Krooninen sairaus

tiivistelmä

Terapeuttisia tarkoituksia, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on perinteisesti pidetty yksittäinen sairaus. On kuitenkin todisteita viittaavat siihen, että kaksi suurta alatyyppiä NSCLC, adenokarsinooma (AC) ja okasolusyöpä (SqCC) reagoivat eri tavoin sekä molekyylitason kohdennettuja ja uuden sukupolven chemotherapies. Siksi tunnistaa molekyylitasolla erot näiden kasvaintyypeille voivat vaikuttaa uusia hoitostrategia. Suoritimme ensimmäinen laajamittainen analyysi 261 ensisijaisen NSCLC kasvaimia (169 AC ja 92 SqCC), integrointi genominlaajuisten DNA kopioluvun, metylaatio ja geeniekspressioprofiilien tunnistaa alatyypin erityisiä molekyyli muutokset liittyvät uusiin agentti design ja hoidon . Vertailu AC ja SqCC genomista ja epigenomic maisemat paljasti 778 muuttunut geenejä vastaaviin ilme muutokset valitaan aikana kasvainten kehittymistä alatyypin-spesifisellä tavalla. Analyysi 200 uutta NSCLCs vahvisti, että nämä geenit ovat vastuussa ajo ero kehittämistä ja tuloksena fenotyyppien AC ja SqCC. Mikä tärkeintä, tunnistimme avain onkogeeninen reittejä häirinnyt kunkin alatyyppi, joka todennäköisesti pohjana niiden ero tuumoribiologiassa ja kliinisiä tuloksia. Downregulation

HNF4α

kohdegeenien oli yleisin reitti erityisiä AC, kun taas SqCC osoitti häiriöitä lukuisia histoni modifioivia entsyymejä sekä transkriptiotekijä

E2F1. In silico

seulontaa ehdokas terapeuttisten yhdisteiden käyttämällä alatyypin-erityisiä polun komponentteja tunnistettu HDAC ja PI3K-estäjien mahdollisina hoidot räätälöidään keuhkojen SqCC. Yhdessä meidän havainnot viittaavat siihen, että AC ja SqCC kehittyvät erilliset patogeneettisiin väyliä, joilla on merkittäviä vaikutuksia meidän lähestymistapa kliinisessä hoidossa NSCLC.

Citation: Lockwood WW, Wilson IM, Coe BP, Chari R, Pikor LA , to KL, et ai. (2012) Levenevien Perimän ja Epigenomic maisemat keuhkosyöpään Alatyypit korostavat valinta Eri onkogeeninen Pathways aikana kasvainten kehittymiseen. PLoS ONE 7 (5): e37775. doi: 10,1371 /journal.pone.0037775

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 08 marraskuu 2011; Hyväksytty: 27 huhtikuu 2012; Julkaistu: 21 toukokuu 2012

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia Kanadan Institutes for Health Research (CIHR) (MOP-86731, MOP-77903, MOP-110949 ), Kanadan Cancer Society (CCS20485), NCI Early Detection Research Network, ja laitos Defence (CDMRP W81XWH-10-1-0634). W.W.L., I.M.W., B.P.C., R.C., K.L.T. ja L.A.P. tukivat stipendejä CIHR ja NSERC (luonnontieteiden ja tekniikan tutkimuksen toimikunta), ja W.W.L. jonka CIHR Jean-Francois Saint Denis Fellowship in Cancer Research, R. C. jonka Banting Postdoctoral Fellowship, K.L.T. ja L.A.P. by Vanier Kanada Graduate Apurahat. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti ja huolimatta nykyiset hoidot, ennuste on edelleen huono, on viiden vuoden pysyvyys 18% [1], [2], [3]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) ovat kaksi tärkeintä histologiset ryhmää. SCLC syntyy pääasiassa hengitysteiden keskiosaan, kun taas NSCLC voi tapahtua keskitetysti tai perifeerisesti. Erilaiset patologia kahden heijastuu niiden kliinisessä hoidossa.

NSCLC on heterogeeninen sairaus, jossa okasolusyöpä (SqCC) ja adenokarsinooma (AC) on hallitseva histologisia alatyyppejä. Perinteisesti nämä alatyyppejä on käsitelty yhtenä sairauden kokonaisuus hoitostrategioita määräytyy yksinomaan taudin vaiheessa. Kuitenkin viime aikoina todisteita Kliinisissä tutkimuksissa on osoitettu, että histologisia alatyyppejä NSCLC reagoivat eri tavoin sekä kohdennettuja lääkkeitä ja äskettäin kehitetty chemotherapies, mahdollisesti liittyviä eroja solujen johtamista ja patogeneettisiin alkuperää [3], [4], [5], [6] , [7], [8], [9]. Yksi parhaita esimerkkejä on folaatin antimetaboliittina Pemetreksediä, joka on ylivoimainen tehokkuus ja käyttö on rajoitettu potilaille, joilla on ei-SqCC, oletettavasti johtuen suuremmasta ilmentymistä tymidylaattisyntaasin vuonna SqCC kasvaimissa [9]. Samoin lukuisat tutkimukset ovat liittäneet korkeampi vaste käsittelemällä AC kanssa EGFR tyrosiinikinaasin estäjät Gefitinibi ja Erlotinibi, mikä heijasti korkeampaa esiintyvyys

EGFR

mutaatiot tässä alatyypin [6], [10]. Nämä poikkeavuudet tuumoribiologiassa ja kliinisen vasteen korostavat tarvetta määritellä taustalla geneettinen, epigeneettiset ja aineenvaihdunnan yhtäläisyyksiä sekä eroja NSCLC alatyyppien määrittelemiseksi sopivampi väyliä terapeuttisesta.

Initial geeniekspressioprofilointi tutkimukset pystyivät eristää AC ja SqCC kasvaimia niitä vastaaviin histologinen ryhmittymät perustuu usean geenin malleja; kuitenkin kriittisesti tapahtumia tumorgenesis voidaan peittää reaktiivisia muutoksia tutkiessaan ekspressioprofiileja yksin [11], [12], [13]. Kääntäen, DNA kopioluvun tai DNA metylaatiomuutokset vastaava geenien ilmentymisen muutoksia ovat usein pidetään siitä, että onnettomuus. Tällaisia ​​DNA-tason muutokset ovat kriittisiä sääntelyn tapahtumia ajo etenemisen ja muiden syövän fenotyyppien [14], [15], [16]. Koska SqCC ja AC uskotaan kehittyä erilliseen solun suvusta eri alueilla keuhkojen välillä geneettisiä muutoksia tarvitaan kasvaimen aloittamista voi esiintyä sukuperänä-rajoitetusti. Esimerkiksi monistaminen sukujuuret selviytymisen onkogeenien

Sox2

ja

TITF1 /NKX2-1

äskettäin todettu keskeisiä tapahtumia erityisiä kehitykseen keuhkojen SqCC ja AC, tässä järjestyksessä [17] , [18]. Kuitenkin, nämä geenit eivät yksin riitä selittämään fenotyyppisen monimuotoisuuden alatyypeistä, mikä viittaa siihen, että suurin osa geenien vastuussa ero kehittämistä edelleen tuntematon. Vaikka geneettiset ja epigeneettiset erot SqCC ja AC on kuvattu, alhainen genomin kattavuus ja /tai pienet otoskoot ovat olleet rajoittavia [19], [20], [21], [22], [23], [24].

tässä tutkimuksessa teimme ensimmäinen laajamittainen analyysi ensisijaisen NSCLC kasvaimia (261 yhteensä -169 AC ja 92 SqCC), integroimalla korkea resoluutio DNA kopiomäärä, metylaatio ja geeniekspressioprofiilien kriittisesti alatyypin erityisiä molekyyli- piirteitä. Luonnehdinta genomisen ja epigenomic maisemia AC ja SqCC paljasti hämmästyttävän määrän eroja DNA-tasolla ja sitä seuraava geeniekspression muutoksia, jotka valitaan aikana alatyypin erityisiä keuhkojen kasvainten kehittymiseen. Mikä tärkeintä, tunnistimme avain kasvaimia synnyttävän reittejä häirinnyt näitä muutoksia, jotka todennäköisesti toimivat pohjana ero käyttäytymistä tuumoribiologiassa ja kliinisiä tuloksia. Lopuksi kautta prognoosi- analyysi ja

in silico

seulontaan ehdokas terapeuttisten yhdisteiden käyttämällä alatyypin erityisiä polun komponentteja, näytämme miten nämä uudet löydökset voivat vaikuttaa meidän lähestymistapa kliinisessä hoidossa NSCLC.

Tulokset

arvio maailmanlaajuisen genomi- epävakautta AC ja SqCC

karsinoomat kaikenlaisten tiedetään satama monet DNA-tason muutosten toisiinsa, osittain karsinogeeniksi altistus [25]. Todellakin, tupakan savu on yhdistetty induktioon ei ainoastaan ​​DNA mutaatioita, vaan myös laaja kromosomaalisten epävakautta [26]. Perustuen erilaiset altistuminen tupakansavulle karsinogeeneille solujen keskeinen (SqCC) ja reuna (AC) hengitysteihin, pyrimme ensin selvittää globaalin perimän epävakaisuuden oli yleisempää kummassakaan alatyypeistä. Me syntyy ja verrataan koko genomin kopioluku profiileja 261 NSCLC kasvaimen 169 AC ja 92 SqCC – by laatoitus resoluution array vertaileva genominen hybridisaatio (CGH) (näyte Set # 1, taulukko S1) [27], [28], [29] , [30]. Hybridisaation jälkeen, vakio poistaminen järjestelmällisten harhojen ja laskennallinen segmentointi alueiden tunnistamiseksi voitto ja tappio, määrä sai, kadonnut, ja neutraali koettimet arvioitiin kunkin kasvaimen. Suhteellinen genomin epästabiilisuuden havaittu AC ja SqCC ryhmiä verrattiin sitten (kuva 1a). Keskimäärin muuttuneen koettimia (per näyte) verrattiin ryhmien välillä käyttäen Mann-Whitneyn U-testiä. Mitään merkittäviä eroja kahden alatyyppiä löydettiin, yhdenmukaisia ​​aiempien työtä, joka osoitti samanlaista DNA sisältöä eri alatyyppejä [31]. Tämä analyysi osoittaa, että ei-alatyyppi on taipumus voiton tai tappion DNA. Siksi havaitut erot muutos taajuus tietyssä lokuksessa voidaan kohdistaa alatyyppi erityistä valintaa geenit sisältyvät muuttunut alueita eikä eriasteisia satunnainen perimän epävakaisuuden liittyy kasvaimen kehitys.

(a) prosentuaalinen kloonien kunkin valtion molemmissa alatyyppejä. Rasiakuvaajien kuvaavat prosenttiosuus kloonien tila -1 (tappio /t), 0 (neutraali), ja +1 (voitto /vahvistus) kussakin alatyyppejä. Prosenttiosuudet laskettiin kullekin näytteelle, ja kunkin tilan. Nämä tontteja osoittavat samankaltaisuutta yhteensä genomin muutos prosentit välillä AC ja SqCC kasvaimet ja viittaavat siihen, että toistuvasti muuttanut alueiden genomin ovat seurausta valinnan sijaan korkeampi taajuus voitto tai tappio DNA joko alatyyppiä. (B) muuttaminen taajuudet 169 AC (punainen) ja 92 SqCC (sininen) kasvaimet näkyvät koko ihmisen genomin. Kiinteä pystysuora mustat viivat edustavat kromosomi rajat taas katko- mustat viivat edustavat kromosomi käsivarteen rajoja. Taajuus kopioluvun voitto merkitään yläpaneelissa. Huomautus tiheä 3q voitto vuonna SqCC alatyyppi, yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien. Muita alueita kopioluvun ero on myös selvää, kuten yleisempää kromosomin 2p AC. Toinen paneeli (keskellä) näkyy taajuus kopioluvun menetys. Yhteinen tuumorisuppressorigeeniä loci kuten kromosomin 3p ovat yhteisiä välillä AC ja SqCC, mutta suuria eroja alueilla, kuten kromosomin 4q. Merkitys kopioluvun eron (käänteinen p-arvo korjataan monimuuttujille) välillä AC ja SqCC alatyyppien on esitetty kolmas (alhaalla) paneeli. Kokomusta viiva edustaa alueita tilastollisesti erilainen (p≤0.01) kun taas harmaat viivat eivät ole.

Erilaiset genomista maisemia luonnehtivat keuhko SqCC ja AC

Vaikka NSCLC alatyypeistä osoittavat samankaltaisia ​​tasoja genomin epästabiilisuuden, jos tietty geneettinen reittejä osallistuvat niiden ero kehittämiseen, erot genomisessa muutoksiin aikana valitut tuumorigeneesin tulisi olla läsnä. Sen määrittämiseksi, geneettisiä muutoksia ainutlaatuinen jokaiselle NSCLC alatyypin olemassa, etsimme toistuvia ei-satunnainen alueilla poikkeama kussakin ryhmässä. Näytteet ryhmitelty alatyypin ja koettimet yhdistetä alueisiin perustuen samanlainen kopioluku tila. Taajuus muutos poikki autosomeiksi määritettiin ja verrattiin alatyyppejä käyttämällä Fisherin testiä ja tuloksena

p

-arvot korjattiin monimuuttujille joiden cut-off ≤0.01 pidetään merkittävinä. Lisäksi olemme tarvitaan alueita muutettaisiin 20% näytteistä peräisin alatyyppi ryhmä ja ero ryhmien välillä 10% pidetään ”kiinnostava”. Kuva 1b näyttää tuloksena genomista maisemia AC ja SqCC taajuuden perusteella voiton ja tappion koko genomin, ja korostetaan vastaava alueiden välinen ero alatyyppejä, jotka tunnistettiin.

Tämä analyysi paljasti 294 alueilla kopio numero epäsuhta SqCC ja AC, 205 joista SqCC erityisiä, kun taas 89 oli AC erityinen (taulukko S2). Vaikka jotkut alueet päällekkäin, luonne muutos (eli vahvistuksen tai tappio) oli yksilökohtaisia ​​ryhmään. Koska muutos tilan välillä alatyypeistä erosivat voimakkaasti, me luokiteltu näitä alatyypin erityisiä kopioluvun muutoksia. Yhteensä nämä muutokset piirissä oli noin 550 Mbp genomin, joiden koko vaihtelee suuressa osassa kromosomissa aseiden (64,8 Mbp päällä 4q) erillisiin huiput vain kiloemäsparin kooltaan (0,05 Mbp useassa paikassa).

Mielenkiintoista , kopioiden määrä profilointi 20 preinvasive keuhkosyöpä

in situ

vaurioita, oletettu esiasteita keuhkojen SqCC kasvaimia, paljasti, että suurin osa (186/204, ~92%) ja SqCC-spesifisiä muutoksia ovat läsnä tässä vaiheessa kasvainten kehittymiseen, mikä viittaa siihen, että nämä tapahtumat voidaan aloittaa aikaisin SqCC kasvainten synnyssä (taulukko S3). Loput muutoksia, jotka ovat läsnä SqCC kasvaimia ja ei löydy karsinooma

in situ

vauriot voivat edustaa mahdollisia kuljettajia SqCC etenemisen (taulukko S3, mahdollisten kohdegeenien näiden alueiden yksilöity taulukossa S4, käsitellään jäljempänä ). Yhdessä nämä tulokset tukevat hypoteesia, että alatyyppejä kehittyä eri geneettisen reittejä.

Gene häiriöt valitaan alatyyppi erityisellä tavalla aikana NSCLC kehitys

Discovery DNA kopioluvun eroja NSCLC alatyyppejä ehdottaa, että geenit näillä alueilla voi olla edullisesti valittu aikana tumorigenesis ja siten vastaava ero kehittämistä ja patologiset ominaisuudet alatyyppejä. Tunnistaa mahdolliset kohdegeenien Näiden muutosten, me integroitu DNA kopioluvun ja geeniekspressiotasot [32]. Geeniekspressioprofiilit oli tuotettu osajoukko kasvaimia, jotka analysoitiin array CGH (20 SqCC ja 29 AC kasvaimia, näyte Set # 2, Taulukko S1). Oletimme, että geenit kohdistetaan alatyypin-spesifisiä muutoksia olisi erilainen DNA-tasolla matching eroihin geeni-ilmentymisen tasolla. Edelleen, analysoimme myös normaalissa keuhkokudoksessa sen varmistamiseksi, että vain geenit ilmentyvät differentiaalisesti tuumorikudoksissa (suhteessa normaaliin) jäi ehdokkaita, ominaisuus sopusoinnussa rooli kasvaimen kehittymisen.

Genes sijaitsee kunkin alatyypin-specific kopioluvun muutos tunnistettiin ja ekspressiotasoja verrattiin toisiinsa SqCC ja AC näytteitä määrittää ne, jotka ilmentyvät eri (p 0,001, kun useita testaus korjaus). Sillä SqCC, 4669 ainutlaatuinen geenit kartoitetaan alatyypin-spesifisten kopioluvun muutoksia (~23 geenien aluetta kohti) ja 797 (17%) näistä oli ekspressoituu differentiaalisesti välillä alatyyppien odotettavissa suuntaan. AC, 2050 ainutlaatuinen geenejä sijaitsivat alatyypin erityisiä kopioluvun muutoksia (~23 aluetta kohden) ja 171 (8%) oli ilmennetty eri välillä alatyyppien odotettavissa suuntaan.

Vaikka jotkut geenit päällekkäin, niiden häiriöitä kuviot olivat ominaisia ​​yksittäiset syöpä tyyppi, viittaavia vastakkaisia ​​rooleja (onkogeeninen vs kasvain ehkäisevästä) riippuen solujen yhteydessä. Siten nämä geenien katsotaan myös alatyypin-erityisiä tavoitteita. Kun yhdistetään, SqCC ja AC alatyypin erityisiä kopioluvun säännelty ehdokkaita edustettuna 968 ainutlaatuisia geenien ja osoittivat selvän eron ilmennystasoissa kahden alatyypeistä.

Lisäksi osoitetaan suhde ilmaisun ja kopioi numero muuttaminen, ehdokas alatyyppi-geenistä oli myös vaaditaan vapautettiin syövän kudoksissa suhteessa normaaliin kudokseen [33]. Analysoimme ekspressiotasot ehdokkaiden riippumaton paneeli 53 SqCC ja 58 AC keuhko- kasvainten ja 67 näytteitä kuorituista keuhkoputken solujen syöpää vapaa yksilöitä (näyte Asettaa # 3 ja # 4, taulukko S1). Kaikkiaan 655 797 SqCC-erityinen ja 143 171 AC-geenit oli vastaavia koettimia tähän array alustalla. Nämä geenit verrattiin toisiinsa vastaavien syövän alatyypin ja normaali keuhkoputken solujen jotta voidaan määrittää ne, jotka olivat merkitsevästi ilmentyvät eri (p 0,001) suuntaan ennustama vastaava kopioluku muutos, jossa ne sijaitsevat. Tämä analyysi paljasti, että 447 (68%) ja SqCC-spesifisten ja 71 (49%) ja AC-geenit olivat vapautettiin syöpäkudoksiin (492 ainutlaatuinen geeni muutoksia, taulukko S4). Koska nämä geenit täyttänyt kaikki kolme määrittelyperusteisiin ehdokas alatyypin erityisiä, kopioluvun muutos säännelty tavoitteita kuin edellä on kuvattu, solmimme he edustavat kriittistä geenin muutokset ajo kehittämiseen kunkin alatyypin (kuva 2).

Muuttunut ehdoton ilmaus tiedot 492 ainutlaatuinen geenejä esillä häiriöitä ilmennystasoissa seurauksena kopioluvun eroista näkyvät. Lisäksi nämä geenit ovat ylös tai alas-säädellä alatyypin jossa ne häiritsi verrattuna normaaliin keuhkokudoksessa (katso tulokset). Korkean tason ilmentymistä näkyy punaisena, kun musta merkitsee sitä pienempi ekspressiotasoja. AC Näytteet merkitty punaisella korostus päällä jokaisen sarakkeen, kun SqCC näytteet on merkitty sinisellä korostuksella. Kukin geeni on järjestetty mukaan sen sijainti kromosomissa. On olemassa selvä ero on näiden geenien ilmentymistä osoittaa niiden erityisiä osallistumista alatyyppeihin.

Eri kasvaimia synnyttävän reitit liittyvät kehittämiseen AC ja SqCC

Cellular reittejä ja prosessien erityisesti häirinnyt yksittäisissä alatyyppiä voi paljastaa avain onkogeenisiä mekanismeja ajo ero kehittämistä AC ja SqCC. Näin ollen, kun on tunnistettu geenejä vastaavat erot alatyyppien, halusimme seuraavaksi tutkia niiden biologisia toimintoja. Voit löytää alatyyppi liittyvien verkkojen biologisesti liittyvien geenien suoritimme Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ja 71 AC ja 447 SqCC erityisiä kohdegeenien (kuva 3, taulukko S5). SqCCs näytteillä häiriöistä geenissä verkostoja, jotka toimivat säätelemään DNA kahdentuminen, rekombinaatio ja korjaus, ylimääräisiä rooleja imukudokset rakennetta ja kehitystä (taulukko S4). Geenit mukana top SqCC verkon liittyivät sitova ja muuttaminen histoni proteiinin H4 sekä sääntelyn NFKB monimutkainen (kuva 3b). Sen sijaan ensisijainen verkkoja AC näytetään liittyvät toiminnot solusta soluun signaloinnin, kehitys ja lääkeainemetaboliaan (taulukko S5). Tärkeimmät AC-geenistä verkosto koostuu pääasiassa geenien säätelee transkriptiotekijä HNF4α (kuva 3a), kun taas AC verkko 2 sisälsi useita geenejä ohjataan TGF ja TP53. Differentiaalinen häiriintyminen geenin verkkojen AC ja SqCC oli edelleen viittaavat erillisten mekanismien tumorigeneesin varten alatyypeistä.

Ingenuity Pathway Analyysi käytettiin tunnistamaan biologisesti liittyvien verkkojen alatyypin spesifisten geenien vapautettu alatyyppispesifiset kopioluvun muutokset (katso menetelmät). Top Tuloksena geeni verkkojen kunkin alatyypin näytetään. a) AC-verkon # 1 liittyvien geenien HNF4 signalointia. b) SqCC verkon # 1 näyttää mahdolliset vuorovaikutukset useiden histoni säätelemällä geenien sekä a) ja b), kiinteät viivat tarkoittavat suoraa vuorovaikutusta, kun taas katkoviivat esittävät välillisen vuorovaikutuksen geenien. Verkkokomponentit korostettu punaisella on voimistunut vastaavana alatyypin taas korostettu vihreä ovat vaimentua. Näitä ei ole korostettu käytetään ohjelmiston näyttää suhteita. Lisätietoja geeneistä ja niiden vuorovaikutuksia löytyvät www.ingenuity.com. tai sisällä keskustelua. Tässä kaaviossa molekyylit ovat edustettuina sellaisenaan; korkkiruuvit edustavat entsyymejä, y-muotoinen molekyylit ovat transmembraaninen reseptorit, sormustin muotoinen molekyylit ovat kuljettajat, kinaasit ovat kolmiomaiset, ja pyöreä molekyylit käsittävät kaikki muut geenituotteet.

Global alatyypin vaihtelusta DNA metylaatiotasoilla kuvastavat eroja soluissa alkuperää

Toisin genomin, joka on samanlainen useimmissa normaaleissa soluissa kehossa, epigenome vaihtelee kudostyypeistä [34], [35]. Samoin syöpä genomit näytteille maailmanlaajuinen hypometylaatio vaihtelevasti riippuen kudoksen alkuperästä [36]. DNA: n metylaatio profiilit vaikuttavat myös Mutaatioiden sisällä eri syöpätyyppejä, kuten DNA hyper- ja hypometylaatio muutoksia tiedetään myös liittyvän kudosten ja geneettistä taustaa [37] sekä tupakointikäyttäytymiseen [38]. Koska erilaiset mutaatiotapahtumaa spektrit kaksi NSCLC alatyyppiä ja niiden todennäköisiä erilaiset solujen alkuperä, olemme tutkineet yleistä DNA metylaatio taso 30 AC ja 13 SqCC näytteet (näyte Set # 4, taulukko S1). Jotta vertailuja SqCC ja AC kasvaimet asianmukaiseen vastaaviin normaaleihin soluihin, DNA: n metylaatio profiilit myös syntyy 30 hyvänlaatuisen keuhkoparenkyymistä näytteitä (AC viite) ja 18 histologisesti normaalin hilseillyttä keuhkoputken epiteelisolujen näytteitä (SqCC viite) sairastavista potilaista NSCLC ( näyte Set # 1, taulukko S1). Analyysi 27578 CpG dinukleotidien antureista kuluessa 13000 CpG-saarekkeiden osoittaa, että DNA: n metylaatio keuhkoputkien epiteeli ja SqCC kasvaimet oli hieman pienempi kuin normaalissa keuhko- tai AC kasvaimet (kuva 4a). Tämä heijastuu ja liioiteltu CpG-dinukleotidit ulkopuolella CpG-saarekkeiden, mikä viittaa siihen, että solut on keskeinen hengitysteiden ovat globaalisti hypometyloidut suhteessa solujen reuna hengitysteihin, onko syöpä vai ei (kuvio 4b). Tässä tapauksessa nämä kaksi ryhmää ovat merkitsevästi erilaiset verrattuna käytettäessä U-testi (

p

0,0001).

keskimääräisten DNA metylaatiotasoilla välillä AC kasvain, AC normaali ( histologisesti normaalit keuhkoparenkyymistä), SqCC kasvain, ja keuhkoputkien epiteelin. a) CpG-saarekkeen koetin keskiarvoja. Keskimääräinen Kunkin profiilit koettimet sijaitsevat CpG-saarekkeiden on piirretty komponentti rasiakuvaajan. Tässä paneelissa, SqCC ja keuhkoputkien epiteelin näytteet näyttävät olevan hieman pienempi DNA metylaatiotasoilla kuin AC kasvain ja AC normaaliryhmää. b) Ei-CpG-saarekkeen koetin keskiarvoja. Keskimääräinen Kunkin profiilit antureista ei sijaitse CpG saaria on piirretty komponentti rasiakuvaajan. Tässä kuvassa β-arvo on taso metylaation määritelty metyloitua signaali /yhteensä signaalin kunkin koettimen. Tässä paneelissa, SqCC ja keuhkoputkien epiteelin ovat huomattavasti pienemmät metylaatio tasolla verrattuna AC kasvain tai AC normaaliryhmää, mikä osoittaa, että ulkopuolella CpG-saarekkeiden, jossa suurin osa genomista metylaation tapahtuu, Keski hengitystiet näytteet ovat hypometyloidut. c) Keskimääräinen ero metylaatiotasoilla klo CpG saarilla. Keskimääräinen ero on piirretty varten 30 AC näytteitä ja 13 SqCC näytteitä. Nämä kaksi ryhmää ovat hyvin samankaltaisia ​​niiden ero profiilin CpG-saarekkeen antureista. d) Keskimääräinen ero metylaatiotasoilla at CpG sivustoja ei sijaitse CpG saaria. Esityksessä keskimääräinen ero metylaatio taso piirretään antureista, jotka eivät sijaitse CpG saaria. Jälleen kaksi ryhmää eivät ole merkittävästi erilaiset jota U-testi.

Voit selvittää nämä suuntaukset näkyivät kasvainspesifisiä epigeneettiset muutokset, (eli ne, jotka ovat olemassa kasvain alatyypin kun verrattuna sopivan normaali solu), vertasimme ero metylaatio profiilit AC ja SqCC kasvaimia. Nämä profiilit saatiin aikaan vähentämällä keskimääräistä normaalin DNA: n metylaation profiilin viittaukset kustakin 30 AC ja 13 SqCC kasvaimia, vastaavasti. Samanlainen yleisarvio kopioluvun muutoksia (voitto ja tappio), ei ollut merkittäviä eroja AC ero profiilit ja SqCC ero profiileja (kuvio 4c) in CpG-saarekkeen antureista tai ei-CpG-saarekkeen koettimia (Kuva 4d). Tämän perusteella olemme jälleen perusteltu, että havaitut erot hypermetylaation tai hypometylaatio taajuuksien väliset alatyyppejä ovat todennäköisesti johtuu alatyypin erityisiä valikoima näitä muutoksia.

Eri epigeneettisellä muutoksia ovat mukana kehittämässä AC ja SqCC alatyyppejä

Vaikka ei eroja globaalissa metylaatiomuutokset havaittiin välillä alatyyppejä, kaksi alatyyppiä saattaa olla ero muutos taajuuksilla yksittäisen loci. Voit selvittää, AC ja SqCC kasvaimia niillä lokuksen liittyviä eroja DNA: n metylaatio, tutkimme taajuudet metylaation muutos at geenin liittyvän lokusten molemmissa alatyyppejä. Kasvain DNA metylaatiotasoilla verrattiin keskiarvoon käytettävissä normaalistua kudosta profiileja. Taajuus koetin hypermetylaation ja hypometylaatio (kasvain-normaali | ≥0.15) AC ja SqCC näytteitä verrattiin käyttämällä Fisherin testiä. Seuraavat korjaus monivertailuja, 2708 koettimia, jotka vastaavat 2384 geenejä havaittiin differentiaalisesti metyloitu (p≤0.05). SqCC ryhmä sisälsi selvästi enemmän toistuvasti hyper- ja hypometyloidut lokusten kuin AC-ryhmä, samanlainen eroja määrän alatyypin-specific kopioluvun geenien havaittiin genomi muutoksia. Itse asiassa vain 8%: n 2708 merkittäviä koettimet useammin muutettu AC, ja loput yleisemmin hyper- tai hypometyloidut in SqCC.

tarkentaa lista differentiaalisesti metyloituneiden geenien, joiden geeniekspression heijastaa joiden odotetaan perustuu niiden epigeneettiset muutos, arvioimme 2384 geenit ero metylaation erilainen ekspressio välillä alatyypeistä sekä differentiaalikaavojen normaaleista kudoksista käyttäen korjattu p-kynnysarvo on

p

0,05. 32 AC kandidaattigeenit ja 297 SqCC geenit täyttänyt nämä tiukat kriteerit ja analysoitiin edelleen niin alatyypin erityisiä epigeneettiseltä säännelty geenejä (taulukko S6).

epigeneettiseltä säännelty geenejä -komplementtivälitteinen geneettisesti geenien

Voit selvittää 32 AC-erityisiä ja 297 SqCC-specific epigeneettiseltä geenien suorittaa samankaltaisia ​​toimintoja kuin alatyypin-geenit löysi DNA kopiomäärä edellä kuvaillun analyysin, polku häiriöiden analyysi. Tämä osoitti, että merkittävin epigeneettiseltä säädelty geeni verkko AC on mukana solusyklin, solukuoleman, ja solujen kehitystä (taulukko S7). Tämä on osittain toisin huipulle AC verkosto kopioluvun geenien, joka samalla on toimintoja, jotka liittyvät kudoksen kehitykseen, mutta myös olla solujen signalointi ja hematologisten järjestelmän toiminta yhteistä (taulukko S4). Yleinen samankaltaisuus AC-geenit, jotka ovat geneettisesti tai epigeneettiseltä säännelty on melko pieni, mikä johtuu todennäköisesti vähäinen määrä AC-geenejä tunnistettiin (mahdollisia syitä tähän käsitellään jäljempänä). Sen sijaan SqCC geeni verkot sekä analyysit ovat hyvin samanlaisia. Esimerkiksi DNA: n kahdentuminen, rekombinaatio ja korjaus ovat erittäin esillä toiminnot geenien tunnistaa molemmat DNA kopioluvun ja DNA: n metylaatio analyysit SqCC (taulukot S5 ja S7, vastaavasti). Lisäksi geenit osallistuvat immunologisten sairauksien ja imukudokseen rakennetta ja kehitystä olivat näkyvästi. Erityisen kiinnostavaa oli rikastumista poikkeavasti metyloitua geenien pienisoluinen keuhkosyöpä signalointireitille (koostuu geenien tiedetään vapautettiin pienisoluinen keuhkosyöpä kuin selityksin mukaan kekseliäisyyttä) (kuvio 5a). Tämä oli kaikkein merkittävästi rikastettu kanoninen reitin kummassakin alatyyppi, joka vaikutti DNA: n metylaation muutoksiin ja se on kiinnostava, koska molemmat keuhkosyövässä (SCLC ja SqCC) syntyvät hengitysteiden keskiosaan samanlaisia ​​tupakansavu karsinogeeneja.

E2F1

on yksi hypometyloidut ja yli-ilmentynyt geenejä edustaa tämän reitin, ja tiedetään yliekspressoituvan SCLC ja ilmentymisen ohjaamiseksi

EZH2,

joka yli-ilmentyy myös SCLC [39], [40]. Tutustua reitin tarkemmin, me tutkimme,

EZH2

oli korkeammin ilmaistu SqCC kuin AC kasvaimet (seurauksena ero

E2F1

ilme). Kuten odotettua, huomasimme, että

EZH2

ilmentyi merkittävästi korkeammalla tasolla SqCC kasvaimia kuin AC kasvaimia, jotka osoittavat biologisen seurauksena

E2F1

häiriöt (kuvio 5b). Differentiaalinen ilmentyminen

EZH2

kahden alatyypin on merkittävä, kun otetaan huomioon lukuisia eroja poikkeavien DNA: n metylaatio havaittu alatyyppejä; Tämä saattaa heijastaa keskeistä roolia EZH2 että Polycomb ryhmä, proteiinikompleksi osallisena DNA: n metylaatio [41].

a) SCLC signalointi komponentit muuttaa DNA-metylaation SqCC. Tässä kaavamaisen SCLC signalointireitin, geenejä, jotka hypometyloidut ja yli-ilmentynyt näkyvät punaisina, ja ne, jotka ovat hypermetyloitunut ja ali-ilmentynyt näkyvät vihreinä. Komponentteja kaikilla tasoilla polku vaikuttaa, mukaan lukien transkriptiotekijä

E2F1

, joka ohjaa ilmentymistä onkogeenisten Polycomb-ryhmän jäsen

EZH2

. b)

EZH2

ilmentyminen 58 AC kasvaimia ja 53 SqCC kasvaimia.

EZH2

ilmentyminen arvioitiin ulkoisen aineisto, ja sen todettiin olevan suurempi, kuten on ennustettu, vuonna SqCC kasvaimissa verrattuna AC kasvaimia käyttämällä U-testi (p 0,0001). c)

FHIT

ero metylaatiotasoilla vuonna SqCC ja AC kasvaimia.

FHIT

osoitettiin vapautettu sekä poistetaan ja hypermetylaation tavalla, joka oli spesifinen SqCC kasvaimia. Näyttää tässä on ero DNA metylaatiotasoilla 30 AC kasvaimia ja 13 SqCC kasvaimia. SqCC kasvaimia hypermetyloitunut paljon suuremmassa määrin kuin AC kasvaimet, yhdenmukaisia ​​aiempien julkaisemat tulokset.

DNA kopiomäärä ja DNA: n metylaatio tiedot ovat toisiaan täydentäviä peräisin geenispesifiseen näkökulmasta samoin. Tämä korostuu seitsemän geenejä (

ATP2C1

,

PCYT1A

,

ZWILCH

,

CENTB2

,

BAG4

,

PARP11

ja

CSDA

, taulukko S8), jotka häiritsivät geeni-annostus yhdessä alatyyppi ja DNA: n metylaation muissa.

PARP11

on yksi tällainen esimerkki ero aktivaatio /inaktivaatio DNA kopiomäärä ja DNA: n metylaatio, jota käsitellään jäljempänä.

koordinoivan geneettiset ja epigeneettiset häiriöitä alatyypin-geenit

sen määrittämiseksi, jos molemmat DNA: n kopioiden lukumäärä, ja DNA: n metylaation poikkeamia samanaikaisesti häiriöitä tahansa geenejä, yhdistimme alatyypin-geenistä luettelot on johdettu käyttämällä kahta analyyttisiä lähestymistapoja on kuvattu edellä (taulukko S9).