Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huolimatta aiempia tutkimuksia, jotka osoittavat ominaisuudet paksusuolensyöpä kantasolujen (CCSCs) ja rooli epiteelin -mesenchymal siirtyminen (EMT) kasvaimen kehitystä, se on edelleen kiistanalainen kuin väliseen suhteeseen CCSCs ja EMT. Tässä tutkimuksessa voidakseen esittää käsityksen tästä suhteesta paksusuolen syöpä, kehitimme HCT116 ja HT29 pallo malleja, joiden tiedetään olevan solujen rikastamiseksi syövän kantasoluja. Verrattuna niiden vanhempien kollegansa, pallojakaantuminen soluilla alempi homotyyppisessä /heterotypic tarttuvuus mutta suuremmat in vitro muuttavien /invasiivisia kapasiteetti, sekä korkeammat tuumorigeenisemmiksi ja metastaattisen potentiaalin in vivo. Rakeiden solut osoittivat myös alassäädetty E-kadheriinin ja säädelty α-SMA ja vimentiinista ilme, joka on tyypillinen fenotyyppi EMT. Jotta voitaisiin tutkia, onko tämä ilmiö liittyy aktivoitumiseen Wnt /β-kateniinin reitin, havaitsimme useita keskeisiä signalointimolekyylien. Verrattuna niiden vanhempien soluja, HCT116 ja HT29 sferoidiviljelmiä solut osoittivat alassäädetty ilmentymä GSK3p, mutta sääteli ilmentymä Slug ja Etana. Ja myös, ylös-säätely nucleus β-kateniinin sferoidiviljelmiä soluissa osoitti, että vapaa β-kateniinin siirretään sytoplasmasta solun tumassa. Tuloksemme osoittavat, että pallomainen solut ovat luonteeltaan paksusuolensyöpä kantasolujen ja EMT voi selittää niiden stemness ja maligniteetti. Ja jatkuva aktivointi Wnt /β-kateniinin reitti voi olla tärkeä rooli EMT on CCSCs.

Citation: Han X-Y, Wei B, Fang J-F, Zhang S, Zhang F-C, Zhang H-B, et ai. (2013) epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon Associatesin ylläpito Stemness in Sferoidiviljelmiä-Derived Stem-Like Colon Cancer Cells. PLoS ONE 8 (9): e73341. doi: 10,1371 /journal.pone.0073341

Editor: Giovanni Camussi, University of Torino, Italia

vastaanotettu: toukokuu 26, 2013; Hyväksytty: 29 heinäkuu 2013; Julkaistu: 09 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Han et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Science Foundation of China (nro 81000960), Key Project of Science Foundation of Guangdong (nro +10251008901000011) ja perustutkimus rahastojen Central yliopistot (nro 12ykpy42). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on kolmanneksi yleisin syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti ja 5 vuoden suhteellinen pysyvyys on vain 53,8-65,2% huolimatta diagnostiikan ja hoidon edistysaskeleet [1], [2]. Kasvaimen uusiutumisen ja etäpesäke on kaksi kriittistä selviytymisen-vaikuttavia tekijöitä paksusuolen syöpä (CRC). On kasvava ymmärrys, että epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) edistää kasvaimen invaasion ja metastaasin [3], [4]. Kuten me kaikki tiedämme, EMT on erittäin konservoitunut cellular ohjelma, jonka avulla polarisoitunut, hyvin erilaistunut epiteelisolujen muuntaa polarisoitumattoman, liikkuvia mesenkyymisolujen. Tämä prosessi pidetään edistää paksusuolen syövän solujen hyökätä tyvikalvon ja ympäröivän mikroympäristössä, kuten imusolmukkeiden ja veren verisuonistoissa lopulta edistää sisäisen tai ekstravasaatio [5].

Viime aikoina yhä enemmän todisteita siitä, että kasvain aloittamista ja etäpesäkkeitä riippuvat pienen väestöryhmästä kasvainsolujen kutsutaan syövän kantasolut (CSCS) laakeri ääretön itseuudistumiseen potentiaalia ja kyky erilaistua eri väestöryhmien käsittää kasvain [6], [7], [8] [9]. Tämän mallin mukaan, syövän kantasolut yllä syövän synnyn, angiogeneesi, etäpesäke, ja uusiutumisen prosessi paksusuolisyövän [10]. Toisin sanoen, syövän kantasoluja ovat vastuussa pahanlaatuisuuden peräsuolen syöpä. Mutta miten syövän kantasolut säilyttää stemness, kuten kyky muuttoliikkeen, invaasion ja metastaasin? Monet tutkijat havaittu, että jotkut syöpäsoluja (kuten rintasyövän, paksusuolisyövän, jne.) Voidaan saada ominaisuudet, kuten syövän kantasoluja epiteelin-mesenkymaalitransitioon [11], [12], [13], [14]. Toisin sanoen, EMT voi luovuttaa syöpäsolu varsi kaltaiset bionomics, mikä osoittaa, että EMT voivat osallistua ylläpitoon stemness of CCSC. Mutta niiden yksityiskohtainen suhde syövän kantasoluja ja EMT ei ole raportoitu. Samaan aikaan vallalla aktivoituminen Wnt /β-kateniinin signalointireitin satunnaisissa CRC, on merkitystä EMT [15]. Nykyinen Tutkimuksen tavoitteena oli osoittaa, jos bionomics paksusuolen syövän kantasoluja ja sen ylläpito stemness liittyvät kanssa EMT tai ei, ja kuvaavat rooli Wnt /β-kateniinin signalointireitin tässä prosessissa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki kokeet, joihin liittyy ihmisen osallistujaa (mukaan lukien kokoelma ihmisen paksusuolen syöpä näytteet) on hyväksynyt Medical Research Ethics komitean Sun Yat-sen University, ja purkamisessa noudatetaan esitettyjen periaatteiden julistuksen Helsingin. Kaikki osallistujat mukana tutkimuksessa allekirjoitti tietoisen suostumuksen muotoja. Ja kaikki eläinkokeet suoritettiin noudattaen niitä kansallisia ja kansainvälisiä ohjeita. Ja tämä projekti hyväksyi Medical Research Animal Ethics komitean Sun Yat-sen University.

Soluviljely

HCT116 (ATCC, CCL-247) ja HT29 (ATCC HTB-38) paksusuolen syöpä solulinjoja ylläpidettiin DMEM /F12, johon oli lisätty 10% FBS: ää, 200 U /ml penisilliiniä ja 200 ug /ml streptomysiiniä. Tumorsphere media (kutsutaan myös seerumittomalla väliaineella, SFM) koostui DMEM /F12-alusta täydennettynä 1 x B27 (Invitrogen), EGF (20 ng /ml, Peprotech), bFGF (10 ng /ml, Peprotech), rutiini insuliinin (5 ug /ml, Invitrogen), 200 U /ml penisilliiniä ja 200 ug /ml streptomysiiniä. 3D kelluva kulttuuri, HCT116 ja HT29 kasvatettu kaksiulotteinen yksikerroksista pilkottiin trypsiinillä, suspendoitiin uudelleen, ja sitten ympättiin tiheydellä 2 x 10

6 solua SFM 100 mm ultra-low kiinnitys astiat (Corning) at 37 ° C: ssa kostutetussa 5% CO2 /95% ilma-atmosfäärissä.

havaitseminen CD133 ilmaisun virtaussytometrialla

solut peräisin yksikerrosviljelyissä ja jousitus aloilla 7. päivänä sen jälkeen, kun ensisijainen kulttuuri olivat havaittu ilmaus CD133. Solut pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä, ja sen jälkeen solun suspensioita inkuboitiin 4 ° C: ssa 01:10 FITC-konjugoitua hiiren monoklonaalinen anti-ihmis-CD133-vasta-ainetta (Ab, Miltenyi Biotec) 45 minuutin ajan pimeässä. Inkuboinnin jälkeen solut pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä, jossa oli 1% BSA: ta ja suspendoitiin uudelleen 400 ui kylmää PBS: ää, 1% BSA: lla virtaussytometriseen analyysiin 1 tunnin kuluessa (h).

immunofluoresenssi

anti-Lgr5 Ab (Abcam), anti-CK20 Ab, anti-E-kadheriinin Ab, anti-β-kateniinin Ab, anti-α-SMA Ab: n ja anti-vimentiinista Ab (Santa Cruz Biotechnologies) on laadittu valmistajan protokollia. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydiä ja läpäiseviksi 0,05% Triton X-100 PBS: ssa huoneenlämpötilassa 20 minuutin ajan. Näytteet blokattiin 1% naudan seerumin albumiinia (Sigma) ja inkuboitiin sopivan primaarisen vasta-aineen kanssa 37 ° C: ssa 1 h. Pesun jälkeen laajasti, ne inkuboitiin Alexa Fluor-488 vuohen anti-hiiri-IgG: tä (Invitrogen) tai Fluor-Cy3 vuohen anti-kani-IgG: llä (Jackson Immunoresearch), 37 ° C: ssa 1 h. Counterstaining ydinten kanssa DAPI (Invitrogen) suoritettiin myös. Tämän jälkeen solut pestiin ja asennettu havainnon alla skannaustoiminnon -konfokaalimikroskoopilla (LSM-710, Zeiss). Täällä, koko tämän käsikirjoituksen, tiedot vähintään kolmen erillisen kokeen on analysoitu todentaa tulosten toistettavuutta.

tasalaatuisuuden ja heterogeenisuus adheesiomäärityksellä

adheesio solujen kyky ECM testattiin fibronektiinin (FN) pinnoitettu 96-kuoppalevyille (Corning). Yksisoluiset suspensiot pallomaisten ja kiinnittyneet solut maljattiin (10

5 /kuoppa), ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 h, pestiin sitten PBS: llä poistamaan ei-liima-soluja. Delt OD 570 nm: n aallonpituudella määritettiin vastaamaan FN tarttumattomat solut käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan). Adheesiota solujen kyky homogeeninen soluihin testattiin käyttäen yksikerrossoluissa-päällystetty 96-kuoppalevyille. Sferoidi ja kiinnittyneet solut maljattiin 10

5 per kuoppa, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 60 min, 90 min, ja 120 min. Sitten ei-liima solut laskettiin ja homotyyppisessä liima aktiivisuus laskettiin käyttämällä kaavaa: homotyyppisessä tarttuvuus (%) = (solujen kokonaismäärä – tarttumaton solua) /solua yhteensä x 100%.

Migration ja invaasio määritykset

Muuttoliike ja invaasio määritykset suoritettiin 24 kuopan siirtokuoppaan kammiot 8 um huokosia polykarbonaatti suodatin insertit (Corning). Kaikkiaan 5 x 10

4 tai 10

5 erottaa sferoidiviljelmiä tai kiinnittyneitä soluja ympättiin päällystämättömiä tai Matrigel kuorrutettu insertit 100 pl seerumia insertit kulkeutumista tai invaasion määritykset vastaavasti. Alakammioissa täytettiin 0,5 ml: lla 10% FBS: ää täydennetyssä DMEM /F12-elatusaineessa. 24 tunnin kuluttua ja /tai 48 h, solut yläpuolella suodattimen poistettiin ja solut alemmalla pinnalla insertin kiinnitettiin ja värjättiin kristallivioletilla. Määrä värjäytyneiden solujen laskettiin valomikroskoopilla. Määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Western blot-analyysi

GSK3p, β-kateniinin, Slug, ja Snail ilmentyminen analysoitiin yhteensä solu-uutteissa tai tumassa tiivisteet erotettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelillä elektroforeesi ja siirrettiin polyvinylideenifluoridia (Millipore). Membraanit pestiin Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, jossa Tween (TBST, joka koostuu 10 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl ja 0,05% Tween 20), estetty 1 h huoneenlämmössä 5% rasvaton maito TBST: ssä, tutkitaan sitten 1 h huoneenlämmössä anti-E-kadheriinin Ab, anti-α-SMA Ab, anti-vimentiinistä Ab, anti-GSK3p Ab, anti-β-kateniinin Ab, anti-Snail Ab (Santa Cruz Biotechnologies), anti- -Slug Ab (BD Pharmingen), anti-α-Tublin Ab: n ja anti-GAPDH Ab (Peprotech). Inkuboinnin jälkeen piparjuuren peroksidilla konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta, immunoreaktiivisia proteiineja havaittiin ECL havaitsemisjärjestelmä (Millipore). Määrällinen analyysit immunoblottaus signaaleja saatiin kautta densitometrisesti analyysin avulla LAS4000 Image Software (Fuji Film). Proteiini pitoisuudet määritettiin käyttäen BCA-proteiinia iinianalyysikitissä (ThermoScientific Biosciences).

In vivo kasvaimen kehittymisen

Voit selvittää sferoidiviljelmiä solut ovat tuumorigeenisemmiksi kuin tarttuu kollegansa in vivo, toteutimme kasvainten kehittymiseen ja maksan etäpesäke kokeiluja. Yhden solut suspendoitiin uudelleen PBS: ään. 100-pl suspensiota, joka sisälsi 2 x 10

6 tarttumattomat solut tai pallomainen solua injektoitiin ihon alle (s.c.) kylkiin 4- 6 viikon ikäisiä BALB /C-nu hiiri, joka on saatu Jackson Laboratory. Ihonalainen kasvain halkaisijat mitattiin digitaalinen työntömitta välein kaksi tai kolme päivää, ja kasvaimen tilavuus mm

3 laskettiin käyttämällä kaavaa: Volume = leveys

2 x pituus x 0,52. Sitten 3 tai 4 viikkoa myöhemmin hiiret tapettiin ja jäädytetyt kudosleikkeet (6 pm) ihon alle kasvaimien tehtiin patologinen havaitsemiseen.

In vivo maksan etäpesäkkeen

maksan metastaattinen mallia käytettiin määrittää metastaattisen potentiaalin pallomainen soluja. Maksametastaaseista vahvistettiin pernansisäistä injektio 4 x 10

6 HCT116 sferoidiviljelmiä tai tarttuvat solut ja pernan poistoa suoritettiin 10 minuutin kuluttua pernansisäistä injektion välttämiseksi perna etäpesäkkeitä. Yleinen terveydentila kirjattiin yksityiskohtaisesti kerran päivässä. Maksan etäpesäkkeiden pesäkkeet tutkittiin ja mitattiin. Ja kudos jakso tehtiin hematoksyliini- eosiinivärjäykset Vahvista patologinen lähde.

Tilastollinen

Tilastollinen merkittävyys määritettiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferroni post-hoc testi monimuuttujille tai Studentin t-testiä. Kaikissa testeissä, P 0,05 tai 0,01 pidettiin tilastollisesti merkitsevä tai erittäin merkitsevä.

Tulokset

Morfologiset ja biologisia ominaisuuksia koskevat colonospheres

Kun viljeltiin seerumivapaassa täydennetty 1 x B27, 20 ng /ml EGF: ää ja 10 ng /ml bFGF, sekä HCT116 ja HT29 koolonkarsinoomasoluissa kasvaa suuri pyöreä, irrallinen kelluva pallojakaantuminen pesäkkeet (kutsutaan colonospheres) (kuvio 1). Morfologisesti normaali polariteetti tarttuvien solujen katosi colonspheres. Sitten määritetään taajuuden pallo muodostavien solujen suorittamalla äärimmäinen rajoittavan laimennuksen analyysi (ELDA) vanhempien ja sferoidiviljelmiä johdettuja HCT-116-soluissa. Taajuus muodostaa colonsphere todettiin olevan 5,5 kertaa suurempi sferoidiviljelmiä solussa kuin emosolulinjassa, mikä osoittaa, että pallomainen solu oli korkeammat itsensä uudistaa kapasiteetti.

Sekä HCT116 ja HT29 voivat muodostaa suuri pyöreä, irrallinen kelluva colonsphere 50-100 pm, kun viljeltiin SFM. FCM-analyysi osoitti, että CD133 ilmentyminen nousevat ≤1.2% jopa 60% -80%, kun viljellään SFM. Ja vahvasti ekspressiota Lgr5 havaittiin immunofluoresenssivärjäyksen. Mutta markkeri eriytetyn epiteelisolujen, CK20 ilmaisu esitetään haitallisia muutoksia.

sferoidiviljelmiä solut osoittivat tehostettu ilmentyminen paksusuolen CSC merkkiaineiden-CD133 ja Lgr5, mutta heikennettyjä ilmaus eriytetty epiteelisolujen markkeri CK20 verrattuna niiden vastaavat vanhempien soluja. Osuus CD133-positiivisten solujen määritettiin virtaussytometrialla vanhempien ja pallomainen solut, mutta niiden todettiin olevan yli 80%: in colonospheres, toisin kuin ≤1% havaittiin vanhempien solulinjoissa (kuvio 1). Kun colonospheres alistettiin immunofluoresenssivärjäystä Lgr5, havaitsimme kirkas Lgr5 värjäytymistä pinnalla kunkin sferoidi solun, että niissä on CSCS in colonosphere (kuvio 1). Tulokset viittaavat siihen, että CSCS oli tehokkaasti rikastuneet colonospheres. Usean erilaistumista määrityksessä pallomainen solut siirrettiin seerumia sisältävää alustaa. Sitten fenotyyppi havaittiin 4 viikon ”kulttuuri. Ja havaitsimme, että pallomainen solut uudelleen kiinni muovi- ja muuttunut kiinnittyneet solut morfologisesti yhdessä alassäädetty CD133 /Lgr5 ilmaisun ja säädelty CK20 (ei kuvassa). Tulokset viittaavat siihen, että pallomainen solut on kyky monen eriyttäminen [10].

Sferoidiviljelmiä soluissa näyttää pienempi tarttuvuus mutta korkeampi in vitro muuttavien /invasiivisen kapasiteetti

tukevat pahanlaatuinen profiilin saadun paksusuolen syöpä sferoidi soluja, suoritimme in vitro arvioimiseksi tarttumista ja muuttavien /invasiivisia kapasiteetti pallomaisten solujen verrattuna niiden kiinnittynyt kollegansa. Tulokset soluadheesioanalyysissä osoitettu, että pallomainen soluilla on alhaisempi kapasiteetti sekä tarttumisen FN (yksi keskeinen ECM komponentit) ja tarttuvuus niiden homogeeninen naapureita, verrattuna niiden vanhempien solut (kuvio 2A ja 2B).

Sferoidiviljelmiä solut ovat pienemmät kapasiteetit molempien kiinnikkeistä FN (A) ja niiden homogeeninen naapurit (B), verrattuna niiden vanhempien kanssa. HCT116 /HT29 pallomainen solut osoittivat 3,8-kertaisesti (p 0,01) ja 4-kertaisesti (p 0,001) nousu kemotaktinen potentiaali 24 h (C). Enemmän sferoidi solut pystyivät tunkeutumaan matrigeelin verrattuna niiden vanhempien kollegansa (p 0,001 ja p 0,05, vastaavasti, D).

Huomasimme, että sferoidiviljelmiä solut näyttää merkittävää kasvua soluliikkuvuus käyttämällä TranswellTM muuttoliike kammiot. HCT116 /HT29 sferoidiviljelmiä solut osoittivat 3,8-kertainen (p 0,01) ja 4-kertainen (p 0,001) nousu kemotaktinen potentiaali 24 tunnin vastaavasti verrattuna niiden kiinnittynyt kollegansa (kuvio 2C). Ja myös, huomattavasti enemmän HCT116 /HT29 sferoidiviljelmiä solut pystyivät hyökätä Matrigel päällystettyjä teriä TranswellTM maahanmuuton kammioissa kuin niiden vanhempien kollegansa (p 0,001 ja p 0,05, vastaavasti) (kuvio 2D). Nämä tulokset osoittavat, että paksusuolen syöpä pallomainen soluja, verrattuna niiden kiinnittyvä kollegansa ovat varustettuja pienempi tarttuvuus, ja korkeammat muuttavien /invasiivisen kapasiteetti, toiminnallinen liittyvä fenotyyppi kasvaimen aggressiivisuus.

Sferoidiviljelmiä soluilla korkeampi tuumorigeenisemmiksi ja metastaattisen potentiaalin vivo

Voit selvittää sferoidiviljelmiä solut ovat tuumorigeenisemmiksi ja metastasoituneen kuin tarttuu kollegansa in vivo, toteutimme kasvainten kehittymiseen ja maksan etäpesäke kokeiluja. Kun 2 x 10

6 solua istutettiin subkutaanisesti nude-hiiriin, kaikki hiirille kehittyi kasvaimia. Siirrettyjen kasvainten vahvistettiin, kuten paksusuolen syöpiä värjäys hematoksyliini-eosiinilla. Ja tilavuudet ihonalainen kasvainten sferoidiviljelmiä soluissa ryhmät olivat huomattavasti korkeammat kuin kiinnittyneitä soluja ryhmien (kuvio 3A, 3B ja 3C).

volyymit ihonalainen kasvain HCT116 sferoidiviljelmiä soluissa ryhmä oli merkittävästi suurempi kuin vuonna HCT116-solut ryhmä (A, B). HT29 sferoidi solut osoittivat samanlaisia ​​tuloksia (C). HCT116 sferoidi solut kehittyi maksan metastaasipesäkkeiden kuin HCT116 (D, F). Etäpesäkkeitä vahvistettiin kuten paksusuolen syöpiin hematoksyliini-eosiinivärjäykset (E).

Koska maksa etäpesäke koski, neljä hiirtä (4/5) kehittyi maksan etäpesäke HCT116 pallomainen soluissa ryhmä, mutta vain yksi hiiri (1/5) teki kiinnittynyt ryhmään (kuvio 3D). Etäpesäkkeitä vahvistettiin myös, kuten paksusuolen syöpiä värjäys hematoksyliini-eosiinilla (kuvio 3E). Tuloksena maksan metastaasipesäkkeiden laskenta osoittaa samankaltaisia ​​tuloksia (kuvio 3F). Yleinen olosuhteet hiiristä pallomainen soluissa ryhmässä ovat huonommin kuin kiinnittyneet solut ryhmässä, ja jotkut heistä kehittyi vatsaonteloon sekä voimakas laihtuminen. Tulokset in vivo kokeissa havainnollistaa, että pallomainen peräisin oleviin soluihin omaavat korkeammat tuumorigeenisemmiksi ja metastaattinen kapasiteetti kuin niiden vanhempien kanssa.

EMT-fenotyyppiä sferoidiviljelmiä liittyvät solut Wnt /β-kateniinin signalointireitin

osoittamiseksi, oliko yhteyksiä pahanlaatuinen profiilit sferoidiviljelmiä solujen ja EMT, havaitsimme niiden EMT-fenotyyppi. Tulokset IF ja Western blotting osoitti, että alas-säätely E-kadheriinin ilmentymisen ja säätely ylöspäin α-SMA ja vimentiinista ilmaisun HCT116 ja HT29 colonospheres verrattuna niiden vanhempien soluja (kuvio 4 ja 5). Toisin sanoen sferoidi soluilla on tunnusomainen mesenkyymisolujen. Aktivoituminen Wnt /β-kateniinin reitti on raportoitu indusoivan EMT [16], [17]. Sitten avain molekyylien Wnt /β-kateniinin reitin todettiin käyttäen Western-blottaus. Verrattuna niiden vanhempien soluja, HCT116 ja HT29 sferoidiviljelmiä solut osoittivat alas-säätely GSK3p ilmentymisen mutta säätely ylöspäin Slug ja Etana ilme. Ja myös, ylös-säätely nucleus β-kateniinin ilmentymistä sferoidiviljelmiä soluissa osoitti, että vapaa β-kateniinin siirto sytoplasmaan solun tumassa (kuvio 5).

edustaja mikrovalokuvia kuvaa korkeampi ilmentyminen E-kadheriinin ja kalvo lokalisaation β-kateniinin HCT116 ja HT-29-tarttuvien solujen kuin vastaava sferoidi solujen immunofluoresenssivärjäyksellä. Ja korkeampi ilmentyminen vimentiinista vuonna sferoidiviljelmiä soluissa havaittiin verrattaessa kiinnittyneitä soluja.

Wnt /β-kateniinin signalointi konstitutiivisesti aktivoituu pallomainen soluissa, mukaan lukien sääteli ilmentymä vimentiinista, Slug, Snail, ja ydinvoiman β-kateniinin, mutta alassäädetty ilmentyminen E-kadheriinin ja GSK3p, vertaamalla vastaavien vanhempien soluja.

keskustelu

käsite kasvain heterogeenisyys, joka oletetaan siellä oli eri fenotyyppejä tuumorikudokseen, ehdotti ensimmäisenä Fidleriltä IJ 70 s viime vuosisadan [18]. Syöpä kantasolujen teoria muotoiltu perustuu tähän käsitteeseen. Syöpä kantasoluja on määritelty ”solujen kasvain, joka on kapasiteettia itsensä uudistamista ja jotka voivat aiheuttaa heterogeeninen suvusta syöpäsolut muodostavat kasvain” äskettäisessä American Association of Cancer Research (AACR) workshop [19] . Tähän asti olemassa syövän kantasoluja on vahvistettu useissa kiinteitä kasvaimia. Ja viimeaikainen tunnistaminen paksusuolensyöpä kasvaimeen aloittamista solujen tuo lisätukea syövän kantasolujen hypoteesi [7]. Tämän teorian mukaan, pieni alapopulaatio syövän kantasoluja kantaa koko ominaisuus maligniteetti, mukaan lukien ja metastaasit.

oli useita menetelmiä saada syövän kantasoluja. Laajasti käytetty menetelmä eristää tai rikastaa paksusuolen syövän kantasoluja on solun lajittelu perustuu solupinnan, kuten CD133, CD44, Musasai-1, jne [20]. Sitten, väriaine-effluxing puolella väestöstä soluja, jotka ilmentävät ABCG2, ATP-sitova kasetti puoliksi kuljettaja, eristettiin syövän kantasoluja [21], [22], [23]. Esillä olevassa tutkimuksessa, saimme kasvaimen pallojen HCT116 ja HT29 koolonsyöpäsolulinjoissa viljelemällä seerumittomassa väliaineessa [24], [25]. Ja seuraava analyysi osoitti, että CD133 ja Lgr5 ilmentymistä näiden sferoidiviljelmiä solujen oli suurempi kuin niiden vanhempien kollegansa, kun taas CK20 ilmentyminen oli alempi joka edustaa eriytettyä endoteelisolujen. Ja kun viljeltiin seerumia sisältävässä väliaineessa, Rakeiden solut uudelleen kiinni muovi- ja näytetään alassäädetty CD133 /Lgr5 ja sääteli CK20 lauseke (ei kuvassa). Tulokset viittaavat siihen, että pallomainen solut on kyky multi-erilaistumista. Lisäksi pallomainen solut voivat muodostaa saman aloilla, mikä osoittaa, että he ovat itse uudistaa kapasiteetti. Näistä tuloksista voidaan päätellä, että syöpä kantasoluja voidaan rikastaa näissä sferoidiviljelmiä soluissa.

suoritettu useita toiminnallisia kokeita, jotta voidaan ottaa tarkempi käsitys biologista käyttäytymistä näiden pallomainen solujen . Ensinnäkin tulokset adheesiomääritystä osoittivat, että sferoidiviljelmiä solut osoittavat alhaisempi kapasiteetin molempien kiinnikkeistä FN (yksi keskeinen ECM komponentit) ja tarttuvuus niiden homogeeninen naapureille. Se oli sanoa, tällainen solujen on helpompi irrottaa ECM ja vapauttaa suurimman kasvaimen. Ja myös, pallojakaantuminen solut näyttää suurempi kapasiteetti in vitro maahanmuutto- ja invaasio, verrattuna niiden kiinnittynyt kollegansa. Kuten me kaikki tiedämme, kapasiteetti muuttoliikkeen ja liukenemiseen tyvikalvon ovat pakollisia etäpesäke syöpäsolujen. Joten sferoidi solut voivat siirtyä kemotaktinen tekijä helpommin. Ja ne voivat olla enemmän mahdollisuus entsyymien eritystä liuottamiseksi tyvikalvon, ja helpompi hyökätä pienten suonten sitten siirtyä muihin elimiin mukana veren virtausta. Voit selvittää sferoidiviljelmiä solut ovat tuumorigeenisemmiksi ja metastaattisen in vivo, kasvainten kehittymiseen ja maksan etäpesäke kokeet suoritettiin. Ja tulokset osoittivat, että tilavuudet ihonalaisen kasvaimen pallomainen soluissa ryhmät olivat merkittävästi korkeampia kuin tarttuvien solujen. Ja myös, maksa metastaasipesäkkeiden laskenta osoitti samanlaisia ​​tuloksia. Havainnot in vivo kokeissa havainnollistaa, että pallomainen peräisin oleviin soluihin omaavat korkeammat tuumorigeenisemmiksi ja metastaattinen kapasiteetti kuin niiden vanhempien kanssa.

solut invasiivisen rintamilla näytteille muutoksia epiteelin rakenteeseen ja toimintaan, joka johtaa liukeneminen adherens liittymissä, menetys apikaalisella-pohjapinta polariteetin menetys epiteelin markkereita, uudelleenjärjestely aktiinisytoskeletonin, induktio mesenkymaalisten geenien ilmentyminen ohjelman ja parannettu liikkuvuus ja hyökkäys: prosessia kutsutaan epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) [26] , [27], [28]. Yleisesti E-kadheriinin, β-kateniinin ja α-kateniinin sitoutuvat kompleksin muodostamiseksi. Ja yhteys E-kadheriinin-β-kateniinin-α-kateniinin monimutkainen Aktiinisytoskeletonin on erittäin tärkeää, että ylläpito solun polariteetti ja soluadheesion. Joten, oikea lokalisaatio E-kadheriinin ja vyöliitos on erittäin tärkeä perustamisen ja vakauttaminen näiden välisissä liitoksissa keskuudessa HCT116 /HT29. Tämä on tärkeä toiminto, erityisesti yhteydessä kasvaimen ja metastaasin, koska menetys E-kadheriinin solun pinnalla on osoitettu olevan rooli kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden [16], [29]. Tutkimuksessamme pallojakaantuminen solut osoittivat alas-säätely E-kadheriinin ja säätely ylöspäin α-SMA ja vimentiinista, ja jälkimmäinen kaksi molekyyliä ovat markkereita mesenkyymisolujen. Joten, pallomainen solut näyttää fenotyyppi EMT mukaan tuloksemme. Ja biologista käyttäytymistä pallomaisten solujen sopusoinnussa mesenkyymisolujen, kuten ei-polaarisia morfologista merkki, pienempi tarttuvuus mutta suuremmat in vitro muuttavien /invasiivisen kapasiteettia.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet avainasema Wnt /β-kateniinin signalointi väylän itseuudistumisen epiteelisolujen kantasolujen [30], [31]. Sen sijaan, dysregulaatio Wnt /β-kateniinin signalointireitin on liitetty koolonin karsinogeneesissä [32], [33]. On todettu, että hyvin konservoitunut Wnt /β-kateniinin signalointireitin tiiviisti EMT [34]. Wnt /β-kateniinin signalointireitin sisältävät monia komponentteja, kuten Wnt proteiinit, Frizzled (Fz), Dishevelled (DSH), APC /GSK3p /ak- siini kompleksi, β-kateniinin, TCF /LEF transkriptiotekijän, ja jotkut kohdegeenien (c-myc , sykliini D, surviviinia Snail, Slug, jne.). Yleensä ilman Wnt, APC /GSK3p /ak- siini kompleksin (tuhoaminen kompleksi) sijaitsee sytoplasmassa, jossa se sitoutuu ja fosforyloi β-kateniinin. Jälkimmäinen poistuu tämän jälkeen monimutkaisia ​​ubikitinoituja by b-TrCP (joka sitoutuu fosforyloitu ”degron” motiivi β-kateniinin), sitten hajotetaan proteasomin. Vuonna kunnon aktivaation Wnt /β-kateniinin signalointireitin, Wnt indusoi yhdistys ak- siini fosforyloituine LRP. APC /GSK3p /ak- siini kompleksi hajoaa, ja β-kateniinin on vakiintunut. Kertynyt β-kateniinin sytoplasmassa translokoituu tumaan ja sitoutuu TCF /LEF, parantaa ilmentymistä kohdegeenien, kuten Slug ja Etana, joka aiheuttaa EMT ja etäpesäke paksusuolensyöpä [35]. Aktivoitumista Wnt-signaalin esto APC /GSK3p /ak- siini monimutkainen, tumaansiirtymiseen of β-kateniinin, ja ylös-säätely Slug ja Etana ovat avainkohtia EMT sääntelyn paksusuolen syöpä [36]. Tutkimuksessamme säätely alaspäin GSK3p ja säätely ylöspäin Slug ja Etana ilmaisun havaittiin. Ja myös, ylös-säätely nucleus β-kateniinin ilmentymistä sferoidiviljelmiä soluissa osoittaa, että vapaa β-kateniinin siirto sytoplasmaan solun tumassa.

Yhteenvetona Tutkimuksessamme tarjoaa todisteita syövän kantasoluja . Rakeiden johdetut solut HCT116 ja HT29 solulinjoissa rikastaa kantasoluja kaltaisia ​​soluja. Verrattuna niiden kiinnittynyt kollegansa, kelluva-pallo peräisin olevat solut näytetään alempi homotyyppisessä /heterotypic tarttuvuus mutta suuremmat in vitro muuttavien /invasiivisia kapasiteetti, sekä korkeammat tuumorigeenisemmiksi ja metastaattisen potentiaalin in vivo. Ja ne osoittavat tyypillisiä fenotyyppiä EMT (alas-säänneltyjen E-kadheriinin ja säädelty vimentiinista), mikä voi selittää heidän maligniteetti. Ja aktivointi Wnt /β-kateniinin polku (down-regulation GSK3p ja ajan säätely Slug, Snail ja nucleus β-kateniinin) voi olla tärkeä rooli EMT on CCSCs.

Kiitokset

Haluamme kiittää Qi Zhang, Cui-Ling Qi, Li-Jie Pan, ja Yu Yang apua prosessissa kokeen.