Krooninen sairaus

tiivistelmä

Gene

MAGEA1

kuuluu ryhmään ihmisen ituradan-geenit, jotka ovat riippuvaisia ​​DNA metylaatio tukahduttamisvälineiden somaattisten kudoksissa. Monet näistä geeneistä, joita kutsutaan syöpä-ituradan (CG) geenit, tulee demetyloitunut ja aktivoida erilaisia ​​kasvaimia, jossa ne koodaavat kasvaimen antigeenejä. Prosessi johtaa DNA demetylaation CG geenien kasvaimia jää epäselväksi. Aiemmat tiedot osoittivat, että histoni asetylaatio voisi olla kyse. Täällä, tutkimme suhteellinen osuus DNA: n metylaation ja histoni asetylointi on epigeneettiset sääntelyn geenin

MAGEA1

. Osoitamme, että

MAGEA1

DNA hypometylaatio ilmaistessaan melanoomasolujen todellakin korreloi paikallisen korotukset histoni H3 asetylointi (H3ac). Kuitenkin, kun

MAGEA1

-negatiivinen solut altistettiin histonideasetylaasi- inhibiittori (TSA), havaitsimme vain lyhytaikaisia ​​aktivointi-geenin ja ei havaittu demetylaation sen promoottorin. Kuten herkempi määritys, käytimme solukloonin kätkeminen metyloitu

MAGEA1 /hph

rakentaa, joka antaa resistenssin hygromysiini, kun stabiili uudelleen aktivointi. TSA aiheuttama vain ohimenevä de-tukahduttaminen siirtogeenin, ja ei johtanut syntymistä hygromysiini-resistenttien solujen. Silmiinpistävä vastakohta, ohimenevä väheneminen DNA-metyylitransferaasi-1 reportteri solukloonia synnytti hygromysiinille resistentit väestöstä, jossa uudelleen aktivoitu

MAGEA1 /hph

siirtogeeni näytetä ole merkitty ainoastaan ​​DNA hypometylaatio, mutta myös merkittävä käänteinen histonimerkkien, mukaan lukien voitot H3ac ja H3K4me2 ja häviöistä H3K9me2. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että DNA: n metylaatio on hallitseva rooli epigeneettiset hierarkiassa säätelevät

MAGEA1

ilme.

Citation: Cannuyer J, Loriot A, Parvizi GK, De Smet C (2013) Epigeneettiset hierarkiaa

MAGEA1

Cancer-ituratageenisegmentit: Promoottori DNA metylointi sanelee paikallistason histonimodifikaation. PLoS ONE 8 (3): e58743. doi: 10,1371 /journal.pone.0058743

Editor: Wei-Guo Zhu, Pekingin yliopiston Health Science Center, Kiina

vastaanotettu: 30 marraskuu 2012; Hyväksytty: 05 helmikuu 2013; Julkaistu 5 maaliskuuta 2013

Copyright: © 2013 Cannuyer et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: JC on sen vastaanottajalle FSR-FNRS-Télévie avustus (https://www2.frs-fnrs.be/). GKP sai apurahan alkaen FSR-FNRS-FRIA (https://www2.frs-fnrs.be/). Tätä työtä tukivat FRSM avustusta FSR-FNRS (vrt. 3.4563.11, https://www2.frs-fnrs.be/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

DNA: n metylaatio, esiintyvät enimmäkseen CpG dinukleotideissä, on voimakas mekanismi geenin repression nisäkässoluissa [1]. Kudosspesifisiä malleja CpG metylaation, joka on perustettu aikana alkionkehityksen, yleensä hyvin säilynyt aikuisten solujen, mutta tulevat muuttaneet perinpohjaisesti syöpäsoluissa [2]. Molemmat voitot (hypermetylaation) ja tappiot (hypometylaatio) DNA metylaatio voidaan havaita samassa kasvainsolu. Poikkeava hypermetylaation syövän vaikuttaa usein edistäjä kasvaimeen synnyssä, ja siksi on liittynyt menetys kasvaimen ehkäisevästä toimintojen [3]. DNA hypometylaatio, toisaalta, on havaittu eri sekvenssien syövän genomien, mukaan lukien toistuvat sekvenssit [4], ja sen osoitettiin tuodaan esille genomisen epävakauden [5]. Yllättäen DNA hypometylaatio kasvaimissa on liittynyt transkription aktivoituminen vain rajallinen määrä geenejä, joista suurin osa on normaalia Ilmentymisalue rajoittuu iturataan [6]. Tämä tietty ryhmä geenejä nimettiin syöpä-ituradan (CG) geenit [7]. Ihmisen CG-geenit sisältävät noin 50 geenejä tai geenien perheiden kohdistamaan erilaisia ​​solutoiminnoille [8]. Aktivointi näistä geeneistä on raportoitu erilaisia ​​kasvaimen tyypit, mukaan lukien keuhkosyöpä, pään ja kaulan alueen syöpä, virtsarakon syöpä, ja melanooma. Yksi merkittävä seuraus aktivaation CG geenien kasvaimia on tuotannon kasvaimen antigeenejä, jotka voidaan tunnistaa sytolyyttisten T-lymfosyyttien [9]. Kliiniset kokeet syövän rokotus kohdistettu tällaisia ​​antigeenejä ovat käynnissä [10]. Voidaan ajatella, ymmärtää mekanismeja, jotka edistävät CG geenisäätelyn voi helpottaa kehittämistä geenin induktion strategioita, jotka tekisivät kasvainsolujen herkempiä immunoterapiaa.

johtava prosessi DNA hypometylaatio ja myöhemmän aktivaation CG geenien kasvaimia jää epäselväksi [11]. Yksi mahdollisuus on, että DNA demetylaatio at CG geenit on seurausta muutoksista tasolla histoniproteiineista, ydinosat kromatiinin. Erityiset tähteiden histoni hännät tehdään erilaisia ​​kemiallisia muunnoksia, kuten asetylointi ja metylointi, joka vaikuttaa kromatiinirakenteeseen ja transkriptio [12]. Useat histonimodifikaation näyttävät myös säädellä DNA metylaatio todetaan [13]. Tukahduttavaa histonimerkkien, kuten metylaatio histoni H3 lysiinin 9 tai 27 (H3K9 tai H3K27), osoitettiin sanella laskeuma DNA: n metylaatio tietyissä loci, suosimalla paikallista rekrytointia DNA metyylitransferaasien [14], [15]. Toisaalta, aktivoimalla histonimodifikaation kuten histoni asetylaatio tai metylaatio histoni H3 lysiinin 4 (H3K4) näyttävät estävän DNA-metylaatio koneet [16], [17]. Näin ollen se oli houkuttelevaa ehdottaa, että DNA demetylaation at CG geenit saattavat olla seurausta muutoksista tasolla histonimodifikaation.

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että CG geeni promoottorit liittyvät usein H3K9 ja H3K27 metylaatio ei- ilmentäviä soluja. Nämä tukahduttavaa muutokset yleensä häviävät aktivoinnin CG geenien kasvainsoluissa, ja tilalle aktiivinen histonimerkkien, kuten histoni asetylaatio ja H3K4 metylaatio [18], [19]. Keskeinen kysymys on, ovatko muutokset tasolla histonimodifikaation ovat syy tai seuraus CG geenin promoottori-DNA demetylaatio kasvainsoluissa. Tutkimukset käyttäen inhibiittorit H3K9 ja H3K27 metyylitransferaasit osoittivat, että nämä olivat omasta pysty indusoimaan merkittävää DNA demetylaation ja aktivointi CG geenien [18], [19]. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin seuraavia inhibition H3K4 demethylases [19]. Sen sijaan useat tutkimukset raportoitu, että CG-geenin ilmentyminen voidaan indusoida soluissa, joita käsiteltiin inhibiittorin histonideasetylaaseja [20] – [22]. Eräässä raportissa [20], mutta ei muita, oli hoidossa osoitettu aiheuttavan DNA demetylaation CG geenin promoottori. Nämä havainnot esiin siis sitä mahdollisuutta, että voitot on histoni asetylaatio voi olla riittävä laukaista aiheuttavat DNA demetylaation ja aktivointi CG geenien tuumorisoluissa.

Esillä olevassa tutkimuksessa arvioimme mahdollisuuksia histoni asetylaatio indusoida DNA demetylaatio ja aktivointi geenin

MAGEA1

, hyvin tunnettu jäsen CG ryhmän geenejä. Tämä arvioitiin testaamalla vaikutus trikostatiini A (TSA), histonideasetylaasi- inhibiittoria, ei-ilmentävien melanoomasolujen ja solun klooni kätkeminen metyloitu

MAGEA1 /hph

rakentaa, joka mahdollistaa valinnan (hygromysiiniresistenssi ) soluja, joissa aktivointi siirtogeenin tapahtunut. Lisäksi tämä herkkä reportteri solujen järjestelmää, jota käytetään käänteisen kokeen, jossa me arvioitiin kyky inhibiittorin DNA: n metylaatio aiheuttaa muutoksia histonimerkkien sisällä

MAGEA1

promoottori.

tulokset

histoni muutoksia, jotka liittyvät

MAGEA1

aktivaation melanoomasolulinjojen

tunnistamiseksi histonimodifikaation muutoksia, jotka liittyvät

MAGEA1

aktivointia, teimme chromatin immunosaostus (chip) kokeiluja ei-ilmentäviä ja ilmentämissolulinjat. Kokeet suoritettiin kuolemattomaksi ihmisen esinahan fibroblastit (HFF2-hTERT) ja kaksi melanoomasolulinjoja, jotka eivät ilmennä

MAGEA1

(SK-MEL-23 ja EB16-MEL), sekä kolme melanoomasolulinjat, että do ilmaista

MAGEA1

(MZ2-MEL3.1, BB74-MEL ja Mi13443-MEL). Kuten odotettua, arviointi

MAGEA1

promoottori-DNA: n metylaation tason kvantitatiivisen MS-PCR: llä näissä solulinjoissa, osoitti korkean metylaatiotasoilla ei-ilmentävien solujen ja alhainen metylaatio ilmentävät solut (Fig. 1A). ChIP kokeita, tutkimalla

MAGEA1

5′-alue, paljasti etuoikeutetut rikastamisen dimetyloidut H3K9 (H3K9me2) in

MAGEA1

-negatiivinen versus

MAGEA1

positiivisia solulinjoja (kuvio . 1 B). Silmiinpistävä vastakohta, asetylaatio histoni H3 (H3ac) ja dimetylaatio on H3K4 (H3K4me2) sisällä

MAGEA1

5′-alueella lisääntyi selvästi kolmen ilmentäviä solulinjoja, verrattuna ei-ilmentävien solujen (Fig. 1 B). Merkittävää rikastumista trimetyloidaan H3K27 (H3K27me3) sisällä

MAGEA1

5′-alueen havaittiin HFF2-hTERT-solut, mutta ei mitään muita solulinjoja. Yhdessä meidän tulokset viittaavat siihen, että DNA-demetylaation ja aktivointi

MAGEA1

melanoomasoluissa liittyy menetys H3K9me2, ja voitot H3ac ja H3K4me2 sisällä 5′-geenin alue. Tämä oli sopusoinnussa mahdollista roolia histoni asetylointi on epigeneettiset aktivointi

MAGEA1

tuumorisoluissa.

,

MAGEA1

mRNA ekspressiotasot (ylempi paneeli) ja 5′-alueen DNA: n metylaation tason (alempi paneeli) arvioitiin kolme ei-ilmentäviä solulinjoja (HFF2-hTERT, SK-MEL-23 ja EB16-MEL) sekä kolme ilmentäviä solulinjoja (MZ2 -MEL3.1, BB74-MEL ja Mi13443-MEL). Arvot edustavat keskiarvoa (± SEM) kahdesta erillisestä qRT-PCR: llä tai QMS-PCR, jolloin aina kahtena kappaleena.

B

, siru-kvantitatiivinen PCR: ää käytettiin saman solulinjojen arvioida rikastuminen ilmoitettu histoni Räätälöinti joko

MAGEA1

5′-alue tai

GAPDH

promoottori (joka edustaa kaikkialle aktiivinen promoottori). Tiedot ilmenevät vähintään kaksi riippumatonta ChIP kokeita kahdella kahtena qPCR toimenpiteet kussakin tapauksessa.

TSA indusoi ohimenevä aktivoituminen

MAGEA1

melanoomasoluissa

jotta voitaisiin arvioida panos histonien asetylointi on epigeneettiset sääntelyn

MAGEA1

, otimme esiin SK-MEL-23 ja EB16-MEL solulinjojen histonideasetylaasi (HDAC) estäjä TSA, ja tutkitaan sen vaikutus transkription ja DNA: n metylaatio tasolla geenin. SK-MEL-23-solut, altistuminen TSA liittyi 3,3-kertainen nousu

MAGEA1

mRNA-tasolla, kun arvioidaan yhden päivän kuluttua hoidon. Kuitenkin tämä vaikutus katosi päivää 4 ja 7 hoidon jälkeen (Fig. 2A). In EB16-MEL, emme voineet havaita mitään merkittävää aktivoitumista

MAGEA1

jälkeen TSA (Fig. 2A), mikä oli yhdenmukainen aiempien tietoja, jotka osoittavat, että vaikutus TSA

MAGEA1

aktivointi on solu-tyyppiriippuvainen [22]. Vertailun vuoksi molemmissa solulinjoissa käsiteltiin DNA: n metylaation inhibiittorin 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-azadC). Koska tämä lääke aiheuttaa replikointi-riippuvaisena DNA-demetylaation, hoito säilyi neljä päivää ennen analyysiä. Kvantitatiivinen RT-PCR kokeet paljastivat, että 5-azadC (1 uM) indusoi merkittäviä

MAGEA1

ilmaisua molemmissa solulinjoissa. SK-MEL-23-soluja, taso

MAGEA1

mRNA havaittiin sen jälkeen, kun 4 päivää 5-azadC hoito oli 135 kertaa suurempi kuin on havaittu yhden vuorokauden kuluttua TSA hoitoon. Lisäksi molemmissa solulinjoissa, 5-azadC-indusoidun aktivaation

MAGEA1

vielä havaittiin päivinä 3 ja 6 poistamisen jälkeen lääkkeen (Fig. 2B).

SK-MEL -23 ja EB16-MEL solulinjoja altistettiin joko 300 nM TSA 24 h aikana (

), tai 1 uM 5-azadC aikana 96h (

B

), ja RNA uutettiin soluja päivinä 1, 4 ja 7, kun TSA hoidon tai päivinä 4, 7, 10 sen jälkeen, kun 5-azadC hoitoon.

MAGEA1

ilmentymisen tasot määritettiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä. Arvot, jotka ovat peräisin kolmesta itsenäisestä kokeesta, normalisoitiin

ACTINB

ekspressiotaso, ja on ilmaistu suhteessa vallinneelle tasolle kuin käsitellyissä soluissa (ctrl). *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001.

C

, vaikutus TSA ja 5-azadC on

MAGEA1

5′-alueen DNA demetylaation arvioitiin käyttämällä MS-PCR: llä DNA-näytteitä uutettiin 10 päivää sen jälkeen, kun alusta hoitoja. Data (fold demetylaation) vastaavat suhteellisen määrän metyloimattomien sekvenssien käsitellyissä soluissa raportoitu hoitamattomilla soluissa (ctrl). Arvot edustavat keskiarvoa (± SEM) kolmen itsenäisen Qms-PCR kokeissa. *

P

0,05, **

P

0,01.

Yhdenmukainen meidän ilme tutkimuksissa, kvantitatiivinen MS-PCR tulokset paljastivat, että TSA ei aiheuttanut merkittävä lasku

MAGEA1

promoottori metylaatio tasolla, joko SK-MEL-23 tai EB16-MEL solulinjoissa (Fig. 2C). Merkittävä demetylaation

MAGEA1

promoottorin sijasta havaittiin molemmissa solulinjoissa jälkeen 5-azadC hoitoa (Fig. 2C).

Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että vaikka TSA voi aiheuttaa ohimenevää derepression on

MAGEA1

in alunperin ei-ilmentäviä soluja, se ei johda DNA demetylaatio ja pitkäaikainen transkription aktivoitumisen geenin.

histonimodifikaation liittyy

in vitro

metyloitu

MAGEA1

siirtogeenin

kyvyttömyys havaita TSA aiheuttama demetylaatio ja pitkäaikaisen aktivoitumisen geenin

MAGEA1

, kuten on raportoitu tässä edellä, saattaa johtua kokeellisen rajoituksista . On mahdollista, todellakin, että epigeneettiset vaikutus TSA

MAGEA1

tapahtunut vain pieni osa soluista, jolloin sitä on vaikea havaita merkittäviä geeniaktivaatiota ja DNA metylaatiomuutokset käsitellyssä solupopulaation. Lisäksi avoin epigeneettisiä aktivointi

MAGEA1

TSA voi vaatia läsnä sopivien transkriptiotekijöitä, jotka voivat olla läsnä SK-MEL-23 tai EB16-MEL-solulinjat. Olemme osoittaneet, todellakin, että pitkän aikavälin aktivoinnin

MAGEA1

ei ainoastaan ​​DNA-demetylaation prosessi, mutta myös läsnä transkription aktivaattoreita estää myöhemmin remetylaatiossa promoottorin [23].

Tämän vuoksi päätimme arvioida uudelleen vaikutusta TSA on aiemmin perustettu solu järjestelmä (MZ2-MEL.TrHM), joka sisältää valittavissa

MAGEA1

rakentaa [24]. MZ2-MEL.TrHM solut sisältävät siirtogeenin (

MAGEA1 /hph

), joka käsittää suuren osan

MAGEA1

lokus (mukaan lukien promoottori alue), jota seuraa sekvenssi, joka koodaa resistenssin hygromysiinille (

hph

; Fig. 3A). Siirtogeeniä metyloitiin

in vitro

ennen transfektiota, ja pysyy metyloidut ja äänetön MZ2-MEL.TrHM soluja, jotka ovat sen vuoksi herkkiä hygromysiinille. Olemme kuitenkin osoitti, että hygromysiini-resistenttejä (hygro

r) solukloonien syntyy kun

MAGEA1 /hph

siirtogeenin tulee vakaasti aktivoitu, esimerkiksi seuraavia ohimeneviä hoidon 5-azadC [24]. Tärkeää on, MZ2-MEL.TrHM solut olivat peräisin

MAGEA1

ilmentävä melanoomasolulinja. Nämä solut siis oltava kaikki tarvittavat transkriptiotekijöitä varmistaa pitkän aikavälin aktivointi geenin promoottori, osoituksena läsnäolo aktiivisen ja metyloitumattomat endogeenisen

MAGEA1

geeni.

, Kaavioesitys rakenteen ja DNA metylaatiostatuksen aktiivisen metyloimatonta (tyhjät ympyrät)

MAGEA1

geenin ja aktiivinen metyloitu (täytetyt ympyrät)

MAGEA1 /TES-

siirtogeenin MZ2-MEL .TrHM soluja. Mustat laatikot vastaavat

MAGEA1

eksonit, tummanharmaa laatikko sisällä

MAGEA1 /hph

siirtogeenin edustaa

hph

transkriptioyksikkö, ja tähti (*) on sivusto, jossa on 12 emäsparin tag-sekvenssi (kantaen

Xba

restriktiokohta) lisättiin. Alempi paneeli on suurennos amplikonin, joka monistettiin siru kokeita, ja osoittaa odotettu fragmenttikokoja seuraavat

Xba

I ruoansulatusta.

B

, siru kokeita sovellettiin MZ2-MEL.TrHM. Saatu

MAGEA1

amplikonien pilkottiin

Xba

I ja erotettiin agaroosigeeleillä, siten paljastaen suhteellinen rikastuminen ilmoitettu histonimodifikaation sisällä joko

MAGEA1

geenin (ylemmän kaistan ) tai

MAGEA1 /hph

siirtogeenin (alempi kaista).

C

, suhteellinen rikastuminen histonimerkeissä siirtogeenin pääteltiin määrällisesti kaistaintensiteettejä in geelielektroforeesi kuvia (ImageJ ohjelmisto), ja laskemalla alemman /ylemmän suhde. Data, joka normalisoitiin alemman /ylemmän suhde tulonäytteiden, peräisin vähintään kahden itsenäisen ChIP kokeita kahdella PCR /Xbal /elektroforeesin analysoi kussakin tapauksessa. *

P

0,05, ***

P

0,001.

ensimmäinen suoritettu ChIP kokeissa tunnistamaan histonimodifikaation liittyvä hiljainen

MAGEA1 /TES-

siirtogeenin MZ2-MEL.TrHM soluissa. Läsnäolo-tag-sekvenssi

MAGEA1 /HPH

siirtogeenin, lisätään asemassa +158 suhteessa transkription aloituskohdasta ja sisältävät

Xba

-I restriktiokohta, salli meidän erottaa

MAGEA1

amplikoneihin peräisin joko eksogeenisen siirtogeenin tai endogeeninen geeni. Siten MZ2-MEL.TrHM chromatin johdettu

MAGEA1

amplikoneihin pilkottiin

Xba

-I, jolloin saadaan ylempi kaista (330 bp) peräisin endogeeninen

MAGEA1

geenin ja alemman nauhan (269 bp), jotka johtuvat

MAGEA1 /hph

siirtogeenin seuraavat elektroforeesilla agaroosilla (Fig. 3A, B). Soveltamalla tätä menettelyä analyysiin siru johdettujen chromatin näytteitä, huomasimme, että H3ac ja H3K4me2 histonimerkkien voimakkaasti köyhdytetty sisällä

MAGEA1 /HPH

siirtogeenin, verrattuna endogeenisen

MAGEA1

geenin. Sen sijaan, tukahduttava H3K9me2 merkki ilmestyi pääasiallisesti rikastettua sisällä siirtogeenin (Fig. 3B, C). Nämä tulokset osoittavat, että sen jälkeen integroitumista MZ2-MEL.TrHM genomin,

in vitro

metyloitu

MAGEA1 /hph

siirtogeenin hyväksyi histonimerkkien liittyy tyypillisesti tukahdutettu tilan

MAGEA1

geeni ei-ilmentävien solujen.

puute pitkäaikaisen aktivoitumisen

MAGEA1 /hph

seuraavat TSA hoidon

Kuten huomasimme alhainen histoni asetylaatio sisällä hiljainen

MAGEA1 /hph

siirtogeenin, testasimme kykyä TSA aiheuttaa stabiilin aktivointi siirtogeenin, ja siten syntyy hygro

r-kloonien joukossa käsiteltiin MZ2-MEL.TrHM solupopulaation. Lisäksi tavanomaisen 24 TSA hoitoa, joka on 72 tuntia pitkä TSA altistuksen levitettiin MZ2-MEL.TrHM soluja, koska on raportoitu, että pitkäaikainen hoito HDAC-estäjät voivat joissakin tapauksissa olla tarpeen indusoida paikallisia DNA demetylaatio [25]. Pitoisuus TSA 72 tunnin hoidon alennetaan 80 nM, koska suuremmilla annoksilla havaittiin tappaa useimmat solut tämän ajanjakson aikana. Lisäksi TSA-käsiteltyjä soluja, analysoimme myös soluja käsiteltiin optimaalinen annos 5-azadC (20 nM; Fig. 4A). 5-azadC tällä annoksella havaittiin indusoivan

MAGEA1 /hph

mRNA: n ilmentymisen tasolle verrattavissa niihin, 1. päivänä seuraavan 24 TSA hoitoa (Fig. 4B). Siksi hoito-optimaalinen annos 5-azadC pystyimme tarkistaa, onko meidän hygromysiini valintamenettely oli vielä tehokkaasti olosuhteissa, joissa vain matalan tason aktivointi siirtogeenin tapahtui.

, kaavamainen ääriviivat kokeen. MZ2-MEL.TrHM soluja käsiteltiin tai ei (kontrolli) kanssa 300 nM TSA 24 tuntia, 80 nM TSA 72 h tai 20 nM 5-azadC varten 72h. Kolmen päivän kuluttua, 10

6 solua kustakin ryhmästä siirrettiin kahteen pulloihin (75 cm

2), ja valittiin väliaineessa, joka sisälsi hygromysiiniä (180 ug /ml) aikana 13 päivää.

B

, ilmentymistaso on

MAGEA1 /hph

siirtogeenin kvantifioitiin qRT-PCR osoitettuna ajankohtana (d1 tai d3) kussakin ryhmässä soluja. Tulokset edustavat keskiarvoa (± SEM) on al vähintään kolmen itsenäisen kokeen. ***

P

0,001.

C

, taso DNA demetylaation

MAGEA1 /hph

5′-alue eri solujen arvioitiin kvantitatiivinen MS-PCR käyttäen alukkeita, jotka nimenomaan täydentää koodattu siirtogeeni sekvenssi. Tiedot (fold DNA demetylaation) laskettiin kuvassa 2C, ja vastaavat keskiarvoa (± sem) vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *

P

0,05.

D

, kloonien lukumäärä, jotka selvisivät selektoimalla hygromysiinin laskettiin päivänä 16 kolmeen ryhmään soluja. Tiedot ilmenevät ainakin kaksi erillistä koetta, jokainen kahtena.

kvantitatiivinen RT-PCR kokeet paljastivat, että vaikka pieni mutta merkittävä

MAGEA1 /hph

mRNA induktio havaittiin päivänä 1 Seuraavat 24h TSA hoitoa, tämä induktio oli jo menettänyt kaksi päivää myöhemmin (Fig. 4B). MZ2-MEL.TrHM soluja, jotka oli altistettu 72 tunnin TSA hoito näkyy hyvin vaatimaton nousu

MAGEA1 /hph

mRNA: n ilmentymisen (ei merkitsevä,

p = 0,1428

), verrattuna kontrollisoluja (Fig. 4B). Tämä vähäinen induktio oli todennäköisesti johtuu alennettua pitoisuus TSA tässä kunnossa. Lisäksi kvantitatiivinen MS-PCR suunnattu erityisesti siirtogeenisten

MAGEA1

5′-alueella, ei paljastanut demetylaatio tämän DNA-sekvenssin joko TSA-käsiteltyjen solujen populaatioita, verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuvio. 4C) . Sitä vastoin solut, joita käsiteltiin-optimaalinen annos 5-azadC näkyy kohtalainen, vaikkakin merkittävä, DNA demetylaation

MAGEA1 /HPH

siirtogeenin.

Jotta voidaan havaita harvinainen soluihin jossa

MAGEA1 /hph

siirtogeenin aktivointi on saattanut tapahtua, ja jotka ovat voineet jäädä näkymättömäksi meidän RT-PCR ja MS-PCR-analyysit, esitimme eri käsitelty MZ2-MEL.TrHM solupopulaatioden valinnan hygromysiini. Kun 13 päivän valinta, hygro

r pesäkkeet laskettiin. Keskimääräinen tiheys hygro

r kloonit jälkeen saatu joko 24 tai 72 tunnin TSA hoito (6 x 10

-6 ja 5,5 × 10

-6, vastaavasti) ei ollut suurempi kuin mitä havaitaan käsittelemätön kontrolli soluja (9,5 x 10

-6), ja vastasi näin ollen taustan tasolle spontaanisti hygro

r revertanttien soluja (Fig. 4D). Verrattuna hoito-optimaalinen annos 5-azadC johti syntymistä huomattavasti suurempi määrä hygro

r klooneja ( 3 x 10

-4). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että TSA ei indusoi DNA demetylaatio ja vakaa aktivointi

MAGEA1 /HPH

siirtogeenin, ei edes pieni osa käsitellyn MZ2-MEL.TrHM soluissa.

DNA demetylaatio indusoi kääntyminen histonimerkkien in

MAGEA1 /hph

Kun otetaan huomioon aiempien tutkimusten toisten [18], [19], ja havainnot me tässä aikaisemmin kuvatut, on epätodennäköistä, että muutokset tasolla histonimodifikaation voi omasta olla riittävä laukaista aiheuttamaan DNA demetylaatio ja pitkän aikavälin aktivointi

MAGEA1

geeni. Oli siis kohtuullista ehdottaa, että käänteinen histonimerkkien liittyy

MAGEA1

aktivointi on sen sijaan seurausta DNA demetylaatio. Tämän hypoteesin testaamiseksi, me turvautuneet aiemmin perustettu hygro

r Saharan väestö MZ2-MEL.TrHM soluja (H

r väestö, Fig. 5A ja [24]), joka oli saatu seuraavat ohimenevä altistuksen solujen antisense-oligonukleotidien kohdistuu

DNMT1

, hallitseva DNA metyylitransferaasi näissä soluissa [24]. Päätimme tehdä ChIP kokeita H

r väestö, jotta voidaan määrittää vaikutusten DNA demetylaatio on H3ac, H3K4me2 ja H3K9me2 histonimerkkien sisällä

MAGEA1 /HPH

siirtogeenin. Analyysit suoritettiin myös solun klooni (H

r klooni 1), joka oli eristetty H

r väestöstä (Fig. 5A). Kvantitatiivinen RT-PCR ja natriumbisulfiitin sekvensointi vahvisti vankan transkription aktivaation ja DNA demetylaation

MAGEA1 /TES-

siirtogeenin H

r väestö ja H

r klooni 1 (Fig. 5B).

, Kaavamainen ääriviivat johtaminen H

r väestö ja H

r klooni 1 mistä MZ2-MEL.TrHM soluissa (katso viite [24] lisätietoja) . MZ2-MEL.TrHM soluja toistuvasti transfektoiduissa kanssa vastinjuosteoligonukleotidit suunnattu

DNMT1

(

DNMT1-AS

) 7 päivän ajan, ja oli sen jälkeen siirrettiin alustassa, joka sisältää hygromysiini. 9 päivän kuluttua hygromysiinin valinta, kestävä väestö syntynyt (H

r väestö), ja klooni (H

r klooni 1) eristettiin tästä väestöstä rajoittavan laimennuksen. H

r väestö ja H

r klooni 1 sittemmin viljeltiin ilman hygromysiini valintaa.

B

, mRNA ekspressiotaso (suhde 10

4

ACTINB

) ja 5′-alueen DNA metylaatio tila (% metyloituja CpG: t) ja

MAGEA1 /hph

siirtogeenin määritettiin MZ2-MEL.TrHM soluja, H

r väestö ja H

r klooni 1 qRT-PCR ja bisulfiitti sekvensointi vastaavasti.

C

, siru-qPCR käytettiin arvioimaan rikastuminen H3K9me2 sisällä

MAGEA1 /TES-

siirtogeenin kolmeen ryhmään soluja (katso tekstistä yksityiskohdat). Kertainen rikastus tasot saatiin raportoimalla

MAGEA1

5′-alue rikastamiseen arvoja kuin

GAPDH

5′-alueen samasta näytteestä. Tiedot edustavat keskiarvoa (± SEM) kahdesta kolmeen ChIP kokeita kahdella kahtena qPCR mittausta kussakin tapauksessa. ***

P

0,001.

D

, siru /PCR /

Xba

I menettely (ks. 3A, B) levitettiin arvioida rikastumista H3ac ja H3K4me2 sisällä 5′-alueella

MAGEA1 /hph

siirtogeenin kolmessa soluryhmän.

E

, ImageJ analyysit geelielektroforeesia kuvat käytettiin määrällisesti

MAGEA1

5′-alue siirtogeenin /-geenin suhteen. Tulokset edustavat keskiarvoa (± SEM) kahdesta itsenäisestä ChIP kokeissa, jossa on kaksi PCR /Xbal /elektroforeesin analysoi kussakin tapauksessa. **

P

0,01, ***

P

0,001.

analyysi H3K9me2, palanäytteitä toimitettiin kvantitatiivisia PCR alukkeet ei erotella endogeenisen ja siirtogeenisiä

MAGEA1

sekvenssit. Puute H3K9me2 sisällä endogeenisen aktiivinen

MAGEA1

geenin MZ2-MEL.TrHM soluissa (ks. 3B, C) hiljaista kuitenkin, että suurin osa chip peräisin amplikoneihin olisi peräisin

MAGEA1 /hph

siirtogeenin. Tulokset, jotka on esitetty kuviossa 5C, olivat yhdenmukaisia ​​vähentynyt rikastuminen H3K9me2 sisällä 5′-alue

MAGEA1 /TES-

H-

r väestö ja H

r klooni 1 verrattuna kontrolli MZ2-MEL.TrHM soluissa. Analysointia varten H3ac ja H3K4me2, me turvautuneet ChIP-PCR-

Xba

I edellä kuvattua menettelyä (Fig. 3A). Tulokset osoittivat, että vaikka

MAGEA /hph

siirtogeeni ei liittynyt H3ac ja H3K4me2 in MZ2-MEL.TrHM ohjaus solujen, se näkyy merkittävää rikastumista näiden kahden aktivoinnin merkkien H

r väestö ja H-

r klooni 1 (Fig. 5D, E). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että ohimenevää ehtyminen DNMT1 in MZ2-MEL.TrHM soluja, johti syntymistä hygro

r soluja, joissa uudelleen aktivoitua

MAGEA1 /hph

lokuksen näytetä paitsi merkitä DNA hypometylaatio, mutta myös merkittävä käänteinen sen histonimodifikaation profiilia kohti aktiivikonfiguraatiossa.

keskustelu

Genome hypometylaatio havaitaan usein tuumorisoluissa, ja on liittynyt pahanlaatuinen etenemiseen. Silti mekanismeista tämä epigeneettisellä muutos ovat vielä tuntemattomia. Kun otetaan huomioon tiukka yhteys välistä DNA: n metylaation ja histonimodifikaation oli kohtuullista ehdottaa, että DNA hypometylaatio kasvaimissa saattaa olla seurausta tapahtuvien muutosten tasolla histonimerkkien. Korjauksilla histonimodifikaation profiilit todellakin havaittu eri kasvaintyypeissä, ja on joissakin tapauksissa liittynyt mutaatioihin histoni modifioivia entsyymejä [26].

Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet suhdetta DNA metylaatio ja histonimodifikaation sisällä

MAGEA1

geenin, koska se kuuluu ainutlaatuisia CG geenejä, jonka promoottori hypometylaatio on usein havaittu erilaisia ​​kasvaimia ja johdonmukaisesti liittyvät transkription aktivaation [11]. Aikaisemmin on raportoitu, että demetylaation ja aktivointi CG geenien kasvaimiin yleensä liittyy tappioihin tukahduttavia histonimerkkien, ja voitot aktivoimisessa histonimerkkien [18], [19]. Tällainen yhdistys vahvistettiin tämänhetkiseen tutkimuksessa, kun huomasimme, että

MAGEA1

demetylaatio ja aktivoinnin melanoomasolujen korreloivat tappiot H3K9me2, ja voitot H3ac ja H3K4me2. Aiemmat tutkimukset kuitenkin osoittivat, että ilmentyminen

MAGEA1

ei voitu aktivoida yksinkertaisesti moduloimalla H3K9me2 tai H3K4me2 tasoja, mikä viittaa siihen, että nämä kaksi histonimodifikaation ainoastaan ​​toissijainen rooli epigeneettiset sääntelyn tämän geenin [18], [19]. Estäjiä histonideasetylaaseja, kuten TSA, oli sen sijaan havaittiin indusoivan aktivaatio

MAGEA1

, mikä tarkoittaa, että histoni asetylaatio saattavat myötävaikuttaa aktiivisesti epigeneettiset sääntelyn tämän geenin [22], [27]. Nykyinen tiedot osoittavat kuitenkin, että TSA käsittely johtaa vain ohimenevä aktivoituminen

MAGEA1

eikä indusoi DNA demetylaation geenissä promoottori.

Tutkimus tarjoaa perusteellisen vaikutusten analysointi TSA on

MAGEA1

aktivointia, koska testasimme sen vaikutuksia paitsi ei-ilmentäviä solulinjoja, mutta myös MZ2-MEL.TrHM solun klooni, joka sisältää

in vitro

metyloituja siirtogeenin, joka käsittää 5 ’osan

MAGEA1

jota seuraa sekvenssi, joka koodaa resistenssin hygromysiinille. Tämä solu järjestelmä tarjoaa suuren herkkyyden, koska se sallii solujen valinnan (vaikka ne ovat harvinaisia), jossa aktivointi

MAGEA1

promoottorin tapahtunut. Lisäksi, koska solut ilmentävät endogeenistä

MAGEA1

geeni, ne ilmeisesti oltava kaikki tarvittavat tekijät varmistaakseen transkription aktivoitumisen siirtogeenisten

MAGEA1

promoottori, kun se on päästänyt valloilleen chromatin rajoituksia. Tärkeintä, osoitti, että toisin kuin endogeeninen

MAGEA1

-geenin promoottori, eksogeeninen

MAGEA1

siirtogeenin promoottorista MZ2-MEL.TrHM solujen liittyy korkea H3K9me2 ja alhainen H3ac ja H3K4me2.