Krooninen sairaus

tiivistelmä

Etäpesäke on tärkein kuolinsyy potilailla, joilla on kiinteitä kasvaimia. Selvittää niiden tarkka molekyylit liittyvät CRC etäpesäke voi olla tärkeää ymmärtää prosessia, jolla voisi olla käännetty diagnosointiin ja hoitoon CRC. Tässä tutkimuksessa tutkimme yhdistys mikroRNA ekspressiokuvioiden kanssa imusolmuke etäpesäke paksusuolisyövän. Näistä ehdokas miRNA: n ilmentyminen miRNA-145 oli merkittävästi liittyvät imusolmuke etäpesäke CRC. Molemmat

in vitro

ja

in vivo

tutkimus osoitti, että säätely ylöspäin miR 145 voisi parantaa kykyä muuttoliikkeen ja invaasion paksusuolen syöpäsolu, kun taas mitään vaikutusta proliferaatioon havaittiin. Mekanismia edistäminen liittyy vakauttamisen Hsp-27, proteiini, joka on tärkeä rooli edistämisessä etäpesäke. Nämä tulokset voivat olla ratkaiseva ymmärtämiseen CRC etäpesäke ja voidaan kääntää diagnosointiin ja hoitoon CRC.

Citation: Yuan W, Sui C, Liu Q, Tang W, H, Ma J (2014) Up -Regulation of MicroRNA 145 Associatesin imusolmukemääritysmenetelmä etäpesäke sisään peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (7): e102017. doi: 10,1371 /journal.pone.0102017

Editor: Rolf Müller, Philipps University, Saksa

vastaanotettu: 10 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 14 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 14 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Yuan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Basic Research Program of China (Grant no. 2011CB911004), Pekingin Training Project johtava Talents (Z131107000513001), Peking Nova Program (Z131107000413066) ja Beijing Natural Science Foundation of China (Grant no. 7122150). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) sijoittuu kolmanneksi yleisin kasvain ja neljänneksi suurin syy syövän kuolleisuus kaikkialla maailmassa [1]. Vaikka monia saavutuksia on tehty hoidossa CRC viime vuosikymmeninä yleinen eloonjäämisaste potilaiden CRC on marginaalisesti muuttunut. Huono ennuste ja eloonjäämisaste johtuvat pääasiassa etäpesäkkeiden, mikä yli kolmasosa potilaista, joilla CRC lopulta kehittää metastaattisen sairauksia [2]. Siksi selvittää niiden tarkka molekyylit liittyvät CRC etäpesäke voi olla tärkeää ymmärtää prosessia, jolla voisi olla käännetty diagnosointiin ja hoitoon CRC.

MikroRNA (miRNA) ovat 21- 25 nukleotidin single- monisäikeinen, ei-koodaavat RNA-molekyylejä, jotka saavat aikaan toimintoja sitoutumisen 3′-transloimattomat alueet niitä vastaavien mRNA tavoitteet [3]. On arvioitu, että yksi kolmasosa koko ihmisen geenejä voidaan säädellä miRNA, mikä osoittaa, että miRNA on keskeinen rooli fysiologisissa ja patologisissa prosesseissa [4] – [5]. Suuri määrä havainnot osoittavat, että miRNA ovat osallisina ihmisen syövissä. Epätarkoituksenmukainen ilmentyminen miRNA voi johtaa poikkeavaan ilmentymistä geenin tuotteita, jotka saattavat edistää hankintaan tunnusmerkkejä syöpä. Nämä havainnot viittaavat siihen, funktio miRNA kuin tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien [6] – [8].

Äskettäin vakuuttavaa näyttöä osoitti, että sarja miRNA keskeisessä asemassa ovat CRC etäpesäkkeitä. Esimerkiksi, Asangani et ai. tunnistettu mir-21 kuten etäpesäkkeiden promoottori CRC [9]. Liu et ai raportoitu että miR-499-5p parannettu solujen invaasio ja kasvainten etäpesäkkeiden CRC kohdentamalla FOXO4 ja PDCD4 [10]. Okamoto K, osoitti, että säätely ylöspäin miR-493 aikana syövän synnyn voisi estää maksan etäpesäke CRC [11]. Kuitenkin etäpesäke johtui mutkikkaan sarjan biologisten prosessien ja tarkkaa molekyylitason mekanismeista CRC etäpesäke ole läheskään täysin ymmärretty.

Tässä tutkimuksessa miRNA ekspressioprofiileja perusterveydenhuollossa CRC vaurion tai ilman imusolmuke etäpesäke analysoitiin käyttämällä miRNA microarray ja määrällinen Käänteiskopiointia polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR). Tässä suhteessa miR 145 valittiin se näkyy dramaattinen ylössäätöä CRC kanssa imusolmuke etäpesäke verrattuna, että ilman imusolmuke etäpesäke. Molemmat

in vitro

ja

in vivo

tutkimus osoitti, että säätely ylöspäin miR 145 voisi parantaa kykyä muuttoliikkeen ja invaasion peräsuolen syöpäsolun. Lisäksi iTRAQ (isobaaristen tag suhteellista ja absoluuttisia) merkinnät ja 2DLC-ESI-MS /MS (nestekromatografia tandem MS) käytettiin tunnistamaan solun proteiinien, jotka suoraan tai epäsuorasti säätelee miR-145. Nämä tulokset viittaavat siihen, miR 145 voisi olla tärkeä rooli etäpesäkkeiden CRC tasaantuminen Hsp-27.

Tulokset

1. Eri miRNA ilmentyminen profiileja CRC tai ilman imusolmuke etäpesäke

tutkimiseksi yhdistys mikroRNA ekspressiokuvioiden kanssa imusolmuke etäpesäke peräsuolen syöpä, kahdeksan ensisijainen peräsuolen syövän kudoksia johdettu vaiheen II-III peräsuolen syövän potilaille, joilla on (n = 4) tai ilman sitä (n = 4), imusolmuke etäpesäke kerättiin ja miRNA ilmentymisen profiilit niistä määritettiin käyttäen Agilent miRNA microarray. Niistä ainutlaatuinen 851 ihmisen miRNA koetin, 32 miRNA havaittiin differentiaalisesti ilmaistut CRC kudoksissa välillä imusolmuke etäpesäke positiiviset ja negatiiviset ryhmä (

P

0,05). Kaksikymmentä yksi niistä havaittiin merkittävästi kohonneen ekspression CRC imusolmuke etäpesäke. Toisaalta, 11 heistä on ali-ilmentynyt merkittävästi imusolmuke etäpesäke positiivinen CRC kudoksiin. Valvomatta klustereiden analyysi näiden 32 merkitsevästi väärin säädellystä miRNA (21 miRNA merkittäviä yli-ilmentymisen ja 11 miRNA merkittäviä alassäätöä) pystyi erottamaan CRC: t tai ilman imusolmuke etäpesäke (Fig. 1A).

. Sertifioitu tulos mikrosiruanalyysillä. Hierarkkinen ryhmittely 32 huomattavasti väärin säädellystä miRNA ekspressioprofiilit ihmisen primaarisissa peräsuolen syövän kudoksissa, jotka ovat peräisin kolorektaalisyövän potilailla, joilla on (LNM-P, n = 4) tai ilman sitä (LNM-N, n = 4), imusolmuke etäpesäke. B.Validation valittujen miRNA ennustetaan olla väärin säädellystä CRC tai ilman imusolmuke etäpesäke käyttäen qRT-PCR samassa kudoksissa käytettiin mikrosiruanalyysillä. Data esitetään B edustaa kolmen erillisen kokeen, ja esitetään kertainen ilmaisun normalisoida U6 ± SD (keskihajonta) .C. QRT-PCR-analyysi suhteellisen ilmentymisen miR-145 lisää 202 (LNM-N = 99; LNM-P = 103) tapauksissa ihmisen CRC kudosten, mukaan lukien kasvaimen näyte (T) ja vastaavat ei-kasvain kudosnäyte (NT) samasta potilaasta. Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena ja normalisoitiin U6. *

P

0,05, **

P

0,01.

2. Tarkastus miRNA ilmentymisen reaaliaikaista PCR-analyysiä

validoimiseksi miRNA microarray data, suoritimme kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) analysoida ilmentymistason 11 miRNA jotka olivat merkittävästi väärin säädellystä miRNA tai joita ei ilmoiteta sen yhteydessä myös potilaat, joiden miR-99b, -125b, -100, -99a, -152, -199b-5p, -145, -376c, -29b, -95 ja -1274a. Tutkimme ilmaus miRNA samassa kudoksissa käytettiin mikrosiruanalyysillä. Normalisoinnin jälkeen endogeenisen ohjaus U6, qRT-PCR tiedot vahvistivat, että ilmaus 8 miRNA osoitti olevan yhdenmukainen microarray tulokseen. Niistä ilmentymisen miRNA-145 näytetään merkittävin ero syövän kudoksissa kaksi ryhmää (Fig. 1 B).

edelleen varmistamiseksi miR-145 ilmentymisen profiili, qRT-PCR-analyysi suoritettiin ylimääräinen 202 CRC näytteitä (99 CRC potilailla, joilla imusolmuke etäpesäke ja 103 CRC potilailla, joilla ei imusolmuke etäpesäke) (katso taulukko 1 ja taulukko S1). Kuten on esitetty kuviossa. 1C, miR-145 oli ali-ilmentynyt kolorektaalisyövässä yksilöiden tai ilman etäpesäkkeitä verrattuna viereiseen normaaleissa kudoksissa vastaavasti, mikä on aikaisempien raporttien kanssa yhtäpitävä muiden [14]. Ilmaisulla Mir-145 oli merkitsevästi säädellään ylöspäin CRC imusolmuke etäpesäke kuin että ilman imusolmuke etäpesäke. Tämä muutos viittasi siihen, että miR-145 voi olla tärkeä rooli CRC imusolmuke etäpesäke.

3. Yli-ilmentymisen miR 145 ei ole vaikutusta proliferaatioon HCT-8 solua

Voit selvittää, onko ilmentymisen miR 145 vaikuttavat biologiset toiminnot CRC solujen miR 145 ilmentynyt luotiin vuonna HCT-8 soluihin käyttäen lentiviruksesta järjestelmää, jota kutsutaan HCT-8-miR-145 solut tässä asiakirjassa. MIR-145 tasot HCT-8-miR-145 soluja ja mock ohjaus soluja (HCT-8-NC) määritettiin käyttämällä qRT-PCR (Kuva. 2A). Merkittävä säätely ylöspäin miR-145 HCT-8-miR-145-solujen havaittiin verrattuna kasvunopeuteen HCT-8-NC soluissa. Voit tarkkailla vaikutuksen miR 145 on HCT-8 solua, solun kasvunopeus tai solukierron arvioitiin CCK-8 tai FACS määrityksessä, vastaavasti. Kuten on esitetty kuviossa. 2B ja 2C, leviämisen nopeus tai solusyklin HCT-8-miR-145 solut eivät muutu verrattuna HCT-8-NC. Tämä tulos viittasi siihen, että yli-ilmentyminen miR-145 ei merkittävästi vaikuttanut leviämisen tai solusyklin HCT-8-soluista.

(A) qRT-PCR-analyysi miR 145 ilmentymisen HCT-8-soluista, jotka oli transfektoitu lenti-miR 145 ekspressiovektorin tai miRNA negatiivinen kontrolli vektori käyttäen lentivirus järjestelmää. (B) Proliferaationopeudet HCT-8-miR 145 tai HCT-8-NC-solujen havaitaan CCK-8 määrityksessä. (C) Solusyklianalyysiä HCT-8-miR 145 tai HCT-8-NC-solujen virtaussytometrialla. Data edustaa keskimäärin + SD kolmen itsenäisen kokeen.

4. miR-145 edistänyt CRC maahanmuutto- ja invaasion

in vitro

ja

in vivo

jälkeen analysoitava, onko miR 145 osaltaan muuttaa vaeltavien liikkuvuutta CRC soluja. Verrattuna mock ryhmä, solujen vaeltamiseen lisääntyi merkitsevästi HCT-8-miR-145 solujen siirtokuoppaan solussa migraatiokokeessa (Fig. 3A). Samanlainen tulos havaittiin myös solussa invaasiomääritys (Fig. 3B). Olemme myös päättäneet kykyä miR 145 edistää maahanmuuttoa muilla CRC solulinjoissa (SW480 ja SW620). Kuten osoitti kuvassa. S1 File S1, yliekspressio miR 145 lisäsi merkittävästi muuttavia kykyä SW620-solujen, kun taas mitään havaittavaa muutosta SW480-soluissa (tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä nämä tulokset antavat vahvaa näyttöä siitä, että säätely ylöspäin miR 145 voisi edistää solujen vaeltamiseen ja invaasiota

in vitro

. Koska ilmaus miR-145 HCT-8-soluista osoitti alimman ilmaisu verrattuna muihin CRC soluissa, loput työ keskittyi tällä CRC solulinjassa havainnollistaa tyypillisiä validointi.

(A) muuttoliike ja invaasio (B) määritystä HCT-8-miR 145 tai HCT-8-NC soluissa. Kuvat edustivat vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Keskimäärin muuttoliikkeen solujen määrä per kenttä vähintään kolmen itsenäisen kokeen ± SD näkyy sarakkeessa luku. **

P

0,01. (C) Kuva kuvia suoliliepeen imusolmuke etäpesäke päässä nude-hiiriä, jotka oli ruiskutetaan maksassa HCT-8-miR 145 tai HCT-8-NC-soluissa ja sen jälkeen kirurginen ommel. Eläimet tapettiin kaksi viikkoa post sisäiset maksan soluinokulaation. (D) esiintyvyys suoliliepeen imusolmuke etäpesäke hiirissä (taulukko) ja keskimääräinen lukumäärä näkyvissä etäpesäkenystyröiden in suoliliepeen (sarake kuva). **

P

0,01.

edelleen vahvistaa tätä käsitystä, Ortotrooppisessa elinsiirrot nude-hiirimallissa perustettiin tutkimaan, onko yli-ilmentymisen miR 145 voisi edistää kasvaimen etäpesäke

in vivo

. Löysimme mitään merkittävää eroa painon tai tilavuuden primäärikasvaimissa maksassa istutetut sekä HCT-8-miR-145-solut ja HCT-8-NC soluissa. Huomasimme myös, että 100% hiiristä HCT-8-miR-145 ryhmällä oli suoliliepeen imusolmuke etäpesäke ja keskimääräinen etäpesäkenystyröiden määrä saavutti 149 ± 15. Oli kuitenkin yksikään hiiristä HCT-8-NC kontrolliryhmässä näytetään suoliliepeen imusolmukkeiden etäpesäke (Fig. 3C, 3D). Yhdessä nämä tulokset vahvistivat, että korkean tason miR 145 voisi edistää CRC muuttoliikettä ja invaasiota

in vitro

ja

in vivo.

5. Analyysi ilmentyvät eri proteiinien

Edellä esitetyt havainnot osoittivat, että miR 145 toimii prometastatic miRNA CRC. Pyrkiä ymmärtämään paremmin proteiineja vaikuttaa joko suoraan tai epäsuorasti miR 145 yli-ilmentymisen, HCT-8-miR-145 ja HCT-8-NC solut hajotettiin, ja alistettiin iTRAQ merkintöjä, 2DLC-ESI-MS /MS analyysi. Kaikkiaan 1117 erillisten proteiinien tunnistettiin ja määrällisesti, jotka sittemmin suodatettu manuaalisesti valitun suodattimen syrjäytymistä parametreja. Otimme 1,3 kertainen muutos katkaisun varten iTRAQ suhde luokitella proteiinien ylös- tai alaspäin sääntelyä. Tämä raja-sovellettiin, koska useat aikaisemmat iTRAQ tutkimukset laboratoriossamme osoitti, että tekniset vaihtelu oli jatkuvasti alle 30%, kriteeri cutoff on myös otettu edellinen tutkimus [12]. Proteiinit katsottiin ylös tai alas-säädellä ainoastaan ​​heidän ilmaisu suhteet (HCT-8-miR-145 solua vs. HCT-8-NC solua) 1,3 (1 x 1,3) tai 0,77 (1 x 1,3) jA osoitti tilastollisesti merkittävä.

Näin 13 proteiinit seulottiin ulos ilmentyvät eri proteiineja, mukaan lukien 7 merkittävästi säädelty proteiineja ja 6 huomattavan alassäädetty proteiinit (Taulukko S2, S3). Niistä 13 ilmentyvät eri proteiineja, ylös-säätely lämpöshokkiproteiini 27 (Hsp-27) validoitiin käyttäen western blotting (Fig. 4A). Siksi valitsimme Hsp-27 jatkotutkimuksiin.

(A) Ilmaus tasot Hsp-27 tutkittiin in HCT-8-miR 145 tai HCT-8-NC solujen western blotting-analyysi. (B) ekspressio Hsp-27-proteiinia ei havaittu CRC ja viereisten normaaleissa kudoksissa Western blot-määrityksellä. Suhteellinen Hsp27 /aktiini suhteet yksittäisten bändejä näkyvät keskiarvona + keskihajonta on johdettu kaikkien potilaiden näytteistä (Non-kasvainkudoksen, n = 47; LNM-P kasvainkudoksen, n = 41; LNM-N kasvainkudoksen, n = 43). (C-D) MiR-145 Enhanced Hsp-27 Stabiilisuus CRC Cells.HCT-8-miR 145 tai HCT-8-NC-soluja inkuboitiin inhibiittorin sykloheksimidin (CHX, 0,5 ug /ui), (C) tai proteasomi-inhibiittoria MG-132 (5 uM) (D) 24 tuntia. Taso koko Hsp-27 havaittiin Western blot analyysillä. Suhteellinen Hsp27 /aktiini suhteet yksittäisten bändit esitetään keskiarvona ± SD arvoista normalisoitu beeta-aktiini.

edelleen vahvistaa yhdistyksen välillä Hsp-27-proteiinin ja miR-145 ilmentyminen CRC , analysoimme niiden ilmentyminen profiilin ensisijainen ihmisen kudosnäytteiden (kuten 41 CRC LNM, 43 CRC ilman LNM, 47 viereisen ei-kasvainkudoksessa) käyttäen western tai taudille qRT-PCR vastaavasti. Niistä 131 ihmisen kudosnäytteitä, ilmaus Hsp-27 oli merkitsevästi säädellään ylöspäin CRC imusolmuke etäpesäke verrattuna ilman imusolmuke etäpesäke. Tämä suuntaus on johdonmukainen miR 145 mentymisprofiili. Oli vahva positiivinen korrelaatio (Spearman) välillä Hsp-27-proteiinin ja miR-145 lauseke (

r

= 0,402;

P

0,0001) (kuvio 4B, Fig. S2 ja S3 File S1). Nämä tulokset osoittivat, että miR-145 on mukana, ainakin osittain, jopa säätelevä Hsp-27-proteiinin ilmentymisen.

6. Enhancement Hsp-27 vakautta miR-145 CRC soluissa

Ei ollut mitään havaittavaa muutosta Hsp-27 transkription tason jälkeen miR 145 ylössäätöä (tuloksia ei ole esitetty). Vain proteiini mutta ei mRNA Hsp-27 oli moduloidaan miR-145, mikä viittaa siihen, tämä asetus on post- transkriptionaalinen. Tutkimaan edelleen proteiinin säätely ylöspäin Hsp-27 vaikuttaa miR-145, havaitsimme onko miR-145 parantaa vakautta Hsp-27-proteiinia. HCT-8-miR-145-solut ja HCT-8-NC-soluja käsiteltiin joko proteiinisynteesi-inhibiittorin, sykloheksimidin (CHX), tai proteasomin inhibiittoria, MG-132, vastaavasti. Kuten on havainnollistettu 4C ja 4D, tehostettu ilmentyminen Hsp-27 miR 145 yli-ilmennetään soluissa kumottiin, kun inkuboitiin MG132. Tällaista ilmiötä ei löytynyt kun inkuboitu CHX. Nämä tulokset osoittivat, että miR 145 ei voi vaikuttaa proteiinisynteesiä Hsp-27, mutta saattaa hidastaa Hsp-27 hajoamista, mikä parantaa sen vakautta.

7. Alassäätö Hsp-27 vaimenee kasvaimia synnyttävän vaikutuksen miR 145

Voit tarkistaa, onko säätely ylöspäin Hsp-27 vahvistaa osaltaan MIR-145 aiheuttama potevilla CRC solussa, sarja määrityksiä olivat suoritettiin

in vitro

. Hsp-27 siRNA tai ohjata siRNA oli aluksi transfektoitiin HCT-8-miR-145 soluja. Vähentäminen proteiinin ilmentymisen Hsp-27 ollessa vahvistettiin western blottauksella (Fig. 5A). Solumigraation Sitten havaittiin käyttämällä haavan paranemista määritystä (kuvio. 5B). Nämä tulokset osoittivat, että liikkuvuus HCT-8-miR-145-solut, jotka on transfektoitu Hsp-27 siRNA oli huomattavasti hitaampaa kuin transfektoitujen solujen ohjaus siRNA. Samanlainen tulos saatiin myös solun invaasiomääritys. Transwell-Matrigel levinneisyys määritys kokeet suoritettiin HCT-8-miR-145-solut, jotka on transfektoitu Hsp-27 siRNA tai ohjaus siRNA. Verrattuna kontrolliin, kaataa Hsp-27 esti hyökkäyksen kykyä HCT-8-miR-145-solut (Fig. 5C). Muut kolme erilaista siRNA oligoja Hsp-27 pystyivät kerrata samanlaisia ​​fenotyyppejä (Fig. S4 File S1). Nämä tulokset ilmenevät että Hsp-27 oli tärkeä alavirran sovittelija aikana prometastasis liittyvät miR-145.

(A) HCT-8-mir-145 (mir-145) tai HCT-8-NC (NC ) solut transfektoitiin Hsp-27 siRNA (mir-145 + si-HSP27) tai negatiivinen kontrolli siRNA (mir-145 + mock). Ekspression Hsp-27-proteiini havaittiin Western blot-määrityksellä. (B) Haavan paranemista määrityksessä arvioimaan vaikutusta Hsp-27 siRNA HCT-8-miR-145-soluja. (C) knockdovvn Hsp-27 siRNA HCT-8-miR-145 soluissa esti merkittävästi solujen invaasiota. Kuvat edustivat vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Keskimäärin hyökkäystä solujen määrä per kenttä vähintään kolmen itsenäisen kokeen ± SD näkyy sarakkeessa luku. **

P

0,01.

Keskustelu

Etäpesäke on keskeinen tunnusmerkki malignance. Vaikka on olemassa monia raportteja ilmentymisen miR 145 syövissä, raportissa toiminnan miR 145 on etäpesäkkeitä kehittämisessä CRC on harvoin muutaman. Nykyisissä tutkimuksessa selvitimme ilmaus miR 145 ensisijainen syöpäkudoksessa CRC potilaalla ei imusolmuke etäpesäke. MIR-145 tunnistettiin olevan ali-ilmentynyt CRC yksilöiden tai ilman imusolmuke etäpesäke verrattuna viereisten normaaleissa kudoksissa vastaavasti, mikä on aikaisempien raporttien kanssa yhtäpitävä muiden [14] – [16]. Ilmaisulla Mir-145 näytetään dramaattinen ylössäätöä CRC kanssa imusolmuke etäpesäke, joka oli pois odotuksiamme. Koska tietomme, ilmaisu suuntaus kasvaimeen liittyvien geenien yleensä siirtyä kohti yhteen suuntaan pitkin kehitystä kasvain. Vahvista tulos meidän aluksi, tarkka ilmaus miR 145 ensisijainen CRC kudoksen 103 potilaasta, joilla imusolmuke etäpesäke ja 99 potilasta ilman imusolmuke etäpesäke määritettiin käyttäen qRT-PCR. Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena ja normalisoitu vastaan ​​endogeeninen kontrolli U6. Tiukat Kalibrointistandardeihin ja suuri määrä kasvain yksilöihin, joita käytetään tässä tutkimuksessa varmistetaan uskottavuutta tuloksia. Löysimme merkitsevää eroa vertailussa miR 145 ilmentymisen tason viereisissä normaaleissa kudoksissa välillä CRC tai ilman imusolmuke etäpesäke. Kuitenkin selkeä assosiaatio miR-145 ilmaisun ja imusuonten etäpesäkkeitä havaittiin. Näissä CRC potilaan näytteitä, miR-145 osoitti merkittäviä korkeampi ilmentyminen syövän kanssa imusolmuke etäpesäke kuin ilman imusolmuke etäpesäke, joka entisestään vahvistaneet array tuloksen. Lisäksi, kuten me analysoitua tietoa useiden muiden miRNA, myös havaittu vastaava ilmaisu profiilia laskua, palauttaminen, mutta ei enempää alassäätöä yhdessä kehittämiseen CRC (julkaisemattomia tuloksia). Nämä havainnot muiden CRC liittyvien miRNA vahvisti tarkkuutta tulostamme, joka ehdotti, että yksi miRNA ehkä näyttää eri mentymisprofiili eri vaiheissa syöpä. Sitä paitsi vaiheessa ero, ilmentyminen miR-145 näyttää olevan riippuvainen siitä, minkä tyyppistä kudosta. Esimerkiksi Sachdeva et al havaitsivat, että alas-säätely miR 145 oli huomattavampi CRC kuin rintasyövän [17]. Kaikki nämä havainnot osoittivat, että jotkut miRNA voidaan moniajo vuorovaikutuksessa eri kohdegeenien eri soluissa ja kudoksissa [18].

tutkimiseksi suhdetta säätely ylöspäin miR 145 metastasiaa kolorektaalisyövän, miR-145 voitto-of-function tutkimukset suoritettiin ihmisen CRC-soluissa käyttäen lentiviruksen järjestelmää. Tuloksemme osoittivat, että säätely ylöspäin miR 145 voisi edistää CRC muuttoliikettä ja invaasiota

in vitro

ja

in vivo,

taas mitään vaikutusta solujen kasvuun havaittiin. Nämä tiedot olivat ristiriidassa joidenkin muiden raporttien, jotka osoittivat anti-onkogeenisiä roolia miR 145 on etäpesäkkeitä. Kuitenkin tiedot on johdettu näistä havainnoista olivat joko kudosten kuin paksusuolen [17], [19] – [20]. Arndt ym raportoitu onkogeenisessä rooli miR-145 CRC, joka on hyvä kanssa tuloksemme [21]. Nämä löydöt vahvistivat lisäksi, että toimintaa miR 145 syöpään liittyvät kehitys on kudostyypin erityinen.

Tämä tutkimus tarjoaa ensimmäisen todisteita siitä, että miR 145 toimii ensisijaisesti prometastatic miRNA kehittyneissä CRC. On yleisesti, että yksittäisellä erityisellä miRNA voi säädellä useita kohdegeenien, mikä viittaa siihen, että yksittäinen miRNA voi suorittaa erilaisia ​​toimintoja kohdistamalla eri geenien solujen eri yhteyksissä [22]. Varhaisessa vaiheessa CRC, miR 145 säätyy alas, mikä osoittaa sen tavoitteen liittyen solujen lisääntymistä. Tällä pitkälle, korkea ilmentyminen miR 145 voivan olla tavoitearvot, etäpesäke. MiR-17-5p, hyvin tutkittu miRNA, voitaisiin kohdistaa pro- ja antiproliferatiivisia geenejä ja toimia sekä onkogeeni ja tuumorisuppressorina eri syöpiä [13], [23] – [24]. MiR-143, toinen syöpään liittyvä miRNA, sen ilme on aina yhdenmukainen miR-145 (emme koe sen koeskspressio miR 145 tutkimuksessamme), osoitti monitoimilaite syövän etäpesäkkeiden [25]. Yhdessä nämä havainnot tukevat hypoteesia, että miR-145 voi olla monimutkainen tehtävä kehittämisessä CRC.

Jotta paljastaa mahdollinen efek- osallistuvien geenien tämän toiminnon, tunnistimme solun proteiinien, jotka olivat suoraan tai välillisesti säätelee miR-145 käyttämällä iTRAQ merkintöjä ja 2DLC-ESI-MS /MS. Meidän analyysit osoittivat, että Hsp-27 oli säädellään ylöspäin miR 145 yliekspressoitu CRC soluja. Lämpöshokkiproteiini 27 (Hsp-27), tärkeä jäsen pienen Hsp perhe, ilmentyy kaikkialla erilaisissa solutyypeissä ja mukana soluvasteita erilaisiin rasitukset kuten lämpö shokki, hypertoninen stressi, oksidatiivisen stressin [26] – [27]. Korkea Hsp-27 on havaittu olevan yhteydessä etäpesäkkeitä useita kasvaintyypeissä, kuten CRC, eturauhassyövän, mahasyövän, hepatosellulaarinen syöpä, pään ja kaulan okasolusyöpä [28] – [30]. Erityisesti, on näytetty toteen, että lisääntynyt ekspressiotaso Hsp-27 CRC liittyi imusolmukkeen etäpesäke [31] – [32]. Tuloksemme osoittivat, että oli voimakas positiivinen korrelaatio Hsp-27-proteiinin ja miR-145 ilmentymisen ensisijainen ihmisen kudosnäytteitä, mikä osoitti, että miR-145 oli mukana, ainakin osittain, jopa säätelevä Hsp-27-proteiinin ilmentymistä .

knockdovvn Hsp-27 geeniekspressiota siRNA havaittiin käänteinen miR 145 välittämä induktio CRC soluvaelluksen tutkimuksessamme. Rooli miR 145 ylläpito korkean Hsp-27 ei ollut suoran geenikohdistus mutta vakauttaminen Hsp-27. Vaikka rooli ja kliininen tulos Hsp-27 primaarikasvainten on hyvin tutkittu ja dokumentoitu [33], sen tehtävä etäpesäkkeiden invaasio on vielä epäselvä. Lisätutkimukset tunnistaa mekanismia Hsp-27 mukana CRC etäpesäkkeitä lisäävät entisestään ymmärrystämme ylös-säätely miR-145 CRC.

Yhteenvetona, nykyinen tutkimus osoitti, että säätely ylöspäin miR -145 osaltaan imusolmuke etäpesäke CRC. Mekanismia panos liittyy vakauttaminen Hsp-27, proteiini, joka on tärkeä rooli edistämisessä etäpesäke. Tulevasta suunnasta arvioinnin miR 145 tulisi keskittyä mekanismi tutkimuksen, joka voisi johtaa sen soveltamista etäpesäkkeiden diagnostiikassa ja hoidossa CRC.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset näytteet

kudoksen analysoidut näytteet tässä tutkimuksessa saatiin 202 potilasta (117 miestä ja 85 naista), joille tehdään kirurginen resektio CRC Cancer Hospital, Kiina Academy of Medical Sciences, Peking, Kiina. Näytteet käytettiin kirjallisen tietoon perustuva suostumus potilailta ja suostumuksella Kiinan Academy of Medical Sciences Cancer Hospital. Kukaan potilaista ei saanut kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen kirurgista resektiota. Koko näytettä noudattaa tavanomaista jakautumista kliinis ominaisuuksien CRC potilaista. Resektoitiin näytteet histologisesti tutkittiin hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäystä. Primaarikasvaimen kudokset ja vastaavat viereisen ei-kasvaimen kudokset kerättiin välittömästi talteen kirurgisen poiston jälkeen ja pikajäädytettiin nestetypessä myöhempää käyttöä varten. Jaoimme tämä potilas kohortissa kahteen ryhmään. Ne, joilla on vahvistettu LNM oli kutsua kuin imusolmuke positiivinen (LNP) ryhmä ja ilman havaittavaa LNM olivat kutsutaan imusolmuke negatiivinen (LNN) ryhmä. Kaikki tapaukset olivat tarkastettu ja hyväksytty kaksi kokenutta patologia. Kliininen ominaisuudet Näistä näytteistä esitetään taulukossa 1.

Soluviljely

Ihmisen CRC solulinja HCT-8 ostettiin Institute of Basic Medical Sciences Kiinan Academy of Medical Sciences ”soluviljelmässä keskus (Peking, Kiina). Soluja kasvatettiin RPMI 1640: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco, CA), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa ja täydennetty 5% CO

2: ssa kosteassa kammiossa.

mikrosiruanalyysi

Kahdeksan ensisijainen peräsuolen syövän kudoksia johdettu vaiheen II-III peräsuolen syövän potilaiden kanssa (n = 4) tai ilman sitä (n = 4), imusolmuke etäpesäke kerättiin ja ilmaisu profiilit miRNA määritettiin käyttäen Agilent miRNA microarray. Lyhyesti, kokonais-RNA uutettiin tuumorinäytteistä käyttämällä Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion Inc., TX, USA). Laatu ja määrä RNA-näytteet arvioitiin 2100 Bioanalyzer käyttäen RNA 6000 Pico LabChip Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Microarray sisältää koettimia 851 ihmisen miRNA päässä Sanger tietokannasta v.12.0. Microarray kokeet suoritettiin ShanghaiBio Corporation käyttäen Agilent miRNA leimausreagenssista ja hybridisaatio Kits, Agilent ihmisen miRNA array (V2) ja Agilent mikrosirujen skanneri. Kaikki alkuperäiset microarray data talletetaan NCBI GEO tietokannan [GSE48074].

RNA ja reaaliaikainen kvantitatiivinen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio

miRNA puhdistettiin viljellyistä soluista tai kudoksista käyttäen Qiagen miRNeasy Mini Kit. Käänteistranskriptiotuotteiden suoritettiin käyttäen MiScript Reverse Transcription Kit (Qiagen, Saksa).. MiScript SYBR Green PCR Kit yhdistettynä miRNA alukkeilla (mir-29b-1 * luett MS00009289, mir-95 luett MS00010906, mir-100 luett MS00003388, mir-125b luett MS00006629, mir-152 luett MS00003591, mir-376c luett MS00004046, mir-199B luett MS00003731, mir-145 luett MS00003528, mir-99a luett MS00003374, mir-1274a luett MS00014420, mir-99b luett MS00032165, Qiagen, Saksa.) käytettiin havaita kypsä miRNA LightCycler 480 (Roche, Basel, Sveitsi). Suhteellinen ekspressio miRNA verrattuna U6 (cat. No. MS00033740, Qiagen, Saksa.) Laskettiin käyttäen -ΔCt menetelmää. Kaikki qRT-PCR-reaktiot suoritettiin kolminkertaisina.

Generation of lentivirus saavuttaa vahvistusta miR 145 toiminto

Lentivirusvektorikonstruktit pGCsil-GFP Vector käytettiin kuljettaa ihmisen pre-miR-145 (miR -145) tai funktionaalinen kontrolli (NC). Lentivirusvektori rakentaminen ja tuotannon korkean tiitterin lentiviraalinen hiukkasia tehtiin Genechem biologian yritys. Luotu lentivirukset käytettiin infektoimaan HCT-8 24-48 tuntia 1-5 MOI, ja ekspressiotasot miR-145 määritettiin qRT-PCR-määrityksissä. Tartunnan populaatiot jolla välillä 70-90% vihreitä fluoresoivia soluja käytettiin myöhempää kokeilua.

Proliferaatiomääritys

Soluja kasvatettiin RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia. 1 x 10

3-solut ympättiin tasapohjaisille 96 kuopan levyille ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO2. Solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttämällä Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories) at day1, Day3 ja day5. Solusyklin analyysi, solut pestiin ja kiinnitettiin jääkylmällä 75% (v /v) etanolia -20 ° C: ssa 2 tuntia, sitten värjättiin PI pitoisuudessa 50 ug /ml, kun läsnä on RNaasi A ( 100 ug /ml). DNA-pitoisuus analysoitiin virtaussytometrialla analyysi (Beckman Coulter, USA).

Cell muuttoliike /invaasion määritykset

soluliikkuvuus ja invasiivisuus määritettiin 24 hyvin transwell levyn (8 uM huokoskoko; Costar), kuten aiemmin on kuvattu.

10 Lyhyesti, sillä siirtokuoppaan muuttoliike määrityksissä, 1 x 10

4 solut saattaa alkuun kammio vuorattu noncoated kalvo. Sillä invaasio määrityksiä, 3 x 10

4 Solut sijoitettiin ylempään kammioon kunkin insertin päällystetty 200 mg /ml matrigeelin (BD Biosciences, CA, USA).

In vivo

etäpesäkkeiden määrityksissä

in vivo

etäpesäkkeiden määrityksiä, 5 x 10

4 HCT-8-miR-145-soluja tai HCT-8-NC-soluja injektoitiin maksan nude-hiiriin sen jälkeen haavanompeluaineet (kolme kussakin ryhmässä, naispuolinen nu /nu). 2 viikon kuluttua hiiret tapettiin, niiden maksat leikattiin, ja suoliliepeen imusolmukkeiden etäispesäkkeitä laskettiin. Nude-hiiret hankittiin Vital River (Peking, Kiina) ja kasvatettu tietyllä taudinaiheuttajista vapaa (SPF) eläinlaboratoriossa.