Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tausta ja tavoite

Kyllä liittyvä proteiini (YAP) ja transkription koaktivaattoria kanssa PDZ sitova motiivi (TAZ) ovat ydin- efektoreita Hippo reitin. Vaikka ne ovat runsaasti ilmaistu sytoplasmassa ja ytimet paksu- ja peräsuolisyövän (CRC), ja jotka liittyvät kasvaimen leviämisen tila, on ollut vähän tutkimuksia ennakoivan roolin YAP ja TAZ ilme eloonjäämisaste potilaiden CRC. Tässä tutkimuksessa tutkittiin YAP ja TAZ ilmaisun sekä CRC potilaiden ja koolonsyöpäsolulinjaa, ja arvioitu niiden ennusteen arvioinnissa.

Methods

parafinoidut näytteitä 168 sopivaa potilasta tutkittaessa käytettiin YAP ja TAZ ilme immunohistokemiallisesti, ja verrattiin koetuloksiin paksusuolen syövän HCT116 solulinja tutkia niiden kliinistä merkitystä CRC.

tulokset

Tilastollisesti merkittäviä positiivisia korrelaatioita välillä ei havaittu proteiinin ilmentymistä YAP ja TAZ CRC kudoksissa. Potilaat, joilla on korkeampi YAP tai TAZ ilme osoitti suuntaus lyhyempiä eloonjäämisajan; mikä tärkeintä, meidän kohortti tutkimus osoitti, että potilailla, joilla on sekä YAP ja TAZ yli-ilmentyminen esitteli pahin tuloksia. Tätä tukivat monimuuttujamenetelmin. Vuonna HCT116 paksusuolen syöpäsoluja, kyky leviämisen, metastaasin ja invaasion dramaattisesti vähentää knockdovvn YAP ja TAZ ilmaisuja siRNA.

Johtopäätökset

Co-yliekspressio YAP ja TAZ on itsenäinen ennustaja ennuste potilaille, joilla on CRC, ja voi selittää korkeamman leviämisen, etäpesäke, ja huono selviytyminen tulos näistä potilaista.

Citation: Wang L, Shi S, Guo Z, Zhang X, Han S, Yang, et ai. (2013) yli-ilmentyminen YAP ja TAZ on itsenäinen ennustaja ennusteen peräsuolen syövän ja Related leviämisen ja metastaasin koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 8 (6): e65539. doi: 10,1371 /journal.pone.0065539

Editor: Wanjin Hong, Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

vastaanotettu 4 helmikuuta 2013 Hyväksytty: 25 huhtikuu 2013; Julkaistu: 10 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 81072117). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Hippo reitti on tärkeä säätelijä solujen kasvua, lisääntymistä ja apoptoosia. Se havaittiin ensimmäisen geneettinen mosaiikki näytöt

banaanikärpänen

[1], [2]; kuitenkin, on olemassa kasvava määrä todisteita, jotka osoittavat Hippo polku rajoittaa myös urut koko nisäkässysteemeissä [3], [4] estämällä solujen lisääntymisen ja apoptoosin edistämiseksi. Komponentit tämän reitin ovat erittäin konservoituneita nisäkkäillä, ja sisältävät Mst1 /2; WW45; Lats1 /2; Mob1; YAP; TAZ; NF; FRMD6; ja Fat4 [2]. Mst1 /2 ja Last1 /2 ovat kinaasien, ja WW45 ja Mob1 toimivat adapterit /aktivaattoreina nisäkkäillä, yhdessä nämä muodostavat ytimen kinaasi kasetti on Hippo reitin. Yki homologit: Kyllä liittyvä proteiini (YAP) ja sen paralogi, transkription koaktivaattori kanssa PDZ sitova motiivi (TAZ), ovat periaatteessa tavoitteet ytimen Hippo kinaasikaskadin, ja pidetään ydin- efektoreina Hippo reitin [5].

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että poikkeava muuttaminen avaintekijät Hippo polku johtaa hallitsemattomaan solujen kasvua, ja liittyy syövän kehitykseen [6], [7]. Tämä merkitsee sitä, että Hippo polku on kriittinen rooli tukahduttamaan kasvaimen kasvua [8]. Poikkeava aktivaatio YAP on yhteydessä huonoon ennusteeseen useita ihmisen syövistä [5], [9] – [11], myös maksasoluihin, munasarja-, ja pahanlaatuinen mesoteliooma, ja voi toimia onkogeenin rintasyövän [15]. Sellaisenaan, YAP on ehdotettu ehdokkaaksi onkogeeni. Lisäksi yli-ilmentyminen YAP havaittiin parantaa maksan koon ja lopulta johtaa kasvainten kehittymistä ehdollinen siirtogeenisiä hiiriä mallit [5], [12], [13]. Lisätutkimukset ovat osoittaneet, että TAZ, ja TAZ riippuva eritys amfireguliini (AREG), on myös merkittävä rooli rinta kasvainten synnyssä ja etäpesäkkeiden: kun yliekspressoidaan TAZ on tippuu alas ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), sen leviämisen ja onkogeeniset ominaisuudet tukahdutetaan [16].

Vaikka sekä YAP ja TAZ on osoitettu olevan osallisena etenemistä syöpien peräisin eri kudoksista, on tarpeen tutkia kudosspesifisen rooli YAP ja TAZ ilmaisun jotta roolin tutkimiseksi YAP ja TAZ ihmisen peräsuolen syöpä (CRC) ja edelleen ymmärtää funktio Hippo reitin. Äskettäin julkaistut tiedot viittaavat siihen, että yli-ilmentynyt YAP voivat vuorovaikutus β-kateniinin ajaa leviämisen koolonkarsinoomasoluissa, mikä tarkoittaa, että YAP voisi olla rooli syövän hoidossa [17]; kuitenkin tietojemme mukaan tutkimuksen kliininen merkitys YAP ja TAZ, ja ennusteen arvioinnissa on YAP ja TAZ, on rajoitettu, ja merkitys YAP ja TAZ co-yliekspressio CRC, edelleen heikko.

tässä tutkimuksessa tutkimme ennusteen arvioinnissa sekä YAP ja TAZ on retrospektiivinen kohorttitutkimus on viiden vuoden seurannassa, määrittää itsenäisen ennakoivaa roolia YAP ja TAZ potilailla, joilla on CRC. Olemme tunnistaneet synergia näiden kahden proteiinin ja mahdollinen mekanismi, jolla Hippo koulutusjakson moduloi ihmisen CRC etenemistä.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja seuranta

Tutkimus hyväksyttiin eettisen komitean neljännen Military Medical University (FMMU, Xi’an, Kiina), ja kaikki osallistuvat potilaat antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksensa. Retrospektiivinen ryhmä koostui 168 potilasta diagnosoitu mahdollisesti kokoisen CRC välillä helmikuussa 2006 ja joulukuuta 2007 Department of ruuansulatuskanavan leikkauksen of Xijing Hospital, FMMU. Potilaat, joilla on seuraavat kriteerit poissuljettiin: saaneensa adjuvanttihoitoa ennen leikkausta; oli diagnosoitu ruuansulatuskanavan stroomakasvain tai lymfooma; oli ylimääräistä syövät diagnoosit; tai evätä suostumus. Kaikki kliiniset näytteet noudetaan kudoksesta arkistosta Patologian osasto, Xijing sairaala, FMMU. Seuranta on päivitetty kolmen kuukauden välein, alkaen kaikki osallistujat, puhelimitse. Kokonaiselossaoloaika määriteltiin kulunut aika leikkauksen aikana potilaan kuolemaan. Potilaan kuolema perustettiin heidän perheensä.

immunohistokemia ja Scoring

Parafiini upotettujen leikkeiden normaalien ja kasvaimen kudokset värjättiin YAP (H-125: sc-15407; Santa Cruz Biotechnology, USA ) ja TAZ (NP_056287: ab118373; Abcam, UK) ilme. Koska vasta-aine YAP käytettiin tässä tutkimuksessa on polyklonaalinen vasta-aine, käytimme Western blotting tunnistaa vasta-aineen spesifisyys YAP (kuvio S1). Immunohistokemiallinen (IHC) ja YAP ja TAZ tehtiin aikaisemmin kuvatulla [7] pienin muutoksin. Lyhyesti, diat poistettiin parafiini ksyleenillä, ja nesteytyksestä kautta porrastettu alkoholi-sarjassa ennen endogeenisen peroksidaasin blokattiin 3% H

2O

2 metanolissa. Blokkauksen jälkeen vastaan ​​epäspesifinen sitoutuminen proteiineihin, näytteitä inkuboitiin yön yli YAP tai TAZ primaarisilla vasta-aineilla, laimennettiin suositeltu pitoisuudet (1:500), kosteaan tilaan 4 ° C: ssa. Näytteet pestiin kolme kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ennen biotinyloidun sekundaarisen vasta-ainetta 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Visualisointi tehtiin käyttämällä 3,3 ’Diaminobenzidine (DAB) kromogeenilla 2-3 min. Negatiiviset kontrollit valmistettiin korvaamalla primäärinen vasta-aine kanin esi seerumia. YAP ja TAZ värjäys pisteytettiin kaksi riippumatonta patologia, sokaissut kliinisen potilaiden ominaisuuksiin. Pisteytysjärjestelmään palkkaluokkaan ilmaus YAP ja TAZ on kuvattu taulukossa 1.

Cell Culture

Seuraavat ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa: HCT116, LS174T, LOVO, SW480 , ja SW480 käytettiin tässä tutkimuksessa. Kaikki solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC). HCT116 ja LOVO-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM; Invitrogen, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, HyClone); SW480 ja LS174T-soluja viljeltiin RPMI1640 (Invitrogen, CA, USA), jota oli täydennetty 10% FBS: ää; SW620-soluja viljeltiin Leibovitzin L-15 (Invitrogen, CA, USA), väliaine, jossa oli 10% FBS: ää. Kaikki solut viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2.

Transfektio ja geenien

pieni häiritsevä RNA (siRNA) transfektion jälkeen, siRNA duplexes syntetisoitiin (Genepharma, Shanghai, Kiina): (5′-GGUGAUACUAUCAACCAAATT-3 ’), joiden tavoitteena on YAP geeni; (5’-GGAUACAGGAGAAAACGCATT-3 ’), joiden tavoitteena on TAZ-geenin; ja negatiivinen kontrolli duplex, (5’-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3 ’). Nämä siRNA-dupleksit (100 nmol /L) transfektoitiin HCT116-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. HCT116-solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja geenin tai proteiinin analyysiin.

Quantitative Reaaliaikainen Reverse-transkriptaasia Polymerase Chain Reaction

Kokonais-RNA uutettiin solulinjoista käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen) , ja myöhemmin synteesi syklisten DNA (cDNA; TaKaRa, Japani), tehtiin mukaan valmistajan protokollia. Reaaliaikainen kvantitatiivinen käänteisen transkription polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) suoritettiin käyttäen CFX96TM Real-Time PCR -järjestelmää (Bio-Rad, CA, USA) kanssa SYBR Green II -kittiä (# DRR041A; TaKaRa, Japani) mukaan valmistajan ”ohjeet. QRT-PCR-analyysi suoritettiin kokonaistilavuudessa 20 ui seuraavat vahvistus vaiheet: ensimmäinen denaturaatiovaiheen 95 ° C: ssa 10 min; jota seurasi 40 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 15 s; ja sitten venymä 55 ° C: ssa 30 s. Lausekkeet normalisoitiin ihmisen β-aktiini-geenin. Seuraavat alukesekvenssit käytettiin: 5′-ACCCACAGCTCAGCATCTTCG-3 ’(sense) ja 5′-TGGCTTGTTCCCATCCATCAG-3′ (antisense) ja YAP; 5’-GTCACCAACAGTAGCTCAGATC-3 ’(sense) ja 5′-AGTGATTACAGCCAGGTTAGAAAG-3′ (antisense) ja TAZ; 5’-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3 ’(sense) ja 5′-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3’ (antisense) ja β-aktiini.

Western blot -analyysi

Solut kerättiin radioimmunosaostuskokeella puskurissa (Santa Cruz Biotechnology). Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Millipore, MA, USA). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa PBS-puskurissa 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ennen kuin kohdistetaan nteen seuraavat mukaisia ​​vasta-aineita valmistajan ohjeiden: anti-Yap (1:500); anti-TAZ (1:500); ja anti-aktiini (1:5,000, AC40: A4700, Sigma-Aldrich, USA). Membraanit inkuboitiin niihin liittyvien piparjuuriperoksidaasi-konjugoitu (HPC) sekundääriset vasta-aineet, ja vasta-aine-sitoutuneet proteiinit visualisoitiin kemiluminesenssin (New England Nuclear, MA, USA).

Cell Growth määritys (MTT)

Solujen lisääntyminen

in vitro

analysoitiin tetratsoliumsuolaa 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT); koska keltainen MTT väriaine pelkistyy sininen formatsaani hengitysteiden entsyymejä, jotka toimivat ainoastaan ​​eläviä soluja, aste värin muutos on osoitus solujen lisääntymisen. HCT116-solut transfektoitiin 48 h ilman siRNA (vanhempien); erityiset siRNA (si-Con, si-YAP tai si-TAZ); tai ko-transfektoitiin si-YAP ja si-TAZ (si-YAP-TAZ), ja suspendoitiin DMEM, jossa oli 10% FBS: ää. Lyhyesti, 2000 soluja kustakin kloonista (emo, si-Con, si-YAP, si-TAZ, ja si-YAP-TAZ) maljattiin viiden 96-kuoppaisille levyille 200 ul: aan DMEM-elatusainetta. Analysointia varten: 20 ui MTT: n substraattia (alkaen 2,5 mg /ml kantaliuosta PBS: ssä) lisättiin kuhunkin kuoppaan; levyt palautettiin inkubaattoriin vielä 4 tuntia 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2; väliaine poistettiin; solut liuotettiin 150 ui dimetyylisulfoksidiin; ja kolorimetrinen analyysi suoritettiin (aallonpituus 490 nm). Yksi levy analysoitiin heti solujen kiinnittynyt (noin 4 h kuluttua pinnoitus), ja jäljellä olevat levyt testattiin seuraavien neljän peräkkäisen päivän ajan.

Virtaussytometrinen analyysi apoptoottisten solujen

HCT116-soluja transfektoitiin 48 tuntia ilman siRNA (vanhempien); erityiset siRNA (si-Con, si-YAP tai si-TAZ); tai ko-transfektoitiin si-YAP ja si-TAZ (si-YAP-TAZ), ennen kuin ne suspendoitiin PBS: ään tiheydellä 1 x 10

6 solua /ml. Apoptoottiset solut analysoitiin virtaussytometrialla käyttäen CYTOMICS FC 500 virtaussytometrillä (Beckman Coulter), inkuboinnin jälkeen solut sisältävän reagenssin anneksiini V-FITC: llä ja propidiumjodidia (BD Bioscience, CA, USA) 15 minuutin ajan pimeässä huoneenlämpötilassa .

Analyysi invasiivisuus ja liikkuvuus (Migration and Invasion analyysit) B

Solun invaasio ja muuttoliike potentiaalit mitattiin

in vitro

mukaan TranswellTM määritykset (Millipore, Billerica, MA) kuten seuraavasti: HCT116-solut transfektoitiin 48 tuntia ilman siRNA (vanhempien); erityiset siRNA (si-Con, si-YAP tai si-TAZ); tai ko-transfektoitiin si-YAP ja si-TAZ (si-YAP-TAZ); solut suspendoitiin DMEM, jossa on 10 g /l BSA: ta, jonka tiheys on 50 solua /ul; 200 ui solususpensiot ympättiin ylempään kammiot siirtoaltaat, jossa huokoinen kalvo oli joko päällystetty matrigeelin (BD Bioscience) hyökkäykselle määrityksiä, tai vasemmalle päällystämättömiä siirtymiselle määrityksissä. DMEM, jossa 10% seerumia (500 pl) lisättiin alaosaan kuin kemoattraktantti. Siirron jälkeen 24 tuntia, tai invaasio 48 tuntia, solut, jotka oli tunkeutunut suodattimet fiksattiin metanolilla ja värjättiin 4 g /l kristalliviolettia. Lukumäärät siirtynyt ja invasiivisia soluja määritettiin viiden satunnaisen kentiltä Olympus mikroskoopilla (Olympus) at x 10 suurennus.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi tehtiin käyttämällä IBM SPSS tilasto-ohjelmalla (versio 20.0). Spearmanin rank testillä arvioida korrelaatio YAP ja TAZ ilmaisuja; selviytyminen käyrät arvioitiin käyttäen Kalplan-Meier menetelmä; ja jakaumat arvioitiin pitkän rank testi. Coxin suhteellisten riskien mallintaminen tekijöiden mahdollisesti liittyvien selviytymisen tehtiin laskea hazard ratio (HR), ja mitkä tekijät voivat olla merkittävä vaikutus eloonjäämiseen. Erot ominaisuuksiin ryhmien välillä tutkittiin Pearsonin chi-neliö (χ

2) testi ja Fisherin testiä. Kaikki

P

arvot määritettiin 2-tailed testejä ja erot

P

-arvo 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

kliininen merkitys YAP ja TAZ yliekspressio kolorektaalisyövässä Tissue

Voit selvittää esiintyvyys ja kliinistä merkitystä YAP ja TAZ CRC, arvioimme ilmaus YAP ja TAZ proteiinin IHC kasvainkudoksessa näytteitä meidän retrospektiivinen kohortti 168 CRC potilaista jälkeen kasvaimen resektiota. Niistä 168 potilasta, 122 (72,6%) olivat positiivisia YAP ilmaisua, joko ydin- tai sytoplasmista (kuvio 1A); kun taas 46 (27,4%) olivat negatiivisia YAP ilmaisu (kuvio 1 B); 97 (57,8%) näytteistä oli positiivisia TAZ ilmaisu; ja 71 (42,2%) olivat negatiivisia TAZ ilmaisun (kuviot 1E ja F, tässä järjestyksessä). Sitä vastoin vain 3 (18,75%) ja 2 (12,5%) kaikista 16 viereisen normaalin kudoksen näytteen havaittiin positiiviseksi YAP ja TAZ ilme, vastaavasti (kuviot 1C, D, G ja H). Lisäksi oli merkittävä positiivinen korrelaatio YAP ja TAZ (r = 0,630,

P

0,001; taulukko S1), mikä viittaa mahdolliseen korrelaatio näiden proteiinien CRC.

( A) YAP-positiivinen kasvain; (B) YAP-negatiivinen kasvain; (C) YAP-positiivinen normaali kudos; (D) YAP-negatiivinen normaali kudos; (E) TAZ-positiivinen kasvain; (F) TAZ-negatiivinen kasvain; (G) TAZ-positiivinen normaali kudos; (H) TAZ-negatiivinen normaalia kudosta. Kuvat ovat otettu mikroskoopilla (x10). Nämä tulokset osoittavat kliinistä merkitystä YAP ja TAZ yli-ilmentyminen CRC kudoksessa.

Näiden havaintojen, arvioimme suhdetta YAP ja TAZ ilmaisun ja kliiniset piirteet CRC potilaiden Pearson’in -square testi tai Fisherin testiä. Tuloksemme osoittivat, että ilmentyminen YAP ja TAZ liittyi merkittävästi imusolmuke aseman Kolorektaalituumorien (

P

= 0,001 ja

P

= 0,013, vastaavasti), mutta eivät merkittävästi korreloi sukupuoli, kasvaimen sijainnista, kasvaimen koko, solujen erilaistumiseen tai TNM (taulukko 2). Korkea prognostisia vaikutus imusolmukemetastaaseja, ja kokonaismäärä imusolmukkeiden voidaan resektoitiin, on vakiintunut. Tuore tutkimus osoitti, että cut-off-arvot imusolmuke suhde (suhde kasvaimeen soluttautunut solmut resektoitiin imusolmukkeet) ovat vahvoja itsenäisiä ennustavat tekijät CRC potilaille, jotka perustuvat analyysit kliinisen ja histopatologiset tulokset 3026 potilasta, joiden yksi kirurginen keskus yli 25 vuoden aikana [18]. Nämä havainnot johtivat meidät tutkimaan asemaa YAP ja TAZ on ennustetta CRC potilaista.

YAP ja TAZ Co-yliekspressio liittyi Poor Overall Survival

Voit selvittää ennustetekijöiden merkitys YAP ja TAZ ilmaisun CRC potilailla, yritimme suhteuttaa YAP ja TAZ ilmentää kliinisiä tuloksia. Koko Keskimääräinen elinaika hoidettavien joukossa meidän retrospektiivinen kohortissa oli 43 kuukautta (vaihteluväli: 1-56 kuukautta), ja lopussa seuranta-aikana (60 kuukautta), 70 168 potilasta oli elossa, ja 98 potilasta olivat kuolleet. Yhdistyksen välinen YAP ja TAZ proteiinin ilmentymiseen ja eloonjäämisaste CRC potilaista tutkittiin käyttäen Kaplan-Meier-analyysi ja log-rank testi merkitys arvioita. Potilaat jaettiin kahteen ryhmään: ne, joilla on positiivinen ilmaus YAP tai TAZ, ja ne, joilla negatiivinen ilmaus YAP tai TAZ. Tilastollisesti merkittävä ero välillä havaittiin yleistä eloonjäämistä kahteen ryhmään (long-rank-testi:

P

0,02 ja

P

0,001, tässä järjestyksessä). Potilaat, joilla on korkeampi ilmauksia YAP tai TAZ yleensä on suurempi riski kuolla kuin potilailla, joilla on alhaisempi ilmauksia YAP tai TAZ, jossa oikaisematon HR ollessa 1,617 ja 1,643, vastaavasti. Lisäksi, solujen erilaistumista, imusolmuke etäpesäke, ja TNM-luokitus havaittiin liittyvän ennusteen CRC potilaille (taulukko 3). Monimuuttuja-analyysi osoitti, että suuremmat ilmentymistä YAP tai TAZ liittyi vähentäminen kokonaiselinaika, säädetyllä HR oli 2,168 (95% CI: 1,125-4,179;

P

0,001) ja 1,544 (95% CI: 0,999-2,451;

P

= 0,05), vastaavasti, mikä osoittaa, että ilmentymisen YAP tai TAZ voi olla ennustetekijä riippumaton näistä säädettiin ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia (taulukko 3).

tutkimme seuraavaksi co-yliekspressio YAP ja TAZ voisi olla ennustetyövälineenä rooli CRC. Meidän kohortti potilaat jaettiin neljään ryhmään niiden yhteenlaskettu ekspressiotasoja YAP ja TAZ. Tilastollisesti merkittävä ero havaittiin kokonaiselossaoloaikaa tulokseen näiden neljän potilasalaryhmissä; ne, joilla on positiivinen yhteistyössä yliekspressio YAP ja TAZ oli huonoin kokonaiselinaika (kuva 2). Coxin suhteellisten riskien mallia, oikaistu sukupuolen, iän, kasvaimen koko, kasvain sijainti, erilaistumista tila, ja TNM verrattuna YAP tai TAZ lauseke, osoittivat, että negatiivinen ilmaus sekä YAP ja TAZ liittyi merkittävästi parantunut kokonaiselinaikaa; toteaa, ilmaus molempien YAP ja TAZ liittyi merkittävästi huono kokonaiselinaikaa (taulukko 3), jossa oikaistu HR oli 3,118 (95% CI: 1,017-9,559;

P

0,001). Nämä tiedot osoittivat, että YAP ja TAZ yhteistyössä yliekspressio voi olla erityinen ja itsenäinen prognostiset vaikutus keskuudessa CRC potilailla.

(A) korrelaatio YAP ilmaisun kanssa kokonaiselinaikaa; (B) korrelaatiota TAZ ilmaisun kanssa kokonaiselinaikaa; (C) korrelaatio yhdistetyn YAP ja TAZ ilmaisutapoja kokonaiselossaolo. Tilastollisesti merkittävä ero näkyy kokonaiselossaoloaikaa lopputulokseen eri potilasryhmille, joilla ne, joilla on positiivinen co-yliekspressio YAP ja TAZ joilla on huonoin kokonaiselinaika.

yli-ilmentyminen YAP ja TAZ in HCT116 koolonisyöpäsolulinja

jotta edelleen vaikutuksen tutkimiseksi YAP ja TAZ siitä etenemistä CRC testasimme alustavien kohorttitutkimuksen johtopäätökset solulinjakokeissa. Ensin tutkitaan geenin ja proteiinin ekspressiotasot YAP ja TAZ in HCT116, LS174T, LOVO, SW620 ja SW480 koolonsyöpäsolulinjaa. HCT116-solut osoittivat korkeimmat ekspressiotasot sekä YAP ja TAZ (kuviot 3A ja B); siksi HCT116 solulinja valittiin myöhemmin kokeita tutkia YAP ja TAZ CRC etenemiseen.

(A) QRT-PCR-analyysi YAP ja TAZ ilmaisuja; (B) Western blot-analyysi YAP ja TAZ ilmaisuja. β-aktiini käytetään sisäisenä latauskontrollina. HCT116-solut osoittavat korkeimmat ekspressiotasot sekä YAP ja TAZ.

vaikutus YAP tai TAZ siRNA on YAP tai TAZ Tasot Human HCT116 koolonsyöpäsolulinjaa

seuraavaksi tutkinut vaikutus YAP ja TAZ että HCT116-solulinjassa kautta knockdovvn YAP tai TAZ ilmaisu kohdennettuja siRNA. Spesifisyys siRNA kohdistamisen YAP ja TAZ varmistettiin Western blot -analyysillä. Verrattuna soluihin, jotka oli transfektoitu ohjaus siRNA: n ilmentyminen Luskuttaa ja TAZ voimakkaasti vaimennetaan HCT116-soluissa, jotka on transfektoitu 10 ug kohdennetun siRNA: iden (kuvio 4A ja kuvio S2).

(A) Western blot -analyysi solulinjojen kanssa alennettu YAP ja TAZ tasoilla transfektion jälkeen siRNA: vanhempien HCT116-solut kuljettavat no siRNA (vanhempien); ohjaus siRNA (si-Con); siRNA Yap (si-YAP); siRNA on TAZ (si-TAZ); ja kotransfektoitiin siRNA on YAP ja siRNA on TAZ (si-YAP-TAZ). (B) MTT solujen kasvua määrityksissä kontrollisolujen (vanhempien, si-Con); soluja, joilla on alentunut YAP tai TAZ lauseke (si-YAP, si-TAZ); tai soluja, joilla on alentunut YAP ja TAZ lauseke (si-YAP-TAZ). Tiedot esitetään keskiarvona ± SD, N = 3, *

P

0,05. (C) virtaussytometrinen analyysit värjättyjen solujen anneksiini-V-FITC: llä ja PI: kantavien solujen ei siRNA (vanhempien); ohjaus siRNA (si-Con); siRNA Yap (si-YAP); siRNA on TAZ (si-TAZ); ja soluja, joilla on alentunut YAP ja TAZ lauseke (si-YAP-TAZ). Nämä tulokset osoittavat, että YAP ilmaisu on suurempi vaikutus soluproliferaatioon ja tukahduttaminen apoptoosin verrattuna TAZ ilmaisu; kuitenkin synergistinen rooli välillä YAP ja TAZ lisää niiden yhteenlaskettu yksittäisten vaikutuksia.

vaikutus YAP ja TAZ Expression Cell Proliferation

MTT määrityksiä käytettiin määrittämään vaikutuksia vähennetään YAP ja TAZ ilme HCT116 paksusuolisyöpäsolulinjassa kasvu. Ryhmä transfektoitu YAP siRNA osoittivat merkittävää vähenemistä proliferaationopeus suhteessa ryhmään transfektoitu vanhempien tai ohjaus siRNA. Samanlainen suuntaus havaittiin TAZ siRNA; kuitenkin, vaikutus ei ollut yhtä voimakas. Ryhmä, joka oli kotransfektoitiin YAP ja TAZ siRNA osoitti dramaattisin, ja erittäin merkittävä (

P

0,05), laskun proliferaatiossa nopeudella verrattuna vanhempien tai valvoa siRNA ryhmät (kuva 4B); Siksi nämä tulokset osoittivat, että YAP ja TAZ hallussaan synergistinen rooli proliferaatioon koolonkarsinoomasoluissa.

vaikutus YAP ja TAZ Ilmaisu HCT116 Cells Apoptosis Ratio

Sitten tutkittiin eron apoptoosin suhde YAP ja /tai TAZ knockdown ryhmiä ja kontrolliryhmään vahvistaa meidän retrospektiivinen kohorttitutkimus tuloksia. Virtaussytometria-analyysi osoitti, että apoptoosin suhde aleni HCT116-soluissa, jotka on transfektoitu YAP siRNA verrattuna HCT116-soluja, jotka on transfektoitu vanhempien tai si-Con siRNA (17,48% vs. 1,62%,

P

0,05; 17,48% vs. 2,28%,

P

0,05, vastaavasti, kuvio 4C); vaikutus oli hieman heikompi HCT116 transfektoiduissa soluissa TAZ siRNA suhteessa niille transfektoitu vanhempien tai si-Con siRNA (6,48% vs.1.62%,

P

0,05; 6,48% vs. 2,28%,

P

0,05, vastaavasti, kuvio 4C); kuitenkin apoptoosin suhde eniten laski rajusti vuonna HCT116-soluissa kotransfektoitiin YAP ja TAZ siRNA verrattuna transfektoitu vanhempien ja si-Con (33.60% vs. 1,62%,

P

0,01; 33,60 % vs. 2,28%,

P

0,05, vastaavasti, kuvio 4C). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että YAP ilme oli merkittävä rooli edistettäessä solujen lisääntymisen ja tukahduttamaan solujen apoptoosin; TAZ ollut tärkeä, vaikkakin vähemmän merkittävä rooli tässä edistystä; ja synergistinen vaikutus välillä YAP ja TAZ kasvattivat vaikutus soluproliferaatioon ja apoptoosiin edelleen.

vaikutus YAP ja TAZ muuttoliikettä ja Invasion

YAP ja TAZ toiminta on aiemmin osoitettu välittävän kasvain solujen migraation ja invaasion. Havaintomme että supistamalla YAP ja TAZ ilmaisun ollut synergistinen rooli soluproliferaation inhibointi ja kasvu apoptoosin HCT116-solujen johti meidät arvioimaan vaikutusta YAP ja TAZ siRNA kotransfektioon maahanmuutto- ja hyökkäys valmiuksia paksusuolensyöpä solut. Standard, ja Matrigel päällystetty siirtokuoppaan määrityksiä arviointiin käytettiin muuttoliikettä ja invaasio, vastaavasti. Sekä YAP ja TAZ siRNA transfektoidut solut näytetään tilastollisesti merkitsevästi vähensi muuttoliikettä verrattuna valvoa soluihin; lasku oli merkittävämpi ryhmässä transfektoitu TAZ siRNA; kuitenkin, ryhmä transfektoitu sekä YAP ja TAZ osoitti eniten vaikutusta vähentämiseen muuttoliikkeen (kuviot 5A ja B). Suuntaukset olivat samanlaisia ​​matrigeelin invaasio määritykset: klooneja alentunut YAP tai TAZ tasot havaittiin tilastollisesti merkittävä väheneminen invaasiokyvyn verrattuna kontrolliin soluihin; vaikutus oli merkittävämpi TAZ knockdown ryhmä; kuitenkin, merkittävin väheneminen invaasiokyvyn havaittiin, kun molemmat YAP ja TAZ tippuu alas (kuvio 5C ja D).

(A) Kuvat ovat (x 10) muuttoliikkeen määrityksissä HCT116-solujen normaalin tason YAP ja TAZ ilmaisun (vanhempien ja si-Con); soluja tukahdutti taso YAP tai TAZ lauseke (si-YAP tai si-TAZ); ja solujen tukahdutetaan YAP ja TAZ lauseke (si-YAP-TAZ). (B) keskimääräinen lukumäärä soluja viiden riippumattoman muuttoliike määrityksissä on kuvattu aikaisemmin. (C) invaasiomääritys vanhempien HCT116-solujen; si-Con-solut; si-YAP; si-TAZ; ja si-YAP-TAZ solujen muokattu Boyden jaostoa Matrigel kuorrutettu kalvoja. 24 tunnin kuluttua, invasiiviset solut, jotka oli siirretty läpi Matrigel kalvon värjättiin ja laskettiin mikroskoopilla x 10 suurennuksella. (D) Graafinen esitys invasiivisia soluja laskettu keskiarvona ± SD viidestä aloilla. Nämä osoittavat tilastollisesti merkitsevästi vähensi muuttoliikettä sekä YAP ja TAZ siRNA transfektoituja soluja verrattuna valvoa soluihin; vaikutus on suurin ryhmä oli transfektoitu sekä YAP ja TAZ. [Tähdet osoittavat tilastollisesti merkittäviä eroja YAP tai TAZ siRNA transfektoidut solut vs. si-Con tai vanhempien soluja, (*,

P

0,05; **,

P

0,01) .].

keskustelu

YAP ja TAZ ovat merkittäviä alavirtaan tavoitteita Hippo signalointireitin. Tähän mennessä on ollut huomattava määrä näyttöä siitä, että linkit Luskuttaa /TAZ onkogeenin kasvainten muodostumiseen useiden kiinteiden syöpien, mukaan lukien munasarja-, rinta-, eturauhas-, maksa-, ja keuhkojen [7], [9], [12], [15]. Yliekspressio YAP on raportoitu poikkeavasti aktivoida joukko kohdegeenien vastaavien solujen lisääntymistä, eloonjääntiä, anti-apoptoosin, ja muuttoliike [19], [20]. Lisäksi aiemmat tutkimukset ovat tunnistaneet YAP itsenäisenä prognostinen merkkiaine kokonaiselossaoloaika ja taudista vapaan kertaa maksasolusyövän (HCC) potilasta; ja clinicopathologically liittyy kasvaimen erilaistumiseen [21]. Perusteella vakiintuneen näkemyksiä, YAP voi lisätä elimen kokoa, ja toimivat onkogeenin [5], [9]; ja että TAZ voi edistää solujen lisääntymistä, aiheuttaa epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), ja lisätä solujen muuttoliike ja invaasiota [22]; yhdistettynä potentiaalia samankaltaisuutta kudosspesifisiä toimintoja YAP ja TAZ, tutkimme ja tunnettu kliininen merkitys YAP ja TAZ itsenäisenä ennustetekijä määrittämiseksi tulosten CRC potilaista. Meidän tulokset olivat yhdenmukaisia ​​aiemman tutkimuksen [7], että ekspressiotasot sekä YAP ja TAZ oli merkittävästi kohonnut useimmissa CRC kudosten verrattuna viereiseen normaaleissa kudoksissa; kuitenkin, toisin kuin raporteissa rintasyövästä ja keuhkojen okasolusyöpä, löysimme ei ristiriita sytoplasmista ja ydinvoiman ilmaus YAP tai TAZ CRC kudoksissa [15]. Vaihtelut ilmaus YAP eri syövän kudoksissa johtuvat todennäköisesti niiden monimutkaisia ​​kasvain mikroympäristön. Monimuuttujamenetelmin Coxin regressioanalyysisarjoissa, huomasimme, että korkea koekspressio YAP ja TAZ oli ennustetyövälineenä ennustaja eloonjäämisaste CRC potilaiden, riippumatta sukupuolesta, iästä, kasvaimen koon, erilaistuminen tila, verisuonten invaasio, ja TNM-luokitus. Lisäksi alin yleinen eloonjäämisluvut havaittiin potilailla, jotka koekspressoi YAP ja TAZ, ja liittyivät kasvaimia, jolla on suurin kapasiteetti maahanmuutto- ja invaasion.

YAP on tunnustettu ehdokkaaksi onkogeeni, ja tuli tutkimuksen painopiste, kun se oli tunnistettu ihmisen kromosomin 11q22-amplikoni mikä näkyy useissa ihmisen syövissä [14]. TAZ on YAP paralogi, identifioitiin aluksi 14-3-3 sitova proteiini [23]; TAZ on noin 50% sekvenssi-identiteetti YAP, ja samanlainen topologia; TAZ toimii transkription koaktivaattori samalla tavalla Yap [23]; huomata, oli havainto, että YAP ja TAZ jakaa loppupään transkriptiotekijä, TEAD, jotka edistävät solujen proliferaatiota, migraatiota, ankkurointi riippumattoman kasvun, ja EMT, jotka ovat kaikki osallisina syövän taudin alkamisen ja etenemisen [24]. Lisäksi mekanismit TAZ ja YAP sääntelyä Hippo ovat samankaltaisia. Nämä havainnot viittaavat siihen yhteinen sääntely ja toiminta välillä TAZ ja YAP;