Krooninen sairaus

tiivistelmä

Okasolusyöpä pään ja kaulan (SCCHN) induktiohoitoon on aggressiivinen tauti huono selviytyminen ja on kuudenneksi yleisin syöpä maailmassa. Refluksitaudin on yleinen tapahtuma SCCHN potilailla. GPR4 on protoni-tunnistava G-proteiiniin kytketty reseptori, joka voidaan aktivoida asidoosi. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää roolia GPR4 happamassa altistumisen ja kasvaimen angiogeneesiä SCCHN. Tässä tutkimuksessa olemme vahvistaneet, että yli-ilmentävät GPR4 vuonna SCCHN soluissa voisi lisätä ilmaisun ja erittymisen IL6, IL8 ja VEGFA pH 5,9. Tämä vaikutus voitiin estää SB203580 (p38 estäjä). Western blot-analyysi osoitti, että fosforylaatio p38 kasvoi GPR4 infektoituneissa soluissa pH: ssa 5,9, joka voitiin estää SB203580. Putken muodostumista määrityksessä, HMEC-1-soluja inkuboitiin kunnostetun alustan (CM, pH 5,9, 6,5, 7,4), jotka ovat peräisin ohjaus ja GPR4 tartunnan SCCHN soluja. Putkenpituus oli lisääntynyt HMEC-1 soluja inkuboitiin CM alkaen GPR4 infektoiduista soluista verrattuna ohjaus soluihin pH5.9, mikä osoitti angiogeneesiä vaikutus GPR4 happamassa pH: ssa. Neutraloivat vasta-aineet IL6, IL8 ja VEGFA voisi estää putken muodostumiseen HMEC-1-soluissa. In vivo, vaikutus GPR4 angiogeneesiin tutkittiin kananpojan rakkokalvon (CAM) malli. Ohjaus ja GPR4 tartunnan SCCHN-solut ympättiin ylemmän nokkapinnan (n = 5 kussakin ryhmässä) ja 5 ui DMEM /F12 (pH 5,9, 6,5, 7,4), lisättiin solun pinnalla 24 tunnin välein. Neljä päivää myöhemmin, ylempi CAM kerättiin ja suhde verisuonten alueen CAM alueen kvantifioitiin käyttäen Image-Pro Plus 6.0 -ohjelmisto. GPR4 infektoituneita soluja voisi palkata enemmän verisuonten kuin kontrolli solujen pH5.9. Lopuksi olemme ehdottaneet, että GPR4 indusoi angiogeneesiä kautta GPR4 aiheuttama p38-välitteisten IL6, IL8 ja VEGFA eritystä happamissa solunulkoinen pH SCCHN.

Citation: Jing Z, Xu H, Chen X, Zhong Q, Huang J, Zhang Y, et ai. (2016) Proton-Sensing G-proteiini reseptorin GPR4 edistää angiogeneesiä in pään ja kaulan alueen syöpä. PLoS ONE 11 (4): e0152789. doi: 10,1371 /journal.pone.0152789

Editor: Ramani Ramchandran, Medical College of Wisconsin, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 29 syyskuu 2015; Hyväksytty 18 maaliskuuta 2016 Julkaistu: 14 huhtikuu 2016

Copyright: © 2016 Jing et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta Yangfan Program Pekingin kunnallishallinto Sairaalat (no. XMLX201507). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Okasolusyöpä pään ja kaulan (SCCHN) induktiohoitoon on aggressiivinen tauti huono selviytyminen ja on kuudes yleisin syöpä maailmassa [1]. Maailmanlaajuinen esiintyvyys on noin 600000 tapausta vuodessa [2]. Tupakointi ja alkoholin väärinkäyttö ovat merkittäviä riskitekijöitä SCCHN. Refluksitaudin on yleinen tapahtuma SCCHN potilailla [3], mikä osoittaa, että se liittyy kohonnut riski kurkunpään syövän ja nielun syöpä [4]. Kaksikymmentäneljä tuntia double-anturi pH seuranta osoittaa pH ylemmän ruokatorven sulkijalihaksen olevan alle 4 [5]. Acid altistuminen voi johtaa erilaisiin otolaryngological sairaudet kuten krooninen kurkunpään tulehdus, laulu kyhmyjä, Reinke n ödeema, yhteystiedot haavauma ja granulooma, kurkunpään ahtauma, ja puuskittaista laryngospasmi [6]. Ruokatorven okasolusyöpä, jatkuva happo altistuminen edistää verisuonten kehitys [7], joka on keskeisessä asemassa aikana kasvain aloittamisen ja pahanlaatuisten etenemisen [8].

Protoni tunnistava G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR: t), mukaan lukien GPR4, GPR65 (TDAG8), GPR68 (OGR1), ja GPR132 (G2A) on äskettäin tunnistettu uusi pH-antureita, jotka on ehdotettu aktivoitua hapan solunulkoinen pH [9]. On osoitettu, että GPR4 yli-ilmentyy erilaisten maligniteettien [10, 11]. Vuonna epiteelin munasarjasyövän GPR4 ilmaisu tiheys mukana on korkeampi mikrovaskulaarinen tiheys (MVD) [10], ja tämä korreloi tilan imusolmuke etäpesäke ja kliiniseen vaiheeseen. Tämä osoittaa, että GPR4 voi olla osallisena syöpään liittyvien angiogeneesiä. Vuonna SCCHN, korrelaatio happo altistumisen, kasvaimen angiogeneesi ja GPR4 ei ole hyvin tutkittu. Aikaisemmassa tutkimuksessa olemme vahvistaneet GPR4 voisi aktivoida AP1 ja ERK signalointireitteihin happamassa solunulkoinen pH [12]. AP1 on yksi säätelykohtia IL6, IL8 ja VEGFA [13-15]. GPR4 pH-anturi on korreloi positiivisesti korkeampi mikrovaskulaarinen tiheys, joten hypoteesi, että se voisi lisätä ilmentymistä IL6, IL8 ja VEGFA ja aiheuttaa angiogeneesiä happamissa solunulkoisen pH: ssa. Tässä tutkimuksessa olemme ehdottaneet, että GPR4 angiogeneesissä kautta GPR4 aiheuttama IL6, IL8 ja VEGFA eritystä happamissa solunulkoinen pH SCCHN.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

eettinen lupaa tutkimuksen myönsi Research eettisen komitean Pekingin Tongren Hospital (Peking, Kiina).

Cell Culture

SCCHN solulinjat Fadu solut ja Tca8113 soluja, ihmisen mikrovaskulaaristen endoteelisolujen (HMEC-1) käytettiin tutkimuksessa. Fadu solut saatiin valtion Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuanin yliopiston [16]. Tca8113 solut saatiin Kiinan infrastruktuuri Cell Line Resources. HMEC-1-solut, joka on saatu Thermo Fisher, syntyi Ades et ai [17]. Kaikki solut viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, Hyclone, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. Kaikki solut inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2.

Rekombinantti-adenovirus kuljettavat GPR4 Gene

rekombinantti-adenovirusta, joka ekspressoi GPR4 (Ad-GPR4) syntyi menetelmien mukaisesti aikaisemmin kuvatulla tavalla [18]. Lyhyesti, GPR4 oli osa kloonattiin adenovirusvektori pAdxsi (Sinogenomax, Kiina). Rekombinantti adenovirus-konstrukti transfektoitiin pakkaus HEK293-solut, ja sitten näitä soluja jäädytys-sulatettiin useita kertoja vapauttaa solunsisäisiä viruspartikkelien. Viruksen tiitterit testattiin HEK293-soluissa ja plakin muodostavaa yksikköä (pfu) saatiin käyttämällä plakin muodostumista määrityksessä.

Cell Infection and Acid stimulointi

Fadu solut ja Tca8113 soluja ympättiin kuuden kuoppalevyillä, oli 80% konfluenssin seuraavana päivänä. Sitten solut infektoitiin Ad-GPR4 tai Ad-null (tyhjää rekombinanttiadenoviruksen kontrollina). Kahdeksantoista tuntia myöhemmin, happo stimulaatio suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [12]. Lyhyesti, 18 tuntia infektion jälkeen, elatusaineet korvattiin seerumittomalla DMEM /F12 (pH 5,9, 6,5 ja 7,4). Solut kerättiin sen jälkeen, kun stimulaatio 6h. SB203580 (p38-estäjän, 1 uM) käytettiin määrittämään, onko p38-välitteisen eritystä pro-angiogeenisten sytokiineja. Suorittaa p38 inhibition, GPR4 infektoituja soluja pidettiin seerumin puutteessa 4h ja käsiteltiin 1 uM SB203580: ssa 1 tunti, ennen kuin happo stimulaatiota ja sen jälkeen elatusaineet korvattiin seerumittomalla DMEM /F12 (pH 5,9). Solut kerättiin 6h myöhemmin.

kunnostettu alusta

valmistamiseksi väliaine (CM), The Fadu solut ja Tca8113 solut infektoitiin Ad-GPR4 tai Ad-null 18 tunnin viljelmä media korvattiin seerumittomalla DMEM /F12 (pH 5,9, 6,5 ja 7,4), ja soluja ilman infektiota toimi kontrollina. Kuusi tuntia myöhemmin väliaine sentrifugoitiin (4 ° C, 1500 rpm) ja supernatantti otettiin talteen ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti.

Real Time PCR (qPCR) ja semikvantitatiivinen PCR

Yhteensä RNA: t Fadu ja Tca8113 solujen ja SCCHN kudoksia eristettiin käyttäen TRIzol-reagenssia (Life Technologies, USA). Käänteistranskriptio suoritettiin käyttäen FastQuant RT Kit (TIANGEN, Kiina). qPCR suoritettiin valmistajan suosittelemia. Seuraavia alukkeita käytettiin qPCR: IL6 sense 5′-TGAGAGTAGTGAGGAACAAG-3 ’, antisense 5′-CGCAGAATGAGATGAGTTG-3′; IL8 sense 5’-CCTGATTTCTGCAGCTCTGTGT-3 ’, antisense 5′-GGTGGAAAGGTTTGGAGTATGTCT-3′; VEGFA sense 5’-GCCCACTGAGGAGTCCAACATC-3 ’, antisense 5′-CAAGGCCCACAGGGATTTTCT-3’. Alukkeet PCR GPR4 olivat seuraavat: sense 5′-AACCTCTATCGGGTGTTCGTG-3 ’, antisense 5′-TTGGCTGTGCTGTTCCTCTTGG-3’. GAPDH: ta monistettiin sisäisenä standardina. Suhteellinen RNA-tasolla kussakin näytteessä määritettiin 2 (delta Delta C (T)) menetelmällä.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) B

kontrollisoluja ja GPR4 infektoiduissa soluissa stimuloitiin 6 h käyttäen seerumitonta DMEM /F12 (pH 5,9). Sitten väliaine sentrifugoitiin (4 ° C, 1500 rpm) ja supernatantti otettiin talteen. Pitoisuus IL6, IL8 ja VEGFA viljelyalustassa kvantifioitiin ELISA kit mukaisesti valmistajan ohjeiden (Abcam).

Western blot -analyysi

Solut lyysattiin RIPA-puskuriin ( Beyotime, Kiina), jota oli täydennetty 1 mM PMSF: ää. Yhteensä 100 ug proteiineja elektroforeesissa 10% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin sähkön nitroselluloosamembraaneille (Invitrogen, USA). Western blot suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [12]. GPR4 vasta-aine hankittiin elinikä BioSciences (elinikä, USA). Fosfo-p38 (p-p38), yhteensä p38 (p38), fosfori-VEGF-reseptori 2 (Tyr1175) ja VEGF-reseptori 2-vasta-aine hankittiin Cell Signaling Technology (Cell Signaling, USA). GAPDH (Santa Cruz, CA) käytettiin lysaatin latauskontrollina.

Putken muodostumisen määritys

Vahvista vaikutuksen GPR4 on putken muodostumiseen HMEC-1, teimme angiogeneesimääritys päälle kasvutekijä vähennetty matrigeeliin (BD Biosciences). Yksi päivä ennen putken muodostumiseen määritystä, HMEC-1-solut ympättiin 10 cm: n levylle. Sen jälkeen päällystämällä 96-kuoppaisen levyn kanssa Matrigeliä seuraten valmistajan ohjeita, HMEC-1-solut otettiin talteen ja suspendoitiin uudelleen 1 x 10

5 /ml käyttäen CM täydennetty 2% FBS: ää. Sitten 0,1 ml solususpensiota lisättiin 96-kuoppaiselle levylle. VEGFA (1 ng /ml) käytettiin positiivisena kontrollina ja DMEM toimi negatiivisena kontrollina. Levyä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 12 tuntia muodostumisen mahdollistamiseksi kapillaari-rakenteita. Kuvat otettiin valomikroskoopilla ja putken pituus (pikseliä) laskettiin käyttäen Image-Pro Plus 6.0 -ohjelmisto.

Chick rakkokalvon (CAM) Malli

Hedelmöitettyjä Specific taudinaiheuttajista vapaat (SPF) munat saatiin Beijing Laboratory Animal Research Center. Munat olivat kuoriutuneet kostutetussa inkubaattorissa 37,0 ° C: ssa 60%: n kosteudessa. Päivänä 10, suurten verisuonten ja pussi leimattiin muna käyttämällä Cold Light Fountain (STORZ, Saksa). Desinfioinnin jälkeen käyttämällä 75% alkoholia, pyöreä ikkuna avattiin päällä munankuoren, säilyttäen ulompi munankuoren kalvo. Mitättömän reikä oli porattu paikassa ilmarakon. Sitten 20 ui normaalia suolaliuosta lisättiin munankuoren kalvoa. Munankuoren kalvo puhkaistiin käyttämällä ohuella neulalla ja pienet paikantaa reikä ilmarakon vakuoitiin käyttämällä kumista Pumpettia, niin että normaali suolaliuos erotettu ulompi munankuoren kalvo päässä CAM. Munankuoren kalvo kuorittiin pois häiritsemättä CAM. Ikkuna peitettiin parafilmillä ja muna pantiin inkubaattoriin toinen päivä. Sitten 1 x 10

6control ja GPR4 infektoituja soluja ympättiin ylemmän nokkapinnan (n = 5 kussakin ryhmässä). Neliön ikkuna muna oli sinetöity. Sitten 5 ui DMEM /F12 (pH 5,9, 6,5, 7,4), lisättiin solun pinnalla jokaisen 24. Neljä päivää myöhemmin, ylempi CAM kerättiin ja suhde verisuonten alueen CAM alueen kvantifioitiin käyttäen Image-Pro Plus 6.0 -ohjelmisto.

Bioinformatics

Bioinformatics menetelmää käytettiin Li [ ,,,0],19] on kuvattu, lyhyesti, array liittyviä tietoja syövät päässä Affymetrixhuman genomista U133 plus 2.0 alustan otettiin alas ladataan GEO tietokannasta (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), ja ilmennetty eri geenien kasvaimet analysoitiin käyttämällä TumourProfile tietokantaa (https://tumour.bjmu.edu.cn/, julkaisematon) Wang et al aiemmin kuvattu tietojenkäsittely ja mikrosirujen analyysimenetelmiä [20, 21]. Ilmaisu profiilia GPR4 eri syöpien ja vastaava ohjaus (normaali tai ei-kasvain) kudoksiin etsittiin tähän tietokantaan, ja ilmaisun tasot olivat edustettuina keskimääräinen sijoitus tulokset (ARS).

Immunohistokemia ( IHC) B

parafinoidut yksilöiden kurkunpään tai hypopharyngeal okasolusyöpä näytteitä yhdistettynä peri-karsinooma normaali otettiin kudosnäytteet pään ja kaulan tuumorinäytesylinterin Bank of Beijing Tongren sairaalan [12]. Parafiini kudoksen dioja poistettiin vaha, vedettömät ja sijoitettiin 10 mmol /l sitraattipuskuria (pH 6,0), ja kuumennetaan kahdesti mikroaaltouunissa 5 min kukin. Laseja inkuboitiin 3% H2O2: ta 10 min ajan, pestiin PBS: llä, blokattiin 10% normaalia vuohen seerumia 30 min, ja sitten inkuboitiin anti-GPR4 (laimennettu 1: 100; lopullinen konsentraatio 2 ug /ml, käyttöikä, USA ) tai kaniinin normaalilla IgG kontrollina 4 ° C: ssa yön yli. Pesun jälkeen objektilasit värjättiin katalysoidun allekirjoitettu vahvistusta järjestelmän kit (DAKO code k5007) ja kuvat valokuvattiin Olympus IX70 mikroskoopilla. Semikvantitatiivinen ilmentyminen GPR4 laskettiin käyttäen Image-Pro Plus 6.0 -ohjelmisto.

Data Analysis

bioinformatiikan analyysi eroista GPR4 ilmaisun välillä syövät ja kontrollisilkkipaperia arvioitiin käyttäen Wilcoxonin rank- sumtest R (https://www.r-project.org/) ohjelmisto ympäristöön. Bonferronin korjauksen R toiminto ”p.adjust” käytettiin säätää P-arvoja. Kokeelliset tulokset analysoitiin käyttämällä Studentin t-testiä, jossa SPSS19.0 ohjelmisto. P-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

GPR4 stimuloi angiogeneesiä sytokiinierityksen happamassa Solunulkoisilla pH

Sen tutkimiseksi, GPR4 voisi aiheuttaa ekspression angiogeneesiä sytokiinien happamassa solunulkoista pH: ssa, olemme havainneet ilmaus IL6, IL8 ja VEGFA eri pH-arvoissa (pH 7,4, 6,5 ja 5,9). Yli-ilmentyminen GPR4 vuonna GPR4 tartunnan saaneiden solujen validoitu qPCR ja western blot (kuvio 1A). MRNA-tasot IL6, IL8 ja VEGFA Ad-GPR4 solujen lisääntynyt tilastollisesti merkitsevästi verrattuna Ad-null-solut vain pH: ssa 5,9 (kuvio 1 B). Kontrolleihin verrattuna, oli 67.8-, 118- ja 12,5-kertainen induktio varten IL6, IL8 ja VEGFA vastaavasti Ad-GPR4 soluissa. Tämä osoitti, että hapan solunulkoinen pH tehostaa angiogeneesiä sytokiiniekspressiota kautta GPR4, mikä vahvistettiin edelleen proteiinitasolla. Pitoisuudet IL6, IL8 ja VEGFA nosti merkittävästi supernatantissa GPR4 yli-ilmennetään soluissa verrattuna kontrollisoluihin pH: ssa 5,9 (kuvio 1C). Inhibiittori, SB203580, voisivat vähentää ilmentymistä ja erittymistä IL6, IL8 ja VEGFA (kuvio 2A ja 2B), mikä viittaa siihen, että p38 voi osallistua sytokiinien induktiota GPR4. Western blot suoritettiin tutkimaan jos GPR4 voisi lisätä p38 fosforylaatiota eri pH. Fosforylaatiota p38 kasvoi GPR4 yli-ilmennetään soluissa pH: ssa 5,9 (kuvio 2C), mikä voitiin estää SB203580 (kuvio 2D). Tuloksemme oli kirjeenvaihtaja että SCCHN, p38 konstitutiivisesti aktivoitu ja johtaa yhä sytokiinien IL6- ja IL8 [22].

Yhteensä-RNA ja proteiini Ad-GPR4-Fadu soluja, Ad-null- Fadu solut eristettiin sen jälkeen, kun happo stimulaation 6 tuntia. qPCR ja western blot suoritettiin. (A) yli-ilmentyminen GPR4 Ad-GPR4-Fadu solujen comfirmed qPCR ja western blot. (B) ekspressio IL6, IL8 ja VEGFA kasvoi merkittävästi GPR4 tartunnan saaneiden solujen pH 5,9. (C) supernatantit solut kerättiin ja pitoisuudet IL6, IL8 ja VEGFA havaittiin ELISA: lla. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin Tca8113 soluissa (S1 kuvio).

(A) Ad-GPR4-Fadu soluja, SB203580 vähentää ilmentymistä IL6, IL8 ja VEGFA pH 5,9. (B) SB203580 erityksen väheneminen IL6, IL8 ja VEGFA. (C) GPR4 lisääntynyt p38-fosforylaation pH5.9. (D) SB203580 estävät fosforylaatio p38 in GPR4 yliekspressoitu soluissa. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin Tca8113 soluissa (S2 kuvassa).

GPR4 edistää angiogeneesiä in vitro

Sen testaamiseksi, GPR4 voisi edistää putken muodostumiseen, HMEC-1-soluja inkuboitiin CM johdettujen kontrollista soluista ja GPR4 yliekspressoitu soluja. Pituudet putkien (nuolet) olivat merkittävästi lisääntynyt HMEC-1-solut inkuboitiin CM päässä GPR4 infektoiduista soluista verrattuna kontrollisoluihin pH: ssa 5,9 (kuvio 3A). Tämä osoitti, että yli-ilmentyminen GPR4 vuonna SCCHN voisi aiheuttaa angiogeneesiä in vitro happamassa pH: ssa. Vuonna SCCHN, angiogeneesi laukaisee IL-8, IL-6: n ja VEGF [23, 24]. Sen testaamiseksi, onko vaikutus GPR4 angiogeneesin välitti suoraan IL6, IL8 ja VEGFA eritystä, monoklonaalisia neutraloivia vasta-aineita (R tietojoukon talletetaan Cancer Genome Atlas (TCGA) alkaen yhteensä 72 potilasta on kerätty ja käyttää analyysiin [25].

Keräsimme 12 SCCHN näytettä (taulukko 2) ja suoritetaan RT-PCR: llä (kuvio 5A ja 5B) ja immunohistokemiallinen (IHC) värjäämällä (kuvio 5C ja 5D). Kaikki potilaat kärsivät refluksitaudin. Kuten on esitetty kuviossa 5, GPR4 monistettiin 9/12 näytteitä ja voimistunut kasvainkudoksessa (kuvio 5A), kun ympäröivä kasvain normaaleissa kudoksissa (kuvio 5B). GPR4 proteiini, joka ilmentyy korkeammilla tasoilla (punaiset nuolet) kasvainsoluissa verrattuna epiteelisolujen peri-kasvaimen normaaleja kudoksia. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin sekä kurkunpään ja hypopharyngeal syöpiä.

(A) RT-PCR GPR4 syöpäsoluissa kudoksissa. (B) RT-PCR GPR4 peri syöpää normaalien kudosten. GAPDH käytettiin sisäisenä standardina. (C) edustaja kuva IHC kohtalaisen eriytetty hypopharyngeal syöpä. (D) Peri-syöpä- normaalia kudosta samalta potilaalta kuin C. (E) Integroitu optinen tiheys (IOD) positiivisten ekspression solujen (nuolet) laskettiin käyttäen Image-Pro Plus 6.0 -ohjelmisto. Yhteensä 12 tapausta SCCHN olivat mukana. Taso immunoreaktiivisuus luokiteltiin laskemalla integroitu optinen tiheys (IOD) positiivisten ekspressiosoluja.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme ehdottaneet, että kun se altistetaan happamaan ympäristöön, GPR4, yksi protoni-tunnistus GPCR: ien, voivat aiheuttaa angiogeneesiä kautta angiogeneesiä sytokiinin erittymistä SCCHN. Sytokiinit mukana IL6, IL8 ja VEGFA, ja tämä vahvistettiin qPCR ja ELISA. Pro-angiogeeninen vaikutus GPR4 havaittiin putken muodostumisen määritys ja CAM malli.

Angiogeneesi on yksi tunnusmerkkejä syövän [26]. Kasvaimet voi kasvaa yli kriittisen koon tai etäpesäkkeitä muun elimen ilman verisuonten [27], joten ne on rekrytoida uusia verisuonia angiogeneesi. The ’angiogeenisten kytkin ”tasapainottaa angiogeneesiä ja anti-angiogeenisten molekyylien [27]. Yksi signaaleja, jotka laukaisevat tämä kytkin on alhainen pH. Ihmisen melanoomasoluja, happamassa pH: ssa lisää ekspressiota proangiogeeninen tekijät VEGFA ja IL8 [28]. GPR4 pääasiassa toimii protonin anturi ja ilmaistaan ​​endogeenisen in HMEC-1 ja HUVEC. Solunulkoinen asidoosi voi aktivoida GPR4 ja johtaa cAMP-tuotantoa [29]. Hypercapnic asidoosi voi myös aktivoida GPR4 stimuloimaan HUVEC adheesiomolekyyli ilmaisun ja tarttuvuus [30]. Toisessa tutkimuksessa osoitettiin, että GPR4 pelataan keskeinen rooli kasvun, muuttoliike, ja putki muodostumista endoteelisolujen, mutta pH: n muutoksia ei säädellä cAMP-tuotantoa HMEC-1 ja HUVEC [31]. HUVEC, asidoosi aktivoi GPR4 ja lisää ekspressiota IL1, IL2, IL6 ja IL8 [32]. GPR4, kuten pH-anturi, on täysin aktivoitu happamassa pH: ssa 6,8 ja osittain aktivoitu fysiologisella alueella (pH 7,4-6,8) [33, 34]. Refluksitaudin on yleinen tapahtuma pään ja kaulan alueen syöpäpotilasta [3], mikä tarkoittaa, että limakalvon ja kohdunkaulan altistuvat usein alhainen pH. Suhde matala pH ja kasvaimen angiogeneesiä SCCHN ei ole hyvin tutkittu. Tässä tutkimuksessa, ehdotimme, että Ad-null-Fadu ja Ad-null-Tca8113 solujen, alhainen pH ei voinut nostaa ilmaisun IL6, IL8 ja VEGFA. Ad-GPR4 soluissa, ekspressio IL6, IL8 ja VEGFA kasvoi merkittävästi verrattuna ohjaus pH: ssa 5,9, mutta ei pH: ssa 6,8 ja pH: ssa 7,4, mikä saattaa osoittaa, että GPR4 on täysin aktivoitu, pH 5,9 SCCHN ja tämä on sopusoinnussa edellisessä tutkimuksessa [12].

putki muodostumisen määritys ja CAM malli tarkistanut angiogeneesiä vaikutus GPR4. CM johdettu Ad-GPR4-Fadu indusoiman enää putkia HMEC-1-solut ja verisuonten tiheys CAM kuin muissa ryhmissä pH: ssa 5,9. Neutraloivat vasta-aineet IL6, IL8 ja VEGFA vähentää putken pituudet HMEC-1-solut, mikä osoittaa, että GPR4 angiogeneesin kautta IL6, IL8 ja VEGF eritystä. VEGFA ja IL6 kirjataan tärkein angiogeneesiä molekyylien SCCHN ja ovat yhteydessä taudin aggressiivisuuteen ja köyhien potilaiden hoitotuloksiin [35-40]. IL8, lopputuotteena VEGF-reitin, havaittiin myös korkeilla tasoilla SCCHN [40]. Koska tärkeä rooli angiogeneesin syövän etenemiseen, antiangiogeeniset aineet on kehitetty. Vuonna Fadu SCCHN ksenografteja, pitkäaikainen anto bevasitsumabia, joka on endoteelikasvutekijä vasta-, tehokkaasti moduloitu kemoterapia-teho [41]. Faasin II kliinisissä tutkimuksissa SCCHN potilailla, bevasitsumabi plus setuksimabi tai kemoterapiaa osoitti rohkaisevia tuloksia tehokkuudesta [42, 43]. Yliekspressio IL8 johti resistenssiä Bevasitsumabin SCCHN, joten yhteistyö kohdistaminen VEGF ja IL8 voivat auttaa voittamaan vastus ja parantaa terapeuttista tehoa.

Antasidit lääkkeitä kuten histamiini 2 -reseptorin antagonisti (H2-reseptorin salpaaja) ja protonipumpun estäjät (PPI ) käytetään aina hoidossa SCCHN potilailla. Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että käyttö antasidin lääkkeet voivat olla merkittäviä terapeuttisia hyötyjä SCCHN potilaille [44, 45]. Yksi niistä mekanismeista, voi olla, koska antasidin lääkkeet voivat moduloida tarttumista kasvainsolujen endoteeliin [44]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme osoittaneet, että GPR4 edistää pro-angiogeenisten tekijöiden eritystä happamassa pH: ssa. Nämä tulokset osoittavat, että inhibitio GPR4 tai happamassa pH: ssa voi johtaa tuumorin angiogeneesiä. Niinpä me spekuloida, että toinen todennäköinen mekanismi on, että antasidi lääkkeet voivat estää pro-angiogeenisten tekijöiden eritystä pH: ta nostamalla, ja sitten vähentää angiogeneesiä, joka on keskeisessä asemassa aikana syövän etenemiseen. Aikaisemmin osoitimme, että hapan solunulkoinen pH tehostaa matriisimetalloproteinaasi (MMP) lauseke kautta ERK signalointireitille in GPR4 yliekspressoitu soluissa. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että GPR4 voisi lisätä fosforylaation p38 pH 5,9, joka voitiin estää SB203580. SB203580 voisi vähentää ilmentymistä angiogeneesiä sytokiineja, jotka voivat osoittaa p38 on tärkeä rooli välittämisessä sytokiinien.

Yhteenvetona, olemme ehdottaneet, että GPR4 indusoi angiogeneesiä kautta GPR4 aiheuttama p38-välitteisen IL6, IL8 ja VEGFA eritystä happamissa solunulkoinen pH SCCHN.

tukeminen Information

S1 Kuva. GPR4 stimuloi sytokiinien eritystä happamassa pH: ssa Tca8113 soluissa.

Kokonais-RNA ja proteiini Ad-GPR4-Tca8113 soluja, Ad-null-Tca8113 solut eristettiin sen jälkeen, kun happo stimulaation 6 tuntia. qPCR ja western blot suoritettiin. (A) yli-ilmentyminen GPR4 Ad-GPR4-Tca8113 solujen comfirmed qPCR ja western blot. (B) ekspressio IL6, IL8 ja VEGFA kasvoi merkittävästi GPR4 tartunnan saaneiden solujen pH 5,9. (C) supernatantit solut kerättiin ja pitoisuudet IL6, IL8 ja VEGFA havaittiin ELISA: lla.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0152789.s001

(TIF)

S2 kuviossa. SB203580 vähentää sytokiinierityksen p38 fosforylaation Tca8113 soluissa.

(A) Ad-GPR4-Tca8113 soluja, SB203580 vähentää ilmentymistä IL6, IL8 ja VEGFA pH 5,9. (B) SB203580 erityksen väheneminen IL6, IL8 ja VEGFA. (C) GPR4 lisääntynyt p38-fosforylaation pH5.9. (D) SB203580 estävät fosforylaatio p38 in GPR4 infektoituneita soluja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0152789.s002

(TIF)

S3 Fig. Neutraloivat vasta-vaikutukset voivat olla päinvastainen lisäämällä ylimäärä IL6, IL8 tai VEGFA putken muodostumiseen määrityksessä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0152789.s003

(TIF) B S4 Fig . Tube muodostuminen määrityksessä Tca8113 soluja.

(A) Putki pituus (nuolet) ja HMEC-1-soluissa lisääntyi CM johdettu Ad-GPR4-Tca8113 soluissa verrattuna Ad-null- Tca8113 solujen pH 5,9. (B) Neutraloivat vasta-aineet IL6, IL8 ja VEGFA esti putken muodostumista HMEC-1-solut. Isotyyppiä IgG-vasta-ainetta käytettiin kontrollina neutraloimaan ainetesti.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0152789.s004

(TIF)

S5 Fig. Ad-GPR4-Tca8113 soluja rekrytoidaan enemmän verisuonten kuin Ad-null-Tca8113 solujen vasta pH 5,9 CAM mallissa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0152789.s005

(TIF) B S1 Tiedosto . Excel-tiedosto, joka sisältää sitä tukevat tiedot datan Tämän tutkimuksen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0152789.s006

(XLSX) B

Kiitokset

Kiitämme tohtori Pingzhang Wang ( Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center, Pekingin yliopiston Center for Human Disease genomiikka) varten bioinformatiikan analyysi.