitoisuuksilla (50 uM) estäjien, kuoleman nekroosin huomattavasti riittämättömän solujen energian tukemiseksi apoptoottisen prosessin (kuvio 5).

soluja käsiteltiin kahdella eri inhibiittorien pitoisuuksia, 25 uM ja 50 uM. (A) indusoitu solukuolema kahdella eri pitoisuuksilla N4A mitattiin virtaussytometrillä sen jälkeen, kun kaksinkertainen värjäys anneksiini V: n ja PI. (B) kvantitointi virtausta metrimittausmenetelmille data (keskiarvo ± SD) osoittaa annoksesta liittyvä vaikutus N4A. (C) sytogrammeja on YN- solukuolema ja (D) kvantitointiin virtaus- sytometrinen tietoja.

rakenne PFKFB3 • N4A monimutkainen

halusi käyttää N4A inhibiittorin johtoa rakenne-ohjattu optimoinnin edelleen estäjiä. Tämän tehtävän helpottamiseksi, oli välttämätöntä määrittää molekyyli- ominaisuudet N4A sitoutumisen PFKFB3 kiteyttämällä ihmisen PFKFB3 läsnä ollessa N4A. Selvitimme rakennetta tämän monimutkaisen 2,4 päätöslauselman menetelmällä molekyyli korvaaminen käyttäen ensimmäistä PFKFB3 rakenne (PDB-koodi: 2AXN) hakuna malli [29].