Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tupakansavu altistuminen huomattavasti vaarantaa kykyä immuunijärjestelmän suojaamaan hyökkääviä taudinaiheuttajia ja kasvaimen kehittymisen. Nikotiini on psykoaktiivisia komponentti tupakkatuotteita, joka toimii samoin kuin luonnollinen välittäjäaine, asetyylikoliinin, on nikotiinireseptorit (nAChr). Tässä osoitamme, että luonnolliset tappaja (NK) solut ekspressoivat vahvasti nAChR β2. Nikotiinialtistus heikentää kykyä NK-solujen tappamaan kohdesoluja ja vapauta sytokiineja, prosessi, joka on pitkälti kumonnut nAChR β2 puute. Edelleen, nikotiini- tukahduttaminen NF-KB: n aiheuttama transkriptionaalista aktiivisuutta NK-solujen riippuu nAChR β2. Tämä-nAChR-alatyypin lla on myös suuri merkitys NK-solun välittämää valvonta melanooman keuhkojen etäpesäkkeiden, on hiiren keuhkon etäpesäkkeiden malli altistuvat nikotiinille. Tulosten perusteella näyttää nAChR β2 kuin näkyvä koulutusjakson nikotiinin aiheuttaman heikentyneen NK-solujen toimintoja, jotka osaltaan esiintyminen tupakointiin liittyvät patologiat.

Citation: Hao J, Shi FD, Abdelwahab M, Shi SX, Simard , Whiteaker P, et ai. (2013) nikotiinireseptorikohtien β2 Määrittää NK Cell riippuva Etäpesäke hiirimallissa metastasoituneen keuhkosyöpään. PLoS ONE 8 (2): e57495. doi: 10,1371 /journal.pone.0057495

Editor: Fabrizio Mattei, Instituto Superiore di Sanità, Italia

vastaanotettu: 28 lokakuu 2012; Hyväksytty: 21. 2013 Julkaistu: 28 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Hao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee osittain International Science Cooperative Project Kiinan 2006DFB32330 on XXVL; National Basic Research Program Kiinan 2013CB966900 ja FDS; Ohjelma New Century Excellent Talents in University of China (NCET 111067 ja JWH); NFSC 2010CB529405 on XXVL, 81100887 ja 81273287 ja JWH; Yhdysvaltain National Institute of Health (R01AI083294 sen FDS); Key Project of Natural Science Foundation of Tianjin maakunnassa 12JCZDJC24200 että JWH, ja keskeinen hanke Kiinan opetusministeriö (212005 ja JWH). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Tupakointi liittyvät sairaudet, kuten infektio ja kasvaimen kehittymisen on liitetty vaarantunut toimintoja immuunijärjestelmän tupakoitsijoilla [1], [2]. Niistä useita immuuni-muokkaamalla komponentteja tupakansavun, nikotiini on osoitettu olevan merkittävä vaikutus useisiin nikotiiniasetyylikoliini reseptorin (nAChR) -pitoisia leukosyytit sekä synnynnäisen ja adaptiivisen immuunijärjestelmä. Expression of nAChR α7 makrofageissa ja monosyyteissä, ja sen kyky estää immuunivastetta aikana systeemisen tulehduksen ja elinspesifiseen sairaudet on suhteellisen hyvin kuvattu [3], [4], [5], [6], [7] , [8]. Tulokset viittaavat siihen, että nikotiini säätelee intensiteetti endotoksemia ja sepsis [3], [4], [5], ja vaimentaa erityisiä autoimmuunivasteita käytettäessä nAChR α7 riippuvaisella tavalla [6], [7], [8]. Toisaalta, äskettäin on osoitettu, että muut nAChR alatyyppien voi olla tärkeä rooli nikotiinin anti-inflammatorisia vaikutuksia [3], [4], [5], [6], [7], [8]. Tässä yhteydessä ilmaisu profiilia ylimääräisiä nAChr leukosyyteissä ja niiden merkitys taudin suhteellisesti vähemmän tutkittu.

NK-solut ovat suuria, rakeinen lymfosyyttejä, jotka toimivat läpi sytolyyttisen aktiivisuuden ja sytokiinien eritystä. Nämä kaksi funktiota valtuuttaa NK solut synnynnäisen isännän vastustuskykyä tiettyjä mikrobit ja solujen käynnissä pahanlaatuisiksi. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että NK-solujen määrä ja toiminta vähenivät tupakoitsijoilla verrattuna tupakoimattomiin [1], [2]. Altistuminen tupakansavulle vaimentaa sytotoksinen aktiivisuus ja sytokiinien tuotanto NK-solujen ihmisillä ja hiirillä [9], [10], [11], mikä yhdistää NK-solujen virheiden lisääntymiseen infektio ja syöpä. Tupakointi on erityisen liittyy erittäin pahanlaatuisten pienisoluinen keuhkosyöpä. Jopa sen jälkeen, kun kirurginen poisto varhaisessa vaiheessa, lähes puolet potilaista kuolee toissijainen kasvaimen etäpesäke. Oletetaan, että tämä johtuu osittain puutteellinen NK soluvälitteinen immuunivalvonnan koska poikkeava NK solujen toimintaa tupakoitsijoilla kasvattaa uudelleen ilmaantuminen kohdunkaulan syövän etäpesäkkeiden [12].

Täällä me kattavasti tutkittu matkapuhelinverkon ja molekyylitason nikotiinin yhtenä tupakansavun komponentteja, NK-soluja kohtaan. Olemme profiloitu nAChR ilmentymisen NK-solujen ja tunnistettu nAChR β2 tärkein tekijä nikotiinin välittämää vajaatoiminta NK-solun toimintoja. Lisäksi osoitamme, että nikotiini- esto NK-solun toimintojen kautta nAChR p2 lisää merkittävästi -melanoomaetäpesäkemallilla on ksenogeeniset malli.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet

Nainen C57BL /6-hiirten (6-8 vk vanha), rag2

– /-, rag2

– /- γ

c

– /-, kaikki on C57BL /6 tausta, hankittiin Taconic Farms. α7 ja β2 KO hiiret [13], myös ristissä C57BL /6 tausta, ystävällisesti toimitti Dr. Allan C. Collins. Hiiriä pidettiin alle patogeenivapaissa olosuhteissa. Eläinten tutkimuseettiseltä Tianjin Medical University ja St. Joseph sairaala ja Medical Center hyväksyi kaikki kokeet on kuvattu tässä tutkimuksessa.

mRNA puhdistus ja Käänteiskopiointia PCR

mRNA puhdistettiin tuoreesta akuutisti -isolated soluja (~1.5 x 10

6 solua näytettä kohti) käyttämällä μMACS mRNA eristyspakkausta (Miltenyi Biotec), kohti toimitettu protokollaa. Käänteinen transkriptio suoritettiin SuperScript III First Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, USA) noudattamalla toimitukseen protokollaa. Oligo-dT sekvenssit käytettiin prime käänteistranskriptaasin. Sen jälkeen suoritettiin PCR kanssa noudattamalla vakiintuneita menettelyjä, käyttäen erilaisia ​​alukkeita, jotka ovat spesifisiä kullekin kohde-mRNA (taulukko 1). Alukeparia suunniteltiin käyttämällä PubMed n ”Primer-blast” työkalu (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Kunkin parin, eteen ja taakse alukkeet olivat spesifisiä eri eksonit, jotta mahdolliset DNA saastuminen voidaan sulkea pois. PCR suoritettiin käyttäen RedTaq PCR-kittiä (Sigma, USA), mukaan mukana protokollaa. Alukkeet aina testattiin yhteensä aivojen cDNA: n (positiivinen kontrolli), ja optimaalinen hehkutus lämpötila (Tm) on määritetty empiirisesti (jossa käytetään lämpötilagradientti thermocycler), säilyttäen samalla korkean ankaruuden olosuhteissa. Negatiivinen kontrolli (ei cDNA mallia), sisällytettiin jokaiseen joukko reaktioita. PCR-tuotteet kullekin alukeparin positiivisista kontrolleista sekvensoitiin varmistaakseen tarkkuuden tuloksemme.

Kaiken nAChR Expression arvioimana radioligandin saturaatiositoutumisella

-epibatidiinin, joka on selektiivinen β2- ja β4 sisältäviä nAChr (joka voi koota kanssa α4, α5, α6 ja β3 alayksiköitä), käytettiin arvioimaan määrää β2 sisältävien nAChr, kuten aikaisemmin oli tehty [14], [15]. Voidakseen maksimoida määrityksen herkkyydestä, käytimme suuri spesifinen aktiivisuus [

125I] -epibatidiinin (I-Epi; 2200 Ci mmol

-1; PE Life Sciences, Waltham, MA). Tätä varten puhdistettu NK-soluja käytettiin välittömästi eristyksen jälkeen. Solut suspendoitiin uudelleen isotonisessa sitomispuskuriin (mM: NaCl, 144; KCI, 2; CaCl

2, 2, MgSO

4, 1, HEPES 20, pH = 7,5), johon oli lisätty naudan seerumialbumiinia (0,1% (w /v)). Inkuboinnit suoritettiin 22 ° C: ssa 2 h 96-kuoppaisilla levyillä. Näytteitä inkuboitiin eri kahdeksan pitoisuudet (6,25-800 pM) I-Epi kokonaistilavuudessa 30 ui täydennetty isotonista sitomispuskuria. Yhteensä (ei peptidiä lisätty) ja ei-spesifinen sitoutuminen (määritelty 100 mM carbamycholine) mitattiin jokaisesta pitoisuudesta, kolmena kappaleena. Erottamaan β2- peräisin β4 sisältävistä nAChr, 10 nM A85380 lisättiin conjuncton 200 pm-Epi [14]. Sitovat reaktiot lopetettiin ja pestiin suodattamalla käyttäen 96-paikka moninaiset. Hiukkasten jakeet kerättiin yksittäisvektoreiksi kerrosta Inotech 0,75 um säilyttäminen lasikuitusuodattimille kasteltu 0,5% polyetyleeni-. Bound radioligandin kvantifioitiin käyttäen Microbeta levyn laskuri (PerkinElmer Life Sciences, Wellesley, MA).

nikotiinikorvaushoitoon in vivo ja in vitro

in vivo toimitus, 100 mg /ml liuosta, joka sisältää (-) nikotiinibitartraatti (Sigma, St. Louis, MO, USA) fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) tai liuosta, pelkkää PBS: ää valmistettiin tuoreeltaan 24 h ennen pumpun implantaatiota ja ladataan Alzet® osmoottisia minipumppuja (malli 2006, Durect Corporation, Cupertino, CA, USA). Pumput istutettiin ihonalaisesti oikealla puolella takana hiiren ja jatkuvasti toimitetaan joko PBS: ää tai nikotiinin suolaa 3,6 ul /vrk 6 viikon ajan, ja sitten pumput poistettiin. Tämä rinnastaa toimituksen 0,39 mg nikotiinia vapaata emästä per hiiri per päivä. Jotta -30 gm hiiri, joka on yläpäässä painon käytettävien eläinten tutkimuksessa, tämä vastaa ~13 mg nikotiinia vapaata emästä /kg /d tai ~0.54 mg nikotiinia vapaata emästä /kg /h. Plasman nikotiinin tasot hiirillä ~100-200 ng /ml (~0.6-1.2 mM) infuusion jälkeen ~2-4 mg /kg /h lääkeainetta ja ~45 ng /ml (~280 nM) jälkeen infuusiona -0,5 mg /kg /h. Vertailun ihmisen tupakoitsijat ovat huippupitoisuus plasmassa nikotiinin tasot 10-50 ng /ml (~60-310 nM). Täten nikotiinin plasmassa (ekstrapoloitu olevan ~49 ng /ml tai -300 nM) käytettyjen hiirten tutkimuksissa ovat verrattavissa plasmassa ihmisen tupakoitsijoita. Jotkut ohjaus hiiret saivat PBS: ää suoralla injektiot sijaan minipumput mutta joko toimitustapa tuottivat samankaltaisia ​​tuloksia. In vitro kokeissa, 0,1-100 uM /ml nikotiinia lisättiin soluviljelmiin.

B16-melanooma Cell Line ja kasvaimen Challenge

B16-F10-luc2 (B16) on lusiferaasi-ilmentävä solulinja hiiren melanoomaa (Caliper Life Sciences, Alameda, CA, USA). Hiiret osoitettujen genotyyppien altistettiin suonensisäisesti B16-solujen 0,2 ml: aan PBS: ää häntälaskimoon. Solujen määrä käyttää ja ajat uhrauksen viitataan aiemmin vahvistettu protokollat ​​[9], [15], [16] ja määritelty tulososiossa. Eläimet nukutettiin ja lopetettiin kautta exsanguinations kautta vatsan laskimoon reikä. Keuhkot poistettiin ja asetettiin PBS: llä. Kasvaimen kyhmyt laskettiin käyttäen preparointimikroskooppia jonka tutkija sokkoutettu hoitoryhmään. Joissakin tapauksissa, keuhkot upotettiin 67% etanolia, 9% formaldehydiä, ja 4% jääetikkaa liuoksen määrä ja kasvainpesäkkeitä on lueteltu 24-48 tuntia myöhemmin.

eristäminen Lung mononukleaaristen solujen

Lung mononukleaarisia soluja eristettiin, kuten aiemmin on kuvattu [17]. Lyhyesti, keuhkot perfusoitiin esilämmitettyä HBSS alkaen oikeaan kammioon. Solususpensioita mistä leikataan elimiä kertyi Kollagenaasikäsittelyn ja sen jälkeen mekaaninen jauhamisen. Solujätteet poistettiin viemällä nailonverkon läpi. Solut pestiin ja uudelleensuspendoitiin HBSS. Nonparenchymal solut eristettiin tiheys-gradientti sentrifugoimalla Lymphocyte-M (Cedarlane Laboratories).

NK Cell sytotoksisuusmääritykset

NK-solun sytotoksisuutta arvioitiin kromin vapautumisen määrityksellä käyttäen

51Cr- merkitty YAC-1 hiiren lymfooman solulinjassa [18] tai B16 syöpäsoluja. Juuri puhdistettiin NK-soluja inkuboitiin

51Cr-leimattuja kohdesoluja (5 x 10

3) eri efektorisolujen /kohde-suhteilla. 4 tunnin kuluttua inkubaation supernatantit kerättiin ja

51Cr-release mitattiin γ-laskuri (PerkinElmer, Waltham, MA). Prosenttiosuus spesifinen lyysi lasketaan seuraavan kaavan mukaan: (kokeellinen vapautuminen – spontaani vapautuminen) /(maksimi release – spontaani vapautuminen) x 100. Sytotoksisuus määritykset tehtiin kolmena kappaleena [18].

NK Cell Proliferation määritykset

NK-solut eristettiin pernan hiirten, joita oli käsitelty nikotiinia tai PBS: llä. Solut suspendoitiin elatusaineeseen, joka sisälsi Dulbeccon modifikaatio Eaglen väliaineessa (Gibco, Paisley, UK), johon oli lisätty 1% (v /v) vähintään essential medium (Gibco), 2 mM glutamiinia (Flow Laboratory, Irvine, CA, USA), 50 IU /ml penisilliiniä, 50 mg /ml streptomysiiniä, ja 10% (v /v) FCS: ää (kaikki Gibco). 4 × 10

5 solua 200 ul: ssa elatusainetta sijoitettiin kuhunkin kuoppaan 96 kuopan, pyöreä-pohjaisilla mikrotiitterilevyillä (Nunc, Kööpenhamina, Tanska). In vitro nikotiinialtistus kokeissa, nikotiini (0,1-100 uM) lisättiin elatusaineeseen lisäksi LPS: ää (10 ug /ml). Jälkeen 3 päivää inkuboinnin jälkeen solut pulssitettiin 18 h ajan 10 ul: n eriä, jotka sisältävät 1 pCi

3H-methylthymidine (spesifinen aktiivisuus 42 Ci /mmol; MP Biomedicals, Irvine, CA, USA) kuoppaa kohti. Solut kerättiin lasikuitusuodattimille ja tymidiinin verrannollinen soluproliferaation mitattiin sitten. Tulokset ilmaistaan ​​iskuina minuutissa (cpm).

FACS-analyysi

Yksisolususpensiot (10

6 solua) valmistettiin pernan tai imusolmukkeiden ja värjättiin fluorochrome- konjugoiduilla vasta-aineilla. Kaikki vasta-aineet hankittiin BD Biosciences tai eBioscience, ellei toisin mainita. Vasta-aineet suoraan merkitty jokin seuraavista loisteputki tunnisteet: FITC, PE, PerCP, allofykosyaniini (APC), PC5 tai PC7. Seuraavia anti-hiiri-vasta-aineita käytettiin: CD3 (145-2C11), NKG2A (20d5), NKG2D (CX5), Ly49 I (YLI-90), NK1.1 (PK136), perforiini (eBioOMAK-D) ja grantsyymi B (16G6). Virtaussytometriset tiedot koottiin FACSAria

TM-virtaussytometrillä (Becton Dickinson, Mountain View, MD) ja analysoitiin Diva

TM ohjelmisto. Isotyypin negatiivinen kontrolli mAb: itä käytettiin tahrat. Prosenttiosuuden määrittämiseksi tuottavien solujen valitaan sytokiinien, saatavia arvoja isotyyppikontrolleja vähennettiin, joilla on erityisiä mAb.

Tumor in vivo Imaging

Bioluminescence kuvat saatiin käyttämällä IVIS Imaging System 200 Series (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Sillä

in vitro

kuvantamisen, bioluminesoiviin solut laimennettiin sarjoittain 10

5 soluja täydellisessä median musta, kirkas pohja, 24-kuoppalevyillä (Costar, Acton, MA, USA). D-lusiferiini (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA.) 150 ng /ml mediassa lisättiin kuhunkin kuoppaan 5-10 minuuttia ennen kuvantaminen. Imaging oli 1 min /levy. Sillä

in vivo

kuvantamisen, hiiret saivat intraperitoneaalisesti D-Luciferin 150 mg /kg (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Hiiret pantiin sitten päälle lämmitti vaiheessa sisälle valoa tiukka kamera laatikko jatkuva altistuminen 1-2% isofluraania. Imaging kertaa vaihtelivat 1 s 3 rahapajojen. Alueet kiinnostusta näytettyjen kuvien tunnistettiin noin tuumorikohdat ja kvantitoitiin kokonais- fotoni laskee tai fotonien /s käyttäen Living Image® ohjelmistoa (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).

Kasvaimen haaste kokeet suoritettiin melanooma B16 solut, jotka ilmentävät lusiferaasia. Kvantifioimiseksi tuumorikuorma, 10 minuutin kuluttua vatsaonteloon 3 mg /hiiri D-lusiferiini (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA), hiiret nukutettiin ja sijoitettiin valoon tiukka kammiossa IVIS 200 bioluminenssina kuvantamisjärjestelmä (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Tiedot kerättiin fotoneja /sec /cm

2 käyttäen Living Image® ohjelmisto (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).

MRI suoritettiin käyttäen 7T pieneläinten, 30 cm vaakasuora kantoi magneetti ja BioSpec Avance III spektrometri (Bruker, Billerica, MA), jossa on 116 mm korkea teho kaltevuus setti (600 mT /m) ja 72 mm koko kehon hiiri lähetys- /pinta vastaanottaa kelan kokoonpano. Aksiaalinen ja koronan T1-painotettu (MSME; TE 10,5 ms, TR 322 ms, 0,5 mm leikkeen paksuus, matriisi 256 x 256, näkökenttä (FOV) 2,8 cm, kahdeksan keskiarvot, 40 koronan viipaleita, skannaus 22 min, ja 20 aksiaalinen viipaleet, skannauksen aika 16 min) ja rasva-tukahdutetaan turbo spin kaiun T2-painotettu (RARE; TE1 14,5 ms, TE2 65,5 ms, TR 4500 ms, 0,5 mm leikkeen paksuus, Matrix 256 × 256, FOV 2,8 cm, kahdeksan keskiarvoja, 40 koronan viipaleita, skannaus aikaa 28 minuuttia, ja 20 aksiaalinen viipaleet, skannauksen aika 28 minuuttia) kuvia on hankittu, joka kattaa tilavuus aivoja hajukäämissä /otsalohkon halkeama kohdunkaulan selkäydin. MRI tulokset analysoitiin käyttämällä MEDx3.4.3 ohjelmistopakettia (Medical Numerics, Virginia, USA) on Linux-työasemassa.

Sytokiini Kvantifiointi

Standard ELISA arvioimista sytokiini- NK-solut (IFN -γ, MIP1α, ja GM-CSF) suoritettiin käyttäen BD OptEIA ELISA-kittiä (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), kuten aiemmin on kuvattu [18]. Tulokset ilmaistiin keskiarvona sytokiinien konsentraatio (pg /ml) ± SEM.

solunsisäisen sytokiinin värjäystä, yhden solun suspensioita valmistettiin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa neljä päivää pyöreäpohjaiseen levyjen (2 x 10

6 solua /kaivo), ja stimuloitiin seosta PMA (20 ng /ml), ionomysiinillä (1 ug /ml), ja brefeldin A (5 ug /ml) ja vielä 5 h 37 ° C: ssa. Sadonkorjuun jälkeen solut värjättiin pinnan markkereita, kiinteät ja läpäiseviksi Cytofix /Cytoperm kit (BD Biosciences), värjättiin sitten anti-IFN-γ-mAb (XMG1.2) konjugoitu Alexa 647. Kaikki näytteet analysoitiin FACSAria

TM käyttäen Diva

TM-ohjelmisto.

qRT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin solujen suspensioista selkäydin käyttäen TRIzol (Invitrogen). Ensimmäisen juosteen cDNA: n kunkin näytteen syntetisoitiin käyttämällä käänteisen transkription (Invitrogen). RT-PCR suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu, käyttäen ABI Prism 7900-HT-sekvenssin järjestelmä (Applied Biosystems) kanssa QuantiTect SYBR Green PCR -kittiä (QIAGEN), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Seuraavia alukkeita käytettiin: NF-kB eteenpäin, 5′-ATTTGAAACACTGGAAGCACGG-3 ’; NF-kB reverse, 5’CCGCCTTCTGCTTGTAGATAGG -3 ’; IKKα eteenpäin, 5’-TGCACACCGTGCAGAGTCA -3 ’; IKKα kääntää, 5’TGCTTGCAGCCCAACAACT -3 ’; hypoksantiini-guaniini (HPRT) eteenpäin, 5’-AGCCTAAGATGAGCGCAAGT-3 ’; ja HPRT käänteinen, 5’-TTACTAGGCAGATGGCCACA-3 ’. HPRT geeni monistettiin ja toimi endogeeninen kontrolli. 1 ui ensimmäisen juosteen cDNA-tuote monistettiin platina Taq-polymeraasia (Invitrogen) ja geenispesifistä alukepareista. Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena ja kokeet toistettiin kaksi kertaa. Suhteelliset määrät mRNA laskettiin piirtämällä Ct (jakson numero), ja keskimääräinen suhteellinen ilmentyminen määritettiin 2

-ΔΔCt vertailevaa menetelmää.

Tulokset

nAChR Expression Profile NK-solujen ja vahvistus ligandisitoutumismäärityksiä

määrittämiseksi nAChR-mRNA: n ilmentyminen on NK-soluja, me järjestetty NK-solut yhdistettiin pernasolujen rag2

– /- C57BL /6-hiiristä, joista puuttuu T-solujen, NKT solut ja B-solut. mRNA uutettiin hyvin puhdistettu NK-solujen (kuvio 1A) ja nAChR ilmentyminen profiili määritettiin PCR: llä. Tuloksemme osoittavat, että NK-solut ilmentävät nAChR α4, α5, α6, β2 ja β3 muttei α3, α7, α9; eikä β4. Lisäksi ilmaus β2 oli erityisen voimakasta (kuvio 1 B). Sitten tutkittiin, nAChR proteiinit kykenevät sitoutumaan nikotiini- radioligandisitoutumistie- kootaan NK-soluissa käyttämällä

125l-leimattua -epibatidiinin (I-Epi) sitoutumisen määrityksessä (200 pM I-Epi +/- 100 mM carbamylcholine), kuten kuvattu muualla [14], [19], [20], [21]. NK-solut (~ 1 miljoonaa) puhdistettiin FACS, ja hiiren aivokuoren homogenaattia käytettiin positiivisena kontrollina. Erityisiä I-Epi sitoutuminen oli 99 fmol /mg proteiinia NK-soluissa, suunnilleen sama spesifinen sitoutuminen tasot hiiren koko aivojen (kuvio 1 C). Nämä tiedot osoittavat, että NK-solut ilmentävät merkittäviä määriä koottu nAChr (sekä nAChR alayksikön mRNA: t, kuten on esitetty aikaisemmin) tasolle, joka voidaan määrittää tällä määrityksellä. Koska I-Epi sitoutuu sekä β2- ja β4 sisältäviä nAChr [14], kilpailukykyinen sitova nAChR β2-selektiivinen yhdiste A85380 käytettiin erottamaan näiden kahden reseptorin alatyyppiä. Olemme havainneet, että A85380 pitkälti kumotaan I-Epi sitova, mikä osoittaa, että suurin osa nAChr läsnä NK-soluja sisältävät β2-alayksikköä (kuvio 1C). Yhdessä tuloksemme osoittavat, että NK-solut ilmentävät erilaisia ​​nAChR mRNA: iden ja että useimmat näistä alayksiköistä koota osaksi β2 sisältävään nAChr. Voimakas ilmentyminen nAChR β2 NK-soluissa, sekä mRNA ja proteiini tasoilla mukaan β2 sisältäviä nAChr ovat ehdolla sovittelu nikotiinin vaikutuksista NK-solujen toimintaa.

perna tai imusolmuke solujen suspensioita saatiin rag2

– /- hiirissä, ja FACS suoritettiin kuvatulla tavalla

Materiaalit ja menetelmät

osassa. A. Edustavia pistekuvioita solupopulaatioiden ennen ja lajittelun jälkeen näkyvät vasemmalla ja oikealla kädellä paneelit, vastaavasti. Puhtaus NK solut saavuttivat 98%: n puhtaudella lajittelun jälkeen. B. mRNA puhdistettiin lajitellut NK-solut, ja cDNA syntetisoitiin käänteistranskriptiolla. Sen jälkeen suoritettiin PCR käyttäen alukkeita, jotka ovat spesifisiä kullekin hiirelle nAChR alayksikön. Positiivinen kontrolli (+), käyttäen kokonaisia ​​hiiren aivojen cDNA, ja negatiivinen kontrolli (-), ilman cDNA, sisällytettiin kussakin reaktiossa. Kunkin nAChR alayksikön, bändejä positiivinen kontrolli ja vähintään yksi näyte kustakin solutyypistä sekvensoitiin ja vahvistettiin oikean PCR-tuote. C. nAChR ilme arvioidaan radioligandin saturaatiositoutumisella. Data kuvattu edustavat 2-3 erillisen kokeen tulokset olivat samanlaiset.

Influence of nAChR β2 vajauksen Expression of NK solureseptorien ja Efektorimolekyylejä

NK-solujen toimintoja sanelee stimuloiva ja estävä reseptoreihin NK-soluissa. Aktivointi generoidaan kautta NK ryhmän 2 jäsen (NKG2D), jotka tunnistavat stressin indusoituva molekyylejä MHC-luokan I ketjuun liittyvä proteiinit (MICA ja MICB) ja UL-16-sitovia proteiineja 1-4 (ULBP1-4), myös tunnetaan Raet proteiineja, tai luonnollisissa sytotoksisuuden reseptorien (NCRs), jotka tunnistavat viruksen hemagglutiniinin ja vielä määrittämätön kasvaimeen liittyvät ligandi. Inhiboivaa generoidaan sitoutumisen MHC-luokan I molekyylien tappajasolujen immunoglobuliinin kaltainen reseptorit (Kirs) ihmisillä tai Ly49 hiirillä, lisäksi CD94 /NKG2A heterodimeerin molemmilla lajeilla [22], [23]. Vertasimme ilmaus useiden näiden reseptorien pernan NK-solut eristettiin nicotine- tai PBS: llä altistettiin hiiret ja tutkitaan vaikutuksen, jos sellaisia ​​on, nAChR β2 puutos. Expression of estävä reseptorin NKG2A ei muuteta merkittävästi NK-soluissa nikotiini; kun taas ilmaus NKG2D ja Ly49I vähenivät hiirillä, jotka saivat nikotiinia, ja tätä alennusta pitkälti kumottiin nAChR β2

– /- hiirillä (kuvio 2A) [13]. Samanlaisia ​​havaintoja saatiin koskien ilmaus NK-solujen efek- molekyyli Granzyme B ja Perforiinin (kuvio 2B). Havaitsimme myös, että nikotiini on samanlainen vaikutus keuhkojen johdettuja NK-solujen reseptorin profiilin ja efektorimolekyylien (tuloksia ei ole esitetty).

Villityypin (β2

+ /+) tai nAChR P2 knock-out ( β2

– /-) hiiret saivat nikotiinia (Nic) tai PBS: 21 päivää ennen niiden karhittava. Yhden solun suspensiot valmistettiin pernoista. Taajuus ja fenotyypit NK-solujen sisällä mononukleaarisia soluja analysoitiin FACS: llä. A. Expression of NKG2D, NKG2A ja Ly49I aidatulla NK1.1

+ CD3

– soluja. B. Expression Perforiinin ja grantsyymi B erittämä aidatulla NK1.1

+ CD3

– soluja. Juoni tiedot edustavat tulokset kahdesta erillisestä kokeesta (n = 3-4 hiirtä /ryhmä). P-arvot, Opiskelijan

t

-testi, * p 0,05.

nAChR β2 puutos Kääntää estäviä vaikutuksia Nikotiinin NK Cell Functions

Ymmärtääksemme biologiset seuraukset muuttunut NK-solun reseptorin ilmentymisen aiheuttamaa nikotiinialtistus, tutkimme nikotiinin vaikutuksia NK-soluvälitteistä tappamista kohdesolujen, sekä sytokiinien NK-soluja. NK-solujen normaalia edustavat 5-10% perifeerisen veren mononukleaarisia soluja ihmisen ja 1-3% monosyyttien hiiren perna tai imusolmuke. NK-solut hoitamaan tehtävänsä, nämä solut on lisääntyvät alle patologisia tilanteita. Niinpä ensin arvioitu vaikutus nikotiinin NK soluproliferaatioon ja totesi, että nikotiini on vähentynyt NK-solujen lisääntymisen ja numerot (kuvio 3A, B). nAChR β2 puutos suurelta osin palautettu kapasiteettia NK-solujen lisääntymään ja numerot nikotiinin läsnäollessa (kuvio 3A, B).

NK-solut lajiteltiin pernasolujen yksisolususpensioita villityypin (β2

+ /+) tai nAChR p2 knock-out (β2

– /-). A. Soluja viljeltiin sitten, kun läsnä on eri pitoisuuksia nikotiinia (0,1, 1, 10 tai 100 uM), ja [

3H] tymidiinin inkorporaatio mitattiin (10

3 cpm + SEM; ordinaatta). B. NK-solujen lukumäärät arvioidaan β2

+ /+ tai β2

– /- hiirissä, läsnä ollessa tai ilman nikotiinia. (N = 6-8 ryhmää kohti; Opiskelijan

t

-testi, * p 0,05). C.

51Cr-labbed kohdesoluun YAC-1 inkuboitiin NK-soluja, jotka ovat peräisin β2

+ /+ tai β2

– /- hiirissä läsnä ollessa tai ilman nikotiinia, on ilmoitettu efektori /kohde- solusuhteen. Tappaminen kohdesolujen mitataan

51Cr release määrityksessä. D. B16-soluja inkuboitiin NK-soluja, jotka ovat peräisin β2

+ /+ tai β2

– /- hiirissä, läsnä ollessa tai ilman nikotiinia. D-lusiferiini, lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyä kuvattiin, jolloin saatiin fotonia /s per solu. Wells soluilla yksinään (ei nikotiinia) tai solujen (lisätty nikotiini) otettiin mukaan kontrolleina. Tappaminen B16 soluja mitattiin bioluminesenssin kuvantamiseen. Data yhdessä kokeessa kahdesta suoritettu näkyy, n = 3-4 hiirtä /ryhmä. P-arvot, Opiskelijan

t

-testi, * p 0,05. E. tuotanto IFN-γ mitattiin solunsisäisen sytokiinin värjäystä. Dot tontit ovat edustavat kahta erillistä koetta (n = 6-18 hiirtä). F. IFN: n tuotanto-γ: n, TNF-α, GM-CSF, MIP-1α ja MIP-β mukaan lajitellut NK-solujen mitattiin ELISA: lla. P-arvot, Opiskelijan

t

-testi, * p 0,05.

Seuraavaksi arvioitiin vaikutus nikotiinin NK-solun hajotusaktiivisuudella ja mahdollisia rooleja nAChR β2. Verrattuna kontrollihiiriin, jotka saivat PBS: ää, NK-solut nikotiinin-käsitellyistä hiiristä oli vähemmän sytotoksinen YAC-1, joka on perinteinen NK kohdesolun pienempi MHC-luokan I ilmentyminen (kuvio 3C). Ensisijainen ihmisen ja hiiren melanooma, tai solulinjoja, yhteinen ilmaus ligandien luonnon sytotoksisuuden reseptoreihin (NCRs) ja DNAX apumolekyyli-1 (DNAM-1), kaksi nousevan NK-solun reseptorien avain syövän tunnustamista [15]. Lisäksi nämä solut on alhainen MHC-luokan I ilmentymisen [15]. NK-solut pystyvät näin tunnistamaan ja hajottamaan ihmisen ja hiiren melanoomasoluja in vitro ja in vivo ja estää melanooman etäpesäkkeiden adoptiivisessa siirtokokeet [24]. Siksi käytetään hiiren B16-solulinja, joka on johdettu spontaani hiiren melanoomaa, ja osoittivat, että NK-solut helposti tappaa B16 kasvainsoluja, ja että tämä vaikutus oli merkittävästi vähentynyt, kun ne altistetaan nikotiinia (kuvio 3C, D). Tutkia panokset nAChR β2-reseptorin välittävän vaikutukset nikotiinin, teemme nämä kokeet käyttäen nAChR β2

– /- NK-solut (kuvio 3C, D). Kaikissa kokeissa nAChR β2 puutos merkittävästi kumosi nikotiinin.

Viime, tarkastellaan vaikutusta nikotiinin sytokiinituotantoon NK-solujen. Verrattuna kontrollihiiriin, IFN-γ, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β: n ja TNF-α-eritys vähennetään hiiret saivat nikotiinia (kuvio 3E, F). Jälleen nämä parametrit peruutetaan pitkälti nAChR β2

– /- hiirissä. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että nikotiini heikentää NK-solujen toimintoja, kuten solujen lisääntymisen, sytotoksisuus kohti YAC-1 solun ja B16 kasvainsoluihin, ja sytokiinien. Tuloksemme osoittavat myös, että vaikka ilmentyminen useiden nAChr, nAChR β2 tullut tärkeä välittäjä nikotiiniha- vaikutuksia NK-solujen, kuten puute nAChR α7 ei muuta merkittävästi vaikutusta nikotiinin NK-solujen (tuloksia ei ole esitetty).

Nikotiini Estää NF-KB transaktivointi NK-soluissa kautta nAChR β2

Liikkeelle transkriptiotekijän NF-KB on olennainen askel NK-solun aktivaation ja etenee sen cytotoxicic aktiivisuutta ja sytokiinien. Arvioida vaikutusta nikotiinin NF-KB: n aktiivisuutta NK-soluja, me järjestetty NK-solut pernasta rag2

– /- hiirissä, ja viljeltiin eristetty NK-solut yksinään tai yhdessä nikotiinia 24 tuntia. Suoritimme sarjan reaaliaikaisen PCR kokeita katsomalla muutoksia transkriptio runsaasti, ja näin, että lisäämällä nikotiinin tukahdutti geenin transkription NF-KB: n, ja IKKα vaihtoehtoinen säädin NF-KB NK-soluissa (kuvio 4). Sen määrittämiseksi, nAChR β2 on mukana, me Risteytyshevonen rag2

– /- kanssa nAChR β2

– /- hiirillä tuottaa kaksinkertainen hiirten. Kun NK-solut, jotka ovat peräisin näistä hiiristä käytettiin, vaikutus nikotiinin NF-KB: n ja IKKα transkriptio tulee minimiin (kuvio 4). Siten nAChR β2 välittää nikotiinin vaikutuksia NK-solun transkription geenejä, jotka ovat kriittisiä niiden toiminnot.

NK-solut lajiteltiin pemasolu yhden solun suspensiot rag2

– /- ja rag2

– /-β2

– /- hiirissä. NF-KB ja IKKα mRNA lajitellaan NK solujen β2

+ /+ tai β2

– /- hiiret saivat nikotiinia (Nic) mitattiin qRT-PCR. Data yhdessä kokeessa kahdesta suoritettu näkyy, n = 3-4 hiirtä /ryhmä. P-arvot, Opiskelijan

t

-testi, * p 0,05.

nikotiinialtistus Edistää keuhkometastaasitestissä, prosessi, riippuen nAChR β2

Tupakansavu on ollut kokeellisesti todettu lisäävän keuhkosyövän etäpesäkekasvainten taakkaa [11]. Kuten useiden kemikaalien sisältämä tupakansavun voi olla tällainen vaikutus, pyrimme kiinnittämään erityistä roolia nikotiinialtistus tässä prosessissa. Tätä varten olemme ottaneet hiiren B16 solulinja saatu spontaaneista hiiren melanooma. Koska B16 kasvainsolujen korkeat keuhkometastaasitestissä potentiaali ja tällaiset etäpesäkkeitä voidaan estää NK-solujen, tämä malli sopii puuttua rooli nikotiinin ja sen reseptoreihin tässä patologisen prosessin. Tätä tarkoitusta varten, C57BL /6 rag2

– /- hiiriä käsiteltiin nikotiinia tai PBS: n kautta osmoottisen pumpun implantaatio on 14 päivää ja sen jälkeen. Annostus valinta perustuu tupakoitsijoita ja perustella yksityiskohtaisesti menetelmiä osassa ja edellisessä julkaisuissa [7], [8]. Nämä hiiret altistettiin sitten i.v. 1 x 10

6 B16- melanoomasolujen. Kirjallisuuden perusteella [11], [15], [16], emme valmiste kokeita, joissa kasvaintaakkaa ja eloonjäämisluvut verrattiin hiirillä, jotka saivat 1 x 10

5, 2,5 x 10

5, 5 × 10

5, 1 x 10

6 ja 2,5 x 10

6 B16 soluja.