Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eri syöpäsoluja osoittaa muuttuneita herkkyyttä metformiiniin. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat nämä havainnot voi johtua osittain yhteiseen soluviljelmissä käytäntö hyödyntää runsaasti glukoosia, ja kun glukoosi laskee, metformiinin yhä sytotoksisia syöpäsoluja. Vähän glukoosia olosuhteissa vaihtelee 0-5 mM, metformiinin oli sytotoksinen rintasyövän solulinjoissa MCF7, MDAMB231 ja SKBR3, ja munasarjasyövän solulinjoissa OVCAR3, ja PA-1. MDAMB231 ja SKBR3 aiemmin osoitettu olevan vastustuskykyisiä metformiinin normaalissa runsaasti glukoosia välineellä. Kun glukoosi nostettiin 10 mM tai enemmän, kaikki nämä solulinjat tulee vähemmän herkkä metformiiniin. Metformiini hoito vähensi merkittävästi ATP-tasot soluissa inkuboitiin mediassa alhaisen glukoosin (2,5 mM), korkea fruktoosi (25 mM) tai galaktoosia (25 mM). Vähennykset ATP-tasot ei havaittu korkea glukoosi (25 mM). Tämä kompensoivat parannettu Glykolyysivaiheen aktivoimalla AMPK kun oksidatiivisen fosforylaation estyi metformiinia. Kuitenkin parannettu Glykolyysivaiheen oli joko heikentynyt tai poistettava korvaamalla 25 mM glukoosi 2,5 mM glukoosia, 25 mM fruktoosia tai 25 mM galaktoosia. Nämä havainnot viittaavat siihen, että alentamalla glukoosin voimistaa metformiinin solukuolema vähentämällä metformiinin kannustanut Glykolyysivaiheen. Lisäksi matalan glukoosin olosuhteissa metformiini laskivat merkittävästi fosforylaatioon AKT ja eri tavoitteet mTOR, kun taas fosfo- AMPK ei kuitenkaan muuttunut merkitsevästi. Näin mTOR signaloinnin näyttää olevan riippumaton AMPK aktivointia. Lisäksi in vivo tutkimukset käyttäen 4T1 rintasyövän hiirimallissa vahvisti, että metformiini Tuumorin kasvun eston on parantunut, kun glukoosin tasot seerumissa pienenivät kautta kevytolut ketogeeninen ruokavalio. Tulokset tukevat mallia, jossa metformiinin hoidossa syöpäsolujen vähän glukoosia väliaineessa johtaa solukuolemaan vähentämällä ATP tuotantoa ja esto selviytymisen signalointireittien. Parannettu sytotoksisuus metformiinin syöpäsoluja vastaan ​​havaittiin sekä in vitro että in vivo.

Citation: Zhuang Y, Chan DK, Haugrud AB, Miskimins WK (2014) mekanismeja, joilla Matala glukoosi Parantaa sytotoksisuus metformiinia syöpäsolut Molemmat

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 9 (9): e108444. doi: 10,1371 /journal.pone.0108444

Editor: Viji Shridhar, Mayo Clinic College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 29 elokuu 2014; Julkaistu: 25 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Zhuang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuettiin apurahan KG100497 (W.K. Miskimins) Susan G. Komen varten Cure. Seahorse XF24 kokeet tukevat COBRE palkinnon 5P20GM10358 (W.K Miskimins) National Institute of General Medical Sciences National Institutes of Health. Projekti myös tukee osittain jota COBRE ohjaajan palkinnon (Y. Zhuang) ja PHS avustus 1R01CA180033-01 (W.K. Miskimins) National Cancer Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

siirtymistä syövän solut käyvät läpi kyseeseen niiden tavallisten aineenvaihdunnan toimintoihin helpottaa nopeaa kasvupotentiaalia. Otto Warburg raportoitu korkeat Glykolyysivaiheen syöpäsoluissa myös aerobisissa olosuhteissa. Tämä paradoksaalinen muutos on yksi mekanismi, jolla syöpäsolut ovat sovitettu nopeaan lisääntymiseen. Seurauksena tästä muuttunut aineenvaihdunta, syöpäsolut käyttävät suuria määriä glukoosia ja tuottaa suuria määriä laktaattia. Glukoosimetabolia kautta Glykolyysivaiheen myötävaikuttaa ATP synteesi ja tarjoaa välituotteita muita biosynteettisiä prosesseja. Niinpä syöpäsolut ovat riippuvaisia ​​korkea glukoosin oton ja aineenvaihduntaa hengissä [1], [2].

Nykyinen menetelmiä

in vitro

syövän soluviljelmässä yleisesti käyttää suuri glukoosipitoisuus, 25 mM (450 mg /dl), kasvualustassa. Vaikka korkea -kasvatusalustasta luo optimaaliset olosuhteet syöpäsolujen lisääntymistä, nämä glukoosipitoisuus saattaa vaikeuttaa tulkintaa lääkkeen tehon tutkimista varten. Korkea glukoosi yksin on kyky aktivoida leviämisen reittejä syöpäsolu [2], ja jatkuva saatavuus glukoosin antaa vähän normaalia stressiä syöpäsolujen kokemus

in vivo

. Haiman syöpäsoluja, Sinnettin-Smith

et al

. [3] havaittu, että metformiini on toimia AMPK aktivointi tehostettiin käyttämällä 5 mM glukoosia media viljellyissä soluissa.

normaali seerumin glukoosin pidetään tavallisesti välillä 4 ja 6 mM (noin 72-108 mg /dl). Vähäisen ravinteiden saatavuus, seerumin glukoosipitoisuus saattaa pudota 2,5 mM (45 mg /dl), jossa kudosten glukoosi yleisesti alhaisempi. Vähentää glukoosin saatavuus on myös yritetty, kuten syövän hoidossa, erilaisilla menetelmillä. Muokkaus ruokavalio suoralla kalorien rajoittaminen tai paasto on tutkittu menetelmä vähentää syövän kasvua joitakin lupaavia tuloksia [4] – [6]. Yleensä paasto näyttää olevan tehokkaampi kuin jatkuva kalorien rajoittaminen vähentää syövän kasvua [5]. Lisäksi ruokavalio muutos, diabeteksen lääkkeet ovat toinen keino alentaa plasman glukoosia. Kliinisessä tutkimuksessa verrattiin metformiinia tehokkuus nykyisiin tyypin II diabetesta elämäntapaan, metformiinin havaittiin pienempi plasman glukoosi pitoisuuksia noin 3 mM (55 mg /dl) esikäsittelystä tasolla [7]. On kuitenkin syytä huomata, että metformiini ei ole merkittäviä vaikutuksia laskee plasman glukoosin ei-diabeetikoilla [8].

Äskettäin metformiini on saavuttanut uutta mielenkiintoa mahdollisena syövän terapeuttiseen ja kemoterapia adjuvanttia. Metformiini mahdollisuudet syövän vastaista aktiivisuutta oli mukana alemman syövän tyypin II diabeetikoilla verrattuna muihin glukoosin hallintaan lääkkeiden [9]. Tämä vaikutus oli aluksi johtuvan metformiinin n systeemisen glukoosin ja insuliinin säätö- ominaisuudet. Myöhemmin metformiinin havaittiin myös estävän syövän kasvua solutasolla. Anti-onkogeenisiä kanteen metformiinin todennäköisesti yhdistelmä systeemisiä insuliinikontrolli vaikutuksia ja suora solujen vaikutuksia. Monet ryhmät ovat osoittaneet metformiinin n toiminta

in vitro

eri syöpätyyppien [10] – [14]. Kuitenkin jäljittelemään vaikutuksia metformiinin

in vitro

havaitut

in vivo

, suurina pitoisuuksina, tavallisesti 5-20 mM, metformiinin tarvitaan. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat nämä havainnot voi johtua osittain yhteiseen soluviljelmissä käytäntö hyödyntää runsaasti glukoosia, ja kun glukoosi laskee, metformiinin yhä sytotoksisia syöpäsoluja [15], [16]. Lisäksi hiilen lähde syöpäsolujen havaittiin merkittävästi muuttaa syövän vaikutukset metformiinin kanssa, kun verrataan glukoosin glutamiini [17]. Tässä tutkimuksessa syöpäsoluja altistetaan korkealle glutamiinia ilman glukoosin olivat paljon herkempiä inhibitiolle metformiini.

Vaikka tarkkaa mekanismia metformiinin syöpä sytotoksisuus on tuntematon, metformiini n systeeminen toiminta todennäköisesti yhdistyvät suoraan solujen toimintaa parantaa sen vaikutusta syöpäsolujen kasvun esto ja syöpäsolun kuoleman. Tässä osoitamme, että alhainen normaalille glukoosipitoisuus, toisin kuin suuri glukoosipitoisuus olosuhteissa voimistaa metformiinin rinta- ja munasarjasyövän solulinjoissa. Mahdollisia mekanismeja tätä toimintaa tutkitaan. Nämä havainnot voivat paljastaa sekä merkityksellisempää soluviljelytekniikoilla tutkimiseen metformiinin syövän sekä tarjoavat tietoa kliinisestä käytöstä metformiinin liitännäisaineena syövän hoidossa.

Methods

Kemikaalit ja reagenssit

seuraavia kemikaaleja käytettiin tässä tutkimuksessa: metformiini (1, 1-dimetyylibiguanidi,), D – (-) – fruktoosi, D – (+) – galaktoosi, 2-deoksi-D-glukoosia, oligomysiini (Sigma Chemical Co). Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), jossa oli paljon glukoosia (Hyclone), Gibco DMEM ilman glukoosia (Life Technology), SYTOX Green Nucleic Acid Stain (Invitrogen), ja ATP-määritys (Invitrogen).

Soluviljely

ihmisen syöpä MCF7, MDAMB231, OVCAR3, PA-1, SKRB3, ja ihmisen rintarauhasen epiteelisolujen MCF10A solut kaikki hankittiin ATCC ja pidettiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia vaihtelevalla glukoosipitoisuutta ja 1% penisilliini- streptomysiinillä 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. Kaikki solulinjat olivat käytetty kanavan kymmenen saatuaan ATCC varmistamiseksi solulinjan todennus.

Solukuolema määritys käyttäen Sytox Green Nucleic Acid Stain

Solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin ilmoitettu hoito yhden tai kaksi päivää. Sytox Green nukleiinihappo tahra (10 uM) lisättiin suoraan soluihin 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin 10 minuuttia. Levy luettiin heräte /päästö 485 nm ja 530 nm, vastaavasti, jossa on 515 nm sulku käyttäen fluoresenssilevylukijaa (SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Devices, LLC). Fluoresenssi mitattiin, jolloin saatiin kuolleiden solujen määrä. Sen jälkeen, määrittää solujen kokonaismäärä, 0,4% Triton-X100, lisättiin kuhunkin näytteeseen ja inkuboitiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa läpäiseviksi kaikki solut, ja fluoresenssin 485/530 nm: ssä mitattiin jälleen, jolloin saatiin solujen kokonaismäärästä .

ATP-määritys

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja sen jälkeen inkuboitiin 24 tuntia. Hoito annettiin tuoretta alustaa 24 tuntia. Yhtä suuri määrä soluja lyysattiin kummassakin hoitoryhmässä ja 10 ui käytettiin kunkin näytteen seuraten valmistajan protokollaa ATP määritykset (Invitrogen, ATP määritys Kit, A22066). Lyhyesti, 100 ui standardi reaktioliuos mitattiin luminometrillä tausta luminesenssi. Sitten 10 ui lysaattia supernatanttia lisättiin reaktioliuokseen, ja luminesenssi mitattiin uudelleen. Taustaa luminesenssi vähennettiin näytteestä luminenssi ja tulokset esitettiin graafisesti kertaluokkamuutos kontrollinäytteistä.

Western blotting

Solut 35 mm astiat huuhdeltiin kerran PBS: lla ja lyysattiin lisäämällä natriumdodekyylisulfaattia ( SDS) näytepuskuria [2,5 mM Tris-HCI (pH 6,8), 2,5% SDS, 100 mM ditiotreitoli, 10% glyserolia, 0,025% pyronine Y]. Yhtä suuret määrät proteiinia Kunkin ryhmän erotettiin 10%: n tai 15% SDS-polyakryyliamidigeeleillä. Proteiinit siirrettiin Immobilon P -kalvoille (Millipore) käyttämällä puoli- kuivaa Bio-Rad Trans-blot-laitteessa, jossa siirto puskuria 48 mM Tris-HCl ja 39 mM glysiiniä. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa tai 5% BSA: ta Tris-puskuroitu suolaliuos [10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 150 mM NaCl], joka sisälsi 0,1% Tween-20 (TBS-T), yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Sitten membraania inkuboitiin sopivan vasta-aineen kanssa TBS-T, joka sisälsi 5% rasvatonta maitoa tai 5% BSA: lla 1 tunnin ajan huoneenlämmössä tai yön yli 4 ° C: ssa. Sen jälkeen kun oli pesty TBS-T kaivoa inkuboitiin sopivan piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta. Proteiinit havaittiin käyttäen Super Signal West Pico kemiluminesenssisubstraatilla (Pierce Biochemical). Anti-β-aktiini monoklonaalinen vasta-aine (A5441, käytetään 1:10,000) hankittiin Sigma. Vasta-aineita fosforyloidun AKT treoniini 473 (# 05-669 käytetty 1:1000) hankittiin Upstate Biotekniikka. Vasta-aineet AKT fosforyloitiin treoniini 308 (# 4056, käytetään 1:1000), ATK (# 4691, käytetään 1:1000), fosforyloitu S6K (# 9206, käytetään 1:2000), S6K (# 9202, käytetään 1:2000), PARP (# 9542, käytetään 1:2000), lohkaistaan ​​PARP (# 9541, käytetään 1:2000), AMPK fosforyloitiin treoniini 172 (# 2535, käytetään 1:1000), ja AMPK (# 2532, käytetään 1:1000), katkotun kaspaasi 7 (# 9491, käytetään 1:1000) ostettiin Cell Signalling Technology. Toissijainen piparjuuriperoksidaasi-kytkettyä anti-hiiri (# 31430, käytettiin 1:5000) ja anti-kani (# 31460, käytettiin 1:5000) IgG hankittiin Pierce Biochemical.

Lactate määritys

MCF7 maljattiin 96-kuoppalevyille ja käsitelty kuten 15 tuntia. Medium kustakin käsittelystä kerättiin ja testattiin laktaattipitoisuus käyttäen L-laktaatti Assay Kit (Eton Biosciences Inc.). Solut laskettiin käyttäen Sytox Green värjäystä menetelmällä kuten aiemmin on kuvattu. Suhteellinen laktaattitasot saatiin normalisoinnin jälkeen, jonka solujen kokonaismäärä.

mittaus Extra Cellular happamoituminen Rate (ECAR) ja hapenkulutuksen (OCR) B

ECAR ja OCR mitattiin käyttämällä Seahorse XF24 analysaattori mukaan valmistajan ohjeiden (Seahorse Bioscience). Lyhyesti, MCF7-solut maljattiin 40.000 solua /kuoppa XF24-kuoppalevyillä. Soluja käsiteltiin kuten on esitetty seuraavana päivänä. Ennen kuin se prosessoitiin Seahorse XF24 analysaattori, solut pestiin ja tasapainotettiin puskurilla elatusaineella (D5030, Sigma) 37 ° C: ssa CO

2-free-inkubaattorissa yhden tunnin ajan. Alkuperäisen mittaukset ECAR ja OCR saatiin sen jälkeen lisättiin eri pitoisuuksia glukoosia (2,5 mM tai 25 mM), fruktoosi (25 mM) tai galaktoosia (25 mM). ECAR ja OCR ovat edelleen mitattiin seuraavan injektion oligomysiini ja 2-deoksiglukoosille. Solujen määrä saatiin trypsiinikäsittely- solut ja laskemalla hemosytometrillä. ECAR ja OCR piirrettiin normalisoinnin jälkeen, jonka solujen kokonaismäärä.

In vivo

hiirikokeissa

Kaikki kokeet suoritettiin sopusoinnussa institutionaalisten ja kansallisten ohjeiden ja määräysten; pöytäkirja hyväksyttiin institutionaalisten eläinten hoidon ja käytön komitea Sanford Research. Lyhyesti, käyttäen 25 gaugen neulaa, Balb /C-hiiriin ruiskutettiin ihonalaisesti 1 x 10

5-solut kylkeen (10 hiirtä käsittelyä kohti kunnossa). Neljä päivää tuumorisoluinjektion jälkeen, hiiret siirtyi kalori rajoitettu matala hiilihydraatti ketogeeninen ruokavalio (BioServ P3666) varten KD ryhmä (lisätietoja jäljempänä ruokavalion). Ohjaus ryhmät pysyivät normaalin hiiren chow (Teklad Global 18% Protein Jyrsijöiden Diet) ja syötettiin kuin libitum. Metformiini (2 mg /hiiri) intraperitoneaalisesti päivittäin alkaen 7 päivää sen jälkeen, kun kasvaimen injektion jälkeen. Kasvaimen tilavuus arvioitiin käyttämällä

2 x B, jossa A on suurempi halkaisija ja B on pienempi halkaisija. Eläimet lopetettiin kun kasvaimen koko oli suurempi kuin 15 millimetriä sen suurin mitta, tai kasvainten saavuttaa 3000 mm

3, tai kun eläin oli huomattavasti laihtunut.

Serum glukoosimittaus

Seerumin glukoositasot mitattiin käyttäen häntälaskimon verta sen jälkeen, kun lävistyksen hännän 25 olevan neulan tuottaa yksi tippa verta jokaisessa testissä. Glukoosi mitattiin käyttämällä Bayer Contour Glucometer ja glukoosin liuskat.

Diet tietoa

matala hiilihydraatti ketogeeninen ruokavalio ostettiin BioServ (# F3666). Tämä ruokavalio sisältää kaloreita proteiinia, rasvaa ja hiilihydraatteja noin 4,6%, 93,4%, ja 2%: lla. Kaikki hiiret syötetään tämä ruokavalio alistettiin 30% kalori rajoitus (7 kcal /päivä /hiiri) alkaen 4

päivänä sen jälkeen, kun kasvainsolujen injektion jälkeen. Kalori rajoitus määritettiin mittaamalla painon ruoasta päivittäin. Sopiva määrä ketogeeninen ruokavalio annettiin joka päivä petrimaljalle sisällä häkissä. Kalorit nostettiin 7,5 kcal /päivä /hiiri (25% rajoitus) päivänä 7 aloittamisen jälkeen ketogeeninen ruokavalio estää painon menetystä. Kalorit kasvatettiin edelleen 8 kcal /päivä /hiiri päivänä 11. aloittamisen jälkeen ketogeeninen ruokavalio ja ylläpitää tällä tasolla loppuun asti kokeen. Verrokkiruoalla ryhmiä ruokittiin ad libitum vakio hiiren chow (Teklad Global 18% proteiinia jyrsijöiden ruokavalio), joka tarjoaa kaloreita proteiinia, rasvaa ja hiilihydraatteja noin 24%, 18%, ja 58%, vastaavasti.

tilastollinen analyysi

Virhepylväät osoittaneet ovat vakiona poikkeamat keskiarvosta vähintään kolme toistoa. Kaksisuuntainen pareittain Opiskelijan

t

testejä käytettiin verrattaessa kahteen ryhmään.

P

-arvot vähemmän kuin tai yhtä suuri kuin 0,05 katsottiin olevan merkittäviä.

Tulokset

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että metformiini on sytotoksinen monia rinta- ja munasarjasyövän solulinjoissa . Kuitenkin jotkut solulinjat kuten rintojen solulinjojen MDAMB231 ja SKBR3 osoitti vastustuskykyä metformiinin sytotoksisuuteen [14], [18], [19]. Edellinen kokeet suoritettiin DMEM: ssä, joka sisälsi 25 mM glukoosia, joka on merkittävästi korkeampi kuin normaaleissa fysiologisissa olosuhteissa on 4-8 mM. Määrittämään vaikutuksen glukoosipitoisuus on sen sytotoksisuutta metformiinin, testasimme vaikutuksia eri glukoosin kasvualustaan ​​syöpäsolujen altistuvat metformiiniin. Kaikki soluviljelmät alun perin pidettiin runsaasti glukoosia väliaineessa (25 mM glukoosia) ja maljattiin 96-kuoppaisille levyille yksi päivä, seuraavana päivänä soluja käsiteltiin metformiinin (0 mM, 2 mM, 4 mM, 8 mM ja 16 mM) väliaineessa, joka sisältää eri pitoisuuksia glukoosia (0 mM, 2,5 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM ja 25 mM), yhden päivän. Kuten glukoosipitoisuus keskipitkällä lasku, metformiiniin huomattavasti prosenttiosuutta kuolleiden solujen MDAMB231, MCF7, ja SKBR3 soluja (kuvio 1A, 1B, 1C). Aiemmat tiedot osoittavat, että suuri glukoosipitoisuus väliaineessa, sekä MDAMB231 ja SKBR3 solut ovat resistenttejä metformiiniin (8 mM) jopa kolme päivää [14], [18], [19]. Korkeissa glukoosi olosuhteissa näissä solulinjoissa, MDAMB231 ja SKBR3, edelleen vastustuskykyisiä metformiini hoitoja enintään 16 mM lääkekonsentraatioiden. Kuitenkin, kun glukoositasot laskivat 2,5 mM tai vähemmän sekä MDAMB231 ja SKBR3 osoittavat sytotoksista vastetta ja metformiiniin 4 mM 16 mM.

Kaikki soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla metformiinin (0, 2 , 4, 8, 16 mM) väliaineessa, joka sisältää eri glukoosia (0, 2,5, 5, 10, 15, 25 mM) yhden päivän. Prosenttiosuus kuolleet solut määritettiin käyttäen Sytox Green värjäystä. Metformiini merkittävästi lisääntynyt prosenttiosuus kuolleiden solujen pienenee glukoosipitoisuus (A) MDAMB231-soluja, (B) MCF7-soluja, ja (C) SKBR3-soluissa, mutta ei (D) MCF10A soluja. Tulokset esitettiin keskiarvo ± keskihajonta.

Samalla vaikutuksia metformiinin eri glukoosin tutkittiin ei-syöpä ihmisen rintarauhasen epiteelisolujen line MCF10A (kuvio 1 D). Toisin kuin syöpä soluviljelmien vähentäminen glukoosipitoisuus ei merkittävästi herkistää MCF10A metformiinia hoitoon tällä ajanjaksolla. Tämä ero saattaa johtua taustalla eroista glukoosiaineenvaihdunnan normaalin rintarauhasen epiteelisoluissa ja syöpäsoluja.

Sen testaamiseksi, ovatko nämä vaikutukset metformiinin sytotoksisuuteen soveltaa muun syöpäsolutyyppien, tutkimme myös munasarjasyöpäsoluja . Samalla tavalla, joka alentaa glukoosin todettiin lisäävän sytotoksisuuden metformiinin munasarjasyövän solulinjoissa OVCAR3 ja PA-1 (kuvio 2). Tämä viittaa siihen, että alentamalla glukoosin vuon syöpäsoluissa voisi merkittävästi parantaa sytotoksisuuden metformiinin, ja että tämä vaikutus voi olla yleisesti ottaen merkityksellinen eri syöpäsolutyyppien.

. Sen jälkeen 48 tunnin hoitoja metformiinin (5 mM, +) tai kontrolli ajoneuvo (H

2O, -), elävät OVCAR3 solujen määrä määritettiin laskemalla trypaanisini- negatiivisia solujen ja kuolleiden solujen määrä määritettiin laskemalla trypaanisini- positiivisia soluja. B. PA-1 solukuolema määritettiin, kuten on kuvattu julkaisussa A. Faasikontrasti- kuvia (40x) viljeltyjen solujen kanssa (alempi kuva) tai ilman (ylempi kuva) metformiiniin. Pylväsdiagrammit edustaa keskiarvo ± keskihajonta. Kaikki metformiini hoitoryhmissä väliaineessa, joka sisältää matalan glukoosia (1 mM) olivat merkittävästi erilaisia ​​kuin niiden kontrolliryhmiin. * Osoittaa merkitsevää eroa ryhmien välillä.

Muut tunnetut solun toimet metformiinin kuuluvat eston kompleksin I elektroninsiirtoketju ja oksidatiivisen fosforylaation [20]. Tämä toiminta voi johtaa kuolleen tuotannossa ATP ja muiden solujen välituotteita. Solun ATP-tasot MCF7, MDAMB231, ja PA-1 tutkittiin sen jälkeen, kun metformiiniin (24 tuntia) joko korkea glukoosi (25 mM) tai alhainen glukoosi (2,5 mM) kudosviljelyelatusaineeseen (kuvio 3). Tulokset osoittavat, että metformiini pienentää huomattavasti ATP-tasot vain vähän glukoosia väliaineessa. Korkea glukoosi olosuhteissa, tänä ajankohtana, metformiini on taipumus lisätä ATP, mutta ei tasolle merkitys.

MDAMB231 (A) ja (B) MCF7-soluja käsiteltiin ja metformiinin (8 mM) joko 25 mM glukoosi tai 2,5 mM glukoosi yhden päivän ja ATP-tasot mitattiin ja taita muutos ATP verrattuna kontrolli piirrettiin. C. ATP mittaukset PA-1-soluissa 12 tunnin kuluttua metformiinin kanssa tai ilman. Tämä ajankohta valittiin, koska on nopeaa PA-1 kasvun kurissa viljelyolosuhteissa. Tulokset esitettiin keskiarvo ± keskihajonta. Kaikki metformiini hoitoryhmissä väliaineessa, joka sisältää matalan glukoosia (2,5 mM) olivat merkittävästi erilaisia ​​kuin niiden kontrolliryhmiin. * Osoittaa merkitsevää eroa ryhmien välillä.

suuri glukoosipitoisuus olosuhteissa, metformiini käsitellyt solut mahdollisesti ylläpitää ATP-tasot aktivoimalla AMPK ja tehostaa glykolyysiin [21], [22]. Tämän testaamiseksi MCF7-soluja käsiteltiin metformiinin (8 mM) 15 tunnin ajan, solu hapenkulutus (OCR) ja solunulkoisen happamoitumista rate (ECAR) mitattiin käyttäen XF24 merihevosen analysaattori. Kuten odotettua, metformiini esti merkittävästi hapen kulutusta MCF7-solujen alustassa, joka sisälsi joko 25 mM tai 2,5 mM glukoosia (kuvio 4A). Parannettu glykolyysin metformiinin käsitellyissä soluissa 25 mM glukoosia sisältävää alustaa vahvistettiin lisäämällä happamaksi solunulkoisen väliaineen (kuvio 4B) ja laktaatti erittymistä (kuvio 4C). Kuitenkin vähän glukoosia käsiteltyjen syöpäsolujen osoitti vähentynyt kasvattamiselle ECAR ja laktaatintuotto metformiinin, osoittaa alentunut kyky edistää kasvua Glykolyysivaiheen (kuvio 4B, 4C). Siten epäonnistuminen riittävästi edistä Glykolyysivaiheen korreloi kyvyttömyydestä ylläpitää solunsisäisen ATP näissä olosuhteissa.

. MCF7-soluja käsiteltiin ja metformiinin (8 mM) 15 tunnin ajan joko 25 mM tai 2,5 mM glukoosia sisältävässä väliaineessa. Hapenkulutuksen (OCR) määritettiin käyttämällä FX24 väline aineenvaihdunnan vuon analyysiä. Metformiini käsitelty ryhmät olivat merkittävästi erilaisia ​​kuin niiden kontrolliryhmiin. B. MCF7-soluja käsiteltiin ja metformiinin (8 mM) 15 tunnin ajan. Solunulkoinen happamoitumista rate (ECAR) määritettiin käyttämällä FX24 väline aineenvaihdunnan vuon analyysiä. Metformiini hoidetuissa ryhmissä olivat merkitsevästi keskenään erilaisia ​​ja niiden kontrolliryhmiin. C. MCF7-soluja käsiteltiin metformiinin (8 mM) 15 tunnin ajan, ja keskipitkän laktaattitasot mitattiin indikaattorina glykolyyttisten muutostilassa. Metformiini käsitelty ryhmät olivat merkittävästi erilaisia ​​toisistaan. D. uutteet MCF7 ja MDAMB231 solut korjattu yksi päivä metformiinin joko 25 tai 2,5 mM glukoosia käytettiin Western blotting havaitseminen fosforyloidun AMPK ja yhteensä AMPK. p-Actin havaittiin latauskontrollina. Densitometria p-AMPK /AMPK tai p-AMPK /Actin varten MCF7-soluissa esitetään pylväskaaviona. Lohkaista capsase 7 MCF7-soluissa havaittiin western blottauksella. p-Actin havaittiin latauskontrollina. E. MCF7 solut runsaasti glukoosia hoidettiin metformiinilla (8 mM) ja yhdistettä C (10 uM), kuten 15 tuntia. DMSO on ajoneuvon ohjaus yhdisteen C. ECAR määritettiin, kuten on kuvattu B. Metformiini hoidetuissa ryhmissä olivat merkitsevästi keskenään erilaisia. F. MCF7 solut runsaasti glukoosia hoidettiin metformiinilla (8 mM) ja yhdistettä C (10 uM), kuten 15 tuntia. Medium laktaatti-tasot määritettiin kuten C. Metformiini hoidetuissa ryhmissä olivat merkitsevästi keskenään erilaisia. Kaikki pylväskaaviot edustavat keskiarvo ± keskihajonta. * Osoittaa merkitsevää eroa ryhmien välillä.

AMPK tiedetään säännellä Glykolyysivaiheen tehostamalla glukoosin oton ja sääntelyä useiden keskeisten entsyymien koulutusjakson [21] – [25]. Edellisessä tiedot osoittivat, että metformiini voi aktivoida AMPK lisäämällä fosforylaatio AMPK on treoniini 172 elatusaineessa, joka sisälsi 25 mM glukoosia [14]. Siksi tasot AMPK aktivointi metformiinin kohtelu sekä runsaasti glukoosia ja matalan glukoosin tutkittiin. MCF7 ja MDAMB231-soluja käsiteltiin ja metformiinin (8 mM) yhden päivän ajan joko 25 mM tai 2,5 mM glukoosia sisältävässä väliaineessa. Western blottaus suoritettiin havaitsemiseksi fosforyloidun AMPK ja yhteensä AMPK. Molemmissa solulinjoissa metformiinin parantaa tasot fosforyloitua AMPK, aktiivisen entsyymin muodosta, elatusaineessa, joka sisälsi 25 mM glukoosia, mutta ei elatusaineessa, joka sisälsi 2,5 mM glukoosia yhden päivän kuluttua käsittelystä (kuvio 4D). Sen sijaan, kun taas alhainen glukoosi, itse, lisääntynyt fosforylaatiota AMPK, lisäämällä metformiinin näissä olosuhteissa näytti vähenevän sekä fosfo-AMPK ja yhteensä tasoja entsyymin. Tämä osoittaa edelleen densitometery on Western blot MCF7-solujen määrittää suhde fosforyloidun AMPK kokonais- AMPK ja suhde fosforyloidun AMPK aktiinin (kuvio 4D). Kasvatusliuoksessa, joka sisälsi 2,5 mM glukoosia, metformiinin edelleen parannettu aktivointi AMPK verrattuna kontrolliin, osoittaa lisääntynyt suhde fosforyloidun AMPK kokonaismäärään AMPK. Kuitenkin, koska voimakas vähentäminen yhteensä AMPK yhteensä fosforyloidun AMPK väheni metformiinin hoitoon verrattuna kontrolliin. Vähentäminen AMPK tasoilla metformiiniin väliaineessa, joka sisältää 2,5 mM glukoosia liittyi merkittävä apoptoottisen solukuoleman osoituksena lisääntynyt lohkaista kaspaasi 7 (kuvio 4D alapaneeli). Varianssi tasoilla aktiivisen AMPK korkean ja matalan glukoosin sisältävää alustaa voisi olla syynä ero glykolyyttisissä aineenvaihduntaan stimulaatiolle metformiiniin. Edelleen vahvistaa roolia AMPK edistämisessä glykolyysin, MCF7-soluja käsiteltiin yhdisteen kanssa tai ilman C (10 uM), spesifinen inhibiittori AMPK. Kun 15 tuntia alustassa, joka sisälsi 25 mM glukoosia metformiinin kanssa tai ilman, ECAR sekä laktaatti mittaukset saatiin. Laajuus ECAR augmentation ja kertymistä laktaatin kanssa metformiiniin osittain estetty yhteiskäsittely yhdisteen C (kuvio 4E, 4F). Tämä tukee roolia metformiinin aiheuttama AMPK aktivaation stimuloiva Glykolyysivaiheen korkean glukoosin sisältävässä alustassa. Lisäksi nämä havainnot tukevat johtopäätöstä, että epäonnistuminen käyttöön tai ylläpitää AMPK aktivaatio metformiinin vähän glukoosia sisältävässä väliaineessa johtaa ehtyminen ATP.

Ymmärtääksemme paremmin solunsisäisiä muutoksia, jotka tapahtuvat metformiinin hoitoa korkean ja matalan glukoosi media, proteiinin tasot useiden kinaasien tutkittiin. Sekä MCF7 ja MDAMB231-soluja käsiteltiin ja metformiinin (8 mM) yhden päivän ajan alustassa, joka sisälsi joko 25 mM tai 2,5 mM glukoosia. Western blottaus suoritettiin testaamiseksi fosforylaatioon AKT ja tavoitteista mTOR signalointi. Vastaus metformiinia suuresti muuttua huomattavasti alhainen glukoosi olosuhteissa. Vähän glukoosia olosuhteissa metformiinin havaittiin merkittävästi vähentää fosforylaation AKT ja vähentää fosforylaation tasoja tavoitteet mTOR (S6K ja 4EBP1) verrattuna runsaasti glukoosia olosuhteissa (kuvio 5A, 5B). Koska nämä reitit tiedetään edistävät solujen eloonjäämistä sekä glykolyyttisissä aineenvaihduntaa, niiden inhibitioon metformiini voi osaltaan pienentää glykolyysin myöhemmät ehtyminen ATP, ja lopulta solun kuolemaan.

MCF7 ja MDAMB231 solut käsiteltiin metformiinin DMEM, joka sisälsi joko 25 mM glukoosia tai 2,5 mM glukoosia yhden päivän. Western blotting käytettiin arvioitaessa tasot p-AKT (Thr308), p-AKT (Thr473), yhteensä AKT, p-S6K, yhteensä S6K, 4EBP1 (alemman kaistan edustavat hypophosphorylated ja korkeampi bändejä edustavat hyperfosforyloi-), ja β-aktiini kuten lastaus valvonta.

jotta voitaisiin edelleen tutkia roolia glukoosin solujen suojaaminen metformiinin aiheuttama kuolema, vaikutukset glukoosin verrattiin toisiinsa liittyvien sokereita, mukaan lukien heksoosit fruktoosi ja galaktoosi. Aikaisemmin on raportoitu, että fruktoosi ja galaktoosi eivät edistä merkittävästi glykolyyttisen aineenvaihdunnan syöpäsoluissa [26], [27]. Lisäksi käsittely galaktoosi kautta Glykolyysivaiheen tuloksia ei net ATP synteesi. Näiden pohjalta löytää ennustimme, että fruktoosi ja galaktoosi olisi voinut tukea ATP synteesi läsnäollessa metformiinia. Tämän testaamiseksi, glukoosi-soluviljelyelatusaineella oli täydennetty glukoosi, fruktoosi tai galaktoosi ja viljelmiä jälleen analysoitiin solukuolemaa (kuvio 6A, 6B). Rintasyövän solulinjoissa MCF7 ja MDAMB231 käsiteltiin metformiinin kanssa tai ilman ja 1,5 päivää DMEM: ssä, joka sisälsi glukoosia (0 tai 25 mM), fruktoosi (25 mM), galaktoosi (25 mM), tai fruktoosia sekä galaktoosia (12,5 mM kutakin). Edellisiin tuloksiin, lisäämällä glukoosipitoisuus vähentää huomattavasti sytotoksisuutta metformiinin sekä MCF7 ja MDAMB231 soluja. Kuitenkin, fruktoosi ja galaktoosi eivät olleet tehokkaita estämään sytotoksisuuden metformiinia. ATP-tasot tutkittiin myös soluissa hoidettiin metformiinilla väliaineessa, joka sisältää eri heksooseja. Metformiiniin johti merkittävästi vähentynyt ATP-tasot vähän glukoosia, korkea fruktoosi tai korkea galaktoosi olosuhteissa, mutta ei korkea glukoosi (25 mM) olosuhteissa. Väheneminen ATP huolimatta korkea fruktoosi tai galaktoosi saattaa selittää, miksi nämä sokerit eivät pysty pelastamaan soluja metformiinin aiheuttama sytotoksisuuden.

MCF7 (A) ja MDAMB231 (B) Soluja käsiteltiin metformiinin DMEM ilman glukoosia, 25 mM glukoosia, 25 mM galaktoosia, 25 mM fruktoosia, tai 12,5 mM fruktoosia plus 12,5 mM galaktoosia 1,5 päivää. Prosenttiosuus kuolleet solut määritettiin Sytox Green värjäystä. Metformiini hoitoryhmissä 25 mM galaktoosia, 25 mM fruktoosia ja 12,5 mM fruktoosi plus 12,5 mM galaktoosia oli merkittävästi erilainen kuin metformiini hoitoryhmissä 25 mM glukoosia. MCF7 (C) ja MDAMB231 (D) solut käsiteltiin osoitettuun väliaineessa metformiinin kanssa tai ilman (8 mM) yhden päivän ajan ja ATP-tasot mitattiin. Metformiini hoitoryhmissä 2,5 mM glukoosi, 25 mM galaktoosia ja 25 mM fruktoosi olivat merkittävästi erilaisia ​​kuin niiden kontrolliryhmiin. Tulokset näytetään kertainen muutos verrattuna kontrolli. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta. * Tarkoittaa merkitsevää eroa ryhmien välillä.

edelleen tutkia glukoosia tietyn hiilen lähteenä ylläpitämiseksi glykolyysin ja ATP: n läsnä ollessa metformiinin, seuraavan kerran testattiin vaikutuksia lääkkeen oksidatiivisen fosforylaation ja Glykolyysivaiheen mittaamalla OCR ja ECAR 25 mM glukoosia, 25 mM fruktoosia, tai 25 mM galaktoosia media. Zhou et al.